JP2007155684A - 分析装置 - Google Patents
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Abstract
【課題】 高精度で血糖値と糖化ヘモグロビン量を算出する
【解決手段】グルコースの酸化反応を触媒する酵素固定化体とグルコース酸化反応により増減する電気化学的活性物質を検知する機構と、フルクトシルL−バリンに作用するフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ固定化体またはフルクトシルバリルヒスチジンに作用するフルクトシルペプチドオキシダーゼ固定化体とフルクトシルアミノ酸またはフルクトシルペプチドの酸化反応により増減する電気化学的活性物質を検知する機構と、全ヘモグロビンを検知する機構と、フルクトシルL−バリンとヘモグロビンまたはフルクトシルバリルヒスチジンの検知結果とヘモグロビンの検知結果に基づきHbA1cを得る第一演算機構と、全血/血球グルコースとヘモグロビンの検知結果に基づき全血/血球グルコースを血漿グルコースに補正する第二演算機構を備えたグルコースと糖化ヘモグロビンの分析装置。
【選択図】図1
Description
グルコースの酸化反応を触媒する酵素を固定化した固定化体と、グルコース酸化反応により増減する電気化学的活性物質を検知する機構を用いて検体中のグルコース濃度を電気化学的に検知する工程;
フルクトシルL−バリンに作用するフルクトシルアミノ酸オキシダーゼを固定化した固定化体またはフルクトシルバリルヒスチジンに作用するフルクトシルペプチドオキシダーゼを固定化した固定化体と、フルクトシルアミノ酸またはフルクトシルペプチドの酸化反応により増減する電気化学的活性物質を検知する機構を用いて検体中のフルクトシルL−バリンまたはフルクトシルバリルヒスチジンを電気化学的に検知する工程;
全ヘモグロビンを検知する機構を用いて、検体中の全ヘモグロビンを検知する工程;
フルクトシルL−バリンとヘモグロビンまたはフルクトシルバリルヒスチジンの検知結果とヘモグロビンの検知結果に基づき第一演算機構によりHbA1cを得る工程;および
全血/血球グルコースとヘモグロビンの検知結果に基づき第二演算機構により全血/血球グルコースを血漿グルコースに補正する工程。
y=a11×x+b11
フルクトシルバリンの検量線を
y=a12×x+b12
とし、フルクトシルアミノ酸オキシダーゼまたはフルクトシルペプチドオキシダーゼ固定化体と過酸化水素電極を組み合わせた糖化アミノ酸または糖化ペプチド検出系で得られたグルコースの検量線を
y=a21×x+b21
フルクトシルバリンの検量線を
y=a22×x+b22
とすると、x1の濃度のグルコースとx2の濃度のフルクトシルバリンによる応答値は、第1の過酸化水素電極では、
y1=a11×x1+b11+a12×x2+b12
第2の過酸化水素電極では、
y2=a21×x1+b21+a22×x2+b22
となる。
x1=(a12×(y2−b21−b22)−a22×(y1−b11−b12))/(a12×a21−a11×a22)
フルクトシルバリンの濃度x2は
x2=(a11×(y2−b21−b22)−a21×(y1−b11−b12))/(a11×a22−a12×a21)
となる。
x1=(y1−b11)/ a11
フルクトシルバリンの濃度x2は
x2=(a11×(y2−b21−b22)−a21×(y1−b11))/(a11×a22)
となり、グルコース検出系と糖化アミノ酸または糖化ペプチド検出系でグルコースとフルクトシルバリンまたはフルクトシルバリルヒスチジンの検量線を作製し、試料のフルクトシルバリンまたはフルクトシルバリルヒスチジン検出値から、上式により試料中のグルコース濃度とフルクトシルバリン濃度が正確に算出できる。
固定化された酵素に試料を一定時間接触させて反応を進行させるには、試料液を一定時間撹拌しながら反応を起こさせるバッチ方式でも可能であるが、より高精度の測定を実施するためにフロー方式の測定を用いることが望ましい。本発明ではより高精度の測定を行えるフロー方式の装置を開示する。
実施例1
(1)フルクトシルアミノ酸オキシダーゼ固定化カラムの製造
耐火レンガ(30〜60メッシュ)150mgをよく乾燥し、10%γ−アミノプロピルトリエトキシシランの無水トルエン溶液に1時間浸漬した後、よくトルエンで洗浄し、乾燥する。こうしてアミノシラン化処理した担体を5%グルタルアルデヒドに1時間浸漬した後、よく蒸留水で洗浄し、最後にpH7.0、100mMのリン酸ナトリウム緩衝液で置き換え、この緩衝液をできるだけ除いておく。このホルミル化した耐火レンガにpH7.0、100mMリン酸ナトリウム緩衝液にフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ(キッコーマン株式会社製)を18ユニット/mlの濃度で溶解した溶液400μlを接触させ、0〜4℃で1日放置し固定化する。この酵素固定化担体を内径3.5mm、長さ30mmのカラムに充填しフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ固定化カラムとする。
(2)過酸化水素電極の製造
直径2mmの白金線の側面を熱収縮テフロン(登録商標)で被覆し、その線の一端をやすりおよび1500番のエメリー紙で平滑に仕上げる。この白金線を作用極、1cm角型白金板を対極、飽和カロメル電極を参照極として、0.1M硫酸中、+2.0Vで10分間の電解処理を行う。その後白金線をよく水洗した後、40℃で10分間乾燥し、10%γ−アミノプロピルトリエトキシシランの無水トルエン溶液に1時間浸漬後、洗浄する。牛血清アルブミン(シグマ社製、Fraction V)20mgを蒸留水1mlに溶解し、その中にグルタルアルデヒドを0.2%になるように加える。この混合液を手早く先に用意した白金線上に5μlのせ、40℃で15分間乾燥硬化する。これを過酸化水素電極とする。
(3)グルコース電極の製造
(2)と同様の手順で過酸化水素電極を作製する。グルコースオキシダーゼ(シグマ社製、TypeII)を100mg/mlとなるように100mMリン酸緩衝液pH6.0に溶解する。グルコースオキシダーゼが20mg/ml、牛血清アルブミンが5mg/ml、グルタルアルデヒドが0.2%となるように、100mg/mlグルコースオキシダーゼ溶液と牛血清アルブミン溶液とグルタルアルデヒド溶液と100mMリン酸緩衝液pH6.0を混合してグルコースオキシダーゼ固定化酵素溶液とする。このグルコースオキシダーゼ固定化酵素溶液を手早く先に用意した過酸化水素電極上に5μlのせ、40℃で15分間乾燥硬化する。これをグルコースオキシダーゼ電極とする。
(4)測定装置
図2の測定装置において、フロー型比色計(16)とタンパク質分解酵素固定化カラム(14)と第1の固定化酵素カラム(17)は配置せず、過酸化水素電極(18)にグルコース電極、第2の固定化酵素カラム(19)にはフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ固定化カラム、過酸化水素電極(20)に過酸化水素電極を配置する。緩衝液槽(24)より緩衝液Bをポンプ(25)により送液し、計量バルブ(4)を用いて試料100μlを注入する。注入された試料は緩衝液Bの流れにのって恒温槽(13)内に設置された透析モジュール(27)に運ばれ、膜厚さ20μm、分子量分画12000〜14000の再生セルロース膜で試料中の低分子成分のみがグルコース検知系(18)と糖化アミノ酸検知系(19、20)に導かれる。緩衝液槽(1)より緩衝液Aがポンプ(2)により送液されているので、透析モジュール(27)で透析された試料中の低分子成分はグルコース電極(18)とフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ固定化カラム(19)と過酸化水素電極(20)を通過し、試料中のグルコースと糖化アミノ酸から生成した過酸化水素が検知される。
(5)フルクトシルアミノ酸オキシダーゼ固定化カラムの基質特異性
(4)の測定装置を使用して、緩衝液のpHが8.0の場合の各種糖化アミノ酸や糖化ペプチド、アミノ酸、糖に対するフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ固定化カラムの基質特異性を調べた結果を表1に示す。表中の値はフルクトシルグリシンに対する応答を100とした場合の相対値である。
(4)の測定装置を使用して、2、5、10mMのグルコース及び20、50、100μMのフルクトシルバリンを各100μl注入し、検出値を得た。
グルコース検量線
Y(nA)=2.44X(mM)−0.25 r=0.9998
フルクトシルバリン検量線
Y(nA)=0.00X(μM)−0.00
糖化アミノ酸電極
グルコース検量線
Y(nA)=0.030X(mM)+0.029 r=0.9778
フルクトシルバリン検量線
Y(nA)=0.014X(μM)+0.007 r=0.9999
この測定装置を用いてグルコース5mMとフルクトシルバリン80μMの混合標準液を測定したところ、グルコース電極では11.97nAの応答値を、糖化アミノ酸電極では1.29nAの応答値を得た。
比較例1
実施例1(6)と同様にしてグルコースとフルクトシルバリンを含む試料を、糖化アミノ酸電極のみで測定を行った。
(1)フルクトシルアミノ酸オキシダーゼ固定化カラムの製造
実施例1(1)と同様にしてフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ固定化カラムを製造した。
(2)過酸化水素電極の製造
実施例1(2)と同様に過酸化水素電極を作製した。
(3)測定装置
実施例1(4)と同様に図2の測定装置を利用して測定を行った。フロー型比色計(16)とタンパク質分解酵素固定化カラム(14)と第1の固定化酵素カラム(17)と過酸化水素電極(18)は配置せず、第2の固定化酵素カラム(19)にはフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ固定化カラム、過酸化水素電極(20)に過酸化水素電極を配置した。試料は計量バルブにより100μlが注入される。
(4)グルコースとフルクトシルバリン混合標準液の測定
(3)の測定装置を使用し、20、50、100μMのフルクトシルバリンを100μl注入し、検出値を得た。フルクトシルバリンの検量線は、
Y(nA)=0.014X(μM)+0.007 r=0.9999
となった。ただしYは検出値、Xは試料中の濃度、rは相関係数である。
実施例2
(1)フルクトシルペプチドオキシダーゼ固定化カラムの製造
実施例1(1)と同様に耐火レンガ(30〜60メッシュ)150mgをホルミル化する。このホルミル化した耐火レンガにpH7.0、100mMリン酸ナトリウム緩衝液にフルクトシルペプチドオキシダーゼ(キッコーマン株式会社製)を140ユニット/mlの濃度で溶解した溶液200μlを接触させ、0〜4℃で1日放置し固定化する。この酵素固定化担体を内径3.5mm、長さ30mmのカラムに充填しフルクトシルペプチドオキシダーゼ固定化カラムとする。
(2)過酸化水素電極の製造
実施例1(2)と同様に過酸化水素電極を作製した。
(3)グルコース電極の製造
実施例1(3)と同様にしてグルコース電極を作製した。
(4)測定装置
図1の測定装置において、タンパク質分解酵素固定化カラム(14)とフロー型比色計(16)と第1の固定化酵素カラム(17)は配置せず、過酸化水素電極(18)にグルコース電極、第2の固定化酵素カラム(19)にはフルクトシルペプチドオキシダーゼ固定化カラム、第2の過酸化水素電極(20)に過酸化水素電極を配置する。緩衝液槽(1)より緩衝液Aをポンプ(2)により送液し、計量バルブ(4)を用いて試料5μlを注入する。注入された試料は緩衝液Aの流れにのって恒温槽(13)内に設置された混合用配管(15)を通り、温度調整と緩衝液との混合が行われ、その下流のグルコース電極(18)とフルクトシルペプチドオキシダーゼ固定化カラム(19)と過酸化水素電極(20)を通り、試料中のグルコースとフルクトシルバリルヒスチジンから過酸化水素を生成し、電流値の変化を検知する。
(5)フルクトシルペプチドオキシダーゼ固定化カラムの基質特異性
(4)の測定装置を使用して、緩衝液AのpHが7.0の場合の各種糖化アミノ酸や糖化ペプチド、アミノ酸、糖に対するフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ固定化カラムの基質特異性を調べた結果を表2に示す。表中の値はフルクトシルバリンに対する応答を100とした場合の相対値である。
(4)の測定装置を利用して、2、5、10mMのグルコース及び10、20、50、100μMのフルクトシルバリンを各5μl注入し、検出値を得た。
グルコース検量線
Y(nA)=6.74X(mM)−0.28 r=1.0000
フルクトシルバリン検量線
Y(nA)=0.00X(μM)+0.00
糖化ペプチド電極
グルコース検量線
Y(nA)=0.00X(mM)+0.00
フルクトシルバリン検量線
Y(nA)=0.035X(μM)+0.087 r=0.9992
この測定装置を用いてグルコース5mMとフルクトシルバリン80μMの混合溶液を測定したところ、グルコース電極では34.1nAの応答値を、フルクトシルペプチド電極では2.87nAの応答値を得た。
2 緩衝液送液ポンプ
3 ダンパー
4 計量バルブ
5 計量ループ
6 試料管
7 試料吸引ニードル
8 廃棄ポット
9 洗浄液槽
10 バルブ
11 バルブ
12 シリンジポンプ
13 恒温槽
14 タンパク質分解酵素固定化カラム
15 混合用配管
16 フロー型比色計
17 第1の固定化酵素カラム
18 過酸化水素電極
19 第2の固定化酵素カラム
20 過酸化水素電極
21 背圧コイル
22 廃液ボトル
23 廃液ボトル
24 緩衝液槽
25 緩衝液送液ポンプ
26 恒温化用配管
27 透析モジュール
Claims (5)
- グルコースの酸化反応を触媒する酵素を固定化した固定化体とグルコース酸化反応により増減する電気化学的活性物質を検知する機構と、フルクトシルL−バリンに作用するフルクトシルアミノ酸オキシダーゼを固定化した固定化体またはフルクトシルバリルヒスチジンに作用するフルクトシルペプチドオキシダーゼを固定化した固定化体とフルクトシルアミノ酸またはフルクトシルペプチドの酸化反応により増減する電気化学的活性物質を検知する機構と、全ヘモグロビンを検知する機構と、フルクトシルL−バリンとヘモグロビンまたはフルクトシルバリルヒスチジンの検知結果とヘモグロビンの検知結果に基づきHbA1cを得るための第一演算機構と、全血/血球グルコースとヘモグロビンの検知結果に基づき全血/血球グルコースを血漿グルコースに補正する第二演算機構を備えたことを特徴とするグルコースと糖化ヘモグロビンの分析装置。
- グルコースの酸化反応を触媒する酵素を固定化した固定化体とグルコース酸化反応により増減する電気化学的活性物質を検知する機構と、フルクトシルL−バリンに作用するフルクトシルアミノ酸オキシダーゼを固定化した固定化体またはフルクトシルバリルヒスチジンに作用するフルクトシルペプチドオキシダーゼを固定化した固定化体とフルクトシルアミノ酸またはフルクトシルペプチドの酸化反応により増減する電気化学的活性物質を検知する機構と、全ヘモグロビンを検知する機構と、検体中グルコースとフルクトシルL−バリンまたは検体中グルコースとフルクトシルバリルヒスチジンの検知結果に基づき検体中グルコースの影響を排除したフルクトシルL−バリンまたはフルクトシルバリルヒスチジンの測定値を得る第三演算機構と、フルクトシルL−バリンとヘモグロビンまたはフルクトシルバリルヒスチジンの前記測定値とヘモグロビンの検知結果に基づきHbA1cを得るための第一演算機構と、全血/血球グルコースとヘモグロビンの検知結果に基づき全血/血球グルコースを血漿グルコースに補正する第二演算機構とを備えたことを特徴とするグルコースと糖化ヘモグロビンの分析装置。
- 緩衝液を連続して送液する機構と、その下流の緩衝液に検体を注入する機構(4、5、7)を備え、検体を注入する機構(4、5、7)の下流にグルコースの酸化反応を触媒する酵素を固定化した固定化体とグルコース酸化反応により増減する電気化学的活性物質を検知する機構(17、18)と、フルクトシルL−バリンに作用するフルクトシルアミノ酸オキシダーゼを固定化した固定化体またはフルクトシルバリルヒスチジンに作用するフルクトシルペプチドオキシダーゼを固定化した固定化体とフルクトシルバリンまたはフルクトシルバリルヒスチジンの酸化反応により増減する電気化学的活性物質を検知する機構(19、20)を配置するとともに、検体を注入する機構(4、5、7)を含み、その下流に全ヘモグロビン濃度を検知する機構(16)を配置したことを特徴とする請求項1又は2記載のグルコースと糖化ヘモグロビンの分析装置。
- 以下の工程を含む、検体中のグルコースと糖化ヘモグロビンの分析方法:
グルコースの酸化反応を触媒する酵素を固定化した固定化体と、グルコース酸化反応により増減する電気化学的活性物質を検知する機構を用いて検体中のグルコース濃度を電気化学的に検知する工程;
フルクトシルL−バリンに作用するフルクトシルアミノ酸オキシダーゼを固定化した固定化体またはフルクトシルバリルヒスチジンに作用するフルクトシルペプチドオキシダーゼを固定化した固定化体と、フルクトシルアミノ酸またはフルクトシルペプチドの酸化反応により増減する電気化学的活性物質を検知する機構を用いて検体中のフルクトシルL−バリンまたはフルクトシルバリルヒスチジンを電気化学的に検知する工程;
全ヘモグロビンを検知する機構を用いて、検体中の全ヘモグロビンを検知する工程;
フルクトシルL−バリンとヘモグロビンまたはフルクトシルバリルヒスチジンの検知結果とヘモグロビンの検知結果に基づき第一演算機構によりHbA1cを得る工程;および
全血/血球グルコースとヘモグロビンの検知結果に基づき第二演算機構により全血/血球グルコースを血漿グルコースに補正する工程。 - 検体中グルコースとフルクトシルL−バリンまたは検体中グルコースとフルクトシルバリルヒスチジンの検知結果に基づき第三演算機構により検体中グルコースの影響を排除したフルクトシルL−バリンまたはフルクトシルバリルヒスチジンの測定値を得る工程をさらに含み、得られた測定値とヘモグロビンの検知結果に基づき第一演算機構によりHbA1cを得ることを特徴とする、請求項4に記載の方法。
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