JP4639757B2 - 電解質測定用組成物 - Google Patents

Description

本発明は、体液、特に血液または尿中の電解質、例えばカルシウムイオンなどの電解質を測定する試薬組成物に関する。更に詳細には、α−アミラーゼ等の酵素を利用した電解質を測定する試薬組成物に関する。

生体内の電解質の濃度は、通常厳密に代謝調節されていることから、体液中の電解質の測定は生体機能のバロメーターとして生化学的臨床検査の中で最も一般的な分析であり、これらを測定することにより各種疾患の診断が行われる。例えば、血清中のカルシウムイオン量の測定は、低カルシウム血症として、低タンパク血症、低リン血症、腎炎、ネフローゼ、ビタミンＤ欠乏症、副甲状腺機能低下症、クル病等の疾患、高カルシウム血症としては、骨腫瘍、アジソン病、肺気腫、副甲状腺機能亢進症、腎不全等の疾患の診断に用いられる。

カルシウム測定法としては、従来より（１）滴定法、（２）比色法、（３）原子吸光法、（４）炎光光度計法、（５）電極法、（６）酵素法などが知られている。この中で（６）酵素法は正確性かつ簡便性に優れることから臨床検査分野で用いられている。酵素法としてはα−アミラーゼを用いる方法（特許文献１）、ホスホリパーゼＤを用いる方法（非特許文献１）などが挙げられる。

α−アミラーゼを用いる方法はカルシウムイオンによりアポ化α−アミラーゼが活性化され、糖基質例えば２−クロロ−４−ニトロフェニル−４−ｏ−β−Ｄ−ガラクトピラノシル−α−マルトシドに作用し、２−クロロ−４−ニトロフェニル（ＣＮＰ）を生成する。このＣＮＰの生成速度を測定することによりカルシウムイオンを測定する方法である。また、ホスホリパーゼＤを用いる方法はカルシウムイオンによりホスホリパーゼＤが活性化され基質であるビス(ｐ-ニトロフェニル)リン酸に作用しｐ-ニトロフェノール（ＰＮＰ）が遊離する。このＰＮＰの生成速度を測定することによりカルシウムイオンを測定する方法である。これらの方法の酵素反応は定量範囲を適正化するためキレート剤、拮抗阻害剤などのいわゆる競合阻害剤により各酵素の反応を制御している。酵素の作用により生成するＰＮＰ、ＣＮＰは遊離した後プロトンを解離することで発色し４００ｎｍに吸収極大を持つが、各酵素の至適ｐＨである中性付近では特にＰＮＰにおいて十分な解離度が得られずｐＨ、温度などの影響を受けて十分な感度が得られないことが報告されている（非特許文献２）。また、ＰＮＰは血清アルブミンなどの蛋白が結合することでＰＮＰの吸収ピークが単波長側にシフトしその結果測定値が変動することが報告されている（非特許文献３）。
特公平６−８７７９８号公報 日本臨床検査自動化学会会誌 ２００４年４月 Ｖｏｌ．２９，Ｐ３６４ 検査と技術 １９９４年４月 第２２巻 第４号，Ｐ３１７−３２２ 臨床化学 １９８６年 第１５巻 第１号，Ｐ５９−６７

本発明は（ａ）アポ化酵素、（ｂ）競合阻害剤、及び（ｃ）基質を含む電解質測定法において、血清アルブミンなどの蛋白の影響を回避し正確性、精密性のよい電解質測定用組成物を提供することを目的とする。

上記課題に鑑み、本発明は、（ａ）アポ化酵素、（ｂ）競合阻害剤、及び（ｃ）基質を含む電解質測定用組成物において、蛋白吸着防止剤を含有することを特徴とする電解質測定用組成物に関する。

すなわち本発明は、以下のような構成よりなる。
（１）（ａ）アポ化酵素、（ｂ）競合阻害剤、及び（ｃ）基質を含む電解質測定用組成物において、蛋白吸着防止剤を含有することを特徴とする電解質測定用組成物。
（２）蛋白吸着防止剤が２価金属含有化合物、脂肪族カルボン酸、芳香族カルボン酸、またはＳＨ化合物より選ばれた１種または２種以上の物質である（１）の電解質測定用組成物。
（３）２価金属含有化合物が塩化マグネシウム、酢酸マグネシウム、炭酸マグネシウム、硝酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化マンガン、酢酸マンガン、炭酸マンガン、硫酸マンガン、バリウム、硫酸バリウム、炭酸ストロンチウム、塩化ストロンチウム、酢酸ランタン、炭酸ランタン、塩化ランタンである（２）の電解質測定用組成物。
（４）脂肪族カルボン酸が、吉草酸、カプロン酸、エナント酸、カプリル酸、ペラルゴン酸、カプリン酸、ウンデカン酸、ラウリン酸、トリデカン酸、ミリスチン酸、ペンタデカン酸、パルミチン酸、ヘプタデカン酸、ステアリン酸、ノナデカン酸、アラキン酸、ウンデシレン酸、オレイン酸、エライジン酸またはこれらの塩より選ばれた１種以上の物質である（２）の電解質測定用組成物。
（５）芳香族カルボン酸が、安息香酸、フタル酸、サリチル酸またはこれらの塩より選ばれた１種以上の物質である（２）の電解質測定用組成物。
（６）ＳＨ化合物がＮ−アセチルシステイン、ジチオスレイトール、グルタチオン、チオグリセロール、メルカプトエタノール、チオサリチル酸、チオ尿素より選ばれた１種または２種以上の物質である（２）の電解質測定用組成物。
（７）さらにＨＬＢ１５以下の非イオン性界面活性剤を含有する（１）の電解質測定用組成物。
（８）非イオン性界面活性剤がポリオキシエチレンオクチルフェニルエーテルまたはポリオキシエチレンオレイルエーテルである（７）の電解質測定用組成物。
（９）（ａ）アポ化酵素、（ｂ）競合阻害剤、及び（ｃ）基質を含む電解質測定系において、蛋白吸着防止剤を含有することを特徴とする、電解質測定系における、測定の正確性を向上させる方法。
（１０）（ａ）アポ化酵素、（ｂ）競合阻害剤、及び（ｃ）基質を含む電解質測定用組成物において、蛋白吸着防止剤を含有することを特徴とする、電解質測定系における測定の正確性が向上した電解質測定用組成物を、製造する方法。

本発明によれば、血清アルブミンなどの蛋白の影響なく正確性、精密性良く電解質を測定することができる。

本発明の蛋白吸着防止剤は、ＰＮＰ、ＣＮＰなどのフェノール誘導体またはその他酸化還元色素等の指示物質と蛋白質が吸着しこれら指示物質の吸収スペクトルのシフトを抑える効果がある物質であり、かつ本発明の電解質測定用組成物のアポ化酵素、競合阻害剤、基質の存在下でもその正確性、精密性、定量性を損なうことなく当該効果が得られる物質である。

ＰＮＰなどの指示物質は血清蛋白特にアルブミン等の蛋白質に吸着されてその電子状態に変化が生じ、吸収スペクトルが変化すると考えられる。しかし、アルブミンの吸着座は１分子あたりの数が限られており、指示物質はアルブミンの特定の結合部位に吸着するものと考えられる。このことから、アルブミンと指示物質との吸着を抑えるには、アルブミンの吸着座に対し指示物質よりも強く吸着するか、またはアルブミンによる吸着を物理的にブロックするような物質が想定され、本発明の蛋白吸着防止剤はこのような作用機序で指示物質の吸収スペクトルのシフトを防止するものと考えられる。

また、血清蛋白特にアルブミン等の蛋白質と結合親和性がある物質は種々あるが、本発明の（ａ）アポ化酵素、（ｂ）競合阻害剤、及び（ｃ）基質を含む電解質測定用組成物においてはアポ化酵素、競合阻害剤に対し作用する物質、または電解質と錯体を形成し電解質測定の定量性を妨害するものもある。このことから、本発明の蛋白吸着防止剤は（ａ）アポ化酵素、（ｂ）競合阻害剤、及び（ｃ）基質を含む電解質測定用組成物においてその正確性、精密性、定量性を損なうことなくかつ蛋白吸着防止効果が得られるものである。本発明者らは鋭意検討した結果、このような物質として２価金属含有化合物、脂肪族カルボン酸、芳香族カルボン酸、ＳＨ化合物を見出した。これらは単独でも効果が得られるが、２種以上を組合わせて用いることで更に蛋白吸着防止効果が高まる。

２価金属含有化合物としては特に限定されないが、塩化マグネシウム、酢酸マグネシウム、炭酸マグネシウム、硝酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化マンガン、酢酸マンガン、炭酸マンガン、硫酸マンガン、バリウム、硫酸バリウム、炭酸ストロンチウム、塩化ストロンチウム、酢酸ランタン、炭酸ランタン、塩化ランタン等が挙げられる。好ましくは塩化マグネシウム、酢酸マグネシウム、炭酸マグネシウム、硝酸マグネシウム、硫酸マグネシウムである。これらは反応液中濃度として０．０１〜５０ｍＭの濃度で添加することができるが、好ましくは０．１〜２０ｍＭの濃度である。またこれらの２価金属含有化合物は複数組み合わせて用いることができる。

脂肪族カルボン酸としては、飽和脂肪族カルボン酸、不飽和脂肪族カルボン酸が用いられ、またモノカルボン酸、ジカルボン酸、トリカルボン酸のいすれも用いられうる。具体的には、吉草酸、カプロン酸、エナント酸、カプリル酸、ペラルゴン酸、カプリン酸、ウンデカン酸、ラウリン酸、トリデカン酸、ミリスチン酸、ペンタデカン酸、パルミチン酸、ヘプタデカン酸、ステアリン酸、ノナデカン酸、アラキン酸、ウンデシレン酸、オレイン酸、エライジン酸、およびこれらのＮａ、Ｋ、Ｌｉ等の塩が挙げられるが、好適にはカプロン酸、カプリル酸、カプリン酸があり、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム等のアルカリ溶液で溶解される。該脂肪族カルボン酸の試薬組成中濃度は反応液中濃度として、０．００１〜０．５％（Ｗ／Ｖ）の範囲で用いられるが、これらの物質は酵素と競合阻害剤間の阻害親和性に影響することから、０．００１〜０．２％（Ｗ／Ｖ）の範囲が好適である。またこれらの脂肪族カルボン酸は複数組み合わせて用いることができる。

芳香族カルボン酸としては、安息香酸、フタル酸、サリチル酸またはこれらのＮａ、Ｋ、Ｌｉ等の塩が挙げられるが、好適にはサリチル酸Ｎａである。該芳香族カルボン酸の試薬組成中濃度は反応液中濃度として、０．００１〜０．５％（Ｗ／Ｖ）の範囲で用いられるが、これらの物質は酵素と競合阻害剤間の阻害親和性に影響することから、０．００１〜０．２％（Ｗ／Ｖ）の範囲が好適である。またこれらの芳香族カルボン酸は複数組み合わせて用いることができる。

ＳＨ化合物としては、Ｎ−アセチルシステイン、ジチオスレイトール、グルタチオン、チオグリセロール、メルカプトエタノール、チオサリチル酸、チオ尿素が挙げられるが、特にチオサリチル酸、チオグリセロールが好適である。該ＳＨ化合物の試薬組成中濃度は反応液中濃度として、０．００１〜２０ｍＭの範囲で用いられるが、溶解性等を考慮し、０．００１〜１０ｍＭが好適である。またこれらのＳＨ基含有化合物は複数組み合わせて用いることもできる。

本発明ではＨＬＢ１５以下の非イオン性界面活性剤を含有することで前述の蛋白吸着防止剤の効果を更に高めることができる。非イオン性界面活性剤はＨＬＢが１５以下であれば特に限定されないが、更に好ましくはＨＬＢは１２〜１４である。このような非イオン性界面活性剤としてはポリオキシエチレンラウリルエーテル類としてエマルゲン１０８（ＨＬＢ１２．１）、エマルゲン１０９Ｐ（ＨＬＢ１３．６）、エマルゲン１２０（ＨＬＢ１５．３）、ノニオンＫ−２１５（ＨＬＢ１５．２）、ＮＩＫＫＯＬ ＢＬ−９ＥＸ（ＨＬＢ１４．５）、ポリオキシエチレンセチルエーテル類として、エマルゲン２２０（ＨＬＢ１４．２）、ＮＩＫＫＯＬ ＢＣ−１０ＴＸ（ＨＬＢ１３．５）、ノニオンＰ−２０８（ＨＬＢ１１．９）、ノニオンＰ−２１０（ＨＬＢ１２．９）、ノニオンＰ−２１３（ＨＬＢ１４．１）、ポリオキシエチレンステアリルエーテル類として、エマルゲン３２０Ｐ（ＨＬＢ１３．９）、ノニオンＳ−２１５（ＨＬＢ１４．２）、ポリオキシエチレンオレイルエーテル類としては、エマルゲン４０９Ｐ（ＨＬＢ１２．０）、エマルゲン４２０（ＨＬＢ１３．６）、ＮＩＫＫＯＬ ＢＯ−２（ＨＬＢ７．５）、ＮＩＫＫＯＬ ＢＯ−７（ＨＬＢ１０．５）、ＮＩＫＫＯＬ ＢＯ−１０ＴＸ（ＨＬＢ１４．０）、ノニオンＥ−２１５（ＨＬＢ１４．２）、ポリオキシエチレン等が挙げられる。２級アルキルエーテル類としては、ＮＩＫＫＯＬ ＢＴ−７（ＨＬＢ１４．２）、ＮＩＫＫＯＬ ＢＴ−９（ＨＬＢ１４．２）、ＮＩＫＫＯＬ ＢＴ−１２（ＨＬＢ１４．２）、アデカトールＳＯ−１２０（ＨＬＢ１２．０）、アデカトールＳＯ−１３５（ＨＬＢ１３．５）、アデカトールＳＯ−１４５（ＨＬＢ１４．５）、エマルゲン７０７（ＨＬＢ１２．１）、エマルゲン７０９（ＨＬＢ１３．３）等が挙げられる。ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル類としては、エマルゲン８１０（ＨＬＢ１３．１）、エマルゲン９０９（ＨＬＢ１２．４）、エマルゲン９１０（ＨＬＢ１２．２）、エマルゲン９３０（ＨＬＢ１５．１）、トリトンＸ−１００（ＨＬＢ１３．５）、トリトンＸ−１１４（ＨＬＢ１２．４）、ＮＩＫＫＯＬ ＮＰ−７．５（ＨＬＢ１４．０）、等が挙げられる。オキシエチレン・オキシプロピレンブロックコポリマー類としては、エマルゲンＰＰ−１５０（ＨＬＢ１４．２）、エマルゲンＰＰ−２３０（ＨＬＢ１４．２）、エマルゲンＰＰ−２５０（ＨＬＢ１４．２）、エマルゲンＰＰ−２９０（ＨＬＢ１４．２）、ＮＩＫＫＯＬ ＰＢＣ−４４（ＨＬＢ１２．５）、等が挙げられる。脂肪酸エステル類としては、レオドールＴＷ−Ｌ１０６（ＨＬＢ１３．３）、レオドールＴＷ−Ｓ１２０（ＨＬＢ１４．９）、レオドールＴＷ−Ｏ１２０（ＨＬＢ１５．０）、レオドール４６０（ＨＬＢ１３．８）、エマノーン１１１２（ＨＬＢ１３．７）、エマノーンＣＨ−４０（ＨＬＢ１２．５）、エマノーンＣＨ−６０（ＨＬＢ１４．０）、等が挙げられる。ポリオキシエチレンステロール類としては、ＮＩＫＫＯＬ ＢＰＳ−１０（ＨＬＢ１２．５）、ＮＩＫＫＯＬ ＢＰＳＨ−２５（ＨＬＢ１４．５）、等が挙げられる。ポリオキシプロピレン（２）ポリオキシエチレンデシルエーテル類としては、エマレックスＤＡＰＥ−０２０７（ＨＬＢ１２．０）、エマレックスＤＡＰＥ−０２１０（ＨＬＢ１４．０）、等が挙げられる。ポリオキシエチレンスチリルフェニルエーテル類としてはエマルゲンＡ−６０（ＨＬＢ１２．８）、エマルゲンＡ−９０（ＨＬＢ１４．５）、エマルゲンＢ−６６（ＨＬＢ１３．２）、等が挙げられる。該非イオン性界面活性剤の試薬組成中濃度は反応液中濃度として、０．００１〜２％（Ｗ／Ｖ）の範囲で用いられるが、好ましくは０．０１〜１％（Ｗ／Ｖ）である。またこれらの非イオン性界面活性剤は複数組み合わせて用いることができる。

本発明に用いるアポ化酵素としては、測定対象とする電解質量により活性化する酵素であり、当該酵素中の測定対象の電解質が測定に用いられる程度に除去されているものであればよく、このような酵素としては例えばカルシウムイオン測定に用いられる酵素としてα−アミラーゼ、ホスホリパーゼＤ、グルタミン酸デヒドロゲナーゼ、ウレアアミドリアーゼ、トランスグルタミナーゼ等が挙げられる。これら酵素は動物、植物、微生物から採取されるもの、またはこれらの遺伝子を他の微生物に組み込まれた遺伝子組換え微生物より製造されたものなどがあり、また、遺伝子的に性質を改変したものを含有する。また、これら酵素の特異性、安定性を向上させる目的で上記酵素を化学的に修飾したものも用いられる。また、これら酵素は、脱塩処理によってアポ化して用いるが、該脱塩処理は、例えば、透析、限外濾過、イオン交換、カラム除去、電気膜透析などの方法により行われるのが好ましい。このようなアポ化酵素の試薬組成中の濃度は、好ましくは反応液中に０．１〜１０００ＩＵ／ｍｌの範囲で用いられる。

本発明に用いる基質は、測定対象の電解質により活性化する酵素の基質特異性により設定される。また、本発明は、前述のＰＮＰ等の発色基を結合した合成基質に限らず、酵素の作用により生成した生成物にさらに追随酵素を作用させ過酸化水素を生成させ、酸化還元色素をペルオキシダーゼの存在下、発色に導く系に用いられうる基質にも適用される。また、本発明に用いる基質の具体例としては、カルシウムイオン測定に用いる酵素としてα−アミラーゼを用いる場合、例えばマルトオリゴ糖の還元末端にフェニル基、ナフチル基、またはそれらの誘導体をアグリコンとして結合させた誘導体を基質とする方法として、ｐ−ニトロフェニルマルトペンタオシド、ｐ−ニトロフェニルマルトヘキサオシド、ｐ−ニトロフェニルマルトヘプタオシド、２，４−ジクロロニトロフェニルマルトペンタオシド、２−クロロ−４−ニトロフェニルマルトトリオシド、２−クロロ−４−ニトロフェニルマルトペンタオシド等を基質として用い、活性化されたα−アミラーゼを作用させ、必要によりα−グルコシダーゼ等の追随酵素を作用させて、これらの基質からアグリコンを遊離させ、遊離したアグリコンの量を光学的に測定することによりカルシウム等の電解質量を求める。

また、マルトオリゴ糖の還元末端にフェニル基、ナフチル基、またはそれらの誘導体をアグリコンとして結合させたマルトオリゴ糖誘導体の非還元末端のグルコースの４位および６位のヒドロキシル基が何らかの手段で修飾された誘導体を基質とする方法は、基質として非還元末端グルコースがハロゲン、グルコピラノシル基等で修飾されたタイプの基質（例えば、特開昭６０−２３７９９８号公報）あるいは、４位および６位のヒドロキシル基をアルキル基、アルコイル基またはフェニル基で置換したタイプの基質（例えば、特開昭６０−５４３９５号公報、特開平１−１５７９９６号公報）あるいは４位および６位のヒドロキシル基をβ−ガラクトピラノシル基で置換したタイプの基質（例えば、特開平３−２６４５９６号公報、特開平６−３１５３９９号公報）を用いる方法がある。これらの基質は非還元末端が修飾されておりα-グルコシダーゼの影響がないことから原理的に優れている。

なかでも、２−クロロ−４−ニトロフェニル−４−ｏ−β−Ｄ−ガラクトピラノシル−α−マルトシドを用いる方法は、追随酵素を必要としないことから低コストであり、しかも、α−アミラーゼの基質親和性が高いため好感度であるといったメリットがあり好適に用いられる。該基質の試薬組成物中での濃度は、反応液中に好ましくは０．０５〜５０ｍＭ、より好ましくは０．１〜２ｍＭの範囲で用いられる。

本発明に用いる競合阻害剤の役割としては、ブランク反応を抑える、定量性を調節する等が挙げられる。このような競合阻害剤としては金属キレート剤、基質アナログが挙げられる。これらは各々単独で用いることもできるが、これらの競合阻害剤としての役割は同じではあるが、その化学的な機序は異なるため組合わせて用いるのが好ましい。

金属キレート剤としては、測定対象の電解質が特に金属イオンである場合は測定対象以外の金属イオンの試料に存在しうる濃度および当該金属イオンに対するキレート安定度定数を考慮して選択される。また、前述の通り、本発明の蛋白吸着防止剤の当該金属イオンに対するキレート安定度定数よりも大きい方が好ましい。このような金属キレート剤として例えば、１，２−ビス（ｏ−アミノフェノキシ）エタン四酢酸（ＢＡＰＴＡ）、グリコールエーテルジアミン四酢酸（ＧＥＤＴＡ）、エチレンジアミン二プロピオン酸（ＥＤＤＰ）、エチレンジアミンテトラキスメチレンホスホン酸（ＥＤＴＰＯ）、ハイドロキシエチルエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、エチレンジアミン二酢酸（ＥＤＤＡ）、イミノ二酢酸（ＩＤＡ）、ニトリロ三酢酸（ＮＴＡ）、ハイドロキシエチルイミノ二酢酸（ＨＩＤＡ）、ジアミノプロパノール四酢酸（ＤＰＴＡ−ＯＨ）、ニトリロトリスメチレンホスホン酸（ＮＴＰＯ）、ニトリロ三プロピオン酸（ＮＴＰ）、ジヒドロキシエチルグリシン（ＤＨＥＧ）、クエン酸、酒石酸等が挙げられる。なかでも、α−アミラーゼを用いたカルシウムイオン測定に用いられる物質としては、α−アミラーゼの至適ｐＨが中性付近であり、本ｐＨ条件下で金属選択性を保持する、１，２−ビス（ｏ−アミノフェノキシ）エタン四酢酸が好ましい。該金属キレート剤の試薬組成中濃度は反応液中濃度として、０．０１〜１００ｍＭ、好ましくは０．０１〜１０ｍＭ、より好ましくは０．１〜１ｍＭの範囲で用いられる。また、上記に示されるキレート剤を複数組合わせて用いることができる。

基質アナログとしては、例えばカルシウムイオン測定に用いる酵素としてα−アミラーゼを用い、基質として２−クロロ−４−ニトロフェニルマルトトリオシドまたは２−クロロ−４−ニトロフェニル４−ｏ−β−Ｄ−ガラクトピラノシルマルトシドを用いる場合は、マルトオリゴ糖、またはその非還元末端グルコースを修飾したマルトオリゴ糖、またはその還元末端グルコースに非発色源基が結合したマルトオリゴ糖より選ばれる基質が好適に用いられる。

上記マルトオリゴ糖としては、例えば、マルトース、マルトトリオース、マルトテトラオース、マルトペンタオース、マルトヘキサオース、マルトヘプタオースなどグルコース数が２〜７のマルトオリゴ糖が挙げられる。非還元末端グルコースを修飾したマルトオリゴ糖としては、ガラクトシルマルトース、ガラクトシルトリオース、ガラクトシルテトラオース、ガラクトシルペンタオースが挙げられ、還元末端グルコースに非発色源基が結合したマルトオリゴ糖としては、例えば、２，４−ジクロロフェニル−α−Ｄ−マルトトリオシド、２，４−ジクロロフェニル−（αまたはβ）−Ｄ−マルトペンタオシド、２，４−ジクロロフェニル−（αまたはβ）−Ｄ−マルトトリオシドなどが挙げられる。該マルトオリゴ糖の用いる濃度としては、好ましくは反応液中で０．０１〜２５０ｍＭ、より好ましくは０．１〜２００ｍＭである。

本発明の電解質測定用組成物は、試薬の保存安定性を考慮し第一反応、第二反応の２ステップで測定するのが好ましく、第一試薬、第二試薬の２試薬系で構成されるのが好ましい。

各試薬のｐＨは、本発明のアポ化酵素、競合阻害剤、基質、蛋白吸着防止剤の各々の安定性を考慮し、適宜、第一試薬、第二試薬の成分構成を設定する。また、各々の試薬には各構成成分の安定性を鑑みｐＨ条件を設定するが、最終ｐＨは酵素反応および競合阻害剤のバランスをとり、電解質により活性化された各酵素の基質分解反応速度そのものを制御し、測定範囲を最適化することが可能となる。

試薬ｐＨを保持する方法は、公知の方法であれば何ら限定されるものではないが、一般的には緩衝剤が用いられる。緩衝液としては、トリス緩衝液、リン酸緩衝液、ＧＯＯＤ緩衝液などが挙げられる。なかでも、トリス緩衝液、リン酸緩衝液は濃度、温度によってｐＨが変動しやすいが、安価であるという利点がある。一方、ＧＯＯＤ緩衝液にはＭＥＳ、Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ、ＡＣＥＳ、ＢＥＳ、ＭＯＰＳ、ＰＩＰＥＳ、ＴＥＳ、ＨＥＰＥＳ、Ｔｒｉｃｉｎｅ、Ｂｉｃｉｎｅ、ＰＯＰＳＯ、ＴＡＰＳ、ＣＨＥＳ、ＣＡＰＳなどが例示される。該緩衝液のｐＨは５〜９の範囲で調整される。さらには６〜８が好ましい。中でも６．５〜７．５が好ましい。また、第一試薬、第二試薬各々における緩衝剤は、好ましくは１０〜５００ｍＭ、より好ましくは５０〜３００ｍＭの濃度で用いられる。

例えば、α−アミラーゼの安定性至適ｐＨは６〜８の中性付近であり、またキレート剤の安定性至適ｐＨはアルカリ側であることより、本発明の試薬組成物をｐＨ６〜８の範囲で調製するのが好ましいと考えられるが、同時に定量性等の性能を得るには、第一試薬と第二試薬を混合した際に反応至適ｐＨになるように処方することもできる。好ましくはキレート剤を含む試薬をｐＨ７以上、より好ましくはｐＨ７〜９、カルシウムイオンにより活性化するα−アミラーゼを含む試薬をｐＨ６〜７とし、緩衝液濃度またはこれら２試薬の混合比を調整し、反応至適ｐＨになるように処方する。

また、本発明の電解質測定用組成物には、測定対象の電解質がカルシウムイオンの場合は、アルカリ金属のハロゲン化物、例えば、塩化ナトリウム、塩化カリウムなどを３〜３００ｍＭの濃度で添加することができる。

以下、本発明を実施例により具体的に説明する。なお、本発明は実施例により特に限定されるものではない。
（実施例１）
下記のカルシウム測定試薬の第一試薬に、２価金属含有化合物として塩化マグネシウム（４ｍｍｏｌ／Ｌ）、脂肪族カルボン酸としてカプリン酸（０．０２％（Ｗ／Ｖ））、芳香族カルボン酸としてサリチル酸（０．０２％（Ｗ／Ｖ））、ＳＨ化合物としてチオサリチル酸（０．０２％（Ｗ／Ｖ））、チオグリセロール（０．２％（Ｗ／Ｖ））、を表１のように単独もしくは組合わせて添加した１１試薬を調製した。試料は７％（ｗ／ｖ）ヒト血清アルブミン溶液９容に対し、１００ｍｇ／ｄＬカルシウム水溶液を１容添加して調製し、調製した試薬を用いて下記の方法で測定した。比較例として、これら蛋白吸着防止剤を添加しない試薬を調製して同様に測定した。

第一試薬
トリス塩酸バッファー（ｐＨ７．１） ５０ｍＭ
ＮａＣｌ ２００ｍＭ
１，２−ビス（ｏ−アミノフェノキシ）エタン四酢酸 ０．８ｍＭ
ガラクトシルマルトース ０．３％（Ｗ／Ｖ）
エマルゲン４３０（花王；ＨＬＢ１６．２） ０．１％（Ｗ／Ｖ）
ρ-ニトロフェニル-α-Ｄ-マルトペンタオシド ０．５ｍＭ
第二試薬
グッド緩衝液（ｐＨ６．０） ３００ｍＭ
ＮａＣｌ ２００ｍＭ
ガラトシルマルトース ０．３％（Ｗ／Ｖ）
エマルゲン４３０（花王；ＨＬＢ１６．２） ０．１％（Ｗ／Ｖ）
α−グルコシダーゼ（東洋紡社製；ＡＧＨ−２０１） １０Ｕ／ｍＬ
α−アミラーゼ（ブタ膵臓由来） ４．２ＩＵ／ｍL

（測定法）
日立７１７０形自動分析機を用いた。試料量３．５μｌに第一試薬１８０μｌ加え、５分間予備加温した後、さらに第二試薬９０μｌを加えて反応を開始させ、該基質試液添加後２分後からの３分間における１分あたりの吸光度変化を求め、精製水およびカルシウム１０ｍｇ／ｄｌ標準液での２点検量線に基づき試料中のカルシウム量を求めた。測定波長は、主波長４０５ｎｍ、副波長５４６ｎｍとし、測定温度は３７℃で実施した。

結果 表１に示す。１０ｍｇ／ｄＬの試料をｎ＝５で測定したときの平均値が実施例では±３．４％以内であるのに対し、比較例ではそれを超える。

（実施例２）
実施例１に記載のカルシウム測定試薬の第一試薬に、塩化マグネシウム（０、１、２、４、８、１６ｍｍｏｌ／Ｌ）、カプリン酸（０、０．００５、０．０１、０．０２、０．０４、０．０８％（Ｗ／Ｖ））、サリチル酸（０、０．００５、０．０１、０．０２、０．０４、０．０８％（Ｗ／Ｖ））、チオサリチル酸（０、０．００５、０．０１、０．０２、０．０４、０．０８％（Ｗ／Ｖ））、チオグリセロール（０、０．００５、０．０１、０．０２、０．０４、０．０８％（Ｗ／Ｖ））、を表２〜６のように各々調製した。試料は実施例１と同様に調製し、調製した試薬を用いて実施例１同様の方法で測定した。

結果 表２〜７に示す。１０ｍｇ／ｄＬの試料をｎ＝５で測定したときの平均値が実施例である塩化マグネシウム、カプリン酸、サリチル酸、チオサリチル酸、チオグリセロール各々の添加試薬では±３．４％以内であるのに対し、比較例である各々の蛋白吸着防止剤無添加ではそれを超える。

（実施例３）
実施例１に記載のカルシウム測定試薬の第一試薬に、塩化マグネシウム（４ｍｍｏｌ／Ｌ）、カプリン酸（０．０２％（Ｗ／Ｖ））、サリチル酸（０．０２％（Ｗ／Ｖ））、チオサリチル酸（０．０２％（Ｗ／Ｖ））を各々単独で添加した試薬、および界面活性剤のエマルゲン４３０にかえてエマルゲン４２０（花王；ＨＬＢ１３．６）を添加した試薬にさらに塩化マグネシウム（４ｍｍｏｌ／Ｌ）、カプリン酸（０．０２％（Ｗ／Ｖ））、サリチル酸（０．０２％（Ｗ／Ｖ））、チオサリチル酸（０．０２％（Ｗ／Ｖ））を各々単独で添加した試薬を表７のように８試薬を調製した。試料は実施例１と同様に調製し、調製した試薬を用いて実施例１の方法で測定した。比較例として、実施例１に記載の試薬にこれら蛋白吸着防止剤を添加しない試薬を調製して同様に測定した。

結果 表７に示す。１０mg/dLの試料をｎ＝５で測定したときの平均値が実施例では±３．４％以内であるのに対し、比較例ではそれを超える。また、実施例のなかでもエマルゲン４２０を用いた試薬では±２．０％以内であり蛋白吸着防止剤の効果が高められた。

本発明の電解質測定容組成物は、体外診断用医薬品などの用途分野に利用することができ、産業界に寄与することが大である。

Claims (6)

1. （ａ）アポ化α−アミラーゼ、（ｂ）競合阻害剤、及び（ｃ）基質としてマルトオリゴ糖の還元末端にｐ−ニトロフェニル基、または、２−クロロ−４−ニトロフェニル基をアグリコンとして結合させた誘導体を含むカルシウムイオン測定用組成物において、蛋白吸着防止剤としてマグネシウム塩、カプリン酸、サリチル酸塩、チオサリチル酸、または、チオグリセロールを含有することを特徴とするカルシウムイオン測定用組成物
2. さらにＨＬＢ１５以下の非イオン性界面活性剤を含有する請求項１に記載のカルシウムイオン測定用組成物
3. 非イオン性界面活性剤がポリオキシエチレンオクチルフェニルエーテルまたはポリオキシエチレンオレイルエーテルである請求項２に記載のカルシウムイオン測定用組成物
4. アポ化α−アミラーゼが、カルシウムイオンにより活性化されることにより、マルトオリゴ糖の還元末端にｐ−ニトロフェニル基、または、２−クロロ−４−ニトロフェニル基をアグリコンとして結合させた誘導体である基質に作用し、生成するｐ−ニトロフェノールまたは２−クロロ−４−ニトロフェノールの生成速度を測定することにより、カルシウムイオンを測定する方法において、競合阻害剤、及び、蛋白吸着防止剤としてマグネシウム塩、カプリン酸、サリチル酸塩、チオサリチル酸、または、チオグリセロールを作用させることを特徴とする、カルシウムイオン測定方法。
5. さらに、ＨＬＢ１５以下の非イオン性界面活性剤を作用させる請求項４に記載のカルシウムイオン測定方法
6. 非イオン性界面活性剤がポリオキシエチレンオクチルフェニルエーテルまたはポリオキシエチレンオレイルエーテルである請求項５に記載のカルシウムイオン測定方法