WO2011126067A1 - 糖化ヘモグロビンの測定方法 - Google Patents

糖化ヘモグロビンの測定方法 Download PDF

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WO2011126067A1
WO2011126067A1 PCT/JP2011/058776 JP2011058776W WO2011126067A1 WO 2011126067 A1 WO2011126067 A1 WO 2011126067A1 JP 2011058776 W JP2011058776 W JP 2011058776W WO 2011126067 A1 WO2011126067 A1 WO 2011126067A1
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WO
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hemoglobin
glycated
protease
reaction
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PCT/JP2011/058776
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Inventor
研吾 西村
Original Assignee
東洋紡績株式会社
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    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/72—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving blood pigments, e.g. haemoglobin, bilirubin or other porphyrins; involving occult blood
    • G01N33/721—Haemoglobin
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/75—Systems in which material is subjected to a chemical reaction, the progress or the result of the reaction being investigated
    • G01N21/77—Systems in which material is subjected to a chemical reaction, the progress or the result of the reaction being investigated by observing the effect on a chemical indicator
    • G01N21/82—Systems in which material is subjected to a chemical reaction, the progress or the result of the reaction being investigated by observing the effect on a chemical indicator producing a precipitate or turbidity
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/90—Enzymes; Proenzymes
    • G01N2333/902—Oxidoreductases (1.)
    • G01N2333/906—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.7)
    • G01N2333/9065—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.7) acting on CH-NH groups of donors (1.5)
    • G01N2333/90672—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.7) acting on CH-NH groups of donors (1.5) with oxygen as acceptor (1.5.3) in general

Definitions

  • the present invention relates to a method for measuring glycated hemoglobin, and more particularly to a method for measuring a ratio of glycated hemoglobin to hemoglobin.
  • the present invention also relates to a reagent for measuring glycated hemoglobin, and more particularly to a reagent for measuring the ratio of glycated hemoglobin to hemoglobin.
  • a reagent for measuring glycated hemoglobin (for example, HbA1c) using a conventional enzyme method has been affected by glycated amino acids or glycated peptides other than the measurement target component present in the infusion solution.
  • various measuring systems that incorporate an erasing system are known.
  • Patent Documents 1 to 7 and Non-Patent Document 1 use a method of adding a tetrazolium compound
  • Patent Documents 8 and 9 use a sulfone compound and / or a nitro compound
  • Patent Document 10 uses a sucrose ester.
  • Protease reaction promoter Patent Document 11 discloses a protease reaction accelerator containing at least one of a compound containing an acetate group or a salt thereof, N-acyl taurine or a salt thereof, or polyoxyethylene alkyl ether sulfate or a salt thereof Are each disclosed.
  • the tetrazolium salt reacts strongly with a reducing compound such as glycated protein or ascorbic acid to cause coloration. It causes abnormal values in samples containing ascorbic acid.
  • sulfone compounds are inhibitors of enzymes. Particularly frequently used sodium lauryl sulfate, sodium dodecylbenzenesulfonate, lithium lauryl sulfate, and the like are glycated amino acids and / or saccharified. It is an inhibitor that is powerful enough to be a reaction terminator for enzymes that act on peptides. Furthermore, the nitro compound is colored, causing the reagent blank to rise and the measurement accuracy to decrease.
  • Patent Document 11 the additive used is generally expensive.
  • the “compound containing an acetic acid group or a salt thereof”, “N-acyl taurine or a salt thereof” and “polyoxyethylene alkyl ether sulfate or a salt thereof” disclosed in Patent Document 11 are all anionic surfactants. .
  • anionic surfactants are said to adsorb to protein molecules (enzymes) and suppress their activity, and in the form of coexistence with the enzyme to be measured, when actually stored for a long time rather than in an accelerated test Furthermore, there is a possibility that the enzyme activity itself is lowered and adversely affects the measurement.
  • the present invention has an object to solve the problems in the prior art described above.
  • R-OX (I)
  • R is an alkyl group having 9 to 18 carbon atoms or a substituted alkyl group
  • X is a polyoxyethylene residue.
  • the alkyl group of R has 9 or more carbon atoms, preferably 9 to 18, more preferably 12 to 16. Most preferably, the alkyl group of R has 12 carbon atoms.
  • the present invention has the following configuration.
  • [Claim 1] A method for measuring at least one of hemoglobin, glycated hemoglobin, and a ratio of glycated hemoglobin to hemoglobin, the method comprising the following (a) and (b): (A) The following steps 1) to 3) are carried out in the same reaction vessel. (B) Steps 1) and 2) are performed in the same step, and step 3) is started in the next step.
  • (B) a compound represented by the following formula (I) having HLB of 12 or more (preferably HLB of 14 or more, more preferably HLB of 16 or more), and a buffer having a buffer capacity in the range of pH 5.0 to 9.5;
  • the solution contains 0.1-100 U / mL fructosyl amino acid oxidase, and the second reagent contains 500-500000 U / mL protease.
  • R-OX (I) (R is an alkyl group having 12 to 16 carbon atoms or a substituted alkyl group, and X is a polyoxyethylene residue.)
  • the reaction of the protease is accelerated (for example, the entire reaction is completed in only 5 minutes of the second reaction), and as a result, an elimination system can be formed. False high values due to the influence of glycated amino acids or glycated peptides other than components are eliminated.
  • the selected protease promoter does not inhibit the stability of the main reaction enzymes (fructosyl amino acid oxidase (FAOD), peroxidase (PEO), protease) and other erasing enzymes (catalase (CAO)).
  • the selected reaction accelerator has a surface active action and has an effect that it is not necessary to newly add a surface active agent that is essential for a diagnostic agent compatible with an automatic analyzer.
  • the data which examined the elimination ability of the endogenous glycated amino acid in this invention The correlation of the method of this invention and HPLC method regarding the measuring method of HbA1c.
  • a characteristic configuration of the measurement method of the present invention is a method for measuring at least one of hemoglobin, glycated hemoglobin, and a ratio of glycated hemoglobin to hemoglobin, which includes the following (a ) And (b).
  • (A) The following steps 1) to 3) are carried out in the same reaction vessel.
  • (B) Steps 1) and 2) are performed in the same step, and step 3) is started in the next step.
  • Test solution is not particularly limited as long as it is a target for which at least one of hemoglobin, glycated hemoglobin, and the ratio of glycated hemoglobin to hemoglobin is to be measured.
  • the present invention can also be applied to biological samples such as urine and cerebrospinal fluid (that is, samples collected from the living body), drinking water such as juice, foods such as soy sauce and sauce.
  • glycated hemoglobin include HbA1c (glycated protein in which the ⁇ chain of hemoglobin is glycated). Since the method of the present invention can be applied to diabetes diagnosis, it is particularly useful for whole blood samples and blood cell samples.
  • the hemolysis method is not particularly limited, and for example, a method using a surfactant, a method using ultrasonic waves, a method using a difference in osmotic pressure, a method using freezing and thawing, and the like can be used.
  • a method using a surfactant or a method using a difference in osmotic pressure is preferable for reasons such as ease of operation.
  • an automatic analyzer with an automatic hemolysis function for example, JEOL BM9130 type automatic analyzer
  • the stirring power at the time of automatic hemolysis is strong, the surfactant generates bubbles and interferes with sampling.
  • a method using the difference in osmotic pressure is more preferable. *
  • the surfactant examples include polyoxyethylene-pt-octylphenyl ether (Triton surfactant, etc.), polyoxyethylene sorbitan alkyl ester (Tween surfactant, etc.), polyoxyethylene alkyl ether ( Nonionic surfactants such as Brij type surfactants can be used, and specific examples include trade name Triton X-100, trade name Tween-20, trade name Brij 35, and the like.
  • the treatment conditions with the surfactant are usually such that when the blood cell concentration in the treatment solution is 1 to 10% by volume, the surfactant is added so that the concentration in the treatment solution is 0.1 to 1% by weight. Then, it may be stirred at room temperature for 5 seconds to 1 minute.
  • the hemolysis treatment can be performed simultaneously with the reaction in the first step, not as a pretreatment.
  • Examples of the measurement of glycated hemoglobin in the present invention include a method of measuring HbA1c in a measurement sample (for example, whole blood or blood) by a method including the following reaction steps (1) and (2).
  • a measurement sample for example, whole blood or blood
  • a method including the following reaction steps (1) and (2) Reaction of fragmenting a glycated protein into a glycated amino acid and / or glycated peptide by a protease having the ability to excise FVH (fructosylvalylhistidine) from the glycated ⁇ -chain N-terminus of glycated hemoglobin (2) Fragmentation FAOD (fructosyl amino acid oxidase) that reacts with the generated FVH and satisfies the characteristics shown in the following (a) and (b) performs an oxidation-reduction reaction with the FVH, and quantifies the generated hydrogen peroxide or oxygen.
  • FVH
  • protease used in the method of the present invention is not particularly limited.
  • these proteases commercially available ones may be used as they are, or those produced by publicly known literature according to the description may be used. Examples thereof include at least one protease selected from the group consisting of thermolysin, bromelain, papain, porcine pancreatic trypsin, metalloproteinase, and neutral protease.
  • the proteases used in the present invention are preferably the following from the viewpoints of stability, reaction rate (specific activity), availability, and the like.
  • Metalloprotease serine protease, serine carboxypeptidase, proteinase K, bromelain, papain, porcine pancreatic trypsin, Bacillus subtilis-derived protease, Aspergillus oryzae-derived protease, Aspergillus saitoi-derived protease, Streptomyces grisease, etc. It is.
  • Examples of commercially available products include Protease A “Amano” G (Amano Enzyme), Protease M “Amano” G (Amano Enzyme), Protease S “Amano” G (Amano Enzyme), Peptidase R (Amano Enzyme), Papain M?
  • a Bacillus genus-derived metalloproteinase (Toyobo: trade name Toyoteam), thermolysin (Amano Enzyme), Samoaase PC10 (Amano Enzyme), protease (derived from Streptomyces grieseus, Fluka), and protease (Aspergillus saitoi) are preferred.
  • Toyobo trade name Toyoteam
  • thermolysin Amano Enzyme
  • Samoaase PC10 Mano Enzyme
  • protease derived from Streptomyces grieseus, Fluka
  • protease (Aspergillus saitoi)
  • the protease used in the present invention is other than those described above, the protease whose purification method is known has been purified and the structure has been elucidated, or the partial amino acid sequence of the purified enzyme has been clarified, and the information can be obtained. It may be obtained by using and newly screening. Further, it may be obtained by newly screening using a gene or protein sequence estimated from information published in a database. Furthermore, a protease whose gene or protein sequence is actually known, or a protease newly obtained by the above-mentioned method is further modified by genetic engineering or chemical methods. Also good.
  • the FAOD used in the method of the present invention is not particularly limited.
  • enzymes derived from the genus Koniochaeta, Eupenicillium and variants thereof, or enzymes derived from Carbaria clavater YH923 or Neocosmospora vasinfecta 474 and variants thereof can be used.
  • a Cryptococcus neoformans-derived enzyme described in JP-A 2010-35469 and a modified product thereof, or an Aspergillus nidulans-derived enzyme described in JP-A 2010-57474 and a modified product thereof can be used.
  • Commercially available products such as FPOX-301 (trademark) (Toyobo), FPOX-CE (trademark) (Kikkoman), FPOX-EE (trademark) (Kikkoman) and the like can be used.
  • examples of the FAOD used in the method of the present invention include FAOD selected from Phaeosphaeria nodorum-derived enzymes disclosed in PCT / JP2009 / 005173 and variants thereof.
  • the protein which has a fructosyl valyl histidine oxidase activity in any one of the following (I) to (III) can be illustrated.
  • a protein comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1.
  • the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 consists of an amino acid sequence in which one or several amino acid residues are substituted, deleted, inserted and / or added, and has fructosyl valyl histidine oxidase activity protein.
  • FAOD among the proteins described in (II) or (III) above, among the 58th isoleucine from the amino terminus, the 110th glycine from the amino terminus, and the 282nd phenylalanine from the amino terminus A protein in which at least one site is substituted with another amino acid is preferable.
  • a protein in which the 58th isoleucine from the amino terminus is substituted with methionine, threonine, alanine, asparagine, serine, valine, or leucine is preferable.
  • the 110th glycine from the amino terminus is glutamine, methionine, glutamic acid, threonine, alanine, cysteine, histidine, lysine, asparagine, arginine, serine, valine, leucine, aspartic acid, isoleucine, tyrosine or Proteins substituted with phenylalanine are preferred.
  • Such FAOD is preferably a protein in which the 282nd phenylalanine from the amino terminus is substituted with tyrosine. Alternatively, a combination of these mutations may be used.
  • a recombinant vector containing any of the following polynucleotides (IV) to (VII) is prepared, and a transformant obtained by transforming a host with the recombinant vector is used.
  • Culture may be performed to produce a protein having fructosyl valyl histidine oxidase activity, and the protein may be collected.
  • a polynucleotide comprising the base sequence set forth in SEQ ID NO: 2.
  • V a protein having a fructosyl valyl histidine oxidase activity, comprising a base sequence in which one or more and 30 or less bases are substituted, deleted, inserted and / or added in the base sequence described in SEQ ID NO: 2
  • a polynucleotide encoding (VI) A polynucleotide encoding any one of the proteins of the present invention.
  • VII A protein that hybridizes under stringent conditions with a polynucleotide having a base sequence complementary to the polynucleotide of any one of (IV) to (VI) above and has fructosyl valyl histidine oxidase activity Polynucleotide.
  • the FAOD that can be used in the present invention comprises an amino acid sequence in which one or several amino acids are substituted, deleted, inserted and / or added in the amino acid sequence of the protein described above, and is a fructosylva.
  • Including a protein having rilhistidine oxidase activity the site where one or several amino acids are substituted, deleted, inserted and / or added is full of the protein after substitution, deletion, insertion and / or addition. Any site in the amino acid sequence may be used as long as it has kutosylvalylhistidine oxidase activity.
  • “1 or several amino acid residues” is specifically the number of amino acid residues in the range of 10 or less, preferably the amino acid residue in the range of 6 or less.
  • the FAOD that can be used in the present invention is 86.0% or more, more preferably 90.0% of the amino acid sequence of the protein according to the present invention described above (shown in SEQ ID NO: 1). As described above, it includes a protein having an amino acid sequence having a homology of 95.0% or more and having fructosyl valyl histidine oxidase activity.
  • the homology of amino acid sequences can be determined by a known method. Specifically, using GENETYX-WIN (trade name of GENETICS Co., Ltd.) according to the manual of the product, the amino acids that match by the homology search (homology search) between the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 and the amino acid sequence to be compared Homology can be calculated as a percentage of the sequence. Homology can be determined by comparing two sequences that are optimally aligned over the entire region of the sequence being compared. Here, in order to align the base sequence or amino acid sequence to be compared with each other in an optimal state, addition or deletion (for example, a gap) may be allowed.
  • the FAOD protein etc. that can be used in the present invention include, for example, those subjected to intermolecular crosslinking and / or intramolecular crosslinking (for example, disulfide bond), chemical modification (for example, sugar chain, phosphoric acid or other Functional group), label (for example, histidine tag, Myc tag, or Flag tag), or fusion protein (for example, streptavidin, cytochrome, GST or GFP)
  • the FAOD protein that can be used in the present invention may also include a chimeric protein constituted by combining several protein fragments as long as the fructosyl valyl histidine oxidase activity is substantially maintained.
  • HbA1c as glycated hemoglobin
  • the specific aspect of the HbA1c measurement method is not particularly limited as long as it is designed to include the reaction steps (1) and (2) described in [0023], and a commercially available instrument or device is appropriately selected.
  • a general-purpose automatic analyzer for example, Hitachi 7180 type automatic analyzer.
  • reagents for carrying out the enzyme method are used as liquid two agents (first reagent (hereinafter also referred to as R1), Prepare by dividing into two reagents (hereinafter also referred to as R2).
  • a typical measurement pattern is that after dispensing a sample into a measurement cell, the first reagent is added and kept at a constant temperature for several minutes (for example, about 5 minutes for the Hitachi 7180 automatic analyzer described above). (Hereinafter also referred to as the first reaction), and then the second reagent is added and kept at a constant temperature for several minutes (for example, about 5 minutes for the Hitachi 7180 automatic analyzer described above) (this process is referred to as the second reaction hereinafter). Describe). During this time, the absorbance is continuously measured at a substantially constant time interval appropriately set based on the specifications of the equipment used. The measurement wavelength, the amount of liquid added to the sample and each reagent (ratio of liquid amount), the time required for each step, and the like can be adjusted as appropriate based on the specifications of the equipment used.
  • a reagent in which FAOD is arranged in R1 and protease is arranged in R2 may be prepared, and measurement may be performed using an automatic analyzer.
  • this reagent is applied to an automatic analyzer, in the first reaction, ROD is added to free (so-called endogenous) glycated amino acid and / or glycated peptide in which FAOD is present in the measurement object for some reason. Acts to produce hydrogen peroxide (“elimination reaction”).
  • the hydrogen peroxide generated by the above reaction is, for example, in the first step by arranging catalase or the like in R1 when using a system that generates a quinone dye as a hydrogen peroxide quantitative system.
  • Hydrogen peroxide derived from such non-measurement objects is decomposed into oxygen and water immediately (substantially at the same time) following the generation (ie, a quantitative reaction of hydrogen peroxide in the second step).
  • the peroxidase is preferably arranged on R2.
  • R1 a compound represented by the following formula (I) of HLB12 or more is present.
  • HLB14 or more More preferably, it is HLB16 or more.
  • HLB value Whether or not a compound having a predetermined HLB value (or HLB value) is present is determined if the compound being added is clear, and if the compound is a commercial product, the manufacturer of the product Adopts the values described in the catalog. When the manufacturer does not disclose the information, the value described in the academic paper or patent document is adopted. When the chemical formula is clear or when the critical micelle concentration (cmc) is clear, the following formula is used.
  • B 32%
  • C and C are mixed by 68%
  • the best emulsion is obtained.
  • the HLB value of a liquid mixture is represented by the weighted average of each single HLB value.
  • the concentration at which the compound represented by the formula (I) is present is not particularly limited, but in the case where the protease reaction is performed, the lower limit is 0.14% (W / W (wt%) )) The above is preferable. A more preferred lower limit is 0.3% or more, and a more preferred lower limit is 0.75% or more.
  • the upper limit is preferably 10% or less from the viewpoint of solubility and the like. More preferably, the upper limit is 5% or less, and further preferably the upper limit is 3% or less.
  • the concentration of the compound represented by the above formula (I) in R1 is appropriately set based on the specifications of the instrument to be used and each reagent. Is defined by the amount of added liquid (liquid volume ratio).
  • the pH in the first reaction is not particularly limited as long as it is in the range of 5.0 to 9.5.
  • this treatment is usually performed in a buffer solution, and the buffer solution is not particularly limited.
  • Tris-HCl buffer solution, phosphate buffer solution, EPPS buffer solution, MES buffer solution, PIPES buffer solution, etc. Can be given.
  • the concentration of FAOD in the first reaction is not particularly limited as long as it is 0.1 to 100 U / mL.
  • the range is preferably 0.5 to 50 U / mL, more preferably 0.5 to 20 U / mL, and further preferably 1 to 10 U / mL.
  • the concentration and pH of each reagent in the first reaction or the second reaction may vary depending on the liquid volume ratio between the sample and the reagent, but in a normal measurement, R1 is higher than the sample liquid volume. In most cases, the liquid volume or the total liquid volume of R1 and R2 is set to dozens to dozens of times. In such a case, the influence of the sample is ignored and the concentration in the reagent is substantially reduced. It can be defined by pH.
  • fragmentation reaction the step of cleaving FVH from HbA1c by protease by R2 input
  • FAOD acts on the cleaved FVH.
  • the free glycated amino acid and / or glycated peptide originally present in the object to be measured is eliminated, so even if HbA1c is decomposed by protease in the second reaction, it is no longer FAOD and non-measurable object. There is no reaction with the product, and only the product cleaved from HbA1c by the protease can be reacted with FAOD.
  • the pH in the second reaction is not particularly limited as long as it is in the range of 5.0 to 9.5.
  • this treatment is usually performed in a buffer solution, and the buffer solution is not particularly limited.
  • Tris-HCl buffer solution, phosphate buffer solution, EPPS buffer solution, MES buffer solution, PIPES buffer solution, etc. Can be given.
  • the concentration of the protease in the second reaction is not particularly limited as long as it is 500 to 500,000 U / mL.
  • the range is preferably 500 to 50000 U / mL, more preferably 800 to 20000 U / mL, and still more preferably 1000 to 10000 U / mL.
  • a catalase inhibitor such as sodium azide may be arranged in R2 in order to eliminate the influence of catalase added in R1.
  • a catalase inhibitor such as sodium azide
  • R2 a catalase inhibitor
  • an excessive amount of peroxidase and a chromogenic substrate may be added.
  • the peroxidase is preferably added in an amount of activity (U) that is, for example, 5 to 100 times the amount of catalase added (U).
  • the peroxidase used in the above quantitative system is not particularly limited, and for example, commercially available products can be used. Suitable examples include those derived from horseradish, microorganisms and the like. Of these, horseradish-derived peroxidase is preferable.
  • the peroxidase is commercially available with high purity and low cost.
  • the concentration of peroxidase in the present invention is, for example, in the range of 0.01 KU / L to 4 MU / L, preferably 0.1 KU / L to 200 KU / L, more preferably 5 KU / L to 100 KU / L. (KU indicates kilo units, MU indicates mega units.)
  • the chromogenic substrate used in the present invention is not particularly limited, and examples thereof include a hydrogen donor, a leuco isomer, and a tetrazolium salt.
  • the hydrogen donor can be used in combination with a coupler.
  • a combination of a Trinder reagent as a hydrogen donor and 4-aminoantipyrine as a coupler can be mentioned.
  • the Trinder reagent include, but are not limited to, phenol, phenol derivatives, aniline derivatives, naphthol, naphthol derivatives, naphthylamine, naphthylamine derivatives, and the like.
  • these undergo an oxidative condensation reaction with a coupler (such as 4-aminoantipyrine (4-AA)) in the presence of peroxidase to produce a dye.
  • a coupler such as 4-aminoantipyrine (4-AA)
  • hydrogen donors examples include N-ethyl-N-sulfopropyl-3-methoxyaniline, N-ethyl-N-sulfopropylaniline, N-ethyl-N-sulfopropyl-3,5-dimethoxyaniline, N-sulfopropyl.
  • couplers examples include aminoantipyrine derivatives, vanillindiaminesulfonic acid, methylbenzthiazolinone hydrazone (MBTH) (more specifically, 3-methyl-2-benzothiazolinone hydrazone) in addition to the 4-aminoantipyrine.
  • MBTH methylbenzthiazolinone hydrazone
  • SMBTH Sulfonated methylbenzthiazolinone hydrazone
  • SMBTH Sulfonated 3-methyl-2-benzothiazolinone hydrazone
  • a triphenylmethane derivative, a phenothiazine derivative, a diphenylamine derivative etc. can be used. They are directly oxidatively colored in the presence of peroxidase.
  • 4,4′-benzylidenebis (N, N-dimethylaniline), 4,4′-bis [N-ethyl-N- (3-sulfopropylamino) -2,6-dimethylphenyl] methane, 1- (Ethylaminothiocarbonyl) -2- (3,5-dimethoxy-4-hydroxyphenyl) -4,5-bis (4-diethylaminophenyl) imidazole, 4,4′-bis (dimethylamino) diphenylamine, N- ( Carboxymethylaminocarbonyl) -4,4′-bis (dimethylamino) diphenylamine salt (for example, sodium salt), 10- (carboxymethylaminocarbonyl) -3,7-bis (dimethylamino) phenothiazine salt and the like.
  • tetrazolium salt examples include 2,3,5-triphenyltetrazolium salt, 2,5-diphenyl-3- (1-naphthyl) -2H-tetrazolium salt, 3,3 ′-[3,3′-dimethoxy- (1 , 1′-biphenyl) -4,4′-diyl] -bis [2- (4-nitrophenyl) -5-phenyl-2H-tetrazolium] salt, 3,3 ′-[3,3′-dimethoxy- ( 1,1′-biphenyl) -4,4′-diyl] -bis (2,5-diphenyl-2H-tetrazolium) salt, 2- (4-iodophenyl) -3- (4-nitrophenyl) -5 (2,4-disulfophenyl) -2H-tetrazolium salt, 3,3 ′-(1,1′-biphenyl-4,4′-diyl)
  • the amount of the chromogenic substrate used is preferably 0.001 to 10 mmol / L as the final reaction concentration in consideration of solubility. More preferably, it is 0.005 to 0.5 mmol / L.
  • the action of catalase, glutathione peroxidase, or the like originally present in the blood cells may be used to erase the non-measurement target.
  • the following methods can also be employed.
  • a method for removing hydrogen peroxide generated from non-measured glycated amino acids and / or glycated peptides the following methods can also be employed.
  • the following methods can also be employed.
  • hydrogen peroxide generated from a non-measured glycated amino acid and / or glycated peptide is dehydrogenated by a peroxidase reaction, and electrons are donated to an electron donor. Hydrogen peroxide is removed.
  • FAOD, peroxidase, and a coloring agent that develops color by oxidation before adding the protease measure the color development amount in advance, and correct the color development amount.
  • Which of R1 and R2 the HbA1c and the protease are arranged on can be determined as appropriate according to the purpose of measurement and the sample to be measured.
  • specific conditions such as concentration setting when HbA1c and protease are reacted are not particularly limited, and appropriate conditions are examined according to the concentration and type of the sample and the type and concentration of the protease. In addition, it may be adopted.
  • the conditions should be set appropriately so that both reactions can be performed in consideration of the liquid volume ratio of R1 and R2. That's fine.
  • the protease is in the range of 0.1 to 30 MU / L, preferably 2 to 15 MU / L, more preferably 3 to 10 MU / L.
  • FAOD is in the range of 0.1 to 45 U / L, preferably 2 to 15 U / L, and more preferably 3 to 10 U / L.
  • the reaction temperature is, for example, 2 to 60 ° C., preferably 4 to 40 ° C.
  • the reaction time is not particularly limited, for example, in the case of all steps, it is 0.5 to 30 minutes, preferably 10 minutes or less, more preferably 5 minutes or less, more preferably 3 minutes or less, More preferably, it is 2 minutes or less, More preferably, it is 1 minute or less.
  • 0.25 to 15 minutes can be exemplified, preferably 5 minutes or less, more preferably 2.5 minutes or less, Preferably it is 1.5 minutes or less, More preferably, it is 1 minute or less, More preferably, it is 0.5 minute or less.
  • 0.25 to 15 minutes can be exemplified, preferably 5 minutes or less, more preferably 2.5 minutes or less, Preferably it is 1.5 minutes or less, More preferably, it is 1 minute or less, More preferably, it is 0.5 minute or less.
  • the preferred first reaction time-second reaction time combination is 10 minutes-10 minutes, more preferably 5 minutes-5 minutes, more preferably 2.5 minutes-2.5 minutes, more preferably 1.5 minutes-1. .5 minutes, more preferably 1 minute-1 minutes, still more preferably 0.5 minutes-0.5 minutes.
  • the protease reaction becomes the rate-determining factor of the measurement time.
  • the present inventors have found that the protease reaction is significantly promoted by treating the protein with protease in the presence of a compound represented by the following formula (I) of HLB12 or higher, and have reached the present invention.
  • R-OX (I) R is an alkyl group having 9 to 18 carbon atoms or a substituted alkyl group, and X is a polyoxyethylene residue.
  • the alkyl group of R has 9 or more carbon atoms, preferably 9 to 18, more preferably 12 to 16. Most preferably, the alkyl group of R has 12 carbon atoms.
  • the pH is, for example, in the range of 5-9.
  • this treatment is usually performed in a buffer solution, and the buffer solution is not particularly limited.
  • Tris-HCl buffer solution, phosphate buffer solution, EPPS buffer solution, MES buffer solution, PIPES buffer solution, etc. Is given.
  • the enzyme activity is not described in the specification.
  • the measurement method and unit are described in containers, attached instructions, pamphlets, etc. .
  • the substrate should be reasonably selected based on common knowledge of those skilled in the art, and the measurement conditions determined.
  • hemoglobin (hereinafter also referred to as Hb) can be measured. Further, glycated hemoglobin and hemoglobin (hereinafter also referred to as Hb) can be measured simultaneously, and the ratio of glycated hemoglobin to hemoglobin can be determined based on the measurement results.
  • the measurement of hemoglobin (hereinafter also referred to as Hb) measures the absorbance of red (near 550 nm) inherent to Hb at any point during the execution of the first step in the measurement method of the present invention. Thus, measurement can be performed.
  • Hb and HbA1c can be measured simultaneously by measuring the absorbance at around 550 nm.
  • the measurement wavelength in the color development reaction in the measurement of HbA1c, it is preferable to set the measurement wavelength so as not to match between the Hb measurement and the HbA1c measurement by appropriately selecting a substrate that develops color by oxidation. Thereby, the influence which it has on a mutual measurement can be made small.
  • Hb is oxidized in the reaction solution to change to methemoglobin, and the absorbance gradually changes, which may affect the measured values of Hb and HbA1c.
  • Hb is changed to methemoglobin in advance by adding an oxidizing agent such as ferrocyanide, nitrite, potassium nitrate, or azide as a pretreatment to the sample (hereinafter referred to as “methoate”). Description) is preferred.
  • an oxidizing agent such as ferrocyanide, nitrite, potassium nitrate, azide, etc. may be provided and the first reaction may be subjected to methation.
  • FAOD is formulated in the first reagent and protease is formulated in the second reagent.
  • protease is formulated in the second reagent.
  • the protease in the step 3) described in [0015], is preferably allowed to act in the presence of a compound represented by the above formula (I) of HLB12 or higher and a metal ion.
  • metal ions include sodium chloride and potassium chloride.
  • the protease is allowed to act in the presence of potassium ferrocyanide and / or nitrite in the step 3) described in [0015].
  • a buffering agent for example, a borate buffer solution, a phosphate buffer solution, a Tris-HCl buffer solution, a GOOD buffer solution, and the like
  • the reagent composition includes chelating reagents that capture ions that interfere with the enzyme reaction (for example, EDTA and O-dianisidine), ascorbic acid oxidase that eliminates ascorbic acid that interferes with the determination of hydrogen peroxide, Surfactants (such as Triton X-100 and NP-40) as well as various antibacterial and preservatives (such as streptomycin and sodium azide) may be included.
  • salts, enzyme stabilizers, color source stabilizers and the like can be added as necessary.
  • These reagents may be a single reagent or a combination of two or more reagents.
  • preservatives include various types of proclin (registered trademark, Superco), azides, chelating agents, antibiotics, antibacterial agents, and the like.
  • examples of the chelating agent include ethylenediaminetetraacetic acid and its salt.
  • Antibiotics include gentamicin, kanamycin, chloramphenicol and the like.
  • Examples of the antibacterial agent include imidazolidinyl urea.
  • Salts include sodium chloride, potassium chloride, aluminum chloride, calcium chloride and the like.
  • Enzyme stabilizers include sucrose, trehalose, cyclodextrin, glycerol, gluconate, amino acids and the like.
  • inactive proteins such as serum albumins, globulins, or fibrous proteins, can be added as enzyme stabilizers.
  • a preferred protein is bovine serum albumin.
  • Preferred inactive proteins are those that do not contain protease impurities that cause enzymatic degradation.
  • Examples of the dye stabilizer include calixarene sulfate (6) and calixarene sulfate (8).
  • ferrocyanides such as potassium ferrocyanide and nitrites such as sodium nitrite may be added. These additives are effective not only in avoiding the influence of reducing substances, but also in Hb methation and protease reaction promotion.
  • the concentration and conditions of each of the above components consider the reactivity and / or stability depending on the type of reagent and enzyme used. And can be determined as appropriate. In that case, it is preferable to consider the possibility that the components present in the reagent may interfere with each other, thereby affecting the measurement of HbA1c and the stability of the reagent. For example, when protease and FAOD coexist in the second reaction, the conditions can be determined as appropriate so that the characteristics of both enzymes can be utilized as much as possible.
  • the above determination does not necessarily need to be an optimal solution, and may be performed as long as practically sufficient performance is ensured for the measurement of HbA1c according to the purpose and situation.
  • Another characteristic configuration of the present invention is a reagent for measuring at least one of hemoglobin, glycated hemoglobin, and a ratio of glycated hemoglobin to hemoglobin in the same reaction tank, A reagent characterized by a) and (b).
  • a reagent characterized by a) and (b).
  • (A) It is composed of two parts, a first reagent and a second reagent.
  • R-OX (I) (R is an alkyl group having 12 to 16 carbon atoms or a substituted alkyl group, and X is a polyoxyethylene residue.)
  • the number of carbon atoms of the alkyl group of R is preferably 12.
  • the first reagent preferably contains a glycated hemoglobin quantitative dye.
  • the reagent of the present invention it is preferable to contain potassium ferrocyanide and / or nitrite in either the first reagent or the second reagent.
  • the glycated hemoglobin measurement reagent may further contain an enzyme that acts on a glycated amino acid and / or glycated peptide in any part.
  • the glycated hemoglobin measurement reagent is preferably composed of two parts, and the first reagent contains an enzyme that acts on a glycated amino acid and / or glycated peptide, and the second reagent contains a protease.
  • the first reagent may further contain any one or more of catalase, peroxidase, and dye.
  • Examples of the glycated hemoglobin measuring reagent of the present invention include fructosyl valyl histidine oxidase, buffer solution, protease, POD, coloring reagent, chelating reagent that captures ions that interfere with the enzyme reaction, and substances that interfere with the determination of hydrogen peroxide.
  • Ascorbate oxidase to erase certain ascorbic acid, surfactant, stabilizer, excipient, antibacterial agent, preservative, well plate, fluorescence scanner, automatic analyzer, and measurement method according to the present invention are recorded on paper, etc. An instruction manual written on the medium may be included.
  • the glycated hemoglobin measuring reagent of the present invention can be used in the method for measuring glycated hemoglobin of the present invention. Therefore, the kit of this invention may be comprised with the articles
  • the glycated hemoglobin measuring reagent of the present invention substantially includes not only a set of all components required for measurement but also each divided component.
  • the kit of the present invention is substantially applied to R1 that is assumed to be used in combination with R2 or R2 that is assumed to be used in combination with R2. Is included.
  • the absorbance at 660 nm before R2 addition and 1.5 minutes after the addition was measured, and calculation was performed by subtracting the absorbance after 1.5 minutes from the absorbance before R2 addition.
  • the absorbance obtained from Sample 1 (the ratio of glycated hemoglobin to hemoglobin (HbA1c%) was 10.6%) was designated as absorbance AH, and the absorbance obtained from Sample 2 (HbA1c% was 5.1%) was designated as absorbance AL.
  • Tables 1 to 3 show the evaluation results of the protease reaction promoting effect of the test samples.
  • AH-AL shown in Tables 1 to 3 is a difference obtained by subtracting the absorbance AL from the absorbance AH.
  • HbA1c% of Samples 1 and 2 was measured according to a conventional method using HA-8180 (HPLC method, Arkray).
  • AH-AL is large, it can be determined that there is an effect of promoting protease reaction.
  • AH-AL is 40 or more, there is an excellent promoting effect. From the results of Tables 1 to 3, the effect was observed for polyoxyethylene lauryl ether having HLB of 12 or more. In particular, a better reaction promoting effect was obtained with HLB 16 or higher.
  • Activity value (U / mL) ⁇ (( ⁇ OD test / min) ⁇ ( ⁇ OD blank /min)) ⁇ 3.1 mL ⁇ dilution factor ⁇ / (13 ⁇ 1.0 cm ⁇ 0.1 mL)
  • “3.1 mL” indicates the total liquid volume
  • “13” indicates the millimolar extinction coefficient
  • “1.0 cm” indicates the optical path length of the cell
  • “0.1 mL” indicates the enzyme sample. Indicates the liquid volume.
  • the blind mixture is prepared by allowing the reaction mixture (1) to stand at 20 ° C. for 20 seconds, adding 1.0 mL of H 2 SO 4 solution (D), mixing, and then adding 1.0 mL of the enzyme solution.
  • the liquid is subjected to ether extraction in the same manner as described above, and the absorbance is measured (OD blank ). 5.
  • Procedure (1) Take 0.25 mL of the substrate solution (B) in a test tube (32 ⁇ ⁇ 200 mm) and preheat at 25 ° C. for about 5 minutes. (2) Add 0.25 mL of enzyme solution and mix gently. (3) After reacting accurately at 25 ° C. for 5 minutes, 2.5 mL of titanium reagent (C) is added to stop the reaction, and the absorbance at 410 nm is measured using water as a control (OD test ). (4) In the blind test, after heating for 5 minutes, 0.25 mL of the substrate solution (B) is first added and mixed with 2.5 mL of the titanium reagent (C), and then the enzyme solution is added (OD blank ). 5.
  • Table 4 shows the results.
  • the reaction rate decreases as the enzyme activity value decreases, in order to maintain the reaction promoting effect, it is preferable that the reaction accelerator does not affect the stability of the enzyme.
  • a stabilizing effect on FAOD, catalase, and peroxidase was observed in polyoxyethylene lauryl ether of HLB 12 or higher.
  • N-acylamino acid, sugar ester and polyoxyethylene alkyl ether sulfate were subjected to the same test. As a result, a certain degree of reaction promotion effect was observed, but the stability of FAOD, catalase and POD was confirmed. The result was inferior to the example.
  • the absorbance at 660 nm before R2 addition and 1.5 minutes after the addition was measured, and calculation was performed by subtracting the absorbance after 1.5 minutes from the absorbance before R2 addition.
  • the absorbance obtained from Sample 3 (the ratio of glycated hemoglobin to hemoglobin (HbA1c%) was 9.3%) was defined as absorbance AH, and the absorbance obtained from Sample 4 (HbA1c% was 4.5%) was defined as absorbance AL.
  • Table 5 shows the evaluation results of the protease reaction promoting effect of the test sample.
  • AH-AL shown in Table 5 is a difference obtained by subtracting the absorbance AL from the absorbance AH.
  • HbA1c% of specimens 3 and 4 was measured by HA-8180 (HPLC method, Arkray) according to a conventional method.
  • HA-8180 HPLC method, Arkray
  • Table 5 shows the results. From Table 5, it was confirmed that a particularly good reaction was exhibited at 0.2% (in the reaction solution, 0.14%) or more.
  • Example 4 Confirmation of elimination ability of endogenous glycated amino acids and glycated peptides ⁇ Reagent>
  • HbA1c % was calculated by the following formula.
  • HbA1c (%) ⁇ 96.3 ⁇ HbA1c concentration ( ⁇ mol / l) / Hb concentration ( ⁇ mol / l) ⁇ + 1.62 Specimens used were 5.79% HbA1c whole blood specimens collected with EDTA-Na blood collection tubes, each with a concentration of Unicaric N (Terumo; an infusion solution for nutritional tonic containing amino acids, sugars and electrolytes). did. The HbA1c% of the sample was measured according to a conventional method using HA-8180 (HPLC method, Arkray).
  • Example 5 Measurement of standard product ⁇ Reagent>
  • JCCRM 411 (Regular reference standard for IFCC method HbA1c measurement), General Standards Organization for Medical Research (ReCCS) product, 5 levels (from LEBEL1 to LEBEL5), each centrifuged at 800 g ⁇ 5 minutes, A blood cell component diluted 1/40 with the following pretreatment solution was used.
  • -Pretreatment solution aqueous solution containing MES 10 mM (pH 6.5) and NaNO 2 0.5 g / l
  • Table 7 shows the results. From the results, it was confirmed that the measured value of the standard substance was consistent with the displayed value.
  • Example 5-1 to 5-15 and Comparative Example 1 the same tests as in Example 5 were performed by changing the pH, the amount of FAOD added, and the amount of protease added. Tests were carried out by changing the pH in Examples 5-1 to 5-6, the FAOD addition amount in Examples 5-7 to 5-10, and the protease addition amount in Examples 5-11 to 5-15. went. Moreover, the test was done using polyoxyethylene oleyl ether as a comparative example. The detailed reagent composition of each Example and Comparative Example is shown below.
  • Table 8 shows the results. From the results, it was confirmed that the measured value of the standard substance matched the displayed value in the examples.
  • Example 6 Confirmation of correlation in actual sample measurement ⁇ Reagent>
  • Three types of reagents were prepared using the following three types of proteases.
  • A Metalloprotease (Toyobo) 5000KU / L Lot.
  • B Protease (derived from Streptomyces grieseus, Fluka) 5000 KU / L Lot.
  • C Thermolysin (Amano Enzyme) 5000KU / L ⁇ Operation method>
  • As the sample (n 60), a sample collected with an EDTA-Na blood collection tube and diluted 1/20 with the following pretreatment solution was used. The operations other than sample dilution are the same as in Example 4.
  • -Pretreatment solution aqueous solution containing 10 mM PIPES (pH 6.5) and 0.5 g / l NaNO2
  • the control method was HPLC, and measurement was carried out using HA-8180 (Arkray) according to a conventional method.
  • Figures 2 to 4 show the results. The results confirmed that there was a good correlation with existing methods.
  • calibrator 1 Hb 101.0 ⁇ mol / l, HbA1c 3.54 ⁇ mol / l, HbA1c% is 5.0%) and calibrator 2 (Hb 153.8 ⁇ mol / l, HbA1c 13.70 ⁇ mol / l, HbA1c% is 10%). .2%) to obtain a Hb concentration in comparison with a calibration curve prepared using (Measurement of HbA1c concentration)
  • R2 40 microliters was added 1 minute after R1 addition. Absorbance at 660 nm was measured before the addition of R2 and 1 minute after the addition.
  • HbA1c ⁇ 96.3 ⁇ HbA1c concentration ( ⁇ mol / l) / Hb concentration ( ⁇ mol / l) ⁇ + 1.6 ⁇ Sample dilution method>
  • a specimen (n 100) collected with an EDTA-Na blood collection tube was diluted 1/20 with the following pretreatment solution.
  • -Pretreatment solution aqueous solution containing PIPES 10 mM (pH 6.5) and NaNO2 0.5 g / l
  • the control method was HPLC, and measurement was carried out according to a conventional method using HA-8180 (Arkray). The correlation data is shown in FIG. From these results, by using the present invention, it is possible to measure for a short time, and it is possible to quickly report the measurement result.
  • Example dilution method Same as Example 7.
  • the control method was HPLC, and measurement was carried out according to a conventional method using HA-8180 (Arkray).
  • the correlation data is shown in FIG. FIG. 7 shows the time course for 3 samples out of 64 samples. Also in this result, the time course and the correlation were good, and a short time measurement was possible by using the present invention. By shortening the measurement time from this result, measurement can be performed quickly and in a short time.
  • the present invention is useful as a reagent for quantifying HbA1c.

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Abstract

【課題】糖化ヘモグロビンの測定を短時間で終了させること。 【解決手段】１）被検液中のヘモグロビンを定量する工程と内因性の糖化アミノ酸、２）特定の条件下でフルクトシルアミノ酸オキシダーゼを作用させて糖化ペプチドを予め消去する工程、および、３）特定の条件下でプロテアーゼを作用させて糖化ヘモグロビンを定量する工程を同一反応槽で行う、糖化ヘモグロビンの測定方法。

Description

糖化ヘモグロビンの測定方法
　本発明は、糖化ヘモグロビンの測定方法に関し、さらに詳しくは、糖化ヘモグロビンのヘモグロビンに対する割合の測定方法に関する。また本発明は、糖化ヘモグロビンの測定用試薬に関し、さらに詳しくは、糖化ヘモグロビンのヘモグロビンに対する割合の測定用試薬に関する。
　従来の酵素法を用いた糖化ヘモグロビン（例えばＨｂＡ１ｃ）測定試薬は、輸液中に存在する測定対象成分以外の糖化アミノ酸または糖化ペプチドの影響を受けていた。これら、測定対象以外の糖化アミノ酸または糖化ペプチドを消去するために、消去系を組む測定系が種々公知である。
　しかし、汎用の自動分析機、特にもっともよく用いられている第一反応約５分、第二反応約５分の、計約１０分の測定系に適用できる消去系を組むためには、（１）プロテアーゼによる糖化ヘモグロビンからの糖化アミノ酸または糖化ペプチドの切り出し、（２）該糖化アミノ酸または糖化ペプチドの酸化による過酸化水素の生成、および、（３）生成した過酸化水素の定量、の全ての反応を第二反応の約５分間で完了させなければならないが、従来の方法では、特にプロテアーゼの反応が律速になっており、第二反応（約５分間）で反応が完了しない。
　そこで、短時間で反応を完了させるため、プロテアーゼ反応促進剤を添加する方法が種々考案されている。
　例えば、特許文献１～７および非特許文献１にはテトラゾリウム化合物を添加する方法、特許文献８および９にはスルホン化合物及び／又はニトロ化合物を用いる方法、特許文献１０にはショ糖エステルの存在下プロテアーゼを作用させる方法、特許文献１１には酢酸基を含む化合物又はその塩、Ｎ－アシルタウリン又はその塩、若しくはポリオキシエチレンアルキルエーテル硫酸又はその塩のうち少なくとも１種類を含有するプロテアーゼ反応促進剤が、それぞれ開示されている。
ＷＯ２００２／０２７０１２ ＷＯ２００２／０２７３３０ ＷＯ２００２／０２７３３１ 特開２０００－９３１９９ 特開２００１－２９２７９５ 特開２００３－２３２７８９ ＷＯ２０００／２１０１００ ＷＯ２００４／００７７６０ ＷＯ２００３／１０７０１１ ＷＯ２００６／１２０９７６ ＷＯ２００６／０１３９２１
櫻林郁之介等（Ｉｋｕｎｏｓｕｋｅ　Ｓａｋｕｒａｂａｙａｓｈｉｅｔ．ａｌ．）、「ニューエンザイマティック　アッセイ　フォー　グリケイティッドヘモグロビン（Ｎｅｗ　ｅｎｚｙｍａｔｉｃ　ａｓｓａｙ　ｆｏｒ　ｇｌｙｃａｔｅｄｈｅｍｏｇｌｏｂｉｎ）、クリニカル　ケミストリー（ＣｌｉｎｉｃａｌＣｈｅｍｉｓｔｒｙ）、２００３年、第４９巻、第２号、ｐ．２６９－２７４
　上記の特許文献１～７、非特許文献１に記載の方法では、テトラゾリウム塩は還元性を有する化合物、例えば糖化タンパク質やアスコルビン酸等と強く反応し呈色することから糖化タンパク質濃度の高い試料やアスコルビン酸を含む試料で異常値を示す原因になる。
　特許文献８、９に記載の方法では、スルホン化合物は酵素の阻害剤になるものが多く、特によく使用されるラウリル硫酸ナトリウム、ドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウム、ラウリル硫酸リチウム等は糖化アミノ酸及び／又は糖化ペプチドに作用する酵素の反応停止剤となるほど強力な阻害剤である。さらにニトロ化合物は着色しており、試薬ブランクが上昇し測定精度が低下する原因となる。
　特許文献１０に記載の方法では、本特許の反応促進剤に比べ、ショ糖エステルを用いた場合は、共存する酵素の安定性が低い。工業用のショ糖エステルは安価であるが、純度が低く、ロイコ色素が自己発色する恐れがある。純度の高いショ糖エステルは一般的な界面活性剤と比較し高価である。
　特許文献１１に記載の方法では、用いる添加剤が一般的に高価である。
　特許文献１１に開示されている「酢酸基を含む化合物又はその塩」、「Ｎ－アシルタウリン又はその塩」、「ポリオキシエチレンアルキルエーテル硫酸又はその塩」は、いずれもアニオン界面活性剤である。
　これらの中で、実施例１に記載されているように、Ｎ－アシルアミノ酸であるサルコシネートＣＮ－３０、サルコシネートＭＮ、サルコシネートＰＮ、アラニネートＬＮ－３０、アルキルエーテルカルボン酸であるＥＣＴＤ－３ＮＥＸ、ＥＣＴＤ－６ＮＥＸ、ＡＫＹＰＯ－ＲＬＭ１００、Ｎ－アシルタウリン酸であるＬＭＴ、ＳＭＴ、ポリオキシエチレンアルキルエーテル硫酸塩であるＳＢＬ－２Ｔ－３６、ＳＢＬ－４Ｔ、ＳＢＬ－２０３－２７については、現実にプロテアーゼ反応促進効果を有していることが実証されている。
　しかし、一般に、アニオン界面活性剤は、タンパク質分子（酵素）に吸着してその活性を抑えてしまうと言われており、測定酵素と共存する形態で加速試験ではなく実際に長期間保存された場合は、さらに酵素活性そのものが低下し測定に悪影響を及ぼす可能性がある。
　本発明は上記の先行技術における問題点を解決することを課題とする。
　本発明者らは、ＨＬＢ１２以上の下記式（Ｉ）で表される化合物の存在下で、タンパク質をプロテアーゼ処理することにより、プロテアーゼの反応が大幅に促進されることを見出し本発明に到達した。
　Ｒ－Ｏ－Ｘ　・・・（Ｉ）
ここで、Ｒは、炭素数が９～１８のアルキル基または置換アルキル基であり、Ｘは、ポリオキシエチレン残基である。Ｒのアルキル基の炭素数は９以上、好ましくは９～１８、より好ましくは１２～１６である。もっとも好ましくは、Ｒのアルキル基の炭素数は１２である。
　すなわち、本発明は以下のような構成からなる。
［項１］
ヘモグロビン、糖化ヘモグロビン、および、糖化ヘモグロビンのヘモグロビンに対する割合のうち少なくとも１つ以上を測定する方法であって、以下の（ａ）および（ｂ）を特徴とする方法。
（ａ）以下の１）～３）の工程を同一反応槽中で行う。
（ｂ）１）および２）の工程を同一のステップ内で行い、その次のステップで３）の工程を開始させる。
１）被検液中のヘモグロビンを定量する工程、
２）被検液に、ＨＬＢ１２以上（好ましくはＨＬＢ１４以上、さらに好ましくはＨＬＢ１６以上）の下記式（Ｉ）で表される化合物の存在下、ｐＨ５．０～９．５の範囲内で０．１～１００　Ｕ／ｍＬのフルクトシルアミノ酸オキシダーゼを添加し、内因性の糖化アミノ酸および糖化ペプチドを予め消去する工程、
Ｒ－Ｏ－Ｘ　・・・（Ｉ）
（Ｒは、炭素数が１２～１６のアルキル基または置換アルキル基であり、Ｘは、ポリオキシエチレン残基である。）
３）上記２）の反応液に、ｐＨ５．０～９．５の範囲内で５００～５０００００　Ｕ／ｍＬのプロテアーゼを作用させて糖化ヘモグロビンを定量する工程。
［項２］
項１に記載の方法において、
　３）の工程でプロテアーゼをＨＬＢ１２以上（好ましくはＨＬＢ１４以上、さらに好ましくはＨＬＢ１６以上）の上記式（Ｉ）で表される化合物および金属イオンの存在下作用せしめる方法
［項３］
項１または２に記載の方法において、
　３）の工程でプロテアーゼをフェロシアン化カリウムおよび／または亜硝酸塩の存在下作用せしめる方法
［項４］
　同一反応槽中で、ヘモグロビン、糖化ヘモグロビン、および、糖化ヘモグロビンのヘモグロビンに対する割合のうち少なくとも１つ以上を測定するための試薬であって、以下の（ａ）および（ｂ）を特徴とする試薬。
（ａ）第一試薬および第二試薬の２つの部分から構成される。
（ｂ）第一試薬に、ＨＬＢ１２以上（好ましくはＨＬＢ１４以上、さらに好ましくはＨＬＢ１６以上）の下記式（Ｉ）で表される化合物、及びｐＨ５．０～９．５の範囲で緩衝能を有する緩衝液、０．１～１００　Ｕ／ｍＬのフルクトシルアミノ酸オキシダーゼを含み、第二試薬に、５００～５０００００　Ｕ／ｍＬのプロテアーゼを含む。
Ｒ－Ｏ－Ｘ　・・・（Ｉ）
（Ｒは、炭素数が１２～１６のアルキル基または置換アルキル基であり、Ｘは、ポリオキシエチレン残基である。）
［項５］
　項４に記載の試薬において、
　第一試薬に糖化ヘモグロビン定量用色素が含まれる試薬。
［項６］
項４または５に記載の試薬において、
　第一試薬および第二試薬のいずれかにフェロシアン化カリウムおよび／または亜硝酸塩を含有する試薬。
　本発明により、プロテアーゼの反応が促進（たとえば、第二反応の５分のみで全反応が完了する）され、その結果、消去系を組むことができるようになるため、輸液中に存在する測定対象成分以外の糖化アミノ酸または糖化ペプチドの影響による偽高値が解消される。
　選定したプロテアーゼ促進剤は反応主要酵素（フルクトシルアミノ酸オキシダーゼ（ＦＡＯＤ）、ペルオキシダーゼ（ＰＥＯ）、プロテアーゼ）その他消去用酵素（カタラーゼ（ＣＡＯ））の安定性の阻害にならない。選定した反応促進剤は界面活性作用を持ち自動分析機に対応した診断薬において添加が必須である界面活性剤を新たに添加する必要がない、などの効果を有する。
本発明における、内因性の糖化アミノ酸の消去能力を検討したデータ。 ＨｂＡ１ｃの測定方法に関し、本発明の方法とＨＰＬＣ法との相関。 ＨｂＡ１ｃの測定方法に関し、本発明の方法とＨＰＬＣ法との相関。 ＨｂＡ１ｃの測定方法に関し、本発明の方法とＨＰＬＣ法との相関。 ＨｂＡ１ｃの測定方法に関し、本発明の方法とＨＰＬＣ法との相関。 ＨｂＡ１ｃの測定方法に関し、本発明の方法とＨＰＬＣ法との相関。 本発明の方法によるＨｂＡ１ｃ測定の、反応タイムコース例。
　本発明の実施の形態について詳細に説明すれば以下のとおりであるが、本発明はこれに限定されるものではない。なお、本明細書中に記載された非特許文献および特許文献の全てが、本明細書中において参考として援用される。また本明細書中の「～」は「以上、以下」を意味し、例えば明細書中で「★～☆」と記載されていれば「★以上、☆以下」を示す。また本明細書中の「および／または」は、いずれか一方または両方を意味する。
　本発明の測定方法の特徴的な構成
　本発明の特徴的な構成は、ヘモグロビン、糖化ヘモグロビン、および、糖化ヘモグロビンのヘモグロビンに対する割合のうち少なくとも１つ以上を測定する方法であって、以下の（ａ）および（ｂ）を特徴とする方法である。
（ａ）以下の１）～３）の工程を同一反応槽中で行う。
（ｂ）１）および２）の工程を同一のステップ内で行い、その次のステップで３）の工程を開始させる。
１）被検液中のヘモグロビンを定量する工程、
２）被検液に、ＨＬＢ１２以上（好ましくはＨＬＢ１４以上、さらに好ましくはＨＬＢ１６以上）の下記式（Ｉ）で表される化合物の存在下、ｐＨ５．０～９．５の範囲内で０．１～１００　Ｕ／ｍＬのフルクトシルアミノ酸オキシダーゼを添加し、内因性の糖化アミノ酸および糖化ペプチドを予め消去する工程、
Ｒ－Ｏ－Ｘ　・・・（Ｉ）
（Ｒは、炭素数が１２～１６のアルキル基または置換アルキル基であり、Ｘは、ポリオキシエチレン残基である。）
３）上記２）の反応液に、ｐＨ５．０～９．５の範囲内で５００～５０００００　Ｕ／ｍＬのプロテアーゼを作用させて糖化ヘモグロビンを定量する工程。
［被検液］
　被検液は、ヘモグロビン、糖化ヘモグロビン、および、糖化ヘモグロビンのヘモグロビンに対する割合のうち少なくとも１つ以上を測定すべき対象物であれば特に限定されるものではなく、例えば、全血、血漿、血清、血球等の他に、尿、髄液等の生体試料（すなわち生体から採取された試料）や、ジュース等の飲料水、醤油、ソース等の食品類等の試料に対しても適用できる。
　糖化ヘモグロビンとしてはＨｂＡ１ｃ（ヘモグロビンのβ鎖が糖化された糖化タンパク質）が例示できる。
　本発明の方法は、糖尿病の診断に応用することができるため、上記の中でも特に全血試料、血球試料に有用である。特に限定されるものではないが、赤血球内の糖化ヘモグロビンを測定する場合には、全血をそのまま溶血したり、全血から分離した赤血球を溶血したりして、この溶血試料を測定用の試料とすればよい。
　溶血方法は、特に制限されず、例えば、界面活性剤を用いる方法、超音波による方法、浸透圧の差を利用する方法、凍結溶解による方法等が使用できる。この中でも、操作の簡便性等の理由から、界面活性剤を用いる方法または、浸透圧の差を利用する方法が好ましい。また、自動溶血機能付きの自動分析機（例えば、日本電子ＢＭ９１３０形自動分析機）では、自動溶血時の攪拌力が強いため、界面活性剤では、気泡を発生しサンプリングに支障をきたすことから、浸透圧の差を利用する方法がより好ましい。　　
　前記界面活性剤としては、例えば、ポリオキシエチレン－ｐ－ｔ－オクチルフェニルエーテル（Ｔｒｉｔｏｎ系界面活性剤等）、ポリオキシエチレン　ソルビタン　アルキルエステル（Ｔｗｅｅｎ系界面活性剤等）、ポリオキシエチレン　アルキルエーテル（Ｂｒｉｊ系界面活性剤等）等の非イオン性界面活性剤が使用でき、具体的には、例えば、商品名ＴｒｉｔｏｎＸ－１００、商品名Ｔｗｅｅｎ－２０、商品名Ｂｒｉｊ３５等があげられる。前記界面活性剤による処理条件は、通常、処理溶液中の血球濃度が１～１０体積％の場合、前記処理溶液中の濃度が０．１～１重量％になるように前記界面活性剤を添加し、室温で５秒～１分程度攪拌すればよい。
　また、前記浸透圧の差を利用する場合は、例えば、全血の体積に対し２～１００倍体積量の精製水を添加して溶血させる。
　なお、溶血処理は、前処理として行うのではなく、第一ステップで反応と同時に行うこともできる。
［糖化ヘモグロビンの測定］
　まず、本発明における糖化ヘモグロビンの測定に関して説明する。以下の説明は、糖化へモグロビンとしてＨｂＡ１ｃを測定する方法を例示するものを含むが、糖化ヘモグロビンの測定はこれに限定されるものではない。
　また、ヘモグロビンの測定および糖化ヘモグロビンのヘモグロビンに対する割合の測定については、後述する。
　本発明における糖化ヘモグロビンの測定には、例えば、以下の（１）および（２）の反応工程を含む方法により、測定試料（たとえば全血または血液）中のＨｂＡ１ｃを測定する方法が例示される。
（１）糖化ヘモグロビンの糖化されたβ鎖Ｎ末端からＦＶＨ（フルクトシルバリルヒスチジン）を切り出す能力を有するプロテアーゼにより、糖化タンパク質を糖化アミノ酸および／または糖化ペプチドに断片化する反応
（２）断片化されたＦＶＨに反応し、かつ、以下の（ａ）および（ｂ）に示す特性を満たすＦＡＯＤ（フルクトシルアミノ酸オキシダーゼ）が、該ＦＶＨと酸化還元反応を行い、発生した過酸化水素または酸素を定量する反応
　本発明に適用されるプロテアーゼ
　本発明の方法に用いるプロテアーゼは特に限定されない。
　これらのプロテアーゼは、市販のものをそのまま用いても良いし、公知文献に記載されたものをその記載にしたがって製造したものを使用しても良い。
　例えば、サーモリシン、ブロメライン、パパイン、ブタ膵臓由来トリプシン、メタロプロテイナーゼ、中性プロテアーゼからなる群から選択された少なくとも一つのプロテアーゼが例示できる。
　本発明に用いるプロテアーゼは、安定性、反応速度（比活性）、入手の容易性などから、以下のものが好ましい。
　メタロプロテアーゼ、セリンプロテアーゼ、セリンカルボキシペプチダーゼ、プロテイナーゼＫ、ブロメライン、パパイン、ブタ膵臓由来トリプシン、Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｕｂｔｉｌｉｓ由来プロテアーゼ、Ａｓｐｅｇｉｌｌｕｓ　ｏｒｙｚａｅ由来プロテアーゼ、Ａｓｐｅｇｉｌｌｕｓ　ｓａｉｔｏｉ由来プロテアーゼ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｇｒｉｓｅｕｓ由来プロテアーゼ等が使用でき、好ましくはエンドプロテアーゼである。
　市販品としては、例えば、プロテアーゼＡ「アマノ」Ｇ（天野エンザイム）、プロテアーゼＭ「アマノ」Ｇ（天野エンザイム）、プロテアーゼＳ「アマノ」Ｇ（天野エンザイム）、ペプチダーゼＲ（天野エンザイム）、パパインＭ？４０（天野エンザイム）、サーモリシン（大和化成）、サモアーゼＰＣ１０（大和化成）、商品名プロテアーゼＮ（フルカ）、商品名プロテアーゼＮ「アマノ」（天野製薬）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属由来メタロプロテイナーゼ（東洋紡績：商品名トヨチーム）、エンドプロテイナーゼＧｌｕ－Ｃ（ロシュ）等があげられる。なかでも、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属由来メタロプロテイナーゼ（東洋紡績：商品名トヨチーム）、サーモリシン（天野エンザイム）、サモアーゼＰＣ１０（天野エンザイム）、プロテアーゼ（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｇｒｉｓｅｕｓ由来、フルカ）、プロテアーゼ（Ａｓｐｅｇｉｌｌｕｓ　ｓａｉｔｏｉ由来、シグマ）がより好ましい。
　本発明に用いるプロテアーゼは、上記以外のものであっても、製造方法が知られているプロテアーゼについて精製し構造を解明したもの、あるいは、精製した酵素の部分アミノ酸配列等を明らかにし、その情報を利用して新規にスクリーニングして得られたものであっても良い。また、データベースに公開されている情報などから推定される遺伝子やタンパク質の配列を利用して、新規にスクリーニングして得られたものであっても良い。
　さらには、遺伝子やタンパク質の配列が現実に知られているプロテアーゼ、あるいは、上記の方法により新規に得られたプロテアーゼに、さらに遺伝子工学的または化学的等の方法で改変を加えたものであっても良い。
本発明に適用されるＦＡＯＤ
　本発明の方法に用いるＦＡＯＤは特に限定されない。例えば、公知のものとして、コニオカエタ属、ユウペニシリウム属由来酵素およびその改変体、あるいは、カーブラリア・クラベータＹＨ９２３またはネオコスモスポラ・ヴァシンフェクタ４７４由来酵素およびその改変体などが使用できる。
　また、特開２０１０－３５４６９に記載の、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ由来酵素およびその改変体、あるいは、特開２０１０－５７４７４に記載の、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｎｉｄｕｌａｎｓ由来酵素およびその改変体などが使用できる。
　また、市販のものでは、ＦＰＯ－３０１（商標）（東洋紡績）、ＦＰＯＸ－ＣＥ（商標）（キッコーマン）、ＦＰＯＸ－ＥＥ（商標）（キッコーマン）などを使用することができる。
　あるいは、本発明の方法に用いるＦＡＯＤとしては、例えば、ＰＣＴ／ＪＰ２００９／００５１７３に開示されているＰｈａｅｏｓｐｈａｅｒｉａ　ｎｏｄｏｒｕｍ由来酵素およびその改変体から選ばれるＦＡＯＤが挙げられる。
　具体的には、以下の（Ｉ）から（ＩＩＩ）のいずれかに記載の、フルクトシルバリルヒスチジンオキシダーゼ活性を有するタンパク質が例示できる。
（Ｉ）配列番号１に記載されるアミノ酸配列からなるタンパク質。
（ＩＩ）配列番号１に記載されるアミノ酸配列において、１または数個のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、且つフルクトシルバリルヒスチジンオキシダーゼ活性を有するタンパク質。
（ＩＩＩ）配列番号１に記載されるアミノ酸配列と８６．０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、且つフルクトシルバリルヒスチジンオキシダーゼ活性を有するタンパク質。
　このようなＦＡＯＤとしては、中でも、上記（ＩＩ）または（ＩＩＩ）に記載のタンパク質であって、アミノ末端から５８番目のイソロイシン、アミノ末端から１１０番目のグリシンおよびアミノ末端から２８２番目のフェニルアラニンのうち少なくとも１箇所以上が他のアミノ酸に置換されているタンパク質が好ましい。
　このようなＦＡＯＤとしては、上記アミノ末端から５８番目のイソロイシンが、メチオニン、トレオニン、アラニン、アスパラギン、セリン、バリン、または、ロイシンに置換されているタンパク質が好ましい。
　このようなＦＡＯＤとしては、上記アミノ末端から１１０番目のグリシンが、グルタミン、メチオニン、グルタミン酸、トレオニン、アラニン、システイン、ヒスチジン、リシン、アスパラギン、アルギニン、セリン、バリン、ロイシン、アスパラギン酸、イソロイシン、チロシンまたはフェニルアラニンに置換されているタンパク質が好ましい。
　このようなＦＡＯＤとしては、上記アミノ末端から２８２番目のフェニルアラニンが、チロシンに置換されているタンパク質が好ましい。
　あるいは、これらの変異が組み合わさったものでも良い。
　上記のＦＡＯＤの入手方法については、例えば、以下の（ＩＶ）から（ＶＩＩ）のいずれかのポリヌクレオチドを含有する組換えベクターを作製し、該組換えベクターで宿主を形質転換した形質転換体を培養してフルクトシルバリルヒスチジンオキシダーゼ活性を有するタンパク質を生成させ、当該タンパク質を採取すればよい。
（ＩＶ）配列番号２に記載される塩基配列からなるポリヌクレオチド。
（Ｖ）配列番号２に記載される塩基配列において、１つ以上３０以下の塩基が置換、欠失、挿入および／または付加された塩基配列からなり、且つフルクトシルバリルヒスチジンオキシダーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
（ＶＩ）本発明のタンパク質のうちの何れかのタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
（ＶＩＩ）上記（ＩＶ）から（ＶＩ）のいずれかのポリヌクレオチドと相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、且つフルクトシルバリルヒスチジンオキシダーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
　また、本発明に用いることができるＦＡＯＤは、上記で説示したタンパク質のアミノ酸配列において、１または数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、且つフルクトシルバリルヒスチジンオキシダーゼ活性を有するタンパク質をも包含するが、１または数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入および／または付加される部位は、置換、欠失、挿入および／または付加後のタンパク質がフルクトシルバリルヒスチジンオキシダーゼ活性を有していれば、該アミノ酸配列中のどの部位であってもよい。ここで「１または数個のアミノ酸残基」とは、具体的には１０個以内の範囲のアミノ酸残基数であり、好ましくは６個以内の範囲のアミノ酸残基である。
　また、本発明に用いることができるＦＡＯＤは、上記で説示した本発明にかかるタンパク質のアミノ酸配列（配列番号１に示す）において、当該アミノ酸配列と８６．０％以上、より好ましくは９０．０％以上、より好ましくは９５．０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、且つフルクトシルバリルヒスチジンオキシダーゼ活性を有するタンパク質を包含する。
　なお、アミノ酸配列の相同性は、公知の方法で求めることができる。具体的には、ＧＥＮＥＴＹＸ－ＷＩＮ（株式会社ゼネティックスの商品名）を当該商品のマニュアルに従って使用し、配列番号１に示すアミノ酸配列と比較対象のアミノ酸配列とのホモロジーサーチ（ｈｏｍｏｌｏｇｙ　ｓｅａｒｃｈ）により一致するアミノ酸配列の割合（％）として、相同性を計算することができる。相同性は、比較対象の配列の全領域にわたって最適な状態にアラインメントされた２つの配列を比較することにより決定され得る。ここで、比較対象の塩基配列またはアミノ酸配列を最適な状態にアラインメントするために、付加または欠失（例えば、ギャップ等）を許容してもよい。
　また本発明に用いることができるＦＡＯＤタンパク質等は、例えば、分子間架橋および／または分子内架橋（例えば、ジスルフィド結合など）が施されたもの、化学修飾（例えば、糖鎖、リン酸もしくはその他の官能基など）されたもの、標識（例えば、ヒスチジンタグ、Ｍｙｃタグ、またはＦｌａｇタグなど）が付与されたもの、または融合タンパク質（例えば、ストレプトアビジン、シトクロム、ＧＳＴまたはＧＦＰなど）を付与されたものなどが含まれるが、特にこれらに限定されない。さらに、本発明に用いることができるＦＡＯＤタンパク質は、フルクトシルバリルヒスチジンオキシダーゼ活性が実質的に維持される限り、数種のタンパク質の断片を組み合わせて構成したキメラタンパク質も含み得る。
　なお、現時点では本願発明に使用することはできないＦＡＯＤであっても、今後遺伝子工学的または化学的等の方法で改変を加え、上記の特性を有するように改良したものは、本願発明に使用できる。
　あるいは、今後新規に得られたＦＡＯＤであって、上記の特性を有するＦＡＯＤは、本願発明に使用できる。
　そして、そのようなＦＡＯＤを用いて構築したＨｂＡ１ｃの測定系もまた、本願発明の技術思想に包含される。
糖化ヘモグロビンの測定方法
　以下、糖化ヘモグロビンとしてＨｂＡ１ｃを測定する方法を例に挙げて説明する。
　上記ＨｂＡ１ｃ測定方法の具体的な態様は、［００２３］に記載の（１）および（２）の反応工程を含むように設計されていれば特に限定されず、市販の器具や機器を適宜選択して使用して良いが、汎用の自動分析機（たとえば、日立７１８０形自動分析機）を用いるのが便利である。
　これらの自動分析機に酵素法を適用するためには、典型的には、測定前に、酵素法を実施するための試薬を、液状の２剤（第一試薬（以下Ｒ１とも記載）、第二試薬（以下Ｒ２とも記載））に分けて調製する。
　典型的な測定パターンは、測定セルに試料を分注したあと、第一試薬を投入し数分間（たとえば、前出の日立７１８０形自動分析機では約５分間）一定温度で保持（この工程を以下第一反応とも記載）した後、第二試薬を投入してさらに数分間（たとえば、前出の日立７１８０形自動分析機では約５分間）一定温度で保持（この工程を以下第二反応とも記載）する。この間に、使用する機器の仕様などに基づいて適宜設定したほぼ一定の時間間隔で吸光度が継続して測定される。
　測定波長や、サンプルと各試薬の添加液量（液量比）、各ステップに要する時間等は、使用する機器の仕様などに基づいて適宜調節することが出来る。
　例えば、典型的な態様として、Ｒ１にＦＡＯＤ、Ｒ２にプロテアーゼを配した試薬を作製し、自動分析機を用いて測定を行えばよい。
　この試薬を自動分析機に適用した場合、第一反応では、Ｒ１投入により、ＦＡＯＤが測定対象物中に何らかの理由で存在している遊離の（いわゆる内因性の）糖化アミノ酸および／または糖化ペプチドに作用して過酸化水素が生成する（「消去反応」）。
　しかし、この、「測定対象物中に何らかの理由で存在している遊離の糖化アミノ酸および／または糖化ペプチド」は、本来ＦＡＯＤが作用すべき対象である「プロテアーゼによってＨｂＡ１ｃから切り出された」ものではなく、非測定対象であり、測定値に正誤差を与える。
　そこで、上記の反応によって生成した過酸化水素は、例えば過酸化水素の定量系としてキノン色素を生成させる系を用いる場合には、例えばＲ１にカタラーゼ等を配することにより、第一ステップにおいて、このような非測定対象に由来する過酸化水素を、生成に引続いてすぐに（ほぼ同時に）酸素と水に分解させることにより、後の反応（すなわち、第二ステップにおける過酸化水素の定量反応）に影響を与えないようにすることができる（「除去反応」）。なおこの場合は、ペルオキシダーゼはＲ２に配することが好ましい。
　ここで、Ｒ１には、ＨＬＢ１２以上の下記式（Ｉ）で表される化合物を存在させる。好ましくはＨＬＢ１４以上、更に好ましくはＨＬＢ１６以上である。
　式（Ｉ）で表される化合物
　ここで、Ｒは、炭素数が１２～１６のアルキル基または置換アルキル基であり、Ｘは、ポリオキシエチレン残基である。Ｒのアルキル基の炭素数は好ましくは１２である。
　上記式（Ｉ）で表される化合物として具体的な化合物名およびその製品名は、表１に例示されている。
　具体的には、ポリオキシエチレンオレイルエーテル、ポリオキシエチレンラウリルエーテル、ポリオキシエチレントリベンジルフェニルエーテル、ポリオキシエチレンノニルフェニルエーテル、ポリオキシアルキレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンジスチレン化フェニルエーテル、ポリオキシエチレンソルビタンモノヤシ脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンノニルフェニルエーテル、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンデシルエーテル、ポリオキシエチレンオレイン酸エステル、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレン（２０）ノニルフェニルエーテル、ポリオキシエチレン（１８）ノニルフェニルエーテル、ポリオキシエチレン（１５）ノニルフェニルエーテル、ポリオキシエチレン（３０）オクチルフェニルエーテル、ポリグリセリンラウリン酸エステル、などが例示される。
　中でも、ポリオキシエチレンラウリルエーテルには、ＨＬＢ１２以上で顕著な反応促進効果があり好ましい。ＨＬＢ１４以上ではさらに好ましく、ＨＬＢ１６以上ではさらに好ましい。
［ＨＬＢ値の測定方法］
　所定のＨＬＢ値（または、ＨＬＢ価とも記載する。）を有する化合物が存在するか否かは、添加されている化合物が明確である場合は、当該化合物が市販品であれば該製品の製造者がカタログ等に記載している値を採用する。製造者が情報を開示していない場合は、学術論文や特許文献等に記載されている値を採用する。
　化学式が明確である場合や、臨界ミセル濃度（ｃｍｃ）が明らかな場合は、以下の式で計算する。
　　ＨＬＢ価＝７＋Σ（親水基の基数）－ｎ（ＣＨ２基の基数）
または
　　ＨＬＢ価＝７＋４．０２　ｌｏｇ／ｃｍｃ
　添加されている化合物の構造、ｃｍｃが不明の場合などは、ＨＬＢ価のわかっている油相とＨＬＢがすでにわかっている活性剤１種を使って、ＨＬＢ価未知の活性剤と既知の活性剤を種々の割合に混合し、この混合活性剤を用いて一定条件のもとに乳化実験を行い、そのエマルジョンの状態と比較検討することでもとめることができる。
　たとえば、油相Ａ（ＨＬＢ＝７．５）と界面活性剤Ｂ（ＨＬＢ＝２．１）を用いて界面活性剤ＣのＨＬＢ（ＨＬＢをｘとする。）を決定する場合、Ｂを３２％とＣを６８％混合時、もっとも良いエマルジョンができたとすると、
　２．１×３２％　＋　ｘ×６８％＝７．５より　ｘ＝１０と求めることができる。
また、既知のＨＬＢ価をもつ２種以上の界面活性剤を混合する場合は、混合液のＨＬＢ価は、それぞれ単独のＨＬＢ価の加重平均で表す。
　本発明において、上記式（Ｉ）で表される化合物を存在させる濃度は、特に限定されるものではないが、プロテアーゼ反応が行われる場において、下限は０．１４％（Ｗ／Ｗ（重量％））以上が好ましい。さらに好ましい下限は０．３％以上、さらに好ましい下限は０．７５％以上である。
　上限は溶解性などの観点から、１０％以下が好ましい。さらに好ましくは上限５％以下、さらに好ましくは上限３％以下である。
　本発明の方法では、プロテアーゼはＲ２にのみ配されているので、Ｒ１における上記式（Ｉ）で表される化合物の濃度は、使用する機器の仕様などに基づいて適宜設定されたサンプルと各試薬の添加液量（液量比）によって規定される。
　また、第一反応におけるｐＨは５．０～９．５の範囲であれば特に限定されない。また、この処理は、通常、緩衝液中で行われ、前記緩衝液としては、特に制限されないが、例えば、トリス塩酸緩衝液、リン酸緩衝液、ＥＰＰＳ緩衝液、ＭＥＳ緩衝液、ＰＩＰＥＳ緩衝液等があげられる。
　また、第一反応におけるＦＡＯＤの濃度は、０．１～１００　Ｕ／ｍＬであれば特に限定されない。好ましくは０．５～５０　Ｕ／ｍＬの範囲であり、さらに好ましくは０．５～２０　Ｕ／ｍＬであり、さらに好ましくは１～１０　Ｕ／ｍＬである。
　本発明において、第一反応または第二反応における各試薬の濃度やｐＨは、サンプルと試薬との液量比によって変動する可能性があるが、通常の測定では、サンプル液量と比べて、Ｒ１液量、あるいはＲ１とＲ２とを合計した液量を十数倍～数十倍に設定することがほとんどであり、そのような場合、サンプルの影響を無視して実質的に試薬中の濃度やｐＨによって規定することが出来る。
　次に、第二反応では、Ｒ２投入により、プロテアーゼによるＨｂＡ１ｃからＦＶＨを切り出す工程（「断片化反応」）が開始され、それに引続いてすぐに（ほぼ同時に）、切り出されたＦＶＨにＦＡＯＤが作用して酸化還元反応により過酸化水素を生成する工程が開始される。
　第二反応においては、ＦＡＯＤを新たに添加する必要はなく（Ｒ２にＦＡＯＤを配する必要はなく）、Ｒ１に配されたものをそのまま用いることができるが、必要であればＲ２にもＦＡＯＤを配し、第二反応で追添しても差し支えない。
　予め第一反応で、測定対象物中にもともと存在する遊離の糖化アミノ酸および／または糖化ペプチドを消去しているため、第二反応において、ＨｂＡ１ｃをプロテアーゼで分解しても、もはやＦＡＯＤと非測定対象物とが反応することはなく、プロテアーゼによってＨｂＡ１ｃから切り出されたもののみをＦＡＯＤと反応させることができる。
　第二反応におけるｐＨは５．０～９．５の範囲であれば特に限定されない。また、この処理は、通常、緩衝液中で行われ、前記緩衝液としては、特に制限されないが、例えば、トリス塩酸緩衝液、リン酸緩衝液、ＥＰＰＳ緩衝液、ＭＥＳ緩衝液、ＰＩＰＥＳ緩衝液等があげられる。
　また、第二反応におけるプロテアーゼの濃度は、５００～５０００００　Ｕ／ｍＬであれば特に限定されない。好ましくは５００～５００００　Ｕ／ｍＬの範囲であり、さらに好ましくは８００～２００００　Ｕ／ｍＬであり、さらに好ましくは１０００～１００００　Ｕ／ｍＬである。
　第二反応においては、Ｒ１で添加したカタラーゼの影響を排除するため、Ｒ２にアジ化ナトリウムなどのカタラーゼ阻害剤を配してもよい。
　あるいは、カタラーゼとペルオキシダーゼの基質に対する親和性の違いを利用して、カタラーゼとペルオキシダーゼとの添加比率を適切に設定することにより、Ｒ２にカタラーゼ阻害剤を配さない設定も可能である。例えば、第二反応において、過剰量のペルオキシダーゼおよび発色性基質を添加すればよい。この場合、ペルオキシダーゼは、前記カタラーゼの添加量（Ｕ）に対し、例えば、５～１００倍の活性（Ｕ）量を添加することが好ましい。
　上記の定量系（発色系）に用いるペルオキシダーゼは特に限定されるものではなく、例えば市販のものが使用できる。好適なものとしては、西洋ワサビ、微生物などに由来するものが挙げられる。中でも、西洋ワサビ由来のペルオキシダーゼが好ましい。前記ペルオキシダーゼは、高純度かつ低価格のものが商業的に入手可能である。
　本発明におけるペルオキシダーゼの濃度は、例えば、０．０１ＫＵ／Ｌ～４ＭＵ／Ｌの範囲であり、好ましくは０．１ＫＵ／Ｌ～２００ＫＵ／Ｌ、より好ましくは５ＫＵ／Ｌ～１００ＫＵ／Ｌである。
（ＫＵはキロユニット、ＭＵはメガユニットを示す。）
　本発明に用いる発色性基質としては、特に限定されないが、水素供与体、ロイコ体、テトラゾリウム塩などが挙げられる。
　水素供与体はカップラーと組み合せて用いることができる。例えば、水素供与体としてのトリンダー試薬とカップラーとしての４－アミノアンチピリンとの組み合せがあげられる。
　上記トリンダー試薬としては、限定されないが、例えば、フェノール、フェノール誘導体、アニリン誘導体、ナフトール、ナフトール誘導体、ナフチルアミン、ナフチルアミン誘導体等があげられる。
　これらは、例えば、ペルオキシダーゼの存在下で、カップラー（４－アミノアンチピリン（４－ＡＡ）など）に対して酸化縮合反応し色素を生成する。
　水素供与体としては、Ｎ－エチル－Ｎ－スルホプロピル－３－メトキシアニリン、Ｎ－エチル－Ｎ－スルホプロピルアニリン、Ｎ－エチル－Ｎ－スルホプロピル－３，５－ジメトキシアニリン、Ｎ－スルホプロピル－３，５－ジメトキシアニリン、Ｎ－エチル－Ｎ－スルホプロピル－３，５－ジメチルアニリン、Ｎ－エチル－Ｎ－スルホプロピル－３－メチルアニリン、Ｎ－エチル－Ｎ－（２－ヒドロキシ－３－スルホプロピル）－３－メトキシアニリン、Ｎ－エチル－Ｎ－（２－ヒドロキシ－３－スルホプロピル）アニリン、Ｎ－エチル－Ｎ－（２－ヒドロキシ－３－スルホプロピル）－３，５－ジメトキシアニリン、Ｎ－（２－ヒドロキシ－３－スルホプロピル）－３，５－ジメトキシアニリン、Ｎ－エチル－Ｎ－（２－ヒドロキシ－３－スルホプロピル）－３，５－ジメチルアニリン、Ｎ－エチル－Ｎ－（２－ヒドロキシ－３－スルホプロピル）－３－メトキシアニリン、Ｎ－スルホプロピルアニリン、Ｎ－（２－ヒドロキシ－３－スルホプロピル）－２，５－ジメチルアニリン、Ｎ－エチル－Ｎ－（３－メチルフェニル）－Ｎ’－サクシニルエチレンジアミン、Ｎ－エチル－Ｎ－（３－メチルフェニル）－Ｎ’－アセチルエチレンジアミン等が挙げられる。
　カップラーとしては、前記４－アミノアンチピリンの他に、アミノアンチピリン誘導体、バニリンジアミンスルホン酸、メチルベンズチアゾリノンヒドラゾン（ＭＢＴＨ）（更に具体的には、３－メチル－２－ベンゾチアゾリノンヒドラゾン）、スルホン化メチルベンズチアゾリノンヒドラゾン（ＳＭＢＴＨ）（更に具体的には、スルホン化３－メチル－２－ベンゾチアゾリノンヒドラゾン）等も使用できる。
　ロイコ体としては、特に限定されないが、例えば、トリフェニルメタン誘導体、フェノチアジン誘導体、ジフェニルアミン誘導体などが使用できる。
　これらは、ペルオキシダーゼの存在下で直接酸化呈色する。
　例えば、４，４’－ベンジリデンビス（Ｎ，Ｎ－ジメチルアニリン）、４，４’－ビス［Ｎ－エチル－Ｎ－（３－スルホプロピルアミノ）－２，６－ジメチルフェニル］メタン、１－（エチルアミノチオカルボニル）－２－（３，５－ジメトキシ－４－ヒドロキシフェニル）－４，５－ビス（４－ジエチルアミノフェニル）イミダゾール、４，４’－ビス（ジメチルアミノ）ジフェニルアミン、Ｎ－（カルボキシメチルアミノカルボニル）－４，４’－ビス（ジメチルアミノ）ジフェニルアミン塩（例えばナトリウム塩）、１０－（カルボキシメチルアミノカルボニル）－３，７－ビス（ジメチルアミノ）フェノチアジン塩等が挙げられる。
　特に好ましくは、１０－（カルボキシメチルアミノカルボニル）－３，７－ビス（ジメチルアミノ）フェノチアジン塩である。
　テトラゾリウム塩としては、２，３，５－トリフェニルテトラゾリウム塩、２，５－ジフェニル－３－（１－ナフチル）－２Ｈ－テトラゾリウム塩、３，３’－［３，３’－ジメトキシ－（１，１’－ビフェニル）－４，４’－ジイル］－ビス［２－（４－ニトロフェニル）－５－フェニル－２Ｈ－テトラゾリウム］塩、３，３’－［３，３’－ジメトキシ－（１，１’－ビフェニル）－４，４’－ジイル］－ビス（２，５－ジフェニル－２Ｈ－テトラゾリウム）塩、２－（４－ヨードフェニル）－３－（４－ニトロフェニル）－５－（２，４－ジスルホフェニル）－２Ｈ－テトラゾリウム塩、３，３’－（１，１’－ビフェニル－４，４’－ジイル）－ビス（２，５－ジフェニル－２Ｈ－テトラゾリウム）塩、３－（４，５－ジメチル－２－チアゾリル）－２，５－ジフェニル－２Ｈ－テトラゾリウム塩等が挙げられる。
　上記発色系基質の使用量としては、溶解度を考慮して反応終濃度として０．００１～１０ｍｍｏｌ／Ｌが好ましい。より好ましくは０．００５～０．５ｍｍｏｌ／Ｌである。
　測定対象に血球が含まれる場合、非測定対象の消去には、血球中に本来存在しているカタラーゼやグルタチオンペルオキシダーゼ等の作用を利用しても良い。
　また、非測定対象の糖化アミノ酸および／または糖化ペプチドから発生する過酸化水素を除去する方法としては、この他に以下の方法も採用できる。
　例えば、プロテアーゼを添加する前に、ＦＡＯＤとペルオキシダーゼならびに電子供与体を共存させる方法がある。これによれば、プロテアーゼを添加する前に、非測定対象の糖化アミノ酸および／または糖化ペプチドより発生した過酸化水素は、ペルオキシダーゼ反応によって脱水素を起こし、電子は電子供与体に供与され、その結果、過酸化水素は除去される。
　また、プロテアーゼを添加する前に、ＦＡＯＤとペルオキシダーゼならびに酸化により発色する発色剤を添加し、この発色量を予め測定しておき、この発色量で補正を行うことも可能である。
　ＨｂＡ１ｃとプロテアーゼとを、それぞれＲ１、Ｒ２のどちらに配するかは、測定目的や測定対象試料などに応じて、適宜決定されうる。
　また、ＨｂＡ１ｃとプロテアーゼとを反応させる際の濃度設定などの具体的な条件は、特に限定されるものではなく、試料の濃度や種類、プロテアーゼの種類や濃度などに応じて適宜好適な条件を検討の上、採用されればよい。
　また、ＦＡＯＤを、非測定対象の糖化アミノ酸および／または糖化ペプチドを消去するためにも用いる場合は、Ｒ１とＲ２の液量比などを考慮して、両方の反応を行いうる条件に適宜設定すればよい。
　例えば、プロテアーゼは、０．１～３０ＭＵ／Ｌの範囲であり、好ましくは２～１５ＭＵ／Ｌであり、より好ましくは３～１０ＭＵ／Ｌである。
　また、例えば、ＦＡＯＤは、０．１～４５Ｕ／Ｌの範囲であり、好ましくは２～１５Ｕ／Ｌであり、より好ましくは３～１０Ｕ／Ｌである。
　反応温度は、例えば、２～６０℃、好ましくは４～４０℃である。
　反応時間は、特に限定されるわけではないが、例えば、全工程であれば、０．５～３０分間、好ましくは１０分以下であり、さらに好ましくは５分以下、さらに好ましくは３分以下、さらに好ましくは２分以下、さらに好ましくは１分以下である。
　第一反応では、特に限定されるわけではないが、例えば、全工程であれば、０．２５～　　１５分間が例示でき、好ましくは５分以下であり、さらに好ましくは２．５分以下、さらに好ましくは１．５分以下、さらに好ましくは１分以下、さらに好ましくは０．５分以下である。
　第二反応では、特に限定されるわけではないが、例えば、全工程であれば、０．２５～　　１５分間が例示でき、好ましくは５分以下であり、さらに好ましくは２．５分以下、さらに好ましくは１．５分以下、さらに好ましくは１分以下、さらに好ましくは０．５分以下である。
　好ましい第一反応時間－第二反応時間の組合せは１０分－１０分、さらに好ましくは５分－５分、さらに好ましくは２．５分－２．５分、さらに好ましくは１．５分―１．５分、さらに好ましくは１分－１分、さらに好ましくは０．５分－０．５分である。
　酵素法を用いたＨｂＡ１ｃの測定ではプロテアーゼ反応が測定時間の律速になる。
　本発明者らは、ＨＬＢ１２以上の下記式（Ｉ）で表される化合物の存在下で、タンパク質をプロテアーゼ処理することにより、プロテアーゼの反応が大幅に促進されることを見出し本発明に到達した。
　Ｒ－Ｏ－Ｘ　・・・（Ｉ）
ここで、Ｒは、炭素数が９～１８のアルキル基または置換アルキル基であり、Ｘは、ポリオキシエチレン残基である。Ｒのアルキル基の炭素数は９以上、好ましくは９～１８、より好ましくは１２～１６である。もっとも好ましくは、Ｒのアルキル基の炭素数は１２である。
　すなわち本方法を用いることによりプロテアーゼの反応が促進され、それに伴い測定全工程の時間を短縮することが可能である。
　ｐＨは、例えば、５～９の範囲である。また、この処理は、通常、緩衝液中で行われ、前記緩衝液としては、特に制限されないが、例えば、トリス塩酸緩衝液、リン酸緩衝液、ＥＰＰＳ緩衝液、ＭＥＳ緩衝液、ＰＩＰＥＳ緩衝液等があげられる。
　なお、本発明において、酵素の活性については、明細書に記載がないものについては、原則として、市販品については容器や添付の説明書・パンフレット等に測定法や単位の記載があればそれに従う。また、文献に記載されたものであれば、その文献に記載されている活性測定方法に従う。
　活性の定義（測定方法）がわからない場合や、測定に必要な試薬の入手に制約がある場合などにおいては、当業者の常識に基づいて合理的に適宜基質を選定し、測定条件を決定した上で測定する。
［ヘモグロビンの測定］
　上記の態様においては、ヘモグロビン（以下Ｈｂとも記載）を測定することも可能である。また、糖化ヘモグロビンとヘモグロビン（以下Ｈｂとも記載）を同時測定することも可能であるし、それらの測定結果に基づいて、糖化ヘモグロビンのヘモグロビンに対する割合を求めることも可能である。
　ヘモグロビン（以下Ｈｂとも記載）の測定は、本発明の測定方法における第一ステップが実行されている間のいずれかの時点で、Ｈｂが本来有している赤色（５５０ｎｍ付近）の吸光度を測定することにより、測定をすることができる。
　例えば、ＨｂＡ１ｃの測定が行われている間のいずれかの時点、好ましくは本発明の測定方法における第一ステップが実行されている間のいずれかの時点で、Ｈｂが本来有している赤色（５５０ｎｍ付近）の吸光度を測定することにより、ＨｂとＨｂＡ１ｃの同時測定をすることができる。
　ここで、ＨｂＡ１ｃの測定における発色反応において、酸化により発色する基質を適宜選択することにより、Ｈｂ測定とＨｂＡ１ｃ測定とで測定波長が一致しないよう設定することが好ましい。これにより、互いの測定に与える影響を小さくすることができる。
　また、Ｈｂは反応液中で酸化されメトヘモグロビンに変化し、徐々に吸光度が変化するので、ＨｂおよびＨｂＡ１ｃの測定値に影響を与える場合がある。
　これを防止するためには、試料に、前処理として、フェロシアン化物、亜硝酸塩、硝酸カリウム、アジ化物などの酸化剤を加えることにより予めＨｂをメトヘモグロビンに変えておく（以下「メト化」とも記載）ことが好ましい。あるいは、Ｒ１に同様に前処理として、フェロシアン化物、亜硝酸塩、硝酸カリウム、アジ化物などの酸化剤を配しておき第一反応でメト化を行わせることもできる。
　本発明においては、上記態様に示したように、第一試薬にＦＡＯＤを処方し、第二試薬にプロテアーゼを処方する。
　本構成により、第二試薬にプロテアーゼを配することにより、第一試薬中で内因性の糖化アミノ酸またはペプチドの消去が可能となり、内因性の糖化アミノ酸（またはペプチド）を測りこんでしまうことによる、偽高値が解消されうる。
　本発明においては、［００１５］に記載の３）の工程で、プロテアーゼをＨＬＢ１２以上の上記式（Ｉ）で表される化合物および金属イオンの存在下作用せしめることが好ましい。
　金属イオンとしては、塩化ナトリウム、塩化カリウムなどが例示できる。
　本発明においては、［００１５］に記載の３）の工程で、プロテアーゼをフェロシアン化カリウムおよび／または亜硝酸塩の存在下作用せしめることが好ましい。
　本発明において、上記構成の他、緩衝剤（例えば、ホウ酸緩衝液、リン酸緩衝液、トリス塩酸緩衝液、およびＧＯＯＤ緩衝液など）が含まれていてもよい。
　さらに上記試薬組成物には、酵素反応を妨害するイオンを捕捉するキレート試薬（例えば、ＥＤＴＡおよびＯ－ジアニシジンなど）、過酸化水素の定量の妨害物質であるアスコルビン酸を消去するアスコルビン酸オキシダーゼ、各種界面活性剤（例えば、トリトンＸ－１００およびＮＰ－４０など）、ならびに各種抗菌剤および防腐剤（例えば、ストレプトマイシンおよびアジ化ナトリウムなど）などが含まれていてもよい。
　さらには、塩類、酵素安定化剤、色源体安定化剤などを、必要に応じて添加することができる。
　これらの試薬は、単一試薬でも２種類以上の試薬を組み合わせてなるものであってもよい。
　防腐剤としては、プロクリン（登録商標、スペルコ社）各種、アジ化物、キレート剤、抗生物質、抗菌剤などが挙げられる。キレート剤としては、エチレンジアミン四酢酸およびその塩等が挙げられる。抗生物質としては、ゲンタマイシン、カナマイシン、クロラムフェニコール等が挙げられる。抗菌剤としては、イミダゾリジニルウレア等が挙げられる。
　塩類としては塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化アルミニウム、塩化カルシウム等が挙げられる。
　酵素安定化剤としては、シュークロース、トレハロース、シクロデキストリン、グリセロール、グルコン酸塩、アミノ酸類等が挙げられる。
　また、酵素安定化剤として、血清アルブミン類、グロブリン類または繊維性タンパク質類などの不活性タンパク質を添加することができる。好ましいタンパク質は、ウシ血清アルブミンである。好ましい不活性タンパク質は、酵素分解を起こすプロテアーゼ不純物を含まないものである。
　色素安定化剤としては、硫酸カリクスアレン（６）、硫酸カリクスアレン（８）等が挙げられる。
　また還元物質の影響を回避することを目的として、フェロシアン化カリウム等のフェロシアン化物や亜硝酸ナトリウムなどの亜硝酸塩類を添加しても良い。これら添加剤は還元物質の影響回避のみならず、Ｈｂのメト化やプロテアーゼの反応促進においても効果を発揮する。
　上記の各成分（試薬中に存在するプロテアーゼ、ＦＡＯＤなどの酵素、および、他の成分）の濃度・条件等は、使用する試薬・酵素等の種類により、反応性および／または安定性などを考慮して適宜決定することが出来る。
　その際には、試薬中に存在するそれぞれの成分が互いに干渉しあうことにより、ＨｂＡ１ｃの測定や試薬の安定性等に影響が及ぶ可能性についても、考慮することが好ましい。例えば、第二反応で、プロテアーゼとＦＡＯＤが共存する場合は、できるだけ両酵素の特性を活かせるよう適宜条件決定することができる。
　上記の決定は、必ずしも最適解である必要はなく、目的や状況に応じて、ＨｂＡ１ｃの測定に関して実用上十分な性能が担保されていれば差し支えない。
　本発明の、別の特徴的な構成は、同一反応槽中で、ヘモグロビン、糖化ヘモグロビン、および、糖化ヘモグロビンのヘモグロビンに対する割合のうち少なくとも１つ以上を測定するための試薬であって、以下の（ａ）および（ｂ）を特徴とする試薬である。
（ａ）第一試薬および第二試薬の２つの部分から構成される。
（ｂ）第一試薬に、ＨＬＢ１２以上の下記式（Ｉ）で表される化合物、及びｐＨ５．０～９．５の範囲で緩衝能を有する緩衝液、０．１～１００　Ｕ／ｍＬのフルクトシルアミノ酸オキシダーゼを含み、第二試薬に、５００～５０００００　Ｕ／ｍＬのプロテアーゼを含む。
Ｒ－Ｏ－Ｘ　・・・（Ｉ）
（Ｒは、炭素数が１２～１６のアルキル基または置換アルキル基であり、Ｘは、ポリオキシエチレン残基である。）
　Ｒのアルキル基の炭素数は好ましくは１２である。
　本発明の試薬においては、第一試薬に糖化ヘモグロビン定量用色素が含まれることが好ましい。
本発明の試薬においては、第一試薬および第二試薬のいずれかにフェロシアン化カリウムおよび／または亜硝酸塩を含有することが好ましい。
　上記糖化ヘモグロビン測定試薬は、さらに、いずれかの部分に糖化アミノ酸及び／又は糖化ペプチドに作用する酵素を含んでもよい。
　また、上記糖化ヘモグロビン測定試薬は、２つの部分から構成され、第一試薬に糖化アミノ酸及び／又は糖化ペプチドに作用する酵素を含み、第二試薬にプロテアーゼを含む試薬であることが好ましい。
　このような形態の試薬には、第一試薬にさらにカタラーゼ、パーオキシダーゼおよび色素のうちいずれか１つ以上を含ませることができる。
　本発明の糖化ヘモグロビン測定試薬には、例えば、フルクトシルバリルヒスチジンオキシダーゼ、緩衝液、プロテアーゼ、ＰＯＤ、発色試薬、酵素反応を妨害するイオンを捕捉するキレート試薬、過酸化水素の定量の妨害物質であるアスコルビン酸を消去するアスコルビン酸オキシダーゼ、界面活性剤、安定化剤、賦形剤、抗菌剤、防腐剤、ウェルプレート、蛍光スキャナー、自動分析機、および本発明にかかる測定方法を紙などの記録媒体に記載した取り扱い説明書などが含まれていてもよい。
　本発明の糖化ヘモグロビン測定試薬は、本発明の糖化ヘモグロビンの測定方法に利用し得るものである。よって、本発明のキットは、本発明の測定方法の実施に用いられる物品により構成されていてもよい。上記物品の説明については、本発明の測定方法の項における緩衝剤等の説明を援用することができる。
　なお、本発明の糖化ヘモグロビン測定試薬には、測定に必要な全ての構成をセットにしたものだけでなく、分割されている各構成それぞれも、実質的に包含される。例えば、液状のＲ１とＲ２のセットであれば、Ｒ２と組合せて使用することを前提としたＲ１、または、Ｒ２と組合せて使用することを前提としたＲ２についても、実質的に本発明のキットに包含される。
　本発明は、以上説示した各構成に限定されるものではなく、特許請求の範囲に示した範囲で種々の変更が可能であり、異なる実施形態や実施例にそれぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態や実施例についても本発明の技術的範囲に含まれる。また、本明細書中に記載された文献の全てが参考として援用される。
　以下、本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明は以下の実施例により限定されるものではない。
［実施例１］プロテアーゼ反応促進剤のスクリーニング
＜試薬＞
Ｒ１
　ＰＩＰＥＳ　５０ｍｍｏｌ／Ｌ（ｐＨ６．５）
　ＮａＣｌ　５０ｍｍｏｌ／Ｌ
　ＮａＮＯ２　７ｍｍｏｌ／Ｌ
　ＦＰＯＸ－ＣＥ（キッコーマン）　２ＫＵ／Ｌ
　ペルオキシダーゼ（ＰＥＯ－３０２　東洋紡績）６ＫＵ／Ｌ　
　カタラーゼ　１００ＫＵ／Ｌ（東洋紡績）
　化合物各種　　０．２％　（重量％）
Ｒ２
　ＰＩＰＥＳ　５０ｍｍｏｌ／Ｌ（ｐＨ６．５）
　ＣａＣｌ２　１０ｍｍｏｌ／Ｌ
　サーモリシン（天野エンザイム）　５０００ＫＵ／Ｌ
　１０－（カルボキシメチルアミノカルボニル）－３，７－ビス（ジメチルアミノ）フェノチアジン塩（ＤＡ－６７）　（和光純薬）　　　５０μｍｏｌ／Ｌ　
＜操作方法＞
　３７℃にインキュベートされたＲ１；１２０μｌにＥＤＴＡ－２Ｎａ採血管にて採取したＨｂＡ１ｃ検体を精製水で１／２０倍希釈したものから１０μｌを添加し、３７℃で反応を開始し、５分後にＲ２；４０μｌを添加した。Ｒ２添加前及び添加１．５分後の６６０ｎｍの吸光度を測定し、Ｒ２添加前の吸光度から添加１．５分後の吸光度を差し引く計算を行った。検体１（糖化ヘモグロビンのヘモグロビンに対する割合（ＨｂＡ１ｃ％）が１０．６％）から得られた吸光度を吸光度ＡＨ、検体２（ＨｂＡ１ｃ％が５．１％）から得られた吸光度を吸光度ＡＬとした。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
　表１～表３に、上記試験サンプルのプロテアーゼ反応促進効果の評価結果を示した。表１～表３中に示したＡＨ－ＡＬは、吸光度ＡＨから吸光度ＡＬを差し引いた差である。なお、検体１、２のＨｂＡ１ｃ％はＨＡ－８１８０（ＨＰＬＣ法、アークレイ）にて通法に従い測定を実施した。
　ここでＡＨ－ＡＬが大きければプロテアーゼ反応促進効果があると判定できる。特に、ＡＨ－ＡＬが４０以上の場合には優れた促進効果がある。
　表１～表３の結果よりＨＬＢ１２以上のポリオキシエチレンラウリルエーテルに効果が見られた。特にＨＬＢ１６以上でより良好な反応促進効果が得られた。
［実施例２］各酵素の安定性に与える影響
＜試薬＞
Ｒ１
　ＰＩＰＥＳ　５０ｍｍｏｌ／Ｌ（ｐＨ６．５）
　ＮａＣｌ　５０ｍｍｏｌ／Ｌ
　ＮａＮＯ２　７ｍｍｏｌ／Ｌ
　ＦＡＯＤ（ＦＰＯＸ－ＣＥ（キッコーマン））　２ＫＵ／Ｌ
　ＤＡ－６７（和光純薬）　　　２５μｍｏｌ／Ｌ
　カタラーゼ　１００ＫＵ／Ｌ（東洋紡績）
　化合物各種　　０．５％　（重量％）
Ｒ２
　ＰＩＰＥＳ　５０ｍｍｏｌ／Ｌ（ｐＨ６．５）
　ＣａＣｌ２　１０ｍｍｏｌ／Ｌ
　サーモリシン（天野エンザイム）　５０００ＫＵ／Ｌ
　ペルオキシダーゼ（ＰＥＯ－３０２　東洋紡績）２０ＫＵ／Ｌ　
　化合物各種　　０．５％　（重量％）
＜操作方法＞
　反応促進効果の見られた化合物について、上記組成中のＦＡＯＤ、カタラーゼ、ペルオキシダーゼの安定性について、３５℃、２週間保存した試薬を用いて、それぞれ下記の方法にて安定性を検討した。なお、安定性は保存前に同様に測定した活性値に対する、３５℃、２週間保存後の活性値（％）で評価した。
１）ＦＡＯＤ
　酵素活性は、１．０ｍＭのフルクトシルバリルヒスチジンを基質とし、ＦＡＯＤの酵素反応によって生成される過酸化水素を、ペルオキシダーゼ反応により生じた色素の吸光度の増加を測定することによって求めた。
　まず、活性測定試薬３ｍＬを３７℃にて５分間加温した後、当該活性測定試薬に、予め酵素希釈液（０．１％トリトンＸ１００を含む５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．５））にて希釈した酵素溶液０．１ｍＬを加え、反応を開始した。
　３７℃にて５分間反応させた後、単位時間あたりの５００ｎｍの吸光度変化を測定した（ΔＯＤｔｅｓｔ／ｍｉｎ）。盲検としては、酵素溶液の代わりに酵素希釈液０．１ｍＬを用い、同様の操作を行って吸光度変化を測定した（ΔＯＤｂｌａｎｋ／ｍｉｎ）。
　下記計算式に基づいて、得られた吸光度変化から酵素活性を算出した。なお、上記条件下で１分間に１マイクロモルの基質を酸化する酵素量を１単位（Ｕ）と規定した。
（計算式）
　　活性値（Ｕ／ｍＬ）＝｛（（ΔＯＤｔｅｓｔ／ｍｉｎ）－（ΔＯＤｂｌａｎｋ／ｍｉｎ））×３．１ｍＬ×希釈倍率｝／（１３×１．０ｃｍ×０．１ｍＬ）
　なお、上記計算式において、「３．１ｍＬ」は全液量を示し、「１３」はミリモル吸光係数を示し、「１．０ｃｍ」はセルの光路長を示し、「０．１ｍＬ」は酵素サンプル液量を示す。
２）ペルオキシダーゼ
１．原理
　２Ｐｙｒｏｇａｌｌｏｌ＋３Ｈ２Ｏ２　Ｐｕｒｐｕｒｏｇａｌｌｉｎ＋５Ｈ２Ｏ＋ＣＯ２
生成するＰｕｒｐｕｒｏｇａｌｌｉｎをエーテル抽出し，４２０ｎｍの吸光度の変化で測定する。
２．定義
　下記条件下で２０秒間に１．０ｍｇのＰｕｒｐｕｒｏｇａｌｌｉｎを生成する酵素量を１Ｐｕｒｐｕｒｏｇａｌｌｉｎ単位（Ｕ）とする。
３．試薬
　Ａ．　５％（Ｗ／Ｖ）ピロガロール水溶液（用時調製）
　Ｂ．　０．１４７Ｍ　Ｈ２Ｏ２水溶液〔３０％（Ｗ／Ｖ）Ｈ２Ｏ２溶液１．６７ｍＬを蒸留水で希釈して１００ｍＬとする〕
（用時調製）
　Ｃ．　０．１Ｍリン酸緩衝液，　ｐＨ６．０（反応混液及び酵素希釈用）
　Ｄ．　２．０Ｎ　Ｈ２ＳＯ４溶液
　酵素溶液：酵素標品を予め氷冷した０．１Ｍリン酸緩衝液，ｐＨ　６．０で溶解し，同緩衝液で３．０～６．０Ｐｕｒｐｕｒｏｇａｌｌｉｎ　Ｕ／ｍＬに希釈して氷冷保存する。
４．手順
（１）試験管（３２φ×２００ｍｍ）に下記反応混液を調製し，２０℃で約５分間予備加温する。
　１４．０ｍＬ　蒸留水
　２．０ｍＬ　ピロガロール水溶液（Ａ）
　１．０ｍＬ　Ｈ２Ｏ２水溶液（Ｂ）
　２．０ｍＬ　リン酸緩衝液（Ｃ）
（２）酵素溶液１．０ｍＬを加え，反応を開始する。
（３）２０℃で正確に２０秒間反応させた後，Ｈ２ＳＯ４溶液（Ｄ）１．０ｍＬを加えて反応を停止させる。反応停止後の混液から生成したＰｕｒｐｕｒｏｇａｌｌｉｎをエーテル１５ｍＬで抽出する。この操作を５回繰り返し，抽出液を合わせ，更にエーテルを加えて全量を１００ｍＬにする。この液につき４２０ｎｍにおける吸光度を測定する（ＯＤｔｅｓｔ）。
（４）盲検は反応混液（１）を２０℃で２０秒間放置後，Ｈ２ＳＯ４溶液（Ｄ）１．０ｍＬを加えて混和し，次いで酵素溶液１．０ｍＬを加えて調製する。この液につき上記同様にエーテル抽出を行って吸光度を測定する（ＯＤｂｌａｎｋ）。
５．計算式
Ｕ／ｍＬ＝｛ΔＯＤ（ＯＤｔｅｓｔ－ＯＤｂｌａｎｋ）×希釈倍率｝／｛０．１１７×１（ｍＬ）｝
　　　　＝ΔＯＤ×８．５４７×希釈倍率
Ｕ／ｍｇ＝Ｕ／ｍＬ×１／Ｃ
０．１１７：１ｍｇ％　Ｐｕｒｐｕｒｏｇａｌｌｉｎエーテル溶液の４２０ｎｍにおける吸光度
Ｃ：溶解時の酵素濃度（ｃ　ｍｇ／ｍＬ）
（注）１Ｐｕｒｐｕｒｏｇａｌｌｉｎ単位は１３．５国際単位（ｏ－ｄｉａｎｉｓｉｄｉｎｅを基質とし，２５℃の反応条件下）に相当する。
３）カタラーゼ
１．原理
　過酸化水素の減少量をチタン呈色法で測定する。
２．定義
　下記条件下で１分間に１マイクロモルの過酸化水素を分解する酵素量を１単位（Ｕ）とする。
３．試薬
　Ａ．　１０ｍＭリン酸緩衝液、ｐＨ７．０（２５℃）
　Ｂ．　Ｈ２Ｏ２溶液：１６ｍＭ（０．１８２ｍＬの３０％（Ｗ／Ｖ）　Ｈ２Ｏ２を１００ｍＬのｂｕｆｆｅｒＡに溶解する（用時調製）
　Ｃ．　チタン試薬（ナカライテスク製）
　酵素溶液：酵素備品を予め氷冷した緩衝液Ａで０．３５～１．３５Ｕ／ｍＬに希釈する。
４．手順
（１）試験管（３２φ×２００ｍｍ）に０．２５ｍＬの基質溶液（Ｂ）を採り，２５℃で約５分間予備加温する。
（２）酵素溶液０．２５ｍＬを添加し，ゆるやかに混和する。
（３）２５℃で正確に５分間反応させた後，チタン試薬（Ｃ）２．５ｍＬを加えて反応を停止させ、水を対照にして４１０ｎｍの吸光度を測定する（ＯＤｔｅｓｔ）。
（４）盲検は５分間の加温の後、最初に基質溶液（Ｂ）０．２５ｍＬをチタン試薬（Ｃ）２．５ｍＬ加えて混和し、次いで酵素溶液を添加する（ＯＤｂｌａｎｋ）。
５．計算式
Ｕ／ｍＬ＝｛ΔＯＤ（ＯＤｂｌａｎｋ－ＯＤｔｅｓｔ）×３．０ｍＬ×希釈倍率｝／｛Ｆ×５（分）×１．０×０．２５（ｍＬ）｝
　　　　＝ΔＯＤ×３．４３×１／Ｆ×希釈倍率
Ｕ／ｍｇ＝Ｕ／ｍＬ×１／Ｃ
Ｆ：０．１ｍＭ過酸化水素によるチタン呈色生成物の吸光度係数（Ｆは濃度の分かっている過酸化水素を用いて各ロット毎に決定する。通常は０．７前後である）
１．０：光路長（ｃｍ）
Ｃ：溶解時の酵素濃度（ｃ　ｍｇ／ｍＬ）
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
　表４に結果を示す。一般的に酵素の活性値低下に伴って反応速度も低下することから、反応促進効果を保つためには、反応促進剤が酵素の安定性に影響を与えないものが好ましい。ＨＬＢ１２以上のポリオキシエチレンラウリルエーテルに、ＦＡＯＤ、カタラーゼ、ペルオキシダーゼに対する安定化効果が見られた。
　比較例として、Ｎ－アシルアミノ酸、糖エステルおよびポリオキシエチレンアルキルエーテル硫酸塩について同様の試験を行ったところ、ある程度の反応促進効果が見られたが、ＦＡＯＤ、カタラーゼおよびＰＯＤの安定性は、実施例に比べて劣る結果となった。
［実施例３］反応促進剤の添加量検討
＜試薬＞
Ｒ１
　ＭＥＳ　５０ｍｍｏｌ／Ｌ（ｐＨ６．５）
　ＮａＮＯ２　７ｍｍｏｌ／Ｌ
　ＦＡＯＤ（ＦＰＯＸ－ＣＥ（キッコーマン））　２ＫＵ／Ｌ
　ＤＡ－６７（和光純薬）　　　２５μｍｏｌ／Ｌ
　カタラーゼ　１００ＫＵ／Ｌ（東洋紡績）
　化合物各種　各濃度　（重量％）
Ｒ２
　ＭＥＳ　５０ｍｍｏｌ／Ｌ（ｐＨ６．５）
　ＣａＣｌ２　１０ｍｍｏｌ／Ｌ
　サーモリシン（天野エンザイム）　５０００ＫＵ／Ｌ
　フェロシアン化カリウム　０．０１ｇ／Ｌ
　ペルオキシダーゼ（ＰＥＯ－３０２　東洋紡績）２０ＫＵ／Ｌ　
＜操作方法＞
　３７℃にインキュベートされたＲ１；１２０μｌにＥＤＴＡ－２Ｎａ採血管にて採取したＨｂＡ１ｃ検体を精製水で１／２０倍希釈したものから１０μｌを添加し、３７℃で反応を開始し、５分後にＲ２；４０μｌを添加した。Ｒ２添加前及び添加１．５分後の６６０ｎｍの吸光度を測定し、Ｒ２添加前の吸光度から添加１．５分後の吸光度を差し引く計算を行った。検体３（糖化ヘモグロビンのヘモグロビンに対する割合（ＨｂＡ１ｃ％）が９．３％）から得られた吸光度を吸光度ＡＨ、検体４（ＨｂＡ１ｃ％が４．５％）から得られた吸光度を吸光度ＡＬとした。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
　表５に、上記試験サンプルのプロテアーゼ反応促進効果の評価結果を示した。表５中に示したＡＨ－ＡＬは、吸光度ＡＨから吸光度ＡＬを差し引いた差である。なお、検体３、４のＨｂＡ１ｃ％はＨＡ－８１８０（ＨＰＬＣ法、アークレイ）にて通法に従い測定を実施した。
　ここでＡＨ－ＡＬが大きければプロテアーゼ反応促進効果があると判定できる。特に、ＡＨ－ＡＬが３５以上の場合には優れた促進効果がある。
　表５に結果を示す。表５より０．２％（反応液中、０．１４％）以上で特に良好な反応を示すことを確認した。
［実施例４］内因性糖化アミノ酸、糖化ペプチドの消去能の確認
＜試薬＞実施例
Ｒ１
　ＰＩＰＥＳ　５０ｍｍｏｌ／Ｌ（ｐＨ７．０）
　ＮａＣｌ　５０ｍｍｏｌ／Ｌ
　ＮａＮＯ２　７ｍｍｏｌ／Ｌ
　ＦＡＯＤ（ＦＰＯＸ－ＣＥ（キッコーマン））　２ＫＵ／Ｌ
　ＤＡ－６７（和光純薬）　　　１００μｍｏｌ／Ｌ
　カタラーゼ　１００ＫＵ／Ｌ（東洋紡績）
　ポリオキシエチレンラウリルエーテル（花王）　　１．０％　（重量％）
Ｒ２
　ＰＩＰＥＳ　５０ｍｍｏｌ／Ｌ（ｐＨ７．０）
　ＣａＣｌ２　１０ｍｍｏｌ／Ｌ
　サーモリシン（天野エンザイム）　５０００ｋＵ／Ｌ
　ペルオキシダーゼ（ＰＥＯ－３０２　東洋紡績）２０ＫＵ／Ｌ　
＜操作方法＞
　日立７１８０形自動分析機を用いた。
（Ｈｂ濃度の測定）
　３７℃にインキュベートされたＲ１；１２０μｌに下記の検体を精製水で１／２０倍希釈したものからＨｂＡ１ｃ検体１０μｌを添加し、３７℃で反応を開始し、５分後に５０５ｎｍの吸光度を測定した。
　結果を、キャリブレーター１（Ｈｂ　１０１．０μｍｏｌ／ｌ、ＨｂＡ１ｃ　３．５４μｍｏｌ／ｌ、ＨｂＡ１ｃ％が５．０％）とキャリブレーター２（Ｈｂ　１５３．８μｍｏｌ／ｌ、ＨｂＡ１ｃ　１３．７０μｍｏｌ／ｌ、ＨｂＡ１ｃ％が１０．２％）とを用いて作成した検量線と対比してＨｂ濃度を求めた。
（ＨｂＡ１ｃ濃度の測定）
　また、Ｒ１添加、５分後にＲ２；４０μｌを添加した。Ｒ２添加前及び添加５分後の６６０ｎｍの吸光度を測定した。結果を、上記と同じキャリブレーター１とキャリブレーター２とを用いて作成した検量線と対比してＨｂＡ１ｃ濃度を求めた。
（ＨｂＡ１ｃ　％　の測定）
　上記で得られた各検体のＨｂ濃度（μｍｏｌ／ｌ）とＨｂＡ１ｃ濃度（μｍｏｌ／ｌ）から、下記式によりＨｂＡ１ｃ（％）を算出した。
　ＨｂＡ１ｃ（％）＝
｛９６．３×ＨｂＡ１ｃ濃度（μｍｏｌ／ｌ）／Ｈｂ濃度（μｍｏｌ／ｌ）｝＋１．６２
　検体には、ＥＤＴＡ－Ｎａ採血管で採取した５．７９％のＨｂＡ１ｃ全血検体にユニカリックＮ（テルモ；アミノ酸、糖、電解質を含む滋養強壮用の輸液製剤）を各濃度で添加したものを使用した。
　なお、検体のＨｂＡ１ｃ％はＨＡ－８１８０（ＨＰＬＣ法、アークレイ）にて通法に従い測定を実施した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
　アミノ酸、糖を含む輸液製剤中には保存中にアミノ酸と糖が結合した糖化アミノ酸が生成し、この糖化アミノ酸にＦＡＯＤが反応するため、偽高値の原因となることが問題となっているが、表６、図１に結果を示すとおり、本発明においては、内因性の糖化アミノ酸を消去できることを確認した。
［実施例５］標準品の測定
＜試薬＞実施例５
Ｒ１
　ＰＩＰＥＳ　５０ｍｍｏｌ／Ｌ（ｐＨ６．５）
　ＦＡＯＤ（ＦＰＯＸ－ＣＥ（キッコーマン））　５ＫＵ／Ｌ
　ＤＡ－６７（和光純薬）　　　５０μｍｏｌ／Ｌ
　カタラーゼ　１００ＫＵ／Ｌ（東洋紡績）
　ポリオキシエチレンラウリルエーテル（花王）　　１．０％　（重量％）
Ｒ２
　ＰＩＰＥＳ　５０ｍｍｏｌ／Ｌ（ｐＨ６．５）
　ＣａＣｌ２　１０ｍｍｏｌ／Ｌ
　サーモリシン（天野エンザイム）　５０００ＫＵ／Ｌ
　ペルオキシダーゼ（ＰＥＯ－３０２　東洋紡績）２０ＫＵ／Ｌ　
＜操作方法＞
　実施例４と同じ。
　検体には、ＪＣＣＲＭ　４１１（ＩＦＣＣ法ＨｂＡ１ｃ測定用常用参照標準物質）、一般社団法人　検査医学標準物質機構（ＲｅＣＣＳ）品　５水準（ＬＥＢＥＬ１からＬＥＢＥＬ５まで）を用い、それぞれ８００ｇ×５分で遠心して、血球成分を下記の前処理液で１／４０希釈したものを使用した。
・前処理液　；　ＭＥＳ　１０ｍＭ（ｐＨ６．５）とＮａＮＯ２　０．５ｇ／ｌを含む水溶液
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000007
　表７に結果を示す。結果より標準物質の測定値が表示値と一致することを確認した。
　さらに、実施例５－１～５－１５、比較例１として、ｐＨ、ＦＡＯＤの添加量、プロテアーゼの添加量を種々変更して、実施例５と同様の試験を行った。
　実施例５－１～５－６はｐＨを、実施例５－７～５－１０はＦＡＯＤの添加量を、実施例５－１１～５－１５はプロテアーゼの添加量をそれぞれ変えて、試験を行った。また、比較例として、ポリオキシエチレンオレイルエーテルを用いて、試験を行った。
　以下に、各実施例および比較例の詳細な試薬組成を示す。
＜試薬＞実施例５－１
Ｒ１
　Ｒ１
　ＭＥＳ　５０ｍｍｏｌ／Ｌ（ｐＨ６．０）
　ＦＡＯＤ（ＦＰＯ－３０１（東洋紡績）　２ＫＵ／Ｌ
　ＤＡ－６７（和光純薬）　　　５０μｍｏｌ／Ｌ
　カタラーゼ　１００ＫＵ／Ｌ（東洋紡績）
　ポリオキシエチレンラウリルエーテル（花王）　　１．０％　（重量％）
Ｒ２
　ＭＥＳ　５０ｍｍｏｌ／Ｌ（ｐＨ６．０）
　ＣａＣｌ２　１０ｍｍｏｌ／Ｌ
　フェロシアン化カリウム　０．０１ｇ／Ｌ
　ペルオキシダーゼ（ＰＥＯ－３０２　東洋紡績）２０ＫＵ／Ｌ
　サーモリシン（天野エンザイム）　５０００ＫＵ／Ｌ
＜試薬＞実施例５－２
Ｒ１
　Ｒ１
　ＰＩＰＥＳ　５０ｍｍｏｌ／Ｌ（ｐＨ６．５）
　ＦＡＯＤ（ＦＰＯ－３０１（東洋紡績）　２ＫＵ／Ｌ
　ＤＡ－６７（和光純薬）　　　５０μｍｏｌ／Ｌ
　カタラーゼ　１００ＫＵ／Ｌ（東洋紡績）
　ポリオキシエチレンラウリルエーテル（花王）　　１．０％　（重量％）
Ｒ２
　ＰＩＰＥＳ　５０ｍｍｏｌ／Ｌ（ｐＨ６．５）
　ＣａＣｌ２　１０ｍｍｏｌ／Ｌ
　フェロシアン化カリウム　０．０１ｇ／Ｌ
　ペルオキシダーゼ（ＰＥＯ－３０２　東洋紡績）２０ＫＵ／Ｌ
　サーモリシン（天野エンザイム）　５０００ＫＵ／Ｌ
＜試薬＞実施例５－３
Ｒ１
　Ｒ１
　ＰＩＰＥＳ　５０ｍｍｏｌ／Ｌ（ｐＨ７．０）
　ＦＡＯＤ（ＦＰＯ－３０１（東洋紡績）　２ＫＵ／Ｌ
　ＤＡ－６７（和光純薬）　　　５０μｍｏｌ／Ｌ
　カタラーゼ　１００ＫＵ／Ｌ（東洋紡績）
　ポリオキシエチレンラウリルエーテル（花王）　　１．０％　（重量％）
Ｒ２
　ＰＩＰＥＳ　５０ｍｍｏｌ／Ｌ（ｐＨ７．０）
　ＣａＣｌ２　１０ｍｍｏｌ／Ｌ
　フェロシアン化カリウム　０．０１ｇ／Ｌ
　ペルオキシダーゼ（ＰＥＯ－３０２　東洋紡績）２０ＫＵ／Ｌ
　サーモリシン（天野エンザイム）　５０００ＫＵ／Ｌ
＜試薬＞実施例５－４
Ｒ１
　Ｒ１
　ＴＥＳ　５０ｍｍｏｌ／Ｌ（ｐＨ７．５）
　ＦＡＯＤ（ＦＰＯ－３０１（東洋紡績）　２ＫＵ／Ｌ
　ＤＡ－６７（和光純薬）　　　５０μｍｏｌ／Ｌ
　カタラーゼ　１００ＫＵ／Ｌ（東洋紡績）
　ポリオキシエチレンラウリルエーテル（花王）　　１．０％　（重量％）
Ｒ２
　ＴＥＳ　５０ｍｍｏｌ／Ｌ（ｐＨ７．５）
　ＣａＣｌ２　１０ｍｍｏｌ／Ｌ
　フェロシアン化カリウム　０．０１ｇ／Ｌ
　ペルオキシダーゼ（ＰＥＯ－３０２　東洋紡績）２０ＫＵ／Ｌ
　サーモリシン（天野エンザイム）　５０００ＫＵ／Ｌ
＜試薬＞実施例５－５
Ｒ１
　Ｒ１
　ＨＥＰＰＳＯ　５０ｍｍｏｌ／Ｌ（ｐＨ８．０）
　ＦＡＯＤ（ＦＰＯ－３０１（東洋紡績）　２ＫＵ／Ｌ
　ＤＡ－６７（和光純薬）　　　５０μｍｏｌ／Ｌ
　カタラーゼ　１００ＫＵ／Ｌ（東洋紡績）
　ポリオキシエチレンラウリルエーテル（花王）　　１．０％　（重量％）
Ｒ２
　ＨＥＰＰＳＯ　５０ｍｍｏｌ／Ｌ（ｐＨ８．０）
　ＣａＣｌ２　１０ｍｍｏｌ／Ｌ
　フェロシアン化カリウム　０．０１ｇ／Ｌ
　ペルオキシダーゼ（ＰＥＯ－３０２　東洋紡績）２０ＫＵ／Ｌ
　サーモリシン（天野エンザイム）　５０００ＫＵ／Ｌ
＜試薬＞実施例５－６
Ｒ１
　Ｒ１
　ＴＡＰＳ　５０ｍｍｏｌ／Ｌ（ｐＨ８．５）
　ＦＡＯＤ（ＦＰＯ－３０１（東洋紡績）　２ＫＵ／Ｌ
　ＤＡ－６７（和光純薬）　　　５０μｍｏｌ／Ｌ
　カタラーゼ　１００ＫＵ／Ｌ（東洋紡績）
　ポリオキシエチレンラウリルエーテル（花王）　　１．０％　（重量％）
Ｒ２
　ＴＡＰＳ　５０ｍｍｏｌ／Ｌ（ｐＨ８．５）
　ＣａＣｌ２　１０ｍｍｏｌ／Ｌ
　フェロシアン化カリウム　０．０１ｇ／Ｌ
　ペルオキシダーゼ（ＰＥＯ－３０２　東洋紡績）２０ＫＵ／Ｌ
　サーモリシン（天野エンザイム）　５０００ＫＵ／Ｌ
＜試薬＞実施例５－７
Ｒ１
　Ｒ１
　ＰＩＰＥＳ　５０ｍｍｏｌ／Ｌ（ｐＨ６．５）
　ＦＡＯＤ（ＦＰＯ－３０１（東洋紡績）　０．２ＫＵ／Ｌ
　ＤＡ－６７（和光純薬）　　　５０μｍｏｌ／Ｌ
　カタラーゼ　１００ＫＵ／Ｌ（東洋紡績）
　ポリオキシエチレンラウリルエーテル（花王）　　１．０％　（重量％）
Ｒ２
　ＰＩＰＥＳ　５０ｍｍｏｌ／Ｌ（ｐＨ６．５）
　ＣａＣｌ２　１０ｍｍｏｌ／Ｌ
　フェロシアン化カリウム　０．０１ｇ／Ｌ
　ペルオキシダーゼ（ＰＥＯ－３０２　東洋紡績）２０ＫＵ／Ｌ
　サーモリシン（天野エンザイム）　５０００ＫＵ／Ｌ
＜試薬＞実施例５－８
Ｒ１
　Ｒ１
　ＰＩＰＥＳ　５０ｍｍｏｌ／Ｌ（ｐＨ６．５）
　ＦＡＯＤ（ＦＰＯ－３０１（東洋紡績）　１．０ＫＵ／Ｌ
　ＤＡ－６７（和光純薬）　　　５０μｍｏｌ／Ｌ
　カタラーゼ　１００ＫＵ／Ｌ（東洋紡績）
　ポリオキシエチレンラウリルエーテル（花王）　　１．０％　（重量％）
Ｒ２
　ＰＩＰＥＳ　５０ｍｍｏｌ／Ｌ（ｐＨ６．５）
　ＣａＣｌ２　１０ｍｍｏｌ／Ｌ
　フェロシアン化カリウム　０．０１ｇ／Ｌ
　ペルオキシダーゼ（ＰＥＯ－３０２　東洋紡績）２０ＫＵ／Ｌ
　サーモリシン（天野エンザイム）　５０００ＫＵ／Ｌ
＜試薬＞実施例５－９
Ｒ１
　Ｒ１
　ＰＩＰＥＳ　５０ｍｍｏｌ／Ｌ（ｐＨ６．５）
　ＦＡＯＤ（ＦＰＯ－３０１（東洋紡績）　４．０ＫＵ／Ｌ
　ＤＡ－６７（和光純薬）　　　５０μｍｏｌ／Ｌ
　カタラーゼ　１００ＫＵ／Ｌ（東洋紡績）
　ポリオキシエチレンラウリルエーテル（花王）　　１．０％　（重量％）
Ｒ２
　ＰＩＰＥＳ　５０ｍｍｏｌ／Ｌ（ｐＨ６．５）
　ＣａＣｌ２　１０ｍｍｏｌ／Ｌ
　フェロシアン化カリウム　０．０１ｇ／Ｌ
　ペルオキシダーゼ（ＰＥＯ－３０２　東洋紡績）２０ＫＵ／Ｌ
　サーモリシン（天野エンザイム）　５０００ＫＵ／Ｌ
＜試薬＞実施例５－１０
Ｒ１
　Ｒ１
　ＰＩＰＥＳ　５０ｍｍｏｌ／Ｌ（ｐＨ６．５）
　ＦＡＯＤ（ＦＰＯ－３０１（東洋紡績）　１０．０ＫＵ／Ｌ
　ＤＡ－６７（和光純薬）　　　５０μｍｏｌ／Ｌ
　カタラーゼ　１００ＫＵ／Ｌ（東洋紡績）
　ポリオキシエチレンラウリルエーテル（花王）　　１．０％　（重量％）
Ｒ２
　ＰＩＰＥＳ　５０ｍｍｏｌ／Ｌ（ｐＨ６．５）
　ＣａＣｌ２　１０ｍｍｏｌ／Ｌ
　フェロシアン化カリウム　０．０１ｇ／Ｌ
　ペルオキシダーゼ（ＰＥＯ－３０２　東洋紡績）２０ＫＵ／Ｌ
　サーモリシン（天野エンザイム）　５０００ＫＵ／Ｌ
＜試薬＞実施例５－１１
Ｒ１
　Ｒ１
　ＰＩＰＥＳ　５０ｍｍｏｌ／Ｌ（ｐＨ６．５）
　ＦＡＯＤ（ＦＰＯ－３０１（東洋紡績）　２．０ＫＵ／Ｌ
　ＤＡ－６７（和光純薬）　　　５０μｍｏｌ／Ｌ
　カタラーゼ　１００ＫＵ／Ｌ（東洋紡績）
　ポリオキシエチレンラウリルエーテル（花王）　　１．０％　（重量％）
Ｒ２
　ＰＩＰＥＳ　５０ｍｍｏｌ／Ｌ（ｐＨ６．５）
　ＣａＣｌ２　１０ｍｍｏｌ／Ｌ
　フェロシアン化カリウム　０．０１ｇ／Ｌ
　ペルオキシダーゼ（ＰＥＯ－３０２　東洋紡績）２０ＫＵ／Ｌ
　サーモリシン（天野エンザイム）　５００ＫＵ／Ｌ
＜試薬＞実施例５－１２
Ｒ１
　Ｒ１
　ＰＩＰＥＳ　５０ｍｍｏｌ／Ｌ（ｐＨ６．５）
　ＦＡＯＤ（ＦＰＯ－３０１（東洋紡績）　２．０ＫＵ／Ｌ
　ＤＡ－６７（和光純薬）　　　５０μｍｏｌ／Ｌ
　カタラーゼ　１００ＫＵ／Ｌ（東洋紡績）
　ポリオキシエチレンラウリルエーテル（花王）　　１．０％　（重量％）
Ｒ２
　ＰＩＰＥＳ　５０ｍｍｏｌ／Ｌ（ｐＨ６．５）
　ＣａＣｌ２　１０ｍｍｏｌ／Ｌ
　フェロシアン化カリウム　０．０１ｇ／Ｌ
　ペルオキシダーゼ（ＰＥＯ－３０２　東洋紡績）２０ＫＵ／Ｌ
　サーモリシン（天野エンザイム）　２０００ＫＵ／Ｌ
＜試薬＞実施例５－１３
Ｒ１
　Ｒ１
　ＰＩＰＥＳ　５０ｍｍｏｌ／Ｌ（ｐＨ６．５）
　ＦＡＯＤ（ＦＰＯ－３０１（東洋紡績）　２．０ＫＵ／Ｌ
　ＤＡ－６７（和光純薬）　　　５０μｍｏｌ／Ｌ
　カタラーゼ　１００ＫＵ／Ｌ（東洋紡績）
　ポリオキシエチレンラウリルエーテル（花王）　　１．０％　（重量％）
Ｒ２
　ＰＩＰＥＳ　５０ｍｍｏｌ／Ｌ（ｐＨ６．５）
　ＣａＣｌ２　１０ｍｍｏｌ／Ｌ
　フェロシアン化カリウム　０．０１ｇ／Ｌ
　ペルオキシダーゼ（ＰＥＯ－３０２　東洋紡績）２０ＫＵ／Ｌ
　サーモリシン（天野エンザイム）　８０００ＫＵ／Ｌ
＜試薬＞実施例５－１４
Ｒ１
　Ｒ１
　ＰＩＰＥＳ　５０ｍｍｏｌ／Ｌ（ｐＨ６．５）
　ＦＡＯＤ（ＦＰＯ－３０１（東洋紡績）　２．０ＫＵ／Ｌ
　ＤＡ－６７（和光純薬）　　　５０μｍｏｌ／Ｌ
　カタラーゼ　１００ＫＵ／Ｌ（東洋紡績）
　ポリオキシエチレンラウリルエーテル（花王）　　１．０％　（重量％）
Ｒ２
　ＰＩＰＥＳ　５０ｍｍｏｌ／Ｌ（ｐＨ６．５）
　ＣａＣｌ２　１０ｍｍｏｌ／Ｌ
　フェロシアン化カリウム　０．０１ｇ／Ｌ
　ペルオキシダーゼ（ＰＥＯ－３０２　東洋紡績）２０ＫＵ／Ｌ
　サーモリシン（天野エンザイム）　１２０００ＫＵ／Ｌ
＜試薬＞実施例５－１５
Ｒ１
　Ｒ１
　ＰＩＰＥＳ　５０ｍｍｏｌ／Ｌ（ｐＨ６．５）
　ＦＡＯＤ（ＦＰＯ－３０１（東洋紡績）　２．０ＫＵ／Ｌ
　ＤＡ－６７（和光純薬）　　　５０μｍｏｌ／Ｌ
　カタラーゼ　１００ＫＵ／Ｌ（東洋紡績）
　ポリオキシエチレンラウリルエーテル（花王）　　１．０％　（重量％）
Ｒ２
　ＰＩＰＥＳ　５０ｍｍｏｌ／Ｌ（ｐＨ６．５）
　ＣａＣｌ２　１０ｍｍｏｌ／Ｌ
　フェロシアン化カリウム　０．０１ｇ／Ｌ
　ペルオキシダーゼ（ＰＥＯ－３０２　東洋紡績）２０ＫＵ／Ｌ
　サーモリシン（天野エンザイム）　２００００ＫＵ／Ｌ
＜試薬＞比較例１
Ｒ１
　Ｒ１
　ＰＩＰＥＳ　５０ｍｍｏｌ／Ｌ（ｐＨ６．５）
　ＦＡＯＤ（ＦＰＯ－３０１（東洋紡績）　２．０ＫＵ／Ｌ
　ＤＡ－６７（和光純薬）　　　５０μｍｏｌ／Ｌ
　カタラーゼ　１００ＫＵ／Ｌ（東洋紡績）
　ポリオキシエチレンオレイルエーテル（花王）　　１．０％　（重量％）
Ｒ２
　ＰＩＰＥＳ　５０ｍｍｏｌ／Ｌ（ｐＨ６．５）
　ＣａＣｌ２　１０ｍｍｏｌ／Ｌ
　フェロシアン化カリウム　０．０１ｇ／Ｌ
　ペルオキシダーゼ（ＰＥＯ－３０２　東洋紡績）２０ＫＵ／Ｌ
　サーモリシン（天野エンザイム）　５０００ＫＵ／Ｌ
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000008
　表８に結果を示す。結果より実施例において標準物質の測定値が表示値と一致することを確認した。
［実施例６］実検体測定における相関性確認
＜試薬＞実施例
下記、３種のプロテアーゼを用いて、３種の試薬を作製した。
Ｒ１
　ＰＩＰＥＳ　５０ｍｍｏｌ／Ｌ（ｐＨ６．５）
　ＦＡＯＤ（ＦＰＯＸ－ＣＥ（キッコーマン））　５ＫＵ／Ｌ
　ＤＡ－６７（和光純薬）　　　５０μｍｏｌ／Ｌ
　カタラーゼ　１００ＫＵ／Ｌ（東洋紡績）
　ポリオキシエチレンラウリルエーテル（花王）　　１．０％　（重量％）
Ｒ２
　ＰＩＰＥＳ　５０ｍｍｏｌ／Ｌ（ｐＨ６．５）
　ＣａＣｌ２　１０ｍｍｏｌ／Ｌ
　フェロシアン化カリウム　０．０１ｇ／Ｌ
　ペルオキシダーゼ（ＰＥＯ－３０２　東洋紡績）２０ＫＵ／Ｌ
　プロテアーゼ（下記）
　　　Ｌｏｔ．Ａ；　メタロプロテアーゼ（東洋紡績）　　５０００ＫＵ／Ｌ
　　　Ｌｏｔ．Ｂ；プロテアーゼ（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｇｒｉｓｅｕｓ由来、フルカ）５０００ＫＵ／Ｌ
　　　Ｌｏｔ．Ｃ；サーモリシン（天野エンザイム）　５０００ＫＵ／Ｌ
＜操作方法＞
　検体（ｎ＝６０）には、ＥＤＴＡ－Ｎａ採血管で採取した検体を下記の前処理液で１／２０希釈したものを使用した。検体の希釈以外の操作については、実施例４と同様。
　・前処理液　；　ＰＩＰＥＳ　１０ｍＭ（ｐＨ６．５）とＮａＮＯ２　０．５ｇ／ｌを含む水溶液
　対照法はＨＰＬＣ法とし、ＨＡ－８１８０（アークレイ）を用いて、通法に従い測定を実施した。
　図２～４に結果を示す。結果より既存法と良好な相関性を示すことを確認した。
［実施例７］（短時間（６０秒－６０秒）での測定）
［酵素法］
１．試薬
Ｒ１
　Ｒ１
　ＰＩＰＥＳ　５０ｍｍｏｌ／Ｌ（ｐＨ６．５）
　ＦＡＯＤ（ＦＰＯＸ－ＣＥ（キッコーマン））　５ＫＵ／Ｌ
　ＤＡ－６７（和光純薬）　　　５０μｍｏｌ／Ｌ
　カタラーゼ　１００ＫＵ／Ｌ（東洋紡績）
　ポリオキシエチレンラウリルエーテル（花王）　　１．０％　（重量％）
Ｒ２
　ＰＩＰＥＳ　５０ｍｍｏｌ／Ｌ（ｐＨ６．５）
　ＣａＣｌ２　１０ｍｍｏｌ／Ｌ
　フェロシアン化カリウム　０．０１ｇ／Ｌ
　ペルオキシダーゼ（ＰＥＯ－３０２　東洋紡績）２０ＫＵ／Ｌ
　サーモリシン（天野エンザイム）　５０００ＫＵ／Ｌ
 
＜操作方法＞
　（Ｈｂ濃度の測定）
　３７℃にインキュベートされたＲ１；１２０μｌに下記の方法で希釈した検体を１０μｌ添加し、３７℃で反応を開始し、１分後に５０５ｎｍの吸光度を測定した。
　結果を、キャリブレーター１（Ｈｂ　１０１．０μｍｏｌ／ｌ、ＨｂＡ１ｃ　３．５４μｍｏｌ／ｌ、ＨｂＡ１ｃ％が５．０％）とキャリブレーター２（Ｈｂ　１５３．８μｍｏｌ／ｌ、ＨｂＡ１ｃ　１３．７０μｍｏｌ／ｌ、ＨｂＡ１ｃ％が１０．２％）とを用いて作成した検量線と対比してＨｂ濃度を求めた。
（ＨｂＡ１ｃ濃度の測定）
　また、Ｒ１添加、１分後にＲ２；４０μｌを添加した。Ｒ２添加前及び添加１分後の６６０ｎｍの吸光度を測定した。結果を、上記と同じキャリブレーター１とキャリブレーター２とを用いて作成した検量線と対比してＨｂＡ１ｃ濃度を求めた。
（ＨｂＡ１ｃ　％　の測定）
　上記で得られた各検体のＨｂ濃度（μｍｏｌ／ｌ）とＨｂＡ１ｃ濃度（μｍｏｌ／ｌ）から、下記式によりＨｂＡ１ｃ（％）を算出した。
　ＨｂＡ１ｃ（％）＝
｛９６．３×ＨｂＡ１ｃ濃度（μｍｏｌ／ｌ）／Ｈｂ濃度（μｍｏｌ／ｌ）｝＋１．６　
 
＜検体希釈方法＞　
ＥＤＴＡ－Ｎａ採血管で採取した検体（ｎ＝１００）を下記の前処理液で１／２０希釈した。　
・前処理液　；　ＰＩＰＥＳ　１０ｍＭ（ｐＨ６．５）とＮａＮＯ２　０．５ｇ／ｌを含む水溶液
 
　対照法はＨＰＬＣ法とし、ＨＡ－８１８０（アークレイ）を用いて、通法に従い測定を実施した。
　相関データを図５に示す。
　これらの結果より、本発明を用いることにより短時間測定が可能となり、測定結果の迅速なレポートが可能になる。
［実施例８］（短時間（６０秒－６０秒）での測定）
［酵素法］
１．試薬
Ｒ１
　Ｒ１
　ＰＩＰＥＳ　５０ｍｍｏｌ／Ｌ（ｐＨ６．５）
　ＦＡＯＤ（ＦＰＯ－３０１（東洋紡績）　２ＫＵ／Ｌ
　ＤＡ－６７（和光純薬）　　　５０μｍｏｌ／Ｌ
　カタラーゼ　１００ＫＵ／Ｌ（東洋紡績）
　ポリオキシエチレンラウリルエーテル（花王）　　１．０％　（重量％）
Ｒ２
　ＰＩＰＥＳ　５０ｍｍｏｌ／Ｌ（ｐＨ６．５）
　ＣａＣｌ２　１０ｍｍｏｌ／Ｌ
　フェロシアン化カリウム　０．０１ｇ／Ｌ
　ペルオキシダーゼ（ＰＥＯ－３０２　東洋紡績）２０ＫＵ／Ｌ
　メタロプロテアーゼ（東洋紡績）　　４０００ＫＵ／Ｌ
 
＜操作方法＞
（Ｈｂ濃度の測定）
　実施例７と同じ。
（ＨｂＡ１ｃ濃度の測定）
　実施例７と同じ。
（ＨｂＡ１ｃ　％　の測定）
　実施例７と同じ。
 
＜検体希釈方法＞　
　実施例７と同じ。
 
　対照法はＨＰＬＣ法とし、ＨＡ－８１８０（アークレイ）を用いて、通法に従い測定を実施した。
　相関データを図６に示す。また、６４検体中３検体分について、タイムコースを図７に示す。
　本結果においてもタイムコース、相関性とも良好であり、本発明を用いることにより短時間測定が可能であった。本結果より測定時間を短縮化することにより、迅速、短時間での測定が可能となる。
　本発明は、ＨｂＡ１ｃを定量するための試薬に有用である。
 

Claims (6)

  1. 　ヘモグロビン、糖化ヘモグロビン、および、糖化ヘモグロビンのヘモグロビンに対する割合のうち少なくとも１つ以上を測定する方法であって、以下の（ａ）および（ｂ）を特徴とする方法。
    （ａ）以下の１）～３）の工程を同一反応槽中で行う。
    （ｂ）１）および２）の工程を同一のステップ内で行い、その次のステップで３）の工程を開始させる。
    １）被検液中のヘモグロビンを定量する工程、
    ２）被検液に、ＨＬＢ１２以上の下記式（Ｉ）で表される化合物の存在下、ｐＨ５．０～９．５の範囲内で０．１～１００　Ｕ／ｍＬのフルクトシルアミノ酸オキシダーゼを添加し、内因性の糖化アミノ酸および糖化ペプチドを予め消去する工程、
    Ｒ－Ｏ－Ｘ　・・・（Ｉ）
    （Ｒは、炭素数が１２～１６のアルキル基または置換アルキル基であり、Ｘは、ポリオキシエチレン残基である。）
    ３）上記２）の反応液に、ｐＨ５．０～９．５の範囲内で５００～５０００００　Ｕ／
    ｍＬのプロテアーゼを作用させて糖化ヘモグロビンを定量する工程。
  2. 請求項１に記載の方法において、
    　３）の工程でプロテアーゼをＨＬＢ１２以上の上記式（Ｉ）で表される化合物および金属イオンの存在下作用せしめる方法
  3. 請求項１または２に記載の方法において、
    　３）の工程でプロテアーゼをフェロシアン化カリウムおよび／または亜硝酸塩の存在下作用せしめる方法
  4. 　同一反応槽中で、ヘモグロビン、糖化ヘモグロビン、および、糖化ヘモグロビンのヘモグロビンに対する割合のうち少なくとも１つ以上を測定するための試薬であって、以下の（ａ）および（ｂ）を特徴とする試薬。
    （ａ）第一試薬および第二試薬の２つの部分から構成される。
    （ｂ）第一試薬に、ＨＬＢ１２以上の下記式（Ｉ）で表される化合物、及びｐＨ５．０～９．５の範囲で緩衝能を有する緩衝液、０．１～１００　Ｕ／ｍＬのフルクトシルアミノ酸オキシダーゼを含み、第二試薬に、５００～５０００００　Ｕ／ｍＬのプロテアーゼを含む。
    Ｒ－Ｏ－Ｘ　・・・（Ｉ）
    （Ｒは、炭素数が１２～１６のアルキル基または置換アルキル基であり、Ｘは、ポリオキシエチレン残基である。）
  5. 　請求項４に記載の試薬において、
    　第一試薬に糖化ヘモグロビン定量用色素が含まれる試薬。
  6. 請求項４または５に記載の試薬において、
    　第一試薬および第二試薬のいずれかにフェロシアン化カリウムおよび／または亜硝酸塩を含有する試薬。
     
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