JP5829766B2 - 酵素法を利用したヘモグロビンA1c定量分析のための溶血試薬組成物 - Google Patents
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Description
技術的課題
本発明の一つの課題は、従来の酵素法を用いてHbA1cの濃度を測定する方法において、反応速度を加速することにより、測定に要する時間を短縮し、また、反応シグナルを最大にすることにより、反応感度を高めることができる、溶血試薬組成物を提供することである。
前記課題を解決するために、本発明は、酵素法によるHbA1cの定量分析の前処理工程で使用される溶血試薬組成物を提供し、該組成物は、以下の化学式1で表される両性イオン界面活性剤と、亜硝酸化合物とを含有する:
式中、R1およびR2は、独立して、それぞれ直鎖または分岐C1-5アルキルであり;
nは、1〜6の整数であり;
Xは、単結合または
であり;
ここで、Xが
である場合、mは1〜3の整数であり、R3はC13直鎖または分岐アルキルであり、Xが単結合である場合、mは1であり、R3はC13直鎖または分岐アルキルである。
請求項1に記載の溶血試薬組成物を用いて赤血球を溶血する工程(工程1);
工程1で赤血球の溶血により放出されたヘモグロビンの総量を測定する工程(工程2);
プロテアーゼを用いて、工程1で赤血球の溶血により放出されたHbA1cのN末端β鎖の「糖-Val-His-」部分のみを選択的に切断することによって、単量体フルクトシルアミノ酸を得る工程(工程3);
工程3で得られたフルクトシルアミノ酸とFPOX(フルクトシルペプチドオキシダーゼ)とを反応させて過酸化水素を生成する工程(工程4);
POD(ペルオキシダーゼ)と反応させることによって、工程4で生成された過酸化水素を酸化する工程(工程5);
工程5で酸化された過酸化水素と基質による酸化還元反応により誘導された発色の量を測定する工程(工程6);および
工程2で測定されたヘモグロビンの総量と工程6でのHbA1cの量を比較することにより、血液サンプル中のHbA1cの濃度を定量する工程(工程7)。
両性イオン界面活性剤および亜硝酸化合物を含有する本発明の溶血試薬組成物は、両性イオン界面活性剤の存在により溶血速度をかなり加速し、かつ溶血により放出されたヘモグロビンのN末端β鎖をヘモグロビン分子の外側に露出されるように誘導して、より多数の分子の関与を支援し、それによって、HbA1cの反応感度および反応速度を向上させ、かつ亜硝酸化合物は、ヘモグロビンのN末端β鎖のアミノ酸配列が容易に切断されるように、ヘモグロビンのタンパク質構造を柔軟にし、それによって、測定に要する全時間を著しく短縮し、かつ測定精度を向上させる。
本発明は、総ヘモグロビンの濃度を基準にしてHbA1cの相対濃度を測定することに関する。特に、本発明は、改善された溶血試薬組成物を使用して、総ヘモグロビンおよびHbA1cを測定する感度を向上させ、また、測定に要する時間を短縮することを目的としている。
式中、R1およびR2は、独立して、それぞれ直鎖または分岐C1-5アルキルであり;
nは、1〜6の整数であり;
Xは、単結合または
であり;
ここで、Xが
である場合、mは1〜3の整数であり、R3はC13直鎖または分岐アルキルであり、Xが単結合である場合、mは1であり、R3はC13直鎖または分岐アルキルである。
R1およびR2は、独立して、それぞれ直鎖または分岐C1-3アルキルであり;
nは、1〜4の整数であり;
Xは、単結合または
であり;
ここで、Xが
である場合、mは1〜3の整数であり、R3はC13直鎖または分岐アルキルであり、Xが単結合である場合、mは1であり、R3はC13直鎖または分岐アルキルである。
化学式1で表される両性イオン界面活性剤は、以下のとおりである:
3-(ジメチル(3-テトラデカンアミドプロピル)アンモニオ)プロパン-1-スルホナート;
4-(ジメチル(3-テトラデカンアミドプロピル)アンモニオ)ブタン-1-スルホナート;または
3-(ジメチル(テトラデシル)アンモニオ)プロパン-1-スルホナート。
前記溶血試薬組成物を用いて赤血球を溶血する工程(工程1);
工程1で赤血球の溶血により放出されたヘモグロビンの総量を測定する工程(工程2);
プロテアーゼを用いて、工程1で赤血球の溶血時に放出されたHbA1cのN末端β鎖の「糖-Val-His-」部分のみを選択的に切断することによって、単量体のフルクトシルアミノ酸を得る工程(工程3);
工程3で得られたフルクトシルアミノ酸とFPOX(フルクトシルペプチドオキシダーゼ)とを反応させて過酸化水素を生成する工程(工程4);
POD(ペルオキシダーゼ)と反応させることによって、工程4で生成された過酸化水素を酸化する工程(工程5);
工程5で酸化された過酸化水素と基質による酸化還元反応により誘導された発色の量を測定する工程(工程6);および
工程2で測定されたヘモグロビンの総量と工程6での糖化ヘモグロビンの量を比較することにより、血液サンプル中の糖化ヘモグロビンの濃度を定量する工程(工程7)。
本発明は、以下の実施例を参照して、さらに詳細に説明される。しかし、それらは例示のために以下に示されるのであって、本発明を限定するためのものではない。
HbA1cの定量化のための溶血としての前処理の後に使用される酵素反応用の組成物は、800 U/mLの微生物由来のプロテアーゼ、1 U/mLのFPOX(フルクトシルペプチドオキシダーゼ)、10 U/mLのPOD(ペルオキシダーゼ)、および基質としての0.12mMのDA-67(色素)を、100mM MES緩衝液に添加することにより調製した。
溶血試薬組成物1は、界面活性剤としての0.75mg/mLの3-(ジメチル(3-テトラデカンアミドプロピル)アンモニオ)プロパン-1-スルホナート、および亜硝酸化合物としての2mM NaNO2を、100mM MES緩衝液に添加することにより調製した。
溶血試薬組成物2は、実施例1で使用した界面活性剤の代わりに0.75mg/mLの4-(ジメチル(3-テトラデカンアミドプロピル)アンモニオ)ブタン-1-スルホナートを使用したことを除いて、実施例1と同様に調製した。
溶血試薬組成物3は、実施例1で使用した界面活性剤の代わりに0.75mg/mLの3-(ジメチル(テトラデシル)アンモニオ)プロパン-1-スルホナートを使用したことを除いて、実施例1と同様に調製した。
溶血試薬組成物4は、実施例1で使用した界面活性剤の代わりに蒸留水を使用したことを除いて、実施例1と同様に調製した。
溶血試薬組成物5は、実施例1で使用した界面活性剤の代わりに0.75mg/mLの2-(6-(ドデシルオキシ)-4,5-ジヒドロキシ-2-(ジヒドロキシルメチル)-テトラヒドロ-2H-ピラン-3-イルオキシ)-6-(ヒドロキシメチル)-テトラヒドロ-2H-ピラン-3,4,5-トリオールを使用したことを除いて、実施例1と同様に調製した。
溶血試薬組成物6は、実施例1で使用した界面活性剤の代わりに0.75mg/mLの4-(ドデシルジメチルアンモニオ)ブタノアートを使用したことを除いて、実施例1と同様に調製した。
溶血試薬組成物7は、実施例1で使用した界面活性剤の代わりに0.75mg/mLの3-((3-(4-ヘプチルフェニル)-3-ヒドロキシプロピル)ジメチルアンモニオ)プロパン-1-スルホナートを使用したことを除いて、実施例1と同様に調製した。
溶血試薬組成物8は、実施例1で使用した界面活性剤の代わりに0.75mg/mLの3-(ジメチル(3-パルミトアミドプロピル)アンモニオ)プロパン-1-スルホナートを使用したことを除いて、実施例1と同様に調製した。
溶血試薬組成物9は、実施例1で使用した界面活性剤の代わりに0.75mg/mLの3-(ジメチル(オクチル)アンモニオ)プロパン-1-スルホナートを使用したことを除いて、実施例1と同様に調製した。
溶血試薬組成物10は、実施例1で使用した界面活性剤の代わりに0.75mg/mLの3-(デシルジメチルアンモニオ)プロパン-1-スルホナートを使用したことを除いて、実施例1と同様に調製した。
溶血試薬組成物11は、実施例1で使用した界面活性剤の代わりに0.75mg/mLの3-(ドデシルジメチルアンモニオ)プロパン-1-スルホナートを使用したことを除いて、実施例1と同様に調製した。
溶血試薬組成物12は、実施例1で使用した界面活性剤の代わりに0.75mg/mLの3-(ヘキサデシルジメチルアンモニオ)プロパン-1-スルホナートを使用したことを除いて、実施例1と同様に調製した。
溶血試薬組成物13は、亜硝酸化合物の2mM NaNO2を使用しなかったことを除いて、実施例1と同様に調製した。
界面活性剤を使用するためには、サンプル自体の溶解性が優れていることが不可欠である。まず第一に、サンプルが溶解しない場合は、それを全く使用することができないので、前提条件として界面活性剤の溶解性を評価した。
実施例1〜3および比較例1〜8で調製した溶血試薬組成物の溶血速度は、以下に記載する実験によって得られた。
酵素法によってHbA1cの相対濃度を測定するためには、総ヘモグロビンの濃度を一緒に測定することが不可欠である。そのためには、総ヘモグロビンの反応感度を得ることが重要である。
一般的に、基質の正確な定量化は、基質が酵素反応の結果として生成された過酸化水素とペルオキシダーゼとの反応によって発色するときに得ることができる。したがって、界面活性剤と基質との間の発色は、定量分析においてエラーを引き起こす可能性がある。この点に関して、界面活性剤と基質との反応性を、以下のように実施した実験で調べた。
酵素法によりHbA1cの定量化を行うには、HbA1cに対する反応感度が優れていることが重要である。この点に関して、HbA1cの反応感度および溶血反応の速度に対する本発明に従って調製した溶血試薬組成物の効果を、以下に記載する実験で調べた。
一般に、亜硝酸化合物は、総ヘモグロビンの量を測定するために使用される物質として知られている。しかし、本発明でのHbA1c値を測定するための酵素法では、亜硝酸化合物が、酸化剤としてのその役割に加えて、溶血されたHbA1cのタンパク質構造を柔軟に改変することによって、プロテアーゼによる溶血HbA1cのタンパク質構造の配列の切断を媒介する補助作用に関与しているかどうかを確認するために、以下に記載する実験で亜硝酸化合物の役割を調べた。
溶血により放出されたヘモグロビンのN末端β鎖をヘモグロビン分子の外側に露出されるように誘導して、反応へのより多数の分子の関与を支援することによる、HbA1cの反応感度に対する本発明の界面活性剤の効果を調べるために、実験を下記のように行った。
両性イオン界面活性剤と亜硝酸化合物を含有する本発明の溶血試薬組成物は、両性イオン界面活性剤の存在のために溶血速度をかなり加速し、かつ溶血により放出されたヘモグロビンのN末端β鎖をヘモグロビン分子の外側に露出されるように誘導して、反応へのより多数の分子の関与を支援し、それによって、HbA1cの反応感度および反応速度を向上させ、かつ亜硝酸化合物は、ヘモグロビンのN末端β鎖のアミノ酸配列が容易に切断されるように、ヘモグロビンのタンパク質構造を柔軟に改変させ、それによって、測定に要する全時間を著しく短縮し、かつ測定精度を向上させ、したがって、HbA1cの定量分析のための溶血試薬組成物として使用することができる。
Claims (9)
- 化学式1で表される両性イオン界面活性剤が、3-(ジメチル(3-テトラデカンアミドプロピル)アンモニオ)プロパン-1-スルホナート、4-(ジメチル(3-テトラデカンアミドプロピル)アンモニオ)ブタン-1-スルホナート、または3-(ジメチル(テトラデシル)アンモニオ)プロパン-1-スルホナートである、請求項1に記載の溶血試薬組成物。
- 亜硝酸化合物が、亜硝酸ナトリウム、亜硝酸カリウム、亜硝酸マグネシウム、および亜硝酸カルシウムからなる群より選択される少なくとも1つである、請求項1に記載の溶血試薬組成物。
- 請求項1に記載の溶血試薬組成物を用いて赤血球を溶血する工程(工程1);
工程1で赤血球の溶血により放出されたヘモグロビンの総量を測定する工程(工程2);
プロテアーゼを用いて、工程1で赤血球の溶血により放出された糖化ヘモグロビンのN末端β鎖の「糖-Val-His-」部分のみを選択的に切断することによって、単量体のフルクトシルアミノ酸を得る工程(工程3);
工程3で得られたフルクトシルアミノ酸とFPOX(フルクトシルペプチドオキシダーゼ)とを反応させて過酸化水素を生成する工程(工程4);
POD(ペルオキシダーゼ)と反応させることによって、工程4で生成された過酸化水素を酸化する工程(工程5);
工程5で酸化された過酸化水素と基質による酸化還元反応により誘導された発色の量を測定する工程(工程6);および
工程2で測定されたヘモグロビンの総量と工程6での糖化ヘモグロビンの量を比較することにより、血液サンプル中の糖化ヘモグロビンの濃度を定量する工程(工程7)
を含む、糖化ヘモグロビンの定量分析のための方法。 - 前記プロテアーゼが、バシラス属菌種(Bacillus sp.)、アスペルギルス属菌種(Aspergillus sp.)、ストレプトミセス属菌種(Streptomyces sp.)、およびこれらの遺伝子組換え体に由来するプロテアーゼからなる群より選択される少なくとも1つである、請求項5に記載の方法。
- 工程2でのヘモグロビンの総量と工程6での糖化ヘモグロビンの量が光学的に測定される、請求項5に記載の方法。
- 化学式1で表される両性イオン界面活性剤が、赤血球の溶血速度を加速し、かつ酵素活性を向上させる、請求項5に記載の方法。
- 亜硝酸化合物が、ヘモグロビンのタンパク質構造を柔軟にすることによってプロテアーゼ活性を向上させる、請求項5に記載の方法。
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