DE3347104C2 - Verfahren zur Messung von gelösten Bestandteilen und Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens - Google Patents

Abstract

Eine Enzymelektrode mit einem SH-Enzym, d. h. einem Enzym, dessen SH-Gruppen an der enzymatischen Aktivität beteiligt sind, oder ein Reaktor mit einem immobilisierten SH-Enzym wird in Kontakt mit einer Lösung einer SH-Verbindung, wie Mercaptoäthanol gebracht. Dadurch wird die Lebensdauer (zwischen den Messungen) der für die Messung von gelösten Bestandteilen verwendeten Elektrode bzw. des Reaktors erhöht.

Description

dadurch gekennzeichnet, daß man in der Fließstrecke zwischen (a) und (b) eine Schwermetallionenfalle vorsieht

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man eine Schwermetailionenfalle mit unlöslichen SH-Verbindungen verwendet

3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daS man als unlösliche SH-Verbindungen mercaptanisierte Polystyrolteilchen verwendet, die mittels poröser Membranen fixiert sind.

4. Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 3, mit einer Enzymelektrode mit einer immobilisierten Enzymmembran als Fühlmembran und einer Bezugselektrode, dadurch gekennzeichnet, daß in der Fließstrecke zwischen der Enzy.melektrode (1) und der Bezugselektrode (2) eine Einrichtung (41,42,43) zum Abfangen von Schwerrnetallionen vorgesehen ist

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Messung von gelösten Bestandteilen bei dem

(a) eine Enzymelektrode mit einer immobilisierten Enzymmembran als Fühlmembran oder ein immobilisierter Enzymreaktor und

(b) eine Bezugselektrode Verwendung finden,

sowie eine Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens.

Das erfindungsgemäße Verfahren eignet sich besonders zur Messung von gelösten Bestandteilen im Blut und anderen Körperflüssigkeiten unter Verwendung eines SH-Enzyms.

Enzymelektroden, die eine Kombination einer immobilisierten Enzymmembran, die gegenüber dem Substrat (die zu messende Substanz) spezifisch reagiert, mit einer lonenelektrode oder dergleichen umfassen, wurden erstmals vor mehr als 10 Jahren entwickelt; G.G. Guilbault, Handbook of Enzymatic Method of Analysis, Marcel Dekker, New York, 1976. Bis zum gegenwärtigen Zeitpunkt haben mehrere dieser Enzymelektroden die Praxisreife erreicht. Diese Elektroden sind jedoch immer noch mit einer Reihe von ungelösten Schwierigkeiten behaftet. Eine Schwierigkeit besteht in der kurzen Lebensdauer. Es werden nämlich insbesondere SH-Enzyme, die für ihre katalytische Wirkung eine oder mehrere SH-Gruppen benötigen, durch Spurenmengen an Schwermetallen inaktiviert. Einige Metallionen, die zur Bildung von Chelatverbindungen neigen, lassen sich leicht unter Verwendung von Äthylendiamintetraessigsäure oder ähnlichen Verbindungen aus den inaktivierten Enzymen entfernen, jedoch lassen sich auf die gleiche Weise einwertige Kationen, wie Silber (I), nicht leicht beseitigen. Dies ist häufig der Grund für die kurze Lebensdauer von Enzymelektroden.

Wirkt beispielsweise ein einwertiges Schwermetallion (nachstehend als M⁺ bezeichnet) auf ein Enzym (E-SH), bei dem die freien SH-Gruppen wesentlich für die Enzyniaktivität sind, wird das Schwermetallion leicht gemäß folgender Reaktionsgleichung an da? Enzym gebunden:

M+ + E-SH-E-SM +H⁺

Da die SH-Gruppen eine wesentliche Rolle für die katalytische Aktivität spielen, geht bei Ablauf dieser Reaktion die Enzymaktivität verloren.

Kommt eine SH-Verbindung (als R-SH bezeichnet), die gegenüber M⁺ eine größere Reaktivität besitzt, in Kontakt mit M⁺, so reagiert M⁺ gemäß folgender Reaktionsgleichung:

M+ + R-SM + H +

Dies bedeutet daß eine Inaktivierung des SH-Enzyms nicht erfolgt

Bringt man ferner R-SH in Kontakt mit dem an M ⁺ gebundenen, inaktivierten Enzym, läßt sich die enzymatische Aktivität gern* 3 folgender Gleichung wieder herstellen:

E-SM + R-SH — E-SH + R-SM

In K. Cammann »Das Arbeiten mit ionensensitiven Elektroden«, 2. Auflage (1977), Springer Verlag, werden auf Seite 100—106 Biosensoren beschrieben, das heißt Sensoren, die mit Hilfe ionenselektiver Elektroden biochemisch wichtige Verbindungen anzeigen. Gemäß Seite 105, zweiter Absatz hängt die Lebensdauer derartiger Sensoren von der Stabilität der bioaktiven Verbindung, das heißt des verwendeten Enzyms ah. Im weiteren wird ausgeführt daß ein oft beobachteter Aktivitätsabfall durch bestimmte Schwermetallionen, selbst wenn diese nur in Spuren vorhanden sind, verursacht werden kann, und daß ein solcher Aktivitätsabfall zum Beispiel durch Cystein oder durch Komplexbildner verhindert werden kann. Dieses Verfahren erfordert also, der Meßlösung entweder SH-Verbindungen (wie zum Beispiel Cystein), oder einen Komplexbildner zum Abfangen der Schwermetallionen zuzusetzen.

Aufgabe der Erfindung ist es demgegenüber, ein Verfahren und eine Vorrichtung zur Messung von gelösten Bestandteilen bereit zu stellen, bei dem die Inaktivierung von Enzymelektroden oder immobilisierten Enzymreaktoren durch Schwermetallionen verhindert wird, ohne daß eine Zugabe von Fremdsubstanzen zur Meßlösung erforderlich ist.
Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Messung von gelösten Bestandteilen, bei dem (a) eine Enzymelektrode mit einer immobilisierten Enzymmembran als Fühlmembran oder ein immobilisierter Enzymreaktor und (b) eine Bezugselektrode Verwendung finden, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man in der Fließstrecke zwischen (a) und (b) eine Schwermetailionenfalle vorsieht.

Eine weitere Ausführung der Erfindung betrifft eine Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens, mit einer Enzymelektrode mit einer immobilisierten Enzymmembran als Fühlmembran und einer Bezugselektrode, wobei die Vorrichtung dadurch gekennzeichnet ist, daß in der Fließstrecke zwischen der Enzymelektrode und der Bezugselektrode eine Einrichtung zum Abfangen

von Schwermetallionen vorgesehen ist.

Nachstehend wird die Erfindung anhand der Zeichnungen näher erläutert Es zeigt

F i g. 1 eine schematische Darstellung des Elektrodenteils einer Analysenvorrichtung mit einer Enzymelektrode nach dem Stand der Technik und

F i g. 2 eine ychematische Ansicht einer mit einer Einrichtung zum Abfangen von Schwermetallionen ausgerüsteten Analysenvorrichtung gemäß der Erfindung.

Die Erläuterung erfolgt beispielsweise anhand der Messung von Harnstoff-Stickstoff in Blut unter Verwendung einer Enzymelektrode mit immobilisierter Urease.

F i g. 1 ist eine schematische Darstellung des Elektrodenteils des in diesem Beispie! verwendeten Meßsystems. Die einzelnen Bezugszeichen haben folgende Bedeutung: 1 Enzymelektrode, 2 Bezugselektrode, 3 Erdungselektrode, 4 immobilisierte Urease-Membran, 5 für Ammoniumionen selektive Membran. 6 und 7 ionendurchlässige Membranen, 8,9 und 10 Silber 'Silberchlorid-Elektroden, 11,12 und 13 Elektrolytlösungen, 14 kapillares Rohr- bzw. Schlauchsystem, 15 Pufferlösung und 16 Pfeil zur Angabe der Fließrichtung der Pufferlösung.

Läuft beispielsweise eine geringe Menge einer Blutprobe (z. B. 10 μΐ) durch das Kapillarrohr 14 unter Verwendung der Pufferlösung als Träger, wird der in der Probe vorhandene Harnstoff unter der Einwirkung der immobilisierten Ureasemembran der Enzymelektrode hydrolysiert, was zur Bildung von Ammoniumioneü führt. Die Ammoniumionen verändern das Membranpotential der für Ammoniumionen selektiven Membran, was in Abhängigkeit von der Harnstoffkonzentration der Probe zu einer Potentialänderung zwischen der Enzym- und der Bezugselektrode führt.

Silber/Silberchlorid-EIektroden weisen bekanntlich bei derartigen Bestimmungen eine höhere Stabilität bei der Ermittlung des elektrischen Potentials auf. Obgleich Silberchlorid in Wasser nur sehr wenig löslich ist (Löslichkeitsprodukt 1,7 χ 10-'° bei 25⁰C) sind immer Spuren an Ag⁺ in den Elektrolytlösungen 11 bis 13 vorhanden. Außerdem geht ein Teil des AgCl als Komplex (z. B. [Ag(NHj^]⁺ Ci~) in Assoziation mit Ammoniumionen in Lösung,.

Da die für Ammoniumionen selektive Membran 5 nicht hydrophil ist, wird die Passage von in der Elektrolytlösung 11 vorhandenem Ag⁺ durch die Membran nach außen als schwielig angesehen, jedoch gelangen Spurenelemente an Ag⁺ hindurch. Die in den Elektrolytlösungon 12 und 13 vorhandenen Ag⁺-Ionen diffundieren leicht aus dem System, indem sie die ionendurchlässigen Membranen 6 und 7 passieren.

So lang Pufferlösung 15 durch dieses Meßsystem fließt, werden die von den Elektroden 2 und 3 stammenden Ag ⁺ -Ionen leicht wegtransportiert, so daß sie praktisch nicht von der Enzymmembran 4 cingefangen werden. Wenn jedoch der Pufferstrom stoppt, kommt es selbstverständlich zu einer Diffusion von Ag⁺, das schließlich die Enzymmembran erreicht und die Ureaseaktivität hemmt. Bei dieser Anordnung muß daher auch dann, wenn keine Messungen durchgeführt werden, die Pufferlösung kontinuierlich oder zumindest absatzweise durch das System fließen. Dies ist jedoch unwirtschaftlich.

Im Rahmen von Untersuchungen wurde festgestellt, daß bei Anordnungen der Elektroden 1, 2 und 3 in Abständen von 1 cm die Aktivität der immobilisierten Ureasemembran 4 in^r j?halb von 15 Stunden nach Abschalten der Analysenvorrichtung vollständig verschwand.

Dieser Aktivitätsabbau wird nun erfindungsgemäß dadurch verhindert, daß man in der Fließstrecke der Lösung zwischen der Enzymelektrode und der Bezugselektrode eine Schwermetallionenfalle, die mit einem Abfangmittel für einwertige Kationen gefüllt ist, vorsieht.

Bei diesem Abfangmittel handelt es sich bevorzugt

ίο um unlösliche SH-Verbindungen, besonders bevorzugt feine, mercatanisierte Polystyrolteilchen. Diese Teilchen werden in poröse Membranen, wie z. B. hydrophile Polyester-Faservliese, die die Teilchen fest zusammenhalten, gebracht. Die Schwermetallionenfalle dient als Schutz für die Enzymelektroden gegen einwertige Schwermetallionen, die aus der Bezugs- und der Erdungselektrode eluiert werden.

Entsprechendes gilt bei Verwendung eines Enzymreaktors anstelle der Enzymmembrarr. Die Menge des aus der Ammoniiimelektrode eluierten Ag⁺ ist wesentlich geringer als die aus der Bezugselektrode eluierte Menge. Daher kann die mit dem Abfangmittel gefüllte Schwermetallionenfalle entweder stromaufwärts oder stromabwärts zur Ammoniumelektrode angeordnet werden, solange sie sich in der Fließstrecke zwischen dem Reaktor und der Bezugselektrode befindet Normalerweise ist es am günstigsten, die Falle zwischen dem Reaktor und der Ammoniumelektiode anzuordnen.

Hat das Abfangmittel in der Schwermetallionenfalle während langer Ruhepausen zu große Mengen an Schwermetailionen adsorbiert, so lassen sich freie SH-Gruppen leicht regenerieren, indem man eine Pufferlösung mit einem Gehalt an einer löslichen SH-Verbindung durch die Schwermetallionenfalle laufen läßt

F i g. 2 zeigt eine erfindungsgemäße Vorrichtung, bei der eine Einrichtung zum Abfangen von Schwermetallionen vorgesehen ist. SH-Gruppen werden auf bekannte Weise an der Oberfläche von Polystyrolteilchen mit einer durchschnittlichen Teilchengröße von 0,3 mm gebunden, wodurch man mercaptanisierte Polystyrol-Mikroteilchen erhält. Diese mercaptanisierten Teilchen 41 werden in ein 10 mm langes Kappill&rrohr mit einem Innendurchmesser von 2 mm gepackt. Poröse Membranen 42,43 aus hydrophilem Polyesterfaservlies werden oben und unten auf die gepackte Säule gebracht, um ein Austreten der Teilchen zu verhindern. F i g. 2 ist eine Teilansicht einer Analysenvorrichtung. Stromaufwärts sind ein Gefäß für Pufferlösung, eine Pumpe und ein Probeninjektor angeordnet. Nach der Messung ließ man die Analysenvorrichtung 15 Stunden bei unterbrochenem Flüssigkeitsstrom stehen. Anschließend wurden nach Wiederaufnahme der Flüssigkeitszufuhr P/oben gemessen. Die Ergebnisse ließen keine Hinweise auf eine Inaktivierung der Enzymelektrode zu.

Der gleiche Versuch wurde ohne mercaptanisiertf: Polystyrolteilche'. durchgeführt. Dabei wurde die Enzymelektrode durch die 15-stündige Ruhepause vollständiginaktiviert.

Die vorstehenden Beispiele zeigen, daß erfindungsgemäß die Lebensdauer von Reaktoren mit immobilisierten SH-Enzymen und von Enzymelektroden, bei denen immobilisierte SHF.nzymniembranen verwendet werden, stark verlängert werden kann.

Hierzu t Blatt Zeichnungen

Claims (1)

Patentansprüche:

1. Verfahren zur Messung von gelösten Bestandteilen bei dem

(a) eine Enzymelektrode mit einer immobilisierten Enzymmembran als Fühlmembran oder ein immobilisierter Enzymreaktor und

(b) eine Bezugselektrode Verwendung finden,