JPWO2017195838A1 - 測定対象物質の比較対象物質に対する割合を求める方法、プログラム、記憶媒体及び装置 - Google Patents

測定対象物質の比較対象物質に対する割合を求める方法、プログラム、記憶媒体及び装置 Download PDF

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Abstract

測定対象物質の測定試薬を用いた測定対象物質の比較対象物質に対する割合を求める方法であって、比較対象物質の濃度に依存しない単一の検量線（多重検量線）を用いることで、吸光度の測定値から、測定対象物質の比較対象物質に対する割合を簡単に求めることができる。

Description

本発明は、測定物質の比較対象物質に対する割合の測定技術に関する。
臨床検査で行われる検体検査では、患者から採取した血液、髄液、尿、便、組織や細胞等を対象とした検体中の蛋白質、酵素、電解質、金属イオン、脂質、糖質、ビタミン等の化学物質を測定することで、例えば、臓器の異常、細菌やウイルスなどによる感染の状態を把握することができることから、病気の診断、治療方針の判断及び治療効果の指標を得るための手段として用いられる。
測定対象となる検体中の各種化学物質は、その測定値の基準値に対する多寡がすなわち対象とする臓器の異常を表すため、測定値は濃度で表し、単位として、例えば、ｍｇ／ｄＬやｍｏｌ／Ｌが用いられる。また、酵素やビタミンについては活性値を表し、単位として酵素単位或いは国際単位、例えば、ＩＵ／Ｌが利用される。
測定対象の一つである血糖すなわちグルコースは、糖尿病患者の病態（血糖値が高い状態）を把握するために測定され、その単位には、例えば日本国内ではｍｇ／ｄＬが用いられる。血糖検査では、採血時点における正確な血糖値は把握できるが、血糖値は、常に変動しているため（空腹時の基準値は１１０ｍｇ／ｄＬ未満、食後２時間後の基準値は１４０ｍｇ／ｄＬ未満）、血糖の変動範囲（血糖の状態）を把握することができない。つまり糖尿病患者の治療として行われる血糖コントロールの効果を把握することができない。
そこで、血糖コントロールの効果を把握するために、ある一定期間の血糖の状態を反映する蛋白質の糖化の程度を指標として用いる。指標としては、ＨｂＡ１ｃやグリコアルブミンが用いられる。
まず、ＨｂＡ１ｃについて説明する。Ｈｂ（ヘモグロビン）は赤血球中の色素蛋白質であり、αサブユニット、βサブユニットの各２つからなるヘテロ４量体である。赤血球中のＨｂは、赤血球が体内を循環するうちに、非酵素的、すなわち血糖濃度依存的にグルコースと結合する。こうしてグルコースと結合したＨｂ、糖化ＨｂがすなわちＨｂＡ１である。ＨｂＡ１には、βサブユニットに結合する糖の種類によりいくつかの種類があるが、βサブユニットのＮ末端にグルコースが結合したものがＨｂＡ１ｃであり、採血時点から過去１〜２ヶ月の血糖の状態を反映する指標として用いられる。測定値として、ＨｂＡ１ｃの総Ｈｂに対する割合すなわち相対量、単位として％が用いられる。
次に、グリコアルブミンについて説明する。アルブミンは、血中蛋白質の大部分を占め、血液と共に体内を循環するうちにヘモグロビンの場合と同様に、糖と結合し、糖と結合したアルブミン、糖化アルブミンがすなわちグリコアルブミンである。グリコアルブミンは、採血時点から過去２〜３週間の血糖の状態を反映する指標として用いられる。測定値として、グリコアルブミンの総アルブミンに対する割合つまり相対量、単位として％が用いられる。
ＨｂＡ１ｃやグリコアルブミンの他に、測定値として測定対象物質の比較対象物質に対する割合（相対量）を用いるものとしては、アイソザイム（例えば、乳酸脱水素酵素。その存在する組織、細胞或いは細胞小器官、すなわち由来が異なるアイソザイム）が挙げられる。
また、測定値に測定対象物質の比較対象物質に値する割合を用いるのは、比較対象物質の総量が個人、性別、年齢、罹患している疾患等によって幅があるため、測定対象物質の濃度すなわち単位容積あたりの質量等で表記しても、病態を正確に把握することはできないことが理由である。
ＨｂＡ１ｃを例に説明すると、ヒトの血液中の総Ｈｂ濃度は、男性では１３．１〜１６．６ｇ／ｄＬの範囲であり、女性では１２．１〜１４．６ｇ／ｄＬの範囲である。このように、総Ｈｂ濃度の基準値には男女差、個人差、個体内差がある。また、総Ｈｂ濃度は、貧血症状を引き起こす疾患（鉄欠乏性貧血、再生不良性貧血など）や赤血球増加症、脱水症状などの有無によっても大きく変動する。したがって、仮にＨｂＡ１ｃの濃度で表したとしても、Ｈｂは血糖濃度依存的に糖化されるため、総Ｈｂ濃度を見ない限り、すなわちＨｂＡ１ｃと総Ｈｂ濃度との関係を同時に把握することのできる表示値を用いない限り、血糖の状態を正確に把握することはできない。言い換えると、ＨｂＡ１ｃの濃度は同じでも、総Ｈｂ濃度が高いヒトでは、ＨｂＡ１ｃの総Ｈｂに対する割合は低くなり、総Ｈｂ濃度が低いヒトではＨｂＡ１ｃの総Ｈｂに対する割合は高くなるということである。
測定値として測定対象物質の比較対象物質に対する割合を求める方法として、ＨｂＡ１ｃを例に説明すると、第一の方法としては、ＨＰＬＣを用いる方法が知られており、この方法では、測定対象物質及び比較対象物質のピークの面積から、直接、ＨｂＡ１ｃの総Ｈｂに対する割合を求める。
第二の方法としては、免疫法（凝集法或いは凝集阻止法）が知られており（例えば、特許文献１、２、３参照）、試料中のＨｂＡ１ｃ濃度と総Ｈｂ濃度をそれぞれ求めておいてから、最後にＨｂＡ１ｃの総Ｈｂに対する割合を求める。
具体的には、先ず、試料中のＨｂＡ１ｃとＨｂを変性させ、次に免疫反応を行い、免疫反応により生じる吸光度変化による試料中のＨｂＡ１ｃ濃度と総Ｈｂ濃度をそれぞれ求めておいて、最後にＨｂＡ１ｃの総Ｈｂに対する割合を求める。免疫法としては、凝集法や凝集阻止法が知られている。
第三の方法としては、酵素法が知られており（非特許文献１、２参照）、試料中のＨｂＡ１ｃ濃度と総Ｈｂ濃度をそれぞれ求めておいてから、最後にＨｂＡ１ｃの割合を求める。
具体的には、先ず、試料中のＨｂＡ１ｃとＨｂを変性させ、次に、吸光度から総Ｈｂ濃度を求め、次に、ＨｂＡ１ｃをプロテアーゼ処理して生じたβサブユニットＮ末端由来の糖化ジペプチドにフルクトシルペプチドオキシダーゼ、更にペルオキシダーゼを作用させて発生させる過酸化水素と発色剤とにより生じる発色反応を利用して吸光度を測定することでＨｂＡ１ｃ濃度を求めてから、最後にＨｂＡ１ｃの総Ｈｂに対する割合を求める。
特許第２５９６３２２号公報 特許第３５５０６１４号公報 特許第５４６５００８号公報
Ｃｌｉｎ Ｃｈｅｍ．５１、Ａ２４６、２００５ 生物工学誌 第９２巻、第２号、６２−６８．２０１４
しかしながら、上記第一の方法では、測定装置が大がかりで高価である、消耗部品のカラムが高価であるといった問題がある。また、第二、三の方法では、いずれも吸光度測定値から、先ず複雑な計算式を用いてＨｂＡ１ｃ濃度を求める必要があり、このことは、すなわち、測定時に試薬と検体の比率（容積比）を一定に保つ必要があり、特にＨｂＡ１ｃの総Ｈｂに対する割合を求める場合の実際の測定では、検体の前処理時（溶血処理、希釈処理或いは変性処理時）と測定時の少なくとも二回以上、試薬と検体を混合する工程が含まれるため、試薬及び検体の容積のバラツキが生じやすく、ＨｂＡ１ｃ濃度と総Ｈｂ濃度、ひいてはＨｂＡ１ｃの総Ｈｂに対する割合の信頼性は低くならざるを得ない。
仮に、第二、第三のように免疫法や酵素法を用いる反応系で、試薬と検体の容積比の問題に影響されずに、吸光度測定値から、直接、ＨｂＡ１ｃの総Ｈｂに対する割合を求めようとする場合、上述したように総Ｈｂの濃度は検体毎にバラツキがあるため、総Ｈｂ濃度毎に無数の検量線を用意する必要があり、実際問題として不可能である。
本発明は、上記の事情を鑑み、測定対象物質の比較対象物質に対する割合を求める技術、特に、比較対象物質の濃度が検体によりバラツキがある場合において、吸光度測定値から、直接、測定対象物質の比較対象物質に対する割合を求める技術を提供することを目的とする。
本発明の一観点によれば、測定対象物質の測定試薬を用いた測定対象物質の比較対象物質に対する割合を求める方法であって、比較対象物質の濃度が異なる測定対象物質の希釈系列と、前記測定試薬との反応が進行することで生じる前記測定対象物質の希釈系列それぞれの吸光度変化量を求めて得られる複数の検量線が、一つの検量線に収束するような濃度係数を比較対象物質の濃度毎に求める過程において、
測定対象物質の比較対象物質に対する割合（％）＝［Ｘ］／（濃度係数×比較対象物質の濃度） （１）
を得るステップと、比較対象物質の濃度毎の濃度係数と比較対象物質の濃度との関係をあらわす回帰式を求めるステップとを有する測定対象物質の比較対象物質に対する割合を求める方法が提供される。
前記吸光度変化量を求めるステップは、測定対象物質を含む検体と前記測定試薬とによって生じる反応が進行することによって生じる特徴的な単波長における吸光度の増加或いは減少の変化量を求めるステップ、或いは、測定対象物質を含む検体と前記測定試薬とによって生じる反応が進行することによって生じる特徴的な二波長における吸光度の増加或いは減少の変化量であって吸光度が増加する或いは減少する第１の波長における第１の吸光度と吸光度が増加する或いは減少する第２の波長における第２の吸光度との差或いは比を求めるステップを有する。
前記測定試薬が、免疫法の凝集法や凝集阻止法、或いは酵素法のいずれかを利用する測定試薬であって、前記式（１）、及び、比較対象物質の濃度毎に最適化した濃度係数と比較対象物質の濃度との回帰式と、測定試薬を用いて測定対象物質を含む検体を測定して得る吸光度変化量から、測定対象物質の比較対象物質に対する割合を求めるステップを有する。
本発明は、コンピュータに、上記のいずれか１に記載の方法を実行させるためのプログラムであっても良い。
また、上記プログラムを記録するコンピュータ読み取り可能な記録媒体であっても良い。
また、本発明は、測定対象物質の測定試薬を用いた測定対象物質の比較対象物質に対する割合を求める装置であって、上記のいずれか１に記載の方法を実行させるための制御部と、吸光度測定部と、を有する装置であり、制御部と吸光度測定部とは一体、或いは別体に設けられていることが好ましい。
また、本発明は、上記に記載のプログラムを内蔵する制御部を有する装置であっても良く、上記に記載のプログラムを読み込む制御部を有する装置であっても良い。
また、本発明は、上記に記載の方法を実行して得られた回帰式を内蔵する制御部を有する装置であっても良い。
本発明は、上記に記載の方法を実行して得られた回帰式を読み込む制御部を有する装置であっても良い。
本明細書は本願の優先権の基礎となる日本国特許出願番号２０１６−０９６６８１号の開示内容を包含する。
本発明によれば、測定対象物質の比較対象物質に対する割合をより簡単に求めることができる。
免疫反応〜吸光度測定までの工程の一例を示す図である。 本発明の第１の実施の形態によるＨｂＡ１ｃの総Ｈｂに対する割合の測定技術を模式的に示す図である。 ＨｂＡ１ｃの総Ｈｂに対する割合を測定する測定装置の一構成例を示す機能ブロック図である。 抗原抗体反応による金コロイド凝集の吸収スペクトルを分光光度計で測定した結果の一例を示す図である。横軸が波長、縦軸が吸光度であり、経過時間毎の解析結果（測定結果）が示されている。 図２のデータに基づいて得られる図であり、波長５２５ｎｍにおける吸光度と波長６３０ｎｍにおける吸光度の比率を求め、反応開始時間（時間＝０）からの経過時間依存性を示した図である。 総Ｈｂ濃度ｙと吸光度ｘとの関係を示す図である。 総Ｈｂ濃度が０．５、０．７５、１．０、１．５、２．０、２．５ ｍｇ／ｍＬで、ＨｂＡ１ｃの総Ｈｂに対する割合が３．７〜１５．３％の検体を用いて測定を行った際の反応開始５分後のＨｂＡ１ｃの総Ｈｂに対する割合と波長５２５ｎｍにおける吸光度変化（変化量Δ）をプロットしたグラフである。 横軸を総Ｈｂ濃度×ＨｂＡ１ｃの総Ｈｂに対する割合＝[ｘ１]とした図である。 総Ｈｂ濃度が１．５ｍｇ／ｍＬの時にＦａｃｔｏｒが１．００となり、総Ｈｂ濃度が低くなると高くなり総Ｈｂ濃度が高くなると低くなるように、濃度係数Ｆａｃｔｏｒを設定した図である。 総Ｈｂ濃度毎に濃度係数（Ｆａｃｔｏｒ）を最適化した後の図７Ａの回帰曲線を示す図である。 図７Ｂに示す濃度係数を用いて、［ｘ２］と吸光度変化（変化量Δ）との関係を求めた図である。 図８に基づいて、吸光度変化と［ｘ２］との関係を、総Ｈｂ濃度に依存しないようにして一律に求めた検量線である。 本実施の形態による処理の一例を示すフローチャート図である。 図１０に続く図である。 図１１Ａに続く図であり、測定値算出の手順をまとめたフローチャート図である。 濃度係数Ｆａｃｔｏｒを求める、図１１ＡのステップＳ７の処理例を示すフローチャート図である。 濃度係数Ｆａｃｔｏｒを求める、図１２のステップＳ７−４の処理例を示すフローチャート図である。 総Ｈｂ濃度が０．５、０．７５、１．０、１．５、２．０、２．５ｍｇ／ｍＬで、ＨｂＡ１ｃの総Ｈｂに対する割合が３．７〜１５．３％の検体を用いて測定を行った際の反応開始５分後のＨｂＡ１ｃの総Ｈｂに対する割合と波長５２５ｎｍにおける吸光度と波長６３０ｎｍにおける吸光度の比率、すなわち吸光度比（Ｒａｔｉｏ）をプロットしたグラフである。 横軸を総Ｈｂ濃度×ＨｂＡ１ｃの総Ｈｂに対する割合＝［ｘ１］とした図である。 総Ｈｂ濃度が１．５ｍｇ／ｍＬの時にＦａｃｔｏｒが１．００となり、総Ｈｂ濃度が低くなると高くなり総Ｈｂ濃度が高くなると低くなるように、濃度係数Ｆａｃｔｏｒを設定した図である。 総Ｈｂ濃度毎に濃度係数（Ｆａｃｔｏｒ）を最適化した後の図１６Ａの回帰曲線を示す図である。 図１６Ｂに示す濃度係数Ｆａｃｔｏｒを用いて、[ｘ２]と吸光度比（Ｒａｔｉｏ）との関係を求めた図である。 図１７の縦軸と横軸とを入れ替えた検量線を示す図である。 本発明の第３の実施の形態による、総Ｈｂ濃度が１．０、２．０、２．５ｍｇ／ｍＬで、ＨｂＡ１ｃの総Ｈｂに対する割合が５．７〜１５．３％の検体を用いて測定を行った際の反応開始５分後のＨｂＡ１ｃの総Ｈｂに対する割合と波長５２５ｎｍにおける吸光度変化（変化量Δ）をプロットしたグラフであり、濃度の異なる測定対象物質の希釈系列を３種類とした例を示す図である。 横軸を総Ｈｂ濃度×ＨｂＡ１ｃの総Ｈｂに対する割合＝［ｘ１］とした図である。 Ｈｂ濃度が２．０ｍｇ／ｍＬの時にＦａｃｔｏｒが１．００となり、総Ｈｂ濃度が低くなると高くなり総Ｈｂ濃度が高くなると低くなるように、濃度係数Ｆａｃｔｏｒを設定した図である。 総Ｈｂ濃度毎に濃度係数（Ｆａｃｔｏｒ）を最適化した後の図２１Ａの回帰曲線を示す図である。 図２１Ｂに示す濃度係数を用いて、［ｘ２］と吸光度変化（変化量Δ）との関係を求めた図である。 図２２に基づいて、吸光度変化と［ｘ２］との関係を、総Ｈｂ濃度に依存しないようにして一律に求めた検量線である。
免疫法とは、抗原抗体反応を利用する方法であり、検出原理は、凝集法、凝集阻止法のいずれでもよく、また、抗体或いは抗原を担持させる担体を用いてもよく、用いる抗体としては、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体のいずれでもよく、用いる担体としては、ラテックス、金コロイド、ゼラチン粒子など一般的に用いられる素材のものであれば人工担体素材、天然素材のいずれでもよい。凝集法における吸光度変化は、測定対象物質が存在する場合には凝集反応が生じ、吸光度が上昇するものであり、凝集阻止法では、測定対象物質が存在する場合には凝集反応が阻害されるため、吸光度の上昇が抑制されるというものである。また、吸光度の変化の速度や程度は反応系内における測定対象物質が量に応じて異なる。したがって、本発明においては、免疫法を利用した反応により生じる吸光度の増加或いは減少を吸光度変化量として利用することができる。
酵素法とは、測定対象物を測定するために酵素と発色試薬を利用し、酵素反応の結果生じる発色に特異的な吸光度を測定することで反応を検出するものであり、使用する酵素は、例えば、ＨｂＡ１ｃやグリコアルブミンの総ヘモグロビンや総アルブミンに対する割合を求めるための測定で通常用いられている酵素（例えば、プロテイナーゼ、フルクトシルペプチドオキシダーゼ及びペルオキシダーゼ）であればよく、また、ペルオキシダーゼの基質として一般的に用いられる発色試薬（例えば、４−ＡＡ、ＤＭＡ、ＯＰＤ、ＡＤＯＳ、ＴＢＨＢＡ）であれば何でも使用できる。
吸光度変化量とは、測定対象を測定するために利用する免疫法或いは酵素法において生じる反応に特異的な吸収波長における吸光度測定値であって、例えば、単波長の変化量（Δ値）、二波長（主波長と副波長）の差や比（主波長を分子、副波長を分母とした吸光度比、以下、吸光度比或いはＲａｔｉｏと称す。）のいずれでもよい。二波長を利用する場合の利点としては、電圧の変化による吸光度分析装置のドリフト現象による吸光度測定値への影響を回避できるといったことが挙げられる。
比較対象物質とは、測定対象物を含む物質群であり、例えば、ＨｂＡ１ｃに対してはＨｂ、グリコアルブミンに対してはアルブミン、特定の型のアイソザイムに対しては同じ触媒反応を行う全てのアイソザイムを指す。
また、比較対象物質の濃度の測定方法としては、比較対象物質を測定するための反応により生じる吸光度変化を利用する方法であればよく、例えば、Ｈｂの場合は、Ｈｂに特有の吸光度（例えば、４２０〜４３０ｎｍ、５４０ｎｍ、５７０ｎｍ近傍の吸収波長）の測定値を利用する方法、免疫法（例えば、凝集法、凝集阻止法）による反応で生じる吸光度変化量を利用する方法、或いは、Ｈｂを、例えば、界面活性剤、アジ化ナトリウムやシアン化合物等で処理することで完全に酸化或いは還元した状態にし、酸化或いは還元状態において特有な吸光度の測定値を利用する方法が用いられている。また、アルブミンの場合は、Ｈｂと同様に、免疫法を利用する方法の他に、古典的な方法として、色素結合法（或いは、蛋白誤差法ともいう）を利用して吸光度（発色特異的吸収波長）の測定値を利用する方法が用いられている。色素結合法とは、例えば、ブロムクレゾールパープル、ブロムクレゾールグリーン、pH指示薬が、pH変化とは無関係に、蛋白質の存在によって発色する反応を利用する方法である。
比較対象物質の濃度が異なる測定対象物質の希釈系列は、２種類では、濃度係数の回帰式は２点を結んだ直線にしかなり得ず、その精度は低く、逆にその種類が多ければ多い程、本発明により得られる濃度係数の回帰式の精度は高くなるが、その分、吸光度変化量を求める作業において労力が増えるため実際的でない。したがって、本発明を実施するためには、比較対象物質の濃度が異なる測定対象物質の希釈系列を、少なくとも３種類以上、より好ましくは５種類以上用意すると良い。
また、比較対象物質の濃度や測定対象物質の希釈系列については、測定対象により、また、免疫法や酵素法を利用した測定系により、それぞれの測定範囲に応じて設定すればよい。
発明者らは鋭意検討を行い、次のような手順を踏んで本発明の完成に至った。
先ず、異なる比較対象物質の濃度において、測定対象物質の希釈系列を用意し、それぞれについて、免疫法或いは酵素法を利用する反応により生じる吸光度変化量を求めた。
次に、ｘ軸を比較対象物質の濃度毎に測定して得られた測定対象物質の希釈系列、ｙ軸を吸光度変化量としてプロットした検量線を作成した。例えば、免疫凝集法の場合には、比較対象物質の濃度毎に右肩上がりのシグモイド曲線をとる検量線となる。しかし、そのままでは比較対象物質の濃度毎に測定対象物質の希釈系列と吸光度との関係を示す個々の検量線としてそれぞれ独立して存在するだけで、検量線同士の関係を把握することはできない。
そこで、ｘ軸を［ｘ１］＝比較対象物質の濃度と測定対象物質の比較対象物質に対する割合との積、ｙ軸を測定対象物質の吸光度変化量との関数とすることで、比較対象物質の濃度によらない測定対象物質の絶対量と吸光度変化量との関係が明確化すること、更に、図５ではそれぞれがバラバラに存在していた複数の検量線が、一つの検量線へと収束する傾向が明らかになった。つまり、比較対象物質の濃度依存の小さい第一の検量線が得られることを見出した。
このことは、また、比較対象物質の濃度毎の検量線それぞれにおいて係数を任意の整数、例えば１と設定するとき、それぞれの検量線が一つの検量線へと収束する傾向を示したとも言い換えることができる。
このことから、更に、比較対象物質の濃度毎の検量線それぞれを一つの検量線へと収束させるように、比較濃度対象物質の濃度毎の検量線それぞれに対して最適化した係数（以下、濃度係数、或いは、Ｆａｃｔｏｒと称する）を求めることで、ｘ軸を［ｘ２］＝比較対象物質の濃度と測定対象物質の比較対象物質に対する割合と比較対象物質の濃度毎に求めたそれぞれの濃度係数の積、ｙ軸を吸光度変化量との関数で表したところ、比較対象物質濃度毎の複数の検量線は一本の検量線に収束した。つまり、比較対象物質の濃度への依存が第一の検量線よりも小さい第二の検量線（多重検量線）が得られることを見出した。
更に、ｙ軸を求めた比較対象物質の濃度毎の濃度係数、ｘ軸を比較対象物質の濃度としてプロットすると、これらのプロットは回帰式で表すことができ、また、この回帰式を用いることで、実測値のないプロット間の（総ヘモグロビン濃度における）濃度係数をも求めることが可能となった。
また、［ｘ２］は、すなわち吸光度変化量［Ｘ］であり、吸光度変化量［Ｘ］は、［Ｘ］＝（比較対象物質の濃度）×（測定対象物質の比較対象物質に対する割合）×（比較対象物質の濃度毎に求めた濃度係数)の関係式で表すことができることから、さらに、以下の式で表すことができる。
測定対象物質の比較対象物質に対する割合（％）＝［Ｘ］／（濃度係数×比較対象物質の濃度） （１）
したがって、比較対象物質の濃度を得ること、本発明により求めた濃度係数の回帰式と、式（１）とを用いること、及び、測定対象物質の吸光度変化量を測定することで、直接、測定対象物質の比較対象物質に対する割合を求めることができる。
以下に、本発明のいくつかの実施の形態を、図面を参照しながら、詳細に説明する。但し、本発明はこれらに実施の形態に記載された具体例に限定されない。
また、総Ｈｂ濃度、ＨｂＡ１ｃ、吸光度変化（変化量Δ）或いは吸光度比（Ｒａｔｉｏ）は、具体例として説明したものであり、これらを上位概念で表現とすると、それぞれ、比較対象物質の濃度、測定対象物質、吸光度変化量である。すなわち、以下の説明（図面を含む）における用語は、本発明を限定するものではない。
（第１の実施の形態）
図１Ａは、免疫反応〜吸光度測定までの工程の一例を示す図である。図１Ａ（ａ）に示す担体に抗体が結合している状態において、試料である抗原を添加すると、図１Ａ（ｂ）に示すように、抗原抗体反応が発生する。図１Ａ（ｃ）に示すように、免疫凝集反応が生じた状態で、図１Ａ（ｄ）に示すように吸光度測定を行う。このような一般的な抗原抗体反応と吸光度測定とを利用して、同様にＨｂＡ１ｃの濃度を求めることもできる。また、図では担体に２種類の抗体を担持させて、一種類の抗原と反応する例を示したが、抗原と抗体が逆であってもよい。
以下に、ＨｂＡ１ｃの総Ｈｂに対する割合を求める方法について説明する。
図１Ｂは、本発明の第１の実施の形態によるＨｂＡ１ｃ濃度の測定技術を模式的に示す図であり、図１Ｃは、ＨｂＡ１ｃ濃度の測定装置の一構成例を示す機能ブロック図である。
本実施の一つの形態として、ＨｂＡ１ｃの総Ｈｂに対する割合を求めるための試薬に、抗ＨｂＡ１ｃ抗体および抗ＨｂＡ０抗体を担持させた金コロイドを用いる凝集反応に基づくＨｂＡ１ｃ測定試薬が使用できる。
図１Ｂに示すように、金コロイドを用いる凝集反応では、例えば、ＨｂＡ１ｃを含む検体（血液）１と、抗ＨｂＡ１ｃ抗体および抗ＨｂＡ０抗体による金コロイド凝集反応を生じさせるためのＨｂＡ１ｃ測定試薬２を混合して反応をさせる。ＨｂＡ１ｃ測定試薬２は、抗ＨｂＡ１ｃ抗体を担持させた金コロイド３と、抗ＨｂＡ０抗体を担持させた金コロイド５とを含む。検体１とＨｂＡ１ｃ測定試薬２とにより、検体１中のＨｂＡ１ｃとの抗原抗体反応による凝集塊７の生成を、例えば光学的手法により検出することができる。
金コロイドは、コロイド粒子の表面プラズモン共鳴により呈色し、粒径の変化により色調が変化することが知られており、金コロイドを用いる凝集反応では、これを利用し、凝集塊７の生成を反応液の色調変化（赤色から青色、最終的に金色への変化）、すなわち吸収スペクトルの経時変化として観察、測定することができる。
図１Ｃに示すように、例示的に示す本実施の形態によるＨｂＡ１ｃ濃度の測定装置Ａは、発光部１１と、反応セル１５と、受光部２１と、発光部１１，受光部２１を制御する制御部２３と、を有している。発光部１１からの発光が検体１に照射され、その透過光が受光部２１に受光される。制御部２３により制御される発光と受光との関係に基づいて、検体１の光学的特性を評価することができる。この例では、発光部１１には、発光波長の異なる２つのＬＥＤ１１ａ、１１ｂが設けられている。図２以下では、分光分析を行っているが、実際の装置としては、図１Ｃに示すような簡単な装置を用いることが好ましい。
制御部２３は、比較対象物質の濃度が異なる測定対象物質の希釈系列と、前記測定試薬との反応が進行することで生じる前記測定対象物質の希釈系列それぞれの吸光度変化量を求めて得られる複数の検量線が、一つの検量線に収束するような濃度係数を比較対象物質の濃度毎に求める過程において、
測定対象物質の比較対象物質に対する割合（％）＝［Ｘ］／（濃度係数×比較対象物質の濃度） （１）
を得る第１処理部２３ａ（図１１Ｂ等参照）と、比較対象物質の濃度毎の濃度係数と比較対象物質の濃度との関係をあらわす回帰式を求める第２処理部２３ｂ（図１２等参照）とを有する。
第１処理部２３ａと第２処理部２３ｂとの処理の詳細については、後述する。
尚、測定装置は、吸光度測定（分光分析装置）ができるものであればよく、光源は、ＬＥＤや特定の二波長に限定されるものではない。
図２は、抗体を担持させた金コロイド凝集反応の吸収スペクトルを分光光度計で測定した結果の一例を示す図である。横軸が波長、縦軸が吸光度であり、経過時間毎の解析結果（測定結果）が示されている。
図２に示すように、検体と試薬とを用いて反応させた試料に照射した光の波長５２５ｎｍ付近の吸光度の減少および試料に照射した光の６３０ｎｍ付近の吸光度の上昇がみられた。この吸光度の変化は、金コロイド凝集反応に起因するものであり、吸光度は、凝集度合いの目安になる。
波長５２５ｎｍ付近は、金コロイド凝集反応の経時変化において吸光度が低下する波長範囲内であれば、この波長に限定されない。また、波長６３０ｎｍ付近は、金コロイド凝集反応の経時変化において吸光度が上昇する波長範囲内であれば、この波長に限定されない。
従って、この吸光度の変化（減少、増加の少なくともいずれか一方）に基づいて、ＨｂＡ１ｃの量を求めることができる。但し、吸光度の経時変化の変化量（絶対値）が微少である場合、例えば、アンプなどを用いて信号を増幅し、吸光度の経時変化を精度良く求めることもできる。或いは、２つの波長を利用する方法も考えられる。
例えば、図３は、図２のデータに基づいて得られる図であり、波長５２５ｎｍにおける吸光度と波長６３０ｎｍにおける吸光度の比率、吸光度５２５ｎｍ／吸光度６３０ｎｍ（以下、「吸光度比（Ｒａｔｉｏ）」と称する。）を求め、反応開始時間（時間＝０）からの経過時間依存性を示した図である。図３に示すように、吸光度の経時的な減少（吸光度比（Ｒａｔｉｏ）の減少速度）は、ＨｂＡ１ｃ濃度に依存することがわかる。
尚、この場合も、波長５２５ｎｍ付近は、金コロイド凝集反応の経時変化において吸光度が低下する波長範囲内であれば、測定波長はこの波長に限定されない。また、波長６３０ｎｍ付近は、金コロイド凝集反応の経時変化において吸光度が大きくなる波長範囲内であれば、これらの波長に限定されるものではない。
図３より、吸光度比（Ｒａｔｉｏ）の経時変化が顕著に観測できるため、吸光度比（Ｒａｔｉｏ）を用いることで、測定対象であるＨｂＡ１ｃの総Ｈｂに対する割合を簡単に計測することができる可能性があることが理解できる。
測定対象であるＨｂＡ１ｃの総Ｈｂに対する割合は、赤血球中に含まれる総Ｈｂに占める安定型β鎖ｍｏｎｏｇｌｙｃａｔｅｄ Ｈｂ（Ｈｂのβ鎖にグルコースが１分子安定的に結合したＨｂ）の割合で定義される。従って、ＨｂＡ１ｃの総Ｈｂに対する割合を算出するためには、分母となる総Ｈｂ濃度の算出も必要である。
そこで、この点も考慮したＨｂＡ１ｃの総Ｈｂに対する割合の測定技術について、以下に詳細に説明する。
（溶血希釈後の総Ｈｂ濃度測定）
図１０は、本実施の形態による処理の一例を示すフローチャート図である。
まず、検体の前処理として、全血を溶血（赤血球を崩壊させてＨｂを血球外に溶出させる処理）させる（ステップＳ１）。
次いで、総Ｈｂ濃度測定用検量線を、以下のようにして作成した。
溶血に用いた前処理液を希釈液として使用し、段階希釈したＨｂ濃度が既知（終濃度０．５〜２．５ｍｇ／ｍＬ）のキャリブレーターを測定した際の波長４０５ｎｍにおける吸光度を測定する（ステップＳ２）。Ｈｂの特徴的な吸収波長（付近）である４０５ｎｍにおける吸光度を横軸、既知の総Ｈｂ濃度を縦軸にとった。
図４は、総Ｈｂ濃度ｙと吸光度ｘとの関係を示す図であり、この相関図から、総Ｈｂ濃度測定用検量線を求めることができる。
以下の式で表され図４に例示される検量線が求められ（ステップＳ３）、この例では、３次回帰線となっている。
ｙ＝２０１．６７ｘ３＋４７．６５ｘ２＋１５．０５９ｘ−０．３４０９、Ｒ２＝０．９９７３ （２）
この検量線により、総Ｈｂ濃度を求めることができる（ステップＳ４）。
（ＨｂＡ１ｃの定量測定）
総Ｈｂ濃度は、単純な吸光度測定により測定することが可能である。しかしながら、抗原抗体反応によるＨｂＡ１ｃ定量測定は、抗原と抗体との量的バランスの中で行われる。また、上記のように、ＨｂＡ１ｃの濃度(すなわち、測定反応系内のＨｂＡ１ｃの絶対量)は可変値である総Ｈｂ濃度によっても変動する。
そこで、以下のように、総Ｈｂ濃度が０．５、０．７５、１．０、１．５、２．０、２．５ｍｇ／ｍＬで、ＨｂＡ１ｃの総Ｈｂに対する割合が３．７〜１５．３％の検体を用いて測定を行った。
図５は、反応開始５分後のＨｂＡ１ｃの総Ｈｂに対する割合と波長５２５ｎｍにおける吸光度変化（変化量Δ）をプロットしたグラフである。図５に示すように、ＨｂＡ１ｃの総Ｈｂに対する割合と吸光度変化との間に測定反応系内のＨｂＡ１ｃの絶対量への依存が認められる。吸光度変化は、測定反応系内のＨｂＡ１ｃの絶対量に依存しているため、同一のＨｂＡ１ｃの総Ｈｂに対する割合でも総Ｈｂ濃度によって異なる吸光度変化を示すことがわかる。
図５における横軸はＨｂＡ１ｃの総Ｈｂに対する割合であるが、図５をみればわかるように、ＨｂＡ１ｃの総Ｈｂに対する割合に対する吸光度変化（変化量Δ）は、所定のＨｂＡ１ｃ範囲（図では、６％から１２％程度）で、総Ｈｂ濃度にほぼ比例するようになっていることがわかる。
図５より、ＨｂＡ１ｃの総Ｈｂに対する割合を決定する（図１０、ステップＳ５）。
以上に説明したように、本実施の形態では、図５に示すような総Ｈｂ濃度に依存する検量線に基づいて、吸光度変化（変化量Δ）に依存するＨｂＡ１ｃの総Ｈｂに対する割合を求めることができる。
尚、このような検量線として、後述する図１４に示す検量線を用いることもできる。
（第２の実施の形態）
以下、本発明の第２の実施の形態について詳細に説明する。
第１の実施の形態では、図５のように、総Ｈｂ濃度毎に網羅的に検量線を設定する必要があり、ＨｂＡ１ｃの濃度決定のための処理が煩雑になる。
以下に、上記のような課題を解決するための第１の実施の形態のステップＳ５に代えて行う処理方法について詳細に説明する。
本実施の形態では、吸光度変化（変化量Δ）、例えば、波長５２５ｎｍ（図２参照）における吸光度の経時変化に基づく手法について説明する。
図５は、第１の実施の形態でも説明したように、反応開始５分後のＨｂＡ１ｃ濃度と波長５２５ｎｍにおける吸光度変化（変化量Δ）をプロットしたグラフである。図５に示すように、吸光度変化がＨｂＡ１ｃの総Ｈｂに対する割合に依存する関係が認められる。吸光度変化（変化量Δ）は、ＨｂＡ１ｃの濃度（測定反応系内のＨｂＡ１ｃの絶対量）に依存しているため、同一のＨｂＡ１ｃの割合であっても総Ｈｂ濃度によって異なる吸光度変化を示すことがわかる。
図１１Ａは、図１０に続く図である。
まず、図５における横軸はＨｂＡ１ｃの総Ｈｂに対する割合であるが、図５にみられるように、ＨｂＡ１ｃの総Ｈｂに対する割合に対する吸光度変化（変化量Δ）は、総Ｈｂ濃度にほぼ比例するようになっていることがわかる。
ここで、図６に示すように、横軸を総Ｈｂ濃度×ＨｂＡ１ｃの総Ｈｂに対する割合＝［ｘ１］とすると、図５では総Ｈｂ濃度に大きく依存していた吸光度変化（変化量Δ）とＨｂＡ１ｃの割合の関係が、吸光度変化（変化量Δ）と［ｘ１］とは１つの関係として収束していく傾向を有することがわかった。［ｘ１］は、総Ｈｂ濃度×ＨｂＡ１ｃの総Ｈｂに対する割合であり、総Ｈｂ濃度を考慮した第１のＨｂＡ１ｃ濃度と言うことができる。
但し、図６に示すように、吸光度変化（変化量Δ）が大きい［ｘ１］の範囲においては、総Ｈｂ濃度依存が残っており収束があまり良くないことがわかる。そこで、図６の収束が良くなるように、すなわち、吸光度変化（変化量Δ）と［ｘ１］との関係が総Ｈｂ濃度に依存せずに相関性が高くなるように、総Ｈｂ濃度に依存する補正係数（濃度係数：Ｆａｃｔｏｒ）をもたせた。
ここでは、例示的に図７Ａに示すように、総Ｈｂ濃度が１．５０ｍｇ／ｍＬの時にＦａｃｔｏｒが１．００となり、総Ｈｂ濃度が低くなると高くなり総Ｈｂ濃度が高くなると低くなるように、濃度係数Ｆａｃｔｏｒを設定した（ステップＳ６）。
そして、図６に関して、横軸を、［ｘ２］＝総Ｈｂ濃度×Ｆａｃｔｏｒ×ＨｂＡ１ｃの総Ｈｂに対する割合＝濃度係数Ｆａｃｔｏｒ×［ｘ１］とする。そして、吸光度変化（変化量Δ）と［ｘ２］との関係が１つに収束するように、総Ｈｂ濃度毎に濃度係数Ｆａｃｔｏｒを求める（ステップＳ７）。
すると、図７Ｂに示すように、Ｈｂ濃度に関してほぼ単調減少となる濃度係数Ｆａｃｔｏｒを求めることができる。
図７Ｂは、総Ｈｂ濃度ｙと濃度係数ｚとの回帰曲線を示す図であり、以下の回帰式で表すことができる。この例では、３次回帰式となっている。
ｙ＝−０．１８９２ｚ３＋１．０１４ｚ２−２．０７２９ｚ＋２．４９２、Ｒ２＝０．９７９２ （３）
この回帰式により、総Ｈｂ濃度から、その総Ｈｂ濃度における濃度係数を求めることができる。
図８は、図７Ｂに示す濃度係数Ｆａｃｔｏｒを用いて、［ｘ２］と吸光度変化（変化量Δ）との関係を求めた図である。図８に示すように、［ｘ２］の全ての範囲において、総Ｈｂ濃度に依存しない［ｘ２］と吸光度変化（変化量Δ）との関係を求めることができる。
［ｘ２］は、総Ｈｂ濃度×ＨｂＡ１ｃの総Ｈｂに対する割合×濃度係数（Ｆａｃｔｏｒ）であり、総Ｈｂ濃度とその濃度係数とを考慮した第２のＨｂＡ１ｃの総Ｈｂに対する割合と言うことができる。
また、図８のｘ軸とｙ軸とを入れ替えると、図９に示すように、吸光度変化（変化量Δ）と［ｘ２］との関係を、総Ｈｂ濃度に依存しないようにして一律に求めることができる（ステップＳ８）。
すなわち、図９に示す検量線を用いることで、下記の式（４）より、ＨｂＡ１ｃの総Ｈｂに対する割合を従来よりも簡単な処理によって求めることができる。［ｘ２］は、すなわち吸光度変化量［Ｘ］である。
Figure 2017195838
以上のように、本実施の形態によれば、検量線を１つとして、ＨｂＡ１ｃの濃度を簡単に求めることができる。
尚、濃度係数Ｆａｃｔｏｒは、試薬に依存するため、異なるロットの試薬を用いる場合には、図７Ｂの関係を新たに求めることが好ましい。
図１２、図１３は、濃度係数Ｆａｃｔｏｒを求める、上記図１１ＡのＳ７の処理例を示すフローチャート図である。
まず、ステップＳ７−１において、異なる総Ｈｂ濃度毎にＨｂＡ１ｃの希釈系列（希釈した試料）について吸光度を測定する。
ステップＳ７−２において、全ての希釈系列について、測定した吸光度から吸光度変化として吸光度変化（変化量Δ）、或いは、第３の実施の形態において後述する吸光度比（Ｒａｔｉｏ）を求める。
ステップＳ７−３において、異なる総Ｈｂ濃度それぞれの濃度係数Ｆａｃｔｏｒをすべて任意の整数に固定するとき、［ｘ２］と吸光度変化量、或いは、吸光度比（Ｒａｔｉｏ）のＲ２を求める。
ステップＳ７−４において、異なる総Ｈｂ濃度毎に濃度係数Ｆａｃｔｏｒを最適化する。
最適化の手順は、図１３を参照して例示する。
ステップＳ７−５において、総Ｈｂ濃度と濃度係数Ｆａｃｔｏｒのｎ次回帰式を作成する。この図が、例えば図７Ｂである。
図１３に示すように、ステップＳ７−４における、異なる総Ｈｂ濃度毎に濃度係数Ｆａｃｔｏｒを最適化する処理について以下に説明する。
図１３において、一巡目、すなわち、ｎ＝１においては、以下の通りである。
ステップＳ２１−１： 最適化対象の総Ｈｂ濃度以外のそれぞれの濃度における濃度係数Ｆａｃｔｏｒを任意の整数に固定し、最適化対象の総Ｈｂ濃度において［ｘ］と吸光度変化（変化量Δ）或いは吸光度比（Ｒａｔｉｏ）のＲ２が最大になる濃度係数Ｆａｃｔｏｒを求める。
ステップＳ２１−２： ステップＳ２１−１で最適化対象とした濃度において求めた濃度係数Ｆａｃｔｏｒを用い、新たに最適化対象とする濃度を除いた残りの各濃度における濃度係数ＦａｃｔｏｒをステップＳ２１−１で用いた任意の整数に固定し、最適化対象の総Ｈｂ濃度において、［ｘ］と吸光度変化（変化量Δ）或いは吸光度比（Ｒａｔｉｏ）のＲ２が最大になる濃度係数Ｆａｃｔｏｒを求める。
ステップＳ２１−３： ステップＳ２１−１、２で最適化対象としたそれぞれの濃度において求めたＦａｃｔｏｒを用い、新たに最適化対象とする濃度を除いた残りの各濃度におけるＦａｃｔｏｒにステップＳ２１−１で用いた任意の整数に固定して、最適化対象の総Ｈｂ濃度において［ｘ］と吸光度変化（変化量Δ）或いは吸光度比（Ｒａｔｉｏ）のＲ２が最大になる濃度係数Ｆａｃｔｏｒを求める。
ステップＳ２１−４以降： 残りの各濃度についても、順次、同様に、前のステップで求めた濃度係数Ｆａｃｔｏｒを用いて、各濃度において［ｘ］と吸光度変化(変化量Δ)或いは吸光度比（Ｒａｔｉｏ）のＲ２が最大になる濃度係数Ｆａｃｔｏｒを求める。
二巡目以降、すなわち、ｎ≧２においては、以下の処理を行う。
ステップＳ２２−１： 最適化対象の総Ｈｂ濃度以外のそれぞれの濃度における濃度係数Ｆａｃｔｏｒに一巡前で求めたそれぞれの濃度係数Ｆａｃｔｏｒを用い、最適化対象の総Ｈｂ濃度において［ｘ］と吸光度変化（変化量Δ）或いは吸光度比（Ｒａｔｉｏ）のＲ２が最大になる濃度係数Ｆａｃｔｏｒを求める。
ステップＳ２２−２： ステップＳ２２−１で最適化対象とした濃度においては求めた濃度係数Ｆａｃｔｏｒを用い、新たに最適化対象とする濃度を除いた残りの各濃度における濃度係数Ｆａｃｔｏｒに一巡前で求めたそれぞれの濃度係数Ｆａｃｔｏｒを用い、最適化対象の総Ｈｂ濃度において［ｘ］と吸光度変化（変化量Δ）或いは吸光度比（Ｒａｔｉｏ）のＲ２が最大になる濃度係数Ｆａｃｔｏｒを求める。
ステップＳ２２−３： ステップＳ２２−１、ステップＳ２２−２で対象としたそれぞれの濃度において求めた濃度係数Ｆａｃｔｏｒを用い、新たに最適化対象とする濃度を除いた残りの各濃度における濃度係数Ｆａｃｔｏｒに一巡前で求めた各濃度におけるそれぞれの濃度係数Ｆａｃｔｏｒを用いて、最適化対象の総Ｈｂ濃度において、［ｘ］と吸光度変化（変化量Δ）或いは吸光度比（Ｒａｔｉｏ）のＲ２が最大になる濃度係数Ｆａｃｔｏｒを求める。
ステップＳ２２−４以降： 残りの各濃度についても、順次、同様に、前のステップで求めた濃度係数Ｆａｃｔｏｒを用いて、各濃度において［ｘ］と吸光度変化（変化量Δ）或いは吸光度比（Ｒａｔｉｏ）のＲ２が最大になる濃度係数Ｆａｃｔｏｒを求める。
ステップＳ２２−１からステップＳ２２−４の処理を繰り返す。
ステップＳ２３において、最終ステップとして、各総Ｈｂ濃度における濃度係数Ｆａｃｔｏｒが一巡前の値と同じになるとき、Ｆａｃｔｏｒの最適化処理は終了する。
以上のように、異なる総Ｈｂ濃度毎に濃度係数Ｆａｃｔｏｒの最適化処理を行っていき、図７Ｂに示すような濃度係数ＦａｃｔｏｒがＨｂ濃度に依存する関係を求めることができる。尚、図１２、１３に示した最適化手法以外の手法であっても、異なる総Ｈｂ濃度毎に濃度係数Ｆａｃｔｏｒを最適化できる処理であれば利用できる。
以下に測定値算出の手順をまとめる。
図１１Ｂは、図１１Ａに続く図であり、測定値算出の手順をまとめたフローチャート図である。
１）総Ｈｂ濃度を測定する（検量線：吸光度４０５ｎｍ ｖｓ 総Ｈｂ濃度）（ステップＳ１１）。
２）ＨｂＡ１ｃを含む試料の金コロイド凝集反応による吸光度変化量（本実施の形態では吸光度変化（変化量Δ））を測定する（ステップＳ１２）。
３）１）（ステップＳ１１）で得られた総Ｈｂ濃度と、総Ｈｂ濃度と濃度係数の関係を表す回帰式（３）からＦａｃｔｏｒを算出する（検量線：総Ｈｂ濃度 ｖｓ Ｆａｃｔｏｒ）（ステップＳ１３）。
４）上記の式（４）に各値を代入し、ＨｂＡ１ｃの総Ｈｂに対する割合を算出する（ステップＳ１４）。
以上のようにして、本実施の形態によれば、総Ｈｂ濃度に依存しない単一の検量線（多重検量線）を用いることで、吸光度の測定値から、ＨｂＡ１ｃの総Ｈｂに対する割合を簡単に求めることができる。
以上のように、ＨｂＡ１ｃの総Ｈｂに対する割合 ｖｓ 吸光度変化量は総Ｈｂ濃度毎に独立した曲線を描くが、本実施の形態によれば、総Ｈｂ濃度依存的な係数Ｆａｃｔｏｒを設定すると、総Ｈｂ濃度によらず吸光度変化量ｖｓ［Ｘ］は１本の曲線に収束する。従って、総Ｈｂ濃度毎に何本も網羅的に検量線を作成しなくてもＨｂＡ１ｃの総Ｈｂに対する割合の測定が可能となる。
（第３の実施の形態）
以下、本発明の第３の実施の形態について詳細に説明する。
本実施の形態では、吸光度変化の指標として吸光度比（吸光度５２５ｎｍ／吸光度６３０ｎｍ）を変数として、ＨｂＡ１ｃの濃度を求めるための検量線を求めた。
図１４は、総Ｈｂ濃度が０．５、０．７５、１．０、１．５、２．０、２．５ｍｇ／ｍＬで、ＨｂＡ１ｃの総Ｈｂに対する割合が３．７〜１５．３％の検体を用いて測定を行った際の反応開始５分後のＨｂＡ１ｃの総Ｈｂに対する割合と波長５２５ｎｍにおける吸光度と波長６３０ｎｍにおける吸光度の比率、すなわち吸光度比（Ｒａｔｉｏ）をプロットしたグラフである。
まず、図１４における横軸はＨｂＡ１ｃの総Ｈｂに対する割合であるが、図１４をみればわかるように、ＨｂＡ１ｃの総Ｈｂに対する割合に対する吸光度比（Ｒａｔｉｏ）は、総Ｈｂ濃度にほぼ反比例するようになっていることがわかる。
そこで、図１５に示すように、横軸を総Ｈｂ濃度×ＨｂＡ１ｃの総Ｈｂに対する割合＝［ｘ１］とすると、図５では総Ｈｂ濃度に大きく依存していた吸光度比（Ｒａｔｉｏ）とＨｂＡ１ｃの総Ｈｂに対する割合と関係が、吸光度比（Ｒａｔｉｏ）と［ｘ１］とは１つの関係として収束していく傾向を有することがわかった。［ｘ１］は、総Ｈｂ濃度×ＨｂＡ１ｃの総Ｈｂに対する割合であり、総Ｈｂ濃度を考慮した第１のＨｂＡ１ｃの総Ｈｂに対する割合と言うことができる。
但し、図１５に示すように、吸光度比（Ｒａｔｉｏ）の変化が大きい[ｘ１]の範囲においては、総Ｈｂ濃度依存が残っており収束があまり良くないことがわかる。そこで、図１５の収束が良くなるように、すなわち、吸光度比（Ｒａｔｉｏ）と[ｘ１]との関係が総Ｈｂ濃度に依存せずに相関性が高くなるように、第２の実施の形態と同様に総Ｈｂ濃度に依存する補正係数（濃度係数：Ｆａｃｔｏｒ）をもたせた。
ここでは、例示的に図１６Ａに示すように、総Ｈｂ濃度が１．５０ｍｇ／ｍＬの時にＦａｃｔｏｒが１．００となり、総Ｈｂ濃度が低くなると高くなり、総Ｈｂ濃度が高くなると低くなるように、濃度係数Ｆａｃｔｏｒを設定した（図１１Ａ、ステップＳ６）。
そして、図１５に関して、横軸を、［ｘ２］＝総Ｈｂ濃度×Ｆａｃｔｏｒ×ＨｂＡ１ｃの総Ｈｂに対する割合＝濃度係数Ｆａｃｔｏｒ×［ｘ１］とする。そして、吸光度比（Ｒａｔｉｏ）と［ｘ２］との関係が１つに収束するように、濃度係数Ｆａｃｔｏｒを求める（図１１Ａ、ステップＳ７）。
すると、図１６Ｂに示すように、Ｈｂ濃度に関して単調減少となる濃度係数Ｆａｃｔｏｒを求めることができる。
図１６Ｂは、総Ｈｂ濃度ｙと濃度係数ｚとの回帰曲線を示す図であり、以下の回帰式で表すことができる。この例では、３次回帰式となっている。
ｙ＝−０．０８７１ｚ３＋０．５８１９ｚ２−１．５０８ｚ＋２．２１８５、Ｒ２＝０．９９８４ （５）
この回帰式により、総Ｈｂ濃度から、その総Ｈｂ濃度における濃度係数を求めることができる。
図１７は、図１６Ｂに示す濃度係数Ｆａｃｔｏｒを用いて、［ｘ２］と吸光度比Ｒａｔｉｏとの関係を求めた図である。図１７に示すように、［ｘ２］の全ての範囲において、総Ｈｂ濃度に依存しない［ｘ２］と吸光度比（Ｒａｔｉｏ）との関係を求めることができる。
［ｘ２］は、総Ｈｂ濃度×ＨｂＡ１ｃの総Ｈｂに対する割合×濃度係数（Ｆａｃｔｏｒ）であり、総Ｈｂ濃度とその濃度係数とを考慮した第２のＨｂＡ１ｃの総Ｈｂに対する割合と言うことができる。
また、図１７のｘ軸とｙ軸とを入れ替えると、図１８に示すように、吸光度比（Ｒａｔｉｏ）と［ｘ２］との関係を、総Ｈｂ濃度に依存しないようにして一律に求めることができる（図１１Ａ、ステップＳ８）。
すなわち、図１８に示す検量線を用いることで、下記の式（６）より、ＨｂＡ１ｃの濃度を従来よりも簡単な処理によって求めることができる。[ｘ２]は、すなわち吸光度変化量[Ｘ]である。
Figure 2017195838
本実施の形態においては、吸光度変化量として吸光度比（Ｒａｔｉｏ）をパラメータとして用いたため、吸光度の変化量が小さい場合でも、変化量を大きくして検量線を作成することができる。また、ＨｂＡ１ｃの総Ｈｂに対する割合を精度良く測定することができる。
１）総Ｈｂ濃度を測定する（検量線：吸光度４０５ｎｍ ｖｓ 総Ｈｂ濃度）（図１１Ｂ、ステップＳ１１）。
２）ＨｂＡ１ｃを含む試料の金コロイド凝集反応による吸光度変化量として吸光度比（Ｒａｔｉｏ）を測定する（図１１Ｂ、ステップＳ１２）。
３）１）（図１１Ｂ、ステップＳ１１）で得られた総Ｈｂ濃度と、総Ｈｂ濃度と濃度係数の関係を表す回帰式（５）からＦａｃｔｏｒを算出する（検量線：総Ｈｂ濃度 ｖｓ Ｆａｃｔｏｒ）（図１１Ｂ、ステップＳ１３）。
４）上記の式（６）に各値を代入し、ＨｂＡ１ｃの総Ｈｂに対する割合を算出する（図１１Ｂ、ステップＳ１４）。
以上のようにして、本実施の形態によれば、総Ｈｂ濃度に依存しない単一の検量線（多重検量線）を用いることで、吸光度の測定値から、ＨｂＡ１ｃの総Ｈｂに対する割合を簡単に求めることができる。
以上のように、ＨｂＡ１ｃの総Ｈｂに対する割合 ｖｓ 吸光度変化量は総Ｈｂ濃度毎に独立した曲線を描くが、本実施の形態によれば、総Ｈｂ濃度依存的な係数Ｆａｃｔｏｒを設定すると、総Ｈｂ濃度によらず吸光度変化量ｖｓ［Ｘ］は１本の曲線に収束する。従って、総Ｈｂ濃度毎に何本も網羅的に検量線を作成しなくてもＨｂＡ１ｃの総Ｈｂに対する割合の測定が可能となる。
（第４の実施の形態）
第２の実施の形態と同様に、本発明の第４の実施の形態では、吸光度の変化（変化量Δ）、例えば、波長５２５ｎｍ（図２参照）における吸光度の経時変化に基づく手法について説明する。但し、濃度の異なる測定対象物質の希釈系列を３種類とした例を示している。
図１９は、総Ｈｂ濃度が１．０、２．０、２．５ ｍｇ／ｍＬで、ＨｂＡ１ｃの総Ｈｂに対する割合が５．７〜１５．３％の検体を用いて測定を行った際の反応開始５分後のＨｂＡ１ｃの総Ｈｂに対する割合と波長５２５ｎｍにおける吸光度変化（変化量Δ）をプロットしたグラフである。
まず、図１９における横軸はＨｂＡ１ｃの総Ｈｂに対する割合であるが、図１９にみられるように、ＨｂＡ１ｃの総Ｈｂに対する割合に対する吸光度変化（変化量Δ）は、総Ｈｂ濃度にほぼ比例するようになっていることがわかる。
そこで、図２０に示すように、横軸を総Ｈｂ濃度×ＨｂＡ１ｃの総Ｈｂに対する割合＝［ｘ１］とすると、図１９では総Ｈｂ濃度に大きく依存していた吸光度変化（変化量Δ）とＨｂＡ１ｃの総Ｈｂに対する割合との関係が、吸光度変化（変化量Δ）と［ｘ１］とは１つの関係として収束していく傾向を有することがわかった。［ｘ１］は、総Ｈｂ濃度×ＨｂＡ１ｃの総Ｈｂに対する割合であり、総Ｈｂ濃度を考慮した第１のＨｂＡ１ｃの総Ｈｂに対する割合と言うことができる。
但し、図２０に示すように、吸光度変化（変化量Δ）が大きい［ｘ１］の範囲においては、総Ｈｂ濃度依存が残っており収束があまり良くないことがわかる。そこで、図２０の収束が良くなるように、すなわち、吸光度変化（変化量Δ）と［ｘ１］との関係が総Ｈｂ濃度に依存せずに相関性が高くなるように、第２、３の実施の形態と同様に総Ｈｂ濃度に依存する補正係数（濃度係数：Ｆａｃｔｏｒ）をもたせた。
ここでは、例示的に図２１Ａに示すように、総Ｈｂ濃度が２．００ｍｇ／ｍＬの時にＦａｃｔｏｒが１．００となり、総Ｈｂ濃度が低くなると高くなり、総Ｈｂ濃度が高くなると低くなるように、濃度係数Ｆａｃｔｏｒを設定した（図１１Ａ、ステップＳ６）。
そして、図２０に関して、横軸を、［ｘ２］＝総Ｈｂ濃度×Ｆａｃｔｏｒ×ＨｂＡ１ｃの総Ｈｂに対する割合＝濃度係数Ｆａｃｔｏｒ×［ｘ１］とする。そして、吸光度変化（変化量Δ）と[ｘ２]との関係が１つに収束するように、濃度係数Ｆａｃｔｏｒを求める（図１１Ａ、ステップＳ７）。
すると、図２１Ｂに示すように、Ｈｂ濃度に関して単調減少となる濃度係数Ｆａｃｔｏｒを求めることができる。
図２１Ｂは、総Ｈｂ濃度ｙと濃度係数ｚとの回帰曲線を示す図であり、以下の回帰式で表すことができる。この例では、２次回帰式となっている。
ｙ＝０．１８ｚ２−０．９３ｚ＋２．１８、Ｒ２＝１ （７）
この回帰式により、総Ｈｂ濃度から、その総Ｈｂ濃度における濃度係数を求めることができる。
図２２は、図２１Ｂに示す濃度係数Ｆａｃｔｏｒを用いて、［ｘ２］と吸光度変化（変化量Δ）との関係を求めた図である。図２２に示すように、［ｘ２］の全ての範囲において、総Ｈｂ濃度に依存しない［ｘ２］と吸光度変化（変化量Δ）との関係を求めることができる。
［ｘ２］は、総Ｈｂ濃度×ＨｂＡ１ｃの総Ｈｂに対する割合×濃度係数（Ｆａｃｔｏｒ）であり、総Ｈｂ濃度とその濃度係数とを考慮した第２のＨｂＡ１ｃの総Ｈｂに対する割合と言うことができる。
また、図２２のｘ軸とｙ軸とを入れ替えると、図２３に示すように、吸光度変化（変化量Δ）と［ｘ２］との関係を、総Ｈｂ濃度に依存しないようにして一律に求めることができる（図１１Ａ、ステップＳ８）。
すなわち、図２２に示す検量線を用いることで、下記の式（８）より、ＨｂＡ１ｃの濃度を従来よりも簡単な処理によって求めることができる。［ｘ２］は、すなわち吸光度変化（変化量Δ）［Ｘ］である。
Figure 2017195838
以上のようにして、本実施の形態によれば、濃度の異なる測定対象物質の希釈系列を３種類として求めた総Ｈｂ濃度に依存しない単一の検量線（多重検量線）を用いることで、吸光度の測定値から、ＨｂＡ１ｃの総Ｈｂに対する割合を簡単に求めることができる。
１）総Ｈｂ濃度を測定する（検量線：吸光度４０５ｎｍ ｖｓ 総Ｈｂ濃度）（図１１Ｂ、ステップＳ１１）。
２）ＨｂＡ１ｃを含む試料の金コロイド凝集反応による吸光度変化量（本実施の形態では吸光度変化（変化量Δ））を測定する（図１１Ｂ、ステップＳ１２）。
３）１）（図１１Ｂ、ステップＳ１１）で得られた総Ｈｂ濃度と、総Ｈｂ濃度と濃度係数の関係を表す回帰式（７）からＦａｃｔｏｒを算出する（検量線：総Ｈｂ濃度 ｖｓ Ｆａｃｔｏｒ）（図１１Ｂ、ステップＳ１３）。
４）上記の式（８）に各値を代入し、ＨｂＡ１ｃの総Ｈｂに対する割合を算出する（図１１Ｂ、ステップＳ１４）。
以上のように、ＨｂＡ１ｃの総Ｈｂに対する割合 ｖｓ 吸光度変化量は総Ｈｂ濃度毎に独立した曲線を描くが、本実施の形態によれば、総Ｈｂ濃度依存的な係数Ｆａｃｔｏｒを設定すると、総Ｈｂ濃度によらず吸光度変化量ｖｓ［Ｘ］は１本の曲線に収束する。従って、総Ｈｂ濃度毎に何本も網羅的に検量線を作成しなくてもＨｂＡ１ｃの総Ｈｂに対する割合の測定が可能となる。
処理および制御は、ＣＰＵ（Ｃｅｎｔｒａｌ Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ Ｕｎｉｔ）やＧＰＵ（Ｇｒａｐｈｉｃｓ Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ Ｕｎｉｔ）によるソフトウェア処理、ＡＳＩＣ（Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ Ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ Ｃｉｒｃｕｉｔ）やＦＰＧＡ（Ｆｉｅｌｄ Ｐｒｏｇｒａｍｍａｂｌｅ Ｇａｔｅ Ａｒｒａｙ）によるハードウェア処理によって実現することができる。
また、上記の実施の形態において、添付図面に図示されている構成等については、これらに限定されるものではなく、本発明の効果を発揮する範囲内で適宜変更することが可能である。その他、本発明の目的の範囲を逸脱しない限りにおいて適宜変更して実施することが可能である。
また、本発明の各構成要素は、任意に取捨選択することができ、取捨選択した構成を具備する発明も本発明に含まれるものである。
例えば、吸光度測定部と制御部とが一体の装置であっても良い。或いは、個別の（独立した）装置でも良い。
また、制御部は、測定対象物質の比較対象物質に対する割合を求める方法を実行するプログラム或いは測定対象物質の比較対象物質に対する割合を求める方法により得られた回帰式を、内蔵するようにしても良く、装置の外部から読み込んで実行するようにしても良い。
例えば、図１Ｃのうち、発光部１１と、反応セル１５と、受光部２１と、を有する携帯形態可能な検査用の端末（検査装置）を制御部とは別体に形成しても良い。そして、検査用の端末により測定された測定値を、図示しない有線又は無線通信部により、管理センタなどに設けられる制御部２３に送り、検査結果を管理センタ側で求めるようにしても良い。或いは、検査結果を検査用端末に返信してもらうようにしても良い。
このようにすれば、検査用の端末（検査装置）のみを用いて、検体の検査を行うことも可能である。
さらに、回帰式の情報は、測定（試験）用チップに内蔵される試薬の製造ロット毎に変化することから、予め本発明の方法により得られた回帰式の情報を測定（試験）用チップに記憶させるようにしても良い。
また、本実施の形態で説明した機能を実現するためのプログラムをコンピュータ読み取り可能な記録媒体に記録して、この記録媒体に記録されたプログラムをコンピュータシステムに読み込ませ、実行することにより各部の処理を行ってもよい。尚、ここでいう「コンピュータシステム」とは、ＯＳや周辺機器等のハードウェアを含むものとする。
本発明は、ＨｂＡ１ｃ、グリコアルブミン或いはアイソザイム等の比較対象物質に対する割合を求める方法として利用可能である。
１…検体、２…ＨｂＡ１ｃ測定試薬、３…抗ＨｂＡ１ｃ抗体感作金コロイド、５…抗ＨｂＡ０抗体感作金コロイド、７…凝集塊、１１…発光部、１５…反応セル、２１…受光部、２３…制御部。
本明細書で引用した全ての刊行物、特許及び特許出願はそのまま引用により本明細書に組み入れられるものとする。

Claims (10)

  1. 測定対象物質の測定試薬を用いた測定対象物質の比較対象物質に対する割合を求める方法であって、
    比較対象物質の濃度が異なる測定対象物質の希釈系列と、前記測定試薬との反応が進行することで生じる前記測定対象物質の希釈系列それぞれの吸光度変化量を求めて得られる複数の検量線が、一つの検量線に収束するような濃度係数を比較対象物質の濃度毎に求める過程において、
    測定対象物質の比較対象物質に対する割合（％）＝［Ｘ］／（濃度係数×比較対象物質の濃度） （１）
    を得るステップと、
    比較対象物質の濃度毎の濃度係数と比較対象物質の濃度との関係をあらわす回帰式を求めるステップとを有する測定対象物質の比較対象物質に対する割合を求める方法。
  2. 前記吸光度変化量を求めるステップは、
    測定対象物質を含む検体と前記測定試薬とによって生じる反応が進行することによって生じる特徴的な単波長における吸光度の増加或いは減少の変化量を求めるステップ、或いは、
    測定対象物質を含む検体と前記測定試薬とによって生じる反応が進行することによって生じる特徴的な二波長における吸光度の増加或いは減少の変化量であって吸光度が増加する或いは減少する第１の波長における第１の吸光度と吸光度が増加する或いは減少する第２の波長における第２の吸光度との差或いは比を求めるステップを有する請求項１に記載の方法。
  3. 前記測定試薬が、免疫法の凝集法や凝集阻止法、或いは酵素法のいずれかを利用する測定試薬であって、
    前記式（１）、及び、比較対象物質の濃度毎に最適化した濃度係数と比較対象物質の濃度との回帰式と、測定試薬を用いて測定対象物質を含む検体を測定して得る吸光度変化量から、測定対象物質の比較対象物質に対する割合を求めるステップを有する請求項１又は２のいずれか１項に記載の方法。
  4. コンピュータに、
    請求項１から３までのいずれか１項に記載の方法を実行させるためのプログラム。
  5. 請求項４に記載のプログラムを記録するコンピュータ読み取り可能な記録媒体。
  6. 測定対象物質の測定試薬を用いた測定対象物質の比較対象物質に対する割合を求める装置であって、
    請求項１から３までのいずれか１項に記載の方法を実行させるための制御部と、
    吸光度測定部と、を有する装置であり、
    制御部と吸光度測定部とは一体、或いは別体に設けられている装置。
  7. 請求項４に記載のプログラムを内蔵する制御部を有する装置。
  8. 請求項４に記載のプログラムを読み込む制御部を有する装置。
  9. 請求項１から３までのいずれか１項に記載の方法を実行して得られた回帰式を内蔵する制御部を有する装置。
  10. 請求項１から３までのいずれか１項に記載の方法を実行して得られた回帰式を読み込む制御部を有する装置。
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