JPH0459876B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 〔発明の利用分野〕 本発明は溶液中に溶存する物質を酵素電極又は
酵素を固定化したリアクタにより測定する方法に
係り、特にSH酵素を用いた酵素電極又はリアク
タにより血液等の体液中に溶存する物質を測定す
るのに好適な測定方法及び測定装置に関する。

〔従来の技術〕

基質（測定対象物質）に対する反応特異性の高
い酵素を固定化した酵素膜とイオン電極等とを組
合せた酵素電極は10数年前に開発され（G.G.
Guilbault，Handbook of Enzymatic Methode
of Analysis，Marcel Dekker，New York
（1976）、近年その一部が実用段階に達した。しか
しなお寿命が短い等の問題点が依然として残され
ている。特に触媒作用にSH基を必要とするSH酵
素は微量の重金属によつて容易に失活する。一般
にキレート化合物を作りやすい金属はエチレンジ
アミン四酢酸等により除去出来るが、銀のような
一価イオンは、それらによる除去が困難で、酵素
電極の短寿命化の原因物質となつている。

〔発明の目的〕

本発明の目的はSH基を有する酵素を固定化し
た酵素膜を感応膜とする酵素電極とを含む固定化
酵素を用いた生化学用測定装置において、重金属
による酵素電極の失活を防止するため、酵素電極
と参照電極をつなぐ流路中にSH基を有する不溶
性物質からなる重金属補足トラツプを設け、酵素
電極、参照電極等から移動し拡散してくる重金属
を捕捉して、装置の使用時あるいは装置の停止時
においても、酵素電極の重金属による失活を防ぎ
寿命を著しく高めた、固定化酵素を用いた生化学
用測定装置を提供することにある。また、SH基
を有する酵素を固定化した酵素リアクタとこの酵
素リアクタにおける生成物を検知する検知電極及
び参照電極を含む、固定化酵素を用いた生化学用
測定装置において、重金属による酵素リアクタの
失活を防止するため、酵素リアクタと検知電極を
つなぐ流路中に、SH基を有する不溶性物質から
なる重金属捕捉トラツプを設け、検知電極、参照
電極等、の各種電極から移動し拡散してくる重金
属を捕捉して、装置の使用時あるいは装置の停止
時においても、酵素リアクタの重金属による失活
を防ぎ寿命を著しく高めた、固定化酵素を用いた
生化学用測定装置を提供することにある。

〔発明の概要〕

SH酵素（Ｅ−SHで示す）、すなわち酵素活性
にSH基が関与する酵素に例えば一価の重金属イ
オン（M⁺で示す）が作用すると、次式で示すよ
うに、酵素に重金属イオンが容易に結合する。

M⁺＋Ｅ−SH→Ｅ−SM＋H⁺ 上式のSH基が触媒作用に関与している場合に
は、上記の反応により酵素の活性が失われる。

一方、M⁺に対する反応特異性が高い別のSH基
を有する化合物（Ｒ−SHで示す）がM⁺と接触す
ると、次式のように同様の反応が起こり、 M⁺が捕捉される。

M⁺＋Ｒ−SH→Ｒ−SM＋H⁺ そのため、SH酵素の活性が失なわれることが
ない。

さらに、上記M⁺と結合して失活した酵素にＲ
−SHを接触させることにより、次式に示される
ように酵素活性を復活させることが可能である。

Ｅ−SM＋Ｒ−SH→Ｅ−SH＋Ｒ−SM 以下本発明を固定化ウレアーゼ酵素電極を用い
た血中尿素窒素の測定を例にとつて説明する。

第１図は本実施例で用いた測定系の電極部分の
模式図である。図において、１は酵素電極、２は
参照電極、３はアース電極、４は固定化ウレアー
ゼ膜、５はアンモニウム選択透過膜、６及び７は
イオン透過膜、８，９及び１０はAg−AgCl電
極、１１，１２及び１３は電解質液、１４は細
管、１５は緩衝液、１６は緩衝液の流れの方向を
示す矢印である。

さて、細管１４に緩衝液をキヤリアとして血液
等の試料を少量（例えば10μ）流すと、試料中
に含まれる尿素は酵素電極の固定化ウレアーゼ膜
に接したさいに加水分解され、アンモニウムイオ
ンが生じる。アンモニウムイオンはアンモニウム
選択透過膜の膜電位を変化させ、その結果、酵素
電極と参照電極の間に試料中に尿素濃度に依存し
た電位変化が生じる。

通常この種の測定において、電位をとり出す電
極としてAg−AgCl電極が最も安定性に優れてい
ることが知られている。AgClの水に対する溶解
度は小さい（溶解度積1.7×10^-10（25℃））が、微
量のAg⁺は電解質液１１〜１３中に常に存在し、
またアンモニウムイオンによりさらにAgClの一
部は錯塩（例えば〔Ag（NH₃）₂〕⁺Cl）として溶解
する。

アンモニウム選択透過膜５は親水性に欠けるた
め、電解質液１１中に溶存するAg⁺は膜を通して
外部に出難いと考えられるが、微量のAg⁺は透過
する。電解質液１２及び１３中に溶存するAg⁺は
イオン透過膜６及び７を通して容易に外部に拡散
してくる。

本測定系においては、緩衝液１５が流れている
限り電極２及び３に由来するAg⁺は流去し、酵素
膜４に捕捉されにくいが、１５の流れが止まると
Ag⁺は自然拡散して酵素膜に達し、ウレアーゼの
活性を阻害する。

本発明者等の実験によると、電極１，２及び３
を１cm間隔で配置した場合、装置を停止してから
15h以内で固定化ウレアーゼ膜４の活性が完全に
失われた。そこで細管１４に50ｍＭメルカプトエ
タノール溶液を満たし4h放置した後再測定を行
つたところ、ウレアーゼ膜の活性は約80％回復し
た。また、同様に完全に失活したウレアーゼ膜を
50ｍＭメルカプトエタノール溶液に8h接触させ
ておいたところ、膜の活性は完全に回復した。一
方、装置を停止してから直ちに細管１４にメルカ
プトエタノール溶液を満たし、15h後にウレアー
ゼ膜の活性を測定したところ、全く減衰は認めら
れなかつた。

固定化酵素電極の代りに固定化酵素リアクタと
アンモニウム電極を一対として用いた場合にも上
記と同様の効果を示した。

第１図に示した装置による実験とは別に、いく
つかのSH酵素について原理的な実験を行つた。
すなわち、アルコールデヒドロゲナーゼ、アスパ
ラキナーゼ、β−アミラーゼ、ウレアーゼ、フル
クトースジホスフアターゼ、α−グルコシダーゼ
をそれぞれセルロースアセテート膜に固定化し実
験試料とした。フイルタで２室に仕切つた容器を
用意し、各室に60ｍＭリン酸緩衝液を10ｍずつ
入れ、一方に10μM硝酸銀溶液100μ、他方に固
定化酵素膜の小片を加えた。４℃、15h放置後酵
素活性を測定したところ、いずれも活性は消失し
ていた。一方固定化酵素膜を加える方の室に1M
メルカプトエタノール溶液100μをあらかじめ
添加しておき、上記と同様に４℃、15h放置後酵
素活性を測定した。別にコントロールとして、緩
衝液中に固定化酵素膜を入れ、４℃、15h放置し
た。前記酵素膜の酵素活性は、コントロールと比
較して、減衰は認められなかつた。

SH酵素を使用した分析装置（酵素電極、酵素
リアクタ等を備えた分析装置）においては、前記
のように、測定休止中常に固定化酵素を低分子
SH化合物に接触させておくと、重金属、とくに
一価の重金属による酵素の失活が防止出来ること
が明らかになつた。ここで休止中というのは、１
夜程度の休止も数日間の休止も含むものである。

一般に固定化酵素膜は時間の経過と共に徐々に
活性が低下するが、その原因の一つとして重金属
による失活が考えられる。重金属の起源は、前記
のように、各種電極に由来するAg⁺の如く明確な
ものもあるが、使用する試薬中などに不純物とし
て含まれているものもある。これらの微量重金属
も長期的にみると酵素の寿命を低下する要因とな
つている。このような不純物として測定系に入り
込む微量重金属をSH基を有する化合物により捕
捉し、系外に除去出来る。

SH基を有する化合物は還元性物質であるが、
これが目的とする測定に影響を与えない場合には
緩衝液中に添加しておくことが可能である。この
場合のSH基を有する化合物の濃度は、0.1〜100
ｍＭの範囲が好ましく、５〜50ｍＭの範囲がより
好ましい。100ｍＭを越える濃度としてもさしつ
かえないが、不経済であり、かつ悪臭を伴うので
好ましくない。また0.1ｍＭ未満では溶液を多量
に流す必要があり、同様に経済的でない。

SH基を有する化合物としては、緩衝液に溶解
するものであればいかなるものでもよいが、とく
に低分子量のものが溶解しやすいので好ましい。
このような化合物としては、メルカブトエタノー
ル、グルタチオン、システイン、チオグリコール
酸、２−メルカブトエタノールアミン、ベンゼン
チオール、パラチオクレゾール、ジチオスレイト
ール等多くのSH化合物が使用出来る。

本発明の他の方法として、酵素電極と参照電極
の間の液の流路に一価重金属の捕捉剤を詰めたト
ラツプを配置する方法がある。一価重金属の捕捉
剤としては、SH基を有する不溶性物質、例えば
SH化ポリスチレン微粒子などがある。この微粒
子を前記のように流路中に配置し、その前後を微
粒子の流出を防止するため、親水処理したポリエ
ステル不織布などの多孔質膜を配置する。この方
法によつても、参照電極、アース電極から流出す
る一価重金属から酵素電極を保護することができ
る。

酵素電極の代わりに酵素リアクタとアンモニウ
ム電極を用いた場合も同様である。この場合、ア
ンモニウム電極からのAg⁺の流出は、参照電極の
それと比較して極めて少ないので、一価重金属の
捕捉剤を詰めたトラツプは、リアクタと参照電極
の間の流路に配置すれば、アンモニウム電極の上
流側でも下流側でもさしつかえない。しかし通常
は、リアクタとアンモニウム電極の間に設けるこ
とが好ましい。

測定休止時間が長く、すなわち捕捉剤の使用時
間が長く、捕捉剤が多量の重金属を吸着したとき
は、SH基を有する化合物、例えばメルカプトエ
タノールを含む緩衝液をトラツプに流すことによ
り、前述の式からも分かるように重金属捕捉剤と
しての機能を容易に再生させることができる。

本発明のさらに他の方法は、測定休止中にも、
緩衝液を間歇的に流路に流す方法である。すでに
述べたように、重金属は、主として参照電極、ア
ース電極から流出するものであるから、第１図の
如く緩衝液の流路の上流側から、酵素電極、参照
電極、アース電極と配置し、測定休止中も緩衝液
を常時流し続ければ酵素電極は失活しない。しか
し、これは経済的な面から実用的でない。そのた
め、前述の如く緩衝液を間歇的に流路に流せばよ
い。

前記酵素電極と参照電極との間の流路の長さ
は、通常15〜150mmであることが好ましく、20〜
50mmであることがより好ましい。両電極をこのよ
うな間隔で配置したとき、５〜10時間の間隔で、
両電極間の流路に存在する緩衝液の容量の１〜20
倍、より好ましくは２〜10倍の容量の新らしい緩
衝液を流せばよい。例えば、細管が1φ位である
とき10〜50mlの液を流せばよい。もちろん、上記
間隔よりも短かい間隔で、又は液量を多く流して
さしつかえないが経済的ではない。

〔発明の実施例〕

以下、本発明を実施例を用いて説明する。

第２図に本発明の装置の一実施例を示す。第２
図ａは酵素電極を用いた分析装置の原理図であ
り、第２図ｂは酵素リアクタを用いた分析装置の
原理図である。図において、１，２，３はそれぞ
れ酵素電極、参照電極、アース電極である。また
２２はウレアーゼを固定化した酵素リアクタ、２
３はアンモニウム電極である。１４は細管、１５
はキヤリア緩衝液、１７は送液ポンプ、１８は試
料注入器、１９は電極を保持するセル、２０はプ
リアンプ、２１は記録計である。キヤリア緩衝液
をセルに流しながら試料注入器より微量（例えば
10〜20μ）の試料を流路系に注入すると試料は
電極に達し、あるいはリアクタで分解されてから
電極に達し、濃度に応じた信号が得られる。ここ
で緩衝液にSH基を有する化合物としてメルカプ
トエタノール５ｍＭを添加しておくと、流路系に
流出あるいは混在した重金属は常にSH基を有す
る化合物に捕捉され、固定化酵素の重金属により
劣化は防止出来る。このように測定中止時のみな
らず、測定中をSH基を有する化合物が緩衝液中
にあつても、ウレアーゼを固定化した感応膜を有
する酵素電極又はリアクタには悪影響を与えな
い。

第２図は固定化ウレアーゼを用いて尿素を測定
する装置の例を示したものであるが、同一流路系
に多くの固定化酵素を用いた電極等を設置し、多
項目同時測定を行なう装置を第３図に示す。この
場合、例えばグルコース測定用電極等は還元物質
の影響を受けるので、キヤリア緩衝液中に上記物
質を添加しておくと測定精度を低下させることに
なる。図において、２４はウレアーゼのような
SH酵素電極用のセル、２５は参照電極等を備え
たセル、２６はグルコース測定用などの他の電極
を備えたセルを示す。また２７はSH化合物を含
む緩衝液、２８及び２９は流路切り換え弁であ
る。測定中はSH化合物を含まないキヤリア緩衝
液を流路系に流しておく。測定休止あるいは停止
中は弁２８及び２９を切りかえて、SH化合物を
含む緩衝液２７をセル２４だけを通るように流す
か、あるいは緩衝液２７を短時間流路に流したの
ち、ポンプをとめ、液をこの流路系に満たしてお
く。このようにして、他の電極に影響を及ぼすこ
となく、SH酵素電極の劣化を防止することが出
来る。緩衝液２７は適宜交換すれば良い。

なお、メルカプトエタノールに代えて、グルタ
チオン、システイン、チオグリコール酸、２−メ
ルカプトエチルアミン、ベンゼンチオール、パラ
チオクレゾール、ジチオスレイトールなどを用い
た場合も同様の結果を得た。

さらに他の実施例として一価重金属の捕捉剤を
詰めたトラツプを設けた例を第４図を示す。平均
粒径約0.3mmφのポリスチレン微粒子を、公知の
方法により表面にSH基をもたせ、SH化ポリスチ
レン微粒子を得た。このSH化ポリスチレン微粒
子４１を直径２mmφの細管に10mmφの長さに詰
め、その前後に親水処理したポリエステル不織布
の多孔質膜４２，４３を配置して微粒子の流出を
防止した。第４図は、分析装置の一部分を示した
が、この上流側には緩衝液の容器、送液ポンプ、
試料注入器など設けることは、第２図ａと同じで
ある。この装置により試料測定後、15時間送液を
止めて放置し、再び送液を開始して試料を測定し
たが酵素電極の失活は全くみられなかつた。

一方、比較のためSH化ポリスチレン微粒子を
除いて同様の実験を行なつたところ、測定休止15
時間で、酵素電極は完全に失活した。

つぎに間歇的に緩衝液を流す実施例を示す。第
２図ａに示した構造の分析装置を用い、緩衝液１
５として60ｍＭ（pH7.4）のりん酸水溶流を、細
管１４として内径0.5mmのチユーブを使用した。
ただしセル１９内の流路は内径１mmとした。酵素
電極１、参照電極２、アース電極３をそれぞれ20
mmの間隔で配置し、ポンプは、２ml／minの速度
で緩衝液を流すようにし、試料注入器１８から試
料（血清）10μを注入し分析した。測定を８時
間続けたのち、ポンプを止め、あと16時間の間
は、電子装置（図示せず）により、６時間おきに
ポンプを５分間作動させた。このようにして、60
日間測定をくり返し、約5000検体を分析したが、
酵素電極の劣化はみられなかつた。

一方、比較のため、16時間の測定休止中はポン
プを全く作動させなかつたところ、16時間後にポ
ンプを動かしても酵素電極は、失活していた。

〔発明の効果〕

本発明によれば、SH酵素を固定化した酵素膜
を用いる酵素電極あるいは上記酵素を固定化した
リアクタの寿命を著しく高めることができる。

【図面の簡単な説明】

第１図は、本発明の一実施例による酵素電極を
用いた分析装置の電極部分の模式図、第２図ａ，
ｂは、酵素電極を用いた分析装置及び酵素リアク
タを用いた分析装置の原理図、第３図は、酵素電
極を用いた多項目同時分析装置の原理図、第４図
は、捕捉剤トラツプを設けた分析装置の部分模式
図である。 １……酵素電極、２……参照電極、３……アー
ス電極、４……固定化酵素膜、５……アンモニウ
ム選択透過膜、６，７……イオン透過膜、８，
９，１０……Ag−AgCl電極、１１，１２，１３
……電解質液、１４……細管、１５……緩衝液、
１６……流れ方向、１７……ポンプ、１８……試
料注入器、１９……セル、２０……プリアンプ、
２１……記録計、２２……酵素リアクタ、２３…
…アンモニウム電解、２４……SH酵素電極用セ
ル、２５……参照電極用セル、２６……電極セ
ル、２７……SH基を有する化合物を含む緩衝液、
２８，２９……切り換え弁、４１……SH化ポリ
スチレン微粒子、４２，４３……多孔質膜。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ SH基を有する酵素を固定化した酵素膜を感
   応膜とする酵素電極と参照電極とを含む固定化酵
   素を用いた生化学用測定装置において、前記酵素
   電極と前記参照電極をつなぐ流路中に、SH基を
   有する不溶性物質からなる重金属捕捉剤を収納す
   るトラツプを設け重金属を捕捉することを特徴と
   する固定化酵素を用いた生化学用測定装置。 ２ 上記酵素が、ウレアーゼ、アルコールデヒド
   ロゲナーゼ、又はアスパラキナーゼのいずれかで
   あることを特徴とする特許請求の範囲第１項に記
   載の固定化酵素を用いた生化学用測定装置。 ３ 前記重金属捕捉剤が表面にSH基が結合され
   たポリスチレン微粒子であることを特徴とする特
   許請求の範囲第１項に記載の固定化酵素を用いた
   生化学用測定装置。 ４ SH基を有する化合物を含む緩衝液を前記ト
   ラツプに流し前記金重属捕捉剤の重金属捕捉剤性
   能を回復させることを特徴とする特許請求の範囲
   第１項に記載の固定化酵素を用いた生化学用測定
   装置。 ５ SH基を有する酵素を固定化した酵素リアク
   タ、この酵素リアクタにおける生成物を検知する
   検知電極、及び参照電極を含む固定化酵素を用い
   た生化学用測定装置において、前記酵素リアクタ
   と前記検知電極をつなぐ流路中に、SH基を有す
   る不溶性物質からなる重金属捕捉トラツプを設け
   重金属を捕捉することを特徴とする固定化酵素を
   用いた生化学用測定装置。 ６ 上記酵素が、ウレアーゼ、アルコールデヒド
   ロゲナーゼ、又はアスパラキナーゼのいずれかで
   あることを特徴とする特許請求の範囲第５項に記
   載の固定化酵素を用いた生化学用測定装置。 ７ 前記のSH基を有する不溶性物質が、表面に
   SH基が結合されたポリスチレン微粒子であるこ
   とを特徴とする特許請求の範囲第５項に記載の固
   定化酵素を用いた生化学用測定装置。 ８ SH基を有する化合物を含む緩衝液を前記ト
   ラツプに流し前記重金属捕捉剤の重金属捕捉剤性
   能を回復させることを特徴とする特許請求の範囲
   第５項に記載の固定化酵素を用いた生化学用測定
   装置。