JP4255002B2 - 糖化タンパク質割合の測定方法 - Google Patents
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、特定タンパク質中の糖化タンパク質割合を、酵素を用いて測定する場合に有用な測定方法、及びキットに関する。より詳細には、ヘモグロビン中の糖化ヘモグロビン割合、アルブミン中の糖化アルブミン割合のごとき特定タンパク質中の糖化タンパク質割合の測定に有用な測定方法、及びキットに関する。本発明は臨床検査の分野において有用である。
【０００２】
【従来の技術】
近年、糖尿病患者は爆発的に増加しており、ヘモグロビンＡ１ｃ（ＨｂＡ１ｃ）、グリコアルブミン、フルクトサミン、１，５−アンヒドログルシトールなどの血糖コントロールマーカー測定の需要が増加している。なかでもタンパク質中の糖化タンパク質割合で示されるＨｂＡ１ｃ、グリコアルブミンは、個人差が少なく、タンパク質濃度の影響を受けないことから、多用されている。ＨｂＡ１ｃ、グリコアルブミンはこれまで高速液体クロマトグラフ法（ＨＰＬＣ法；特許文献１〜３）や免疫法で測定されてきたが、最近、大量の検体を迅速に処理することが可能であり、かつ正確な酵素法が開発されてきた（特許文献４、５等）。また、本発明者らも正確に糖化タンパク質を測定する目的で、プロテアーゼのグロブリン成分への作用を選択的に阻害する方法（特許文献６）、糖化タンパク質割合の測定方法（特許文献７）を開発してきた。
【０００３】
これらの方法では、別途もしくは同時に特定タンパク質量と糖化タンパク質量を測定し、割合換算をすることから、測定操作が２度必要であり操作が煩雑になる。そこで特定タンパク質中の修飾タンパク質割合に関する方法として、特定タンパク質の一定量を、抗体を用いて固相に吸着させ、その一定量中の修飾タンパク質を測定することにより、別途特定タンパク質を定量することなく修飾タンパク質割合を算出する方法が開発された。（特許文献８、９）。しかしこれらは全て免疫化学的な測定法における修飾タンパク質割合を算出する方法であって、前述の酵素法に適用するには感度不足となり使用することが出来ない。
【０００４】
【特許文献１】
特願昭６０−２２８９６７号公報
【特許文献２】
特開平１−２５７２５７号公報
【特許文献３】
特開平３−２５５３６０号公報
【特許文献４】
特開平６−４６８４６号公報
【特許文献５】
特開平５−１９２１９３号公報
【特許文献６】
特開２００１−５４３９８号公報
【特許文献７】
特開２００１−２０４４９５号公報
【特許文献８】
特開昭６４−１６９６４号公報
【特許文献９】
特開平５−８７８０９号公報
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の課題は酵素を用いて糖化タンパク質割合を正確に測定するに当たり、別途、特定タンパク質を定量することなしに簡便に糖化タンパク質割合を測定する方法およびキットを提供することにある。
さらに具体的には臨床生化学検査における有用な糖化タンパク質割合の測定方法、キットを提供することにある。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
上記の課題を解決するためには、特定タンパク質の一定量を固相に吸着させ、その中の糖化タンパク質量を測定すればよい。最も簡便な固定化方法は前述の抗体を用いた固定化方法であるが、酵素法で測定するには十分な量の特定タンパク質を分離することは困難であった。
そこで本発明者は、鋭意検討した結果、固相上に酵素法で検出しうる十分量の糖化された特定タンパク質を吸着すべく、特定タンパク質に親和性を有する基を導入することにより、酵素で定量可能な量の糖化された特定タンパク質を含む特定タンパク質を結合できること、またその導入量をコントロールすることにより、さまざまな試料においても一定量の特定タンパク質を分離できること、さらに条件によっては吸着液と溶出液を変えずに一定時間後に特定タンパク質の一定量を溶離できることを見出し、本発明の完成に至った。
【０００７】
即ち、本発明は
１）試料を、固相と接触させ、特定タンパク質の一定量を分離し、該タンパク質中の糖化タンパク質量を、酵素を用いて測定することを特徴とする糖化タンパク質割合の測定方法、
２）固相がイオン交換基を導入した固相であり、かつその導入量が試料中の特定タンパク質量より少なく、かつ酵素を用いて測定するに十分感度が取れる量であることを特徴とする上記１）記載の方法、
３）特定タンパク質がアルブミンであり、イオン交換基が弱陰イオン交換基であることを特徴とする上記２）に記載の方法、
４）特定タンパク質がヘモグロビンであり、イオン交換基が弱陽イオン交換基であることを特徴とする上記２）に記載の方法、
５）酵素を用いて測定する方法がプロテアーゼ及び少なくとも糖化アミノ酸に作用する酵素を用いることを特徴とする上記１）〜４）いずれかに記載の方法、
６）試料の中の特定タンパク質に親和性を有し、試料中の特定タンパク質の一定量を分離できる固相、及び該タンパク質中の糖化タンパク質測定用酵素よりなる糖化タンパク質割合測定用キット、
７）固相がイオン交換基を導入した固相であり、かつその導入量が試料中の特定タンパク質量より少なく、かつ酵素を用いて測定するに十分感度が取れる量である上記６）記載のキット、
８）特定タンパク質がアルブミンであり、イオン交換基が弱陰イオン交換基であることを特徴とする上記７）に記載のキット、
９）特定タンパク質がヘモグロビンであり、イオン交換基が弱陽イオン交換基であることを特徴とする上記７）に記載のキット、
１０）糖化タンパク質測定用酵素がプロテアーゼ及び少なくとも糖化アミノ酸に作用する酵素である上記６）〜９）いずれかに記載のキット、
に関する。
さらに詳しくは、臨床生化学検査における糖化タンパク質の測定に有用な試薬、キット及び方法に関する。
【０００８】
【発明の実施の形態】
以下この発明の構成及び好ましい形態について更に詳しく説明する。
本発明に使用しうる試料としては、糖化タンパク質を含有するものであればいかなる試料を用いてもよいが、たとえば血液（全血、血漿、血清、赤血球、溶血液等）、尿、体液、食品、タンパク質製剤などの医薬品などが挙げられ、血液、尿、体液、タンパク質製剤などの医薬品が好ましく、血液、尿、体液が特に好ましく、血液が大変に好ましい。
【０００９】
本発明に使用しうる特定タンパク質としては、試料に含まれるいかなるタンパク質でもその糖化タンパク質割合を測定する意味があるタンパク質であれば測定対象となるが、たとえば、アルブミン、グロブリン成分（α１酸性糖タンパク質、α１アンチトリプシン、αリポタンパク質、ハプトグロビン、α２マクログロブリン、ヘモぺキシン、トランスフェリン、βリポタンパク、フィブリノーゲン、免疫グロブリン等）、ヘモグロビンなどが好ましく、アルブミン、ヘモグロビンが特に好ましい。
本発明に使用しうる固相としては、特定タンパク質に親和性を示し、試料中の特定タンパク質を吸着しうるものであれば如何なる固相を用いてもよい。特定タンパク質に親和性を持たせるには、イオン交換基を導入した固相が、特定タンパク質を吸着できる量が多く、また価格も安い点で好ましい。
【００１０】
イオン交換基を導入する際の固相の材質としては、セルロース、セファロース、シリカゲル、各種ポリマー（たとえばポリスチレンやポリビニルアルコール、ポリアクリロニトリル）、共重合体（例えばメタクリル酸やアクリル酸などを架橋剤（例えばジビニルベンゼンやジビニルトルエン）で架橋させて重合したものなど））、ラテックス、磁性体、または紙等が好ましい。
固相の形状としては、粒状、膜状、シート状及び繊維状などが好ましく、粒状及び膜状が特に好ましく、粒状が大変に好ましい。また、測定用装置の一部となった形状も大変に好ましい。
【００１１】
測定用装置における固相の形態としては、通常の生化学測定と同様に液体をセルに入れて測定を行う場合には、前処理カラムのような形態が大変に好ましく、イオン交換基を導入したセルロース、セファロース、シリカゲル、各種ポリマー、ラテックスや磁性体の粒状、膜状または繊維状物、あるいはシート状の紙を固相としてカラム内に充填して用いればよい。ラテックスの場合、検体測定用の汎用機器を用いた場合にプレートが不要となり、簡便となる点で好ましい。また、磁性体の場合、イオン交換基を導入した超微粒子磁性ビーズと強力磁気による分離システムが、洗浄操作が簡便になる点、分離精度が向上するために測定精度が向上する点で好ましい。また、微小流路が形成されているチップ（例えばマイクロチップ等）を用いたポイントオブケア用の簡便装置の場合には、チップ内の溝を液体が流れていくタイプのものであればその流路壁に直接イオン交換基を導入してもよい。
【００１２】
電極を用いて検出したり、発色を検出する場合には、前述の材質の中で、通常、電極用や比色計用に用いられる材質であれば何を用いてもよいが、膜やろ紙などにイオン交換基を導入しても良い。また公知の方法であればこれ以外の方法も用いることが出来る。
固相へ導入する交換基の量は、試料中の特定タンパク質量より少なく、かつ酵素を用いて測定するに十分感度が取れる量であればいかなる量を用いてもよいが、特定タンパク質がアルブミン若しくはヘモグロビンである場合にはイオン交換基の量として０．０１〜１００ｎｍｏｌが好ましい。また、イオン交換基の量を試料中の特定タンパク質より少なくする方法として、試料の量を増減することで調節する方法も好ましい。
【００１３】
導入するイオン交換基としては、陰イオン交換基と陽イオン交換基が挙げられる。特定タンパク質がアルブミンである場合には弱陰イオン交換基や弱陽イオン交換基が好ましく、特定タンパク質がヘモグロビンである場合には弱陽イオン交換基が好ましい。弱陰イオン交換基の好ましい例としては、ジエチルアミノ基、ジエチルアミノエチル基やピリジン基などの弱塩基およびその誘導体が好ましく、弱陽イオン交換基としてはカルボキシメチル基やカルボキシル基（アクリル酸やメタクリル酸の共重合体）等の弱酸基が好ましいが、特定タンパク質の吸着に特異性を有するイオン交換基であれば、それ以外の交換基を用いてもよい。交換基の導入方法は公知の方法を用いれば良い。
【００１４】
本発明に用いることの出来る洗浄液としては、陰イオン交換基を導入した固相の場合は酸性〜中性の緩衝液、陽イオン交換基を導入した固相の場合は中性〜塩基性の緩衝液が挙げられる。交換基の性状に合わせて、緩衝剤の種類や濃度を適宜調製して用いればよい。例えば、弱陰イオン交換基を導入した固相の場合は、１〜５０ｍＭ程度の酸性〜中性の緩衝液を用いればよく、弱陽イオン交換基を導入した固相の場合は、１〜５０ｍＭ程度の中性〜塩基性の緩衝液を用いればよい。
洗浄後、通常は後述の溶出液を用いて特定タンパク質を溶離するが、特定タンパク質を固相上に吸着したまま、酵素反応による糖化タンパク質量の測定を行なってもよい。
【００１５】
本発明に用いることの出来る溶出液としては、イオン交換樹脂で用いられているの公知の溶出方法を用いればよい。例えば、陰イオン交換基を導入した固相においてはアルカリ性、陽イオン交換基を導入した固相においては酸性の緩衝液を用いるか、陰イオン交換基及び陽イオン交換基において、イオン強度を上げた緩衝液を用いるか、塩を添加してイオン強度を上げた溶液を用いればよく、またこれらを単独で用いても同時に組みあわせて用いても良い。緩衝液の具体例としては、弱陰イオン交換基を導入した固相の場合は、アルカリ性の緩衝液、弱陽イオン交換基を導入した固相の場合は、酸性の緩衝液が好ましい例として挙げられる。イオン強度を上げた溶液の具体例としては、０．１〜１０Ｍ程度の緩衝液にしてイオン強度を上げた溶液、洗浄液に０．１〜１０Ｍ程度の塩を添加してイオン強度を上げた溶液などが挙げられる。尚、本明細書では、特定タンパク質を溶出液で溶離して得た液を『溶出溶離液』ということがある。
【００１６】
本発明に使用しうる糖化タンパク測定用酵素としては、糖化タンパク質を測定できる酵素であれば何でもよく、１種又は２種以上の酵素の組み合わせであってもよい。こ（れら）の酵素は目的の活性が発現すれば、精製物であっても非精製物であってもよい。好ましい一例として、プロテアーゼおよび少なくとも糖化アミノ酸に作用する酵素の組み合わせが挙げられる。
プロテアーゼおよび少なくとも糖化アミノ酸に作用する酵素を用いて糖化タンパク質を測定するには、まず糖化タンパク質をプロテアーゼにより糖化アミノ酸若しくは糖化ペプチドレベルまで分解し、少なくとも糖化アミノ酸に作用する酵素を作用させ、糖化アミノ酸を酸化し、生成するグルコソン若しくは過酸化水素を測定すれば良く、また減少する酸素を公知の方法で測定すればよい。
【００１７】
本発明に使用し得るプロテアーゼとしては、臨床検査に使用できるものであればいかなるプロテアーゼを用いても良いが、試料中の糖化タンパク質に有効に作用し、かつ当該タンパク質由来の糖化アミノ酸及び／若しくは糖化ペプチドを有効に生成するものが好ましく、例えばトリプシン（Tripsin）、キモトリプシン（Chymotripsin）等の動物由来のプロテアーゼ、パパイン（Papain）、ブロメライン（Bromelain）等の植物由来のプロテアーゼ、微生物由来のプロテアーゼ等が挙げられる。
【００１８】
微生物由来のプロテアーゼの例としては、ズブチリシン（Subtilisin）等に代表されるバチルス（Bacillus）属由来プロテアーゼ、プロテアーゼタイプ-XIII（シグマ社製）等に代表されるアスペルギルス（Aspergillus）由来プロテアーゼ、ＰＤ酵素（キッコーマン社製）等に代表されるペニシリウム（Penicillium）由来プロテアーゼ、プロナーゼ(Pronase) 等に代表されるストレプトマイセス（Streptomyces）由来プロテアーゼ、エンドプロテイナーゼLys-c（シグマ社製）等に代表されるリソバクター（Lysobacter）由来プロテアーゼ、プロテイナーゼA（Proteinase A;シグマ社製） 等に代表される酵母（Yeast）由来プロテアーゼ、プロテイナーゼK（Proteinase K;シグマ社製）等に代表されるトリチラチウム（Tritirachium）由来プロテアーゼ、アミノペプチダーゼT（Aminopeptidase T;ベーリンガー・マンハイム社製）等に代表されるサーマス（Thermus）由来プロテアーゼ、エンドプロテイナーゼAsp-N（EndoproteinaseAsp-N;和光純薬社製）等に代表されるシュードモナス（Pseudomonus）由来、リジルエンドペプチダーゼ（Lysylendopeputidase和光純薬社製）等に代表されるアクロモバクター（Achromobacter）由来プロテアーゼが挙げられる。これらの具体的な例は単なる１例に過ぎず、なんら限定されるものではない。
【００１９】
本発明に用いることの出来るプロテアーゼの活性測定法としては、カゼインフォリン法が挙げられる。活性の定義は、１分間、３７℃において１μｇのチロシンに相当する発色を１Ｕとした。
本発明に使用しうる少なくとも糖化アミノ酸に作用する酵素の例としては、糖化アミノ酸及び／または糖化ペプチドに良好に作用する酵素であれば、いかなる酵素を用いてもよく、例えば、αアミノ基が糖化された糖化アミノ酸及び／又は糖化ペプチドに作用する酵素、αアミノ基が糖化された糖化アミノ酸若しくはペプチドに特異的に作用し、実質的にεアミノ基が糖化された糖化アミノ酸には作用しない酵素、αアミノ基が糖化された糖化アミノ酸若しくはペプチドに特異的に作用し、実質的にαアミノ基が糖化された糖化アミノ酸には作用しない酵素、αアミノ基及びεアミノ基が糖化された糖化アミノ酸若しくはペプチドに作用し、プロテアーゼと共存させた状態でも充分な活性を有する酵素などが挙げられる。具体的な酵素種としては、ケトアミンオキシダーゼが好ましい一例として挙げられる。また、糖化アルブミンを測定対象とする場合には、εアミノ基が糖化されたε糖化アミノ酸若しくは糖化ペプチドに作用する酵素が好ましく、糖化ヘモグロビンを測定対象とする場合には、αアミノ基が糖化されたα糖化アミノ酸若しくは糖化ペプチドに作用する酵素が好ましい。
【００２０】
εアミノ基が糖化された糖化アミノ酸に作用する酵素の例としては、ギベレラ（Gibberella）属、アスペルギルス（Aspergillus）属、カンジダ（Candida）属、ペニシリウム（Penicillium）属、フサリウム（Fusarium）属、アクレモニウム（Acremonium）属又はデバリオマイゼス（Debaryomyces）属由来のケトアミンオキシダーゼ等、が挙げられる。
αアミノ基が糖化された糖化アミノ酸若しくはペプチドに作用する酵素の例としては、上記εアミノ基が糖化された糖化アミノ酸に作用する酵素及びコリネバクテリウム（Corynebacterium）由来の酵素が挙げられる。
【００２１】
また、αアミノ基が糖化された糖化アミノ酸若しくはペプチドに特異的に作用し、実質的にεアミノ基が糖化された糖化アミノ酸には作用しない酵素としてはコリネバクテリウム（Corynebacterium）由来の酵素が知られている。一方εアミノ基が糖化された糖化アミノ酸若しくはペプチドに特異的に作用し、実質的にαアミノ基が糖化された糖化アミノ酸には作用しない酵素としては遺伝子操作フルクトサミンオキシダーゼ（FODVII；旭化成社製；PCT/JP02/0072）が知られている。
【００２２】
さらに、αアミノ基及びεアミノ基が糖化された糖化アミノ酸若しくはペプチドに作用し、プロテアーゼと共存させた状態でも充分な活性を有する酵素の例としては、遺伝子組み替え型フルクトサミンオキシダーゼ（FODII；旭化成社製）が挙げられる。
糖化アミノ酸に作用する酵素の活性は特開２００１−２０４４９５（糖化タンパク質割合測定方法）記載の方法にて測定し、３７℃で１分間に１μｍｏｌの過酸化水素を生成する酵素量を１Ｕと定義した。
【００２３】
さらに本発明に基づく酵素を用いた糖化タンパク質の検出には、例えば、発色成分、妨害物質の消去系成分、界面活性剤、塩類、緩衝剤、ｐＨ調製剤や防腐剤などを適宜選択して添加しても良い。
本発明に使用しうる試料を、固相と接触させ、特定タンパク質の一定量を分離し、該タンパク質中の糖化タンパク質を、酵素を用いて測定するキットとしては、前述の固相の形状、材質を適宜選択し、やはり前述の適当な濃度のイオン交換基を導入した固相を適時選択すればよく、用いる酵素としては、分離した一定量の特定タンパク質を定量できるように組成を決定すれば良い。
【００２４】
また妨害物質の消去系を組み込む場合、例えば生化学的な測定、マイクロチップ、電極、ラテックスや磁気ビーズのように段階的に試薬を添加できる場合には、糖化アミノ酸を消去した後に糖化タンパク質を測定する場合は、第一試薬にケトアミンオキシダーゼ含有試薬を用い、第二試薬にプロテアーゼ及びカップラーを処方すれば良い。アスコルビン酸、過酸化水素の消去系を組み込む場合には、第一試薬のケトアミンオキシダーゼ含有試薬に例えばアスコルビン酸オキシダーゼ、パーオキシダーゼ等を処方すれば良い。また膜を用いる場合には第一の層に消去系の酵素を固定化し、第二の層に検出系の酵素を固定化するなど適宜工夫すればよい。電極を検出に用いる場合は消去系の試薬を被検液（試料、溶出溶離液、溶出溶離液を適当な酵素で処理した液等）と混合し処理を行った後検出を行えばよい。また、これらの方法以外の組み合わせを用いても良い。
また、消去反応は被検液（試料、溶出溶離液、溶出溶離液を適当な酵素で処理した液等）から特定タンパク質を吸着する前に行なっても良く、被検液から特定タンパク質を吸着し、その固相上で行なってもよく、特定タンパク質を吸着し、洗浄、溶出して得た溶出溶離液に対して行なっても良い。
【００２５】
本発明に使用し得るケトアミンオキシダーゼ及びプロテアーゼの濃度としては、液状で使用する場合にはケトアミンオキシダーゼ濃度として０．１〜５００Ｕ／ｍｌの濃度で使用すれば良く、好ましくは０．５〜２００Ｕ／ｍｌ、最も好ましくは１．０〜１００Ｕ／ｍｌであるがこれ以外の量を用いても良い。またプロテアーゼの濃度としては０．１Ｕ〜１ＭＵ／ｍｌの濃度で使用すれば良く、好ましくは１Ｕ〜５００ＫＵ／ｍｌ、最も好ましくは５Ｕ〜１００ＫＵ／ｍｌであるがこれ以外の量を用いても良い。酵素類を膜やビーズ、流路壁に固定化する場合には、試料との接触時間、接触量、温度、検出器の感度によって、液状で使用したの濃度から換算して、十分に反応が検出できる量が固定化できていれば良い。
【００２６】
本発明を用いて、たとえば被検液中の糖化アミノ酸を消去した後に糖化タンパク質中の糖化アミノ酸を測定する場合には、まず、一定量の被検液０．０１〜１０００μｌ程度に、ケトアミンオキシダーゼ含有試薬、例えば０．１〜５０００μｌ程度を１〜６０分程度作用させれば良く、これ以外の量や時間を選択しても良い。また、前述のように試薬の作用は膜上等で行ってもよく、分離された一定量の特定タンパク質中の糖化アミノ酸を十分消去できる量であればよい。次に前記反応後にプロテアーゼ試薬を作用させ、定量を行えば良い。
【００２７】
また、当然プロテアーゼを先に作用させ、被検液中の特定タンパク質をアミノ酸、ペプチドレベルまで分解した後にケトアミンオキシダーゼを作用させてもよい。
以上のことから、本発明に於ける、試料を、固相と接触させ、特定タンパク質の一定量を分離し、該タンパク質中の糖化タンパク質を酵素を用いて測定するキットとしては、分離部分は前処理カラムのような形状で提供されても良く、磁性ビーズやラテックスの状態で提供されてもよく、マイクロチップの流路壁に固定化されても良く、膜やろ紙上に固定化されて提供されても良い。酵素を用いて糖化タンパク質を測定する部分は、例えば液状品及び液状品の凍結物あるいは凍結乾燥品として提供でき、また、膜や電極上、マイクロチップの流路壁上に固定化された状態で提供されてもよい。
【００２８】
【実施例】
以下に、本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明は以下の例によって何ら限定されるものではない。
【００２９】
［実施例１］
特定タンパク質を一定量分離する固相の合成、性能評価
１）ジエチルアミノ基の固相への導入
水酸基にエポキシ基を導入することにより活性化し、イオン交換基を導入する。水酸基密度８．０ｍｅｑ／ｇ、比表面積８１ｍ2／ｇのポリビニルアルコール樹脂（粒状：昭和電工社製）に、エピクロルヒドリン５０ｍｅｑ／ｇ、ジメチルスルホキシド１０ｍｌ／ｇ樹脂、水酸化ナトリウム５ｍｅｑ／ｇ樹脂を添加し３０℃で２０時間反応させ、純水で洗浄しエポキシ活性化樹脂を得た。次にジエチルアミン３．５ｍｅｑ／ｇ樹脂をｐＨ１０、３０℃で２０時間反応させ、純水で洗浄しジエチルアミノ基を導入し、ジエチルアミノ基を導入したポリマー（粒状）を得た。ジエチルアミノ基を導入したポリマーの水酸基密度は４．９ｍｅｑ／ｇジエチルアミノ基０．５ｍｅｑ／ｇであった。
【００３０】
２）カルボキシメチル基の固相への導入
１）と同様の操作を行ってエポキシ活性化樹脂を作成し、ジエチルアミンのかわりにクロロ酢酸ナトリウムを反応させカルボキシメチル基を導入したポリマー（粒状）を得た。ポリマーの水酸基密度は４．５ｍｅｑ／ｇジエチルアミノ基０．４８ｍｅｑ／ｇであった。
【００３１】
３）ジエチルアミノ基を導入したポリマーの性能評価
実施例１の１）で得たジエチルアミノ基を導入したポリマー１０ｍｇをキャピラリーに詰め、段階希釈したアルブミン水溶液１０μｌを注入し、洗浄液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ緩衝液 ｐＨ８．５）５０μｌで余分なアルブミンを洗浄除去し、溶出溶離液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ緩衝液 ｐＨ８．５、２２０ｍＭ ＭｇＣｌ2）２０μｌで吸着したアルブミンを溶出した。溶出した溶液中のアルブミン量は市販のアルブミン測定試薬（ＢＣＧ法；和光純薬社製）にてアルブミン量を定量した。結果を表１に示す。
表１から分かるように、２０ｇ／Ｌ以上で常に一定のアルブミンを吸着していることが明白である。
【００３２】
【表１】
【００３３】
［実施例２］
糖化アルブミン割合の測定
実施例１の“３）ジエチルアミノ基を導入したポリマーの性能評価”において、段階希釈したアルブミン水溶液の代わりに、健常者及び患者の血清を用いる以外は同様の方法を実施し、回収した一定量のアルブミンを含む試料を、酵素を用いて測定した。別途ＨＰＬＣ法でＧＡ値を求め、値を比較した。
【００３４】
＜ケトアミンオキシダーゼ含有試薬＞
３０ｍＭ トリス緩衝液（和光純薬社製）ｐＨ７．５
１０Ｕ／ｍｌ ケトアミンオキシダーゼII（ＫＡＯＤII；旭化成社製）
１０Ｕ／ｍｌ アスコルビン酸オキシダーゼ（ロシュ社製；カボチャ由来）
０．５ｍＭ ＥＤＴＡ（和光純薬社製）
１．３ｍＭ ＴＯＯＳ(同人化学研究所社製)
＜発色試薬＞
１５０ｍＭ トリス緩衝液（和光純薬社製）ｐＨ７．５
４０００Ｕ／ｍｌ バチルス属由来プロテアーゼ（プロテアーゼタイプ XXVII；シグマ社製）
５ｍＭ ４−アミノアンチピリン(和光純薬社製)
２０Ｕ／ｍｌ パーオキシダーゼ(シグマ社製)
＜ＨＰＬＣ法＞
グリコアルブミン計（ＧＡＡ−２０００；アークレイ社製）使用
＜試料＞ 健常者血清５検体、患者血清５検体
【００３５】
＜反応手順＞
上記ケトアミンオキシダーゼ含有試薬１８０μｌおよび回収した一定量のアルブミンを含有する試料２０μ１をセルに分注し３７℃で５分間インキュベーションし５５５ｎｍを測光した（Ａ０）。続いて発色試薬１８０μｌを添加し３７℃で５分間インキュベーションし５５５ｎｍを測光し（Ａ１）、試料の吸光度変化（ΔＡ＝Ａ１−Ａ０）を求めた。一方、試料の代わりに蒸留水を用いてブランクの吸光度変化（ブランクΔＡ＝Ａ１ブランク−Ａ０ブランク）を測定し、ブランク引きの試料の感度（ΔＡ−ブランクΔＡ）を求めた。その結果を図１に示す。
図１から分かるように、一定量のアルブミンを分離した試料中から得られる糖化アルブミン測定試薬の感度はＨＰＬＣ法と良く一致していた。このことから、試料を、固相と接触させ、特定タンパク質の一定量を分離し、該タンパク質中の糖化タンパク質を、酵素を用いて測定することにより、別途アルブミンを測定することなく簡便に糖化アルブミン割合を測定可能である。
【００３６】
［実施例３］
糖化ヘモグロビン割合の測定
実施例１で得たカルボキシメチル基を導入したポリマー５０ｍｇをキャピラリーに詰め、以下の方法で糖化ヘモグロビンを測定した。測定は、試料中のヘモグロビンを吸着後、該ポリマーを洗浄液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ緩衝液 ｐＨ６．９）２５０μｌで洗浄して余分なヘモグロビンを洗浄除去し、溶出溶離液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ緩衝液 ｐＨ６．９、２２０ｍＭ ＭｇＣｌ2）１００μｌで吸着したヘモグロビンを溶出した。溶出した溶液中のヘモグロビン量は赤色の吸収を利用して定量した。別途ＨＰＬＣ法で糖化ヘモグロビン（ＨｂＡ１ｃ）値を求め、値を比較した。
【００３７】
＜Ｒ１;ケトアミンオキシダーゼ含有試薬＞
３０ｍＭ トリス緩衝液（和光純薬社製）ｐＨ７．５
１０Ｕ／ｍｌ ケトアミンオキシダーゼII（ＫＡＯＤII；旭化成社製）
１０Ｕ／ｍｌ アスコルビン酸オキシダーゼ（ロシュ社製；カボチャ由来）
０．５ｍＭ ＥＤＴＡ（和光純薬社製）
１．３ｍＭ ＴＯＯＳ(同人化学研究所社製)
＜Ｒ２;プロテアーゼ試薬＞
１５０ｍＭ トリス緩衝液（和光純薬社製）ｐＨ７．５
４０００Ｕ／ｍｌ ストレプトマイセス属由来プロテアーゼ（プロテアーゼタイプXIV；シグマ社製）
＜Ｒ３;発色試薬＞
１５０ｍＭ トリス緩衝液（和光純薬社製）ｐＨ８．０
５ｍＭ ４−アミノアンチピリン(和光純薬社製)
０．１２％ ＴＯＯＳ(同人化学研究所社製)
２４Ｕ／ｍｌ ケトアミンオキシダーゼII（旭化成社製）
２０Ｕ／ｍｌ ＰＯＤ(シグマ社製)
＜試料＞ 健常者全血５検体、患者全血５検体
ＨｂＡ１ｃ値はＨｂＡ１ｃ測定装置（アークレイ社製）にて測定した。
【００３８】
＜反応手順＞
上記Ｒ１試薬０．９ｍｌおよび試料９０μlを混合し、３７℃で１０分反応を行う。続いて、分子量１万カットの膜で濾過し、ろ液にＲ２試薬０．９ｍｌを混合し、３７℃で２時間反応させた。分子量１万カットの膜で濾過し、ろ液をプロテアーゼ反応溶液とした。プロテアーゼ反応溶液１８９μｌをセルに分注し５５５ｎｍを測光した（Ａ０）。続いてＲ３試薬１８０μｌを添加し３７℃で５分間インキュベーションし５５５ｎｍを測光した（Ａ１）。ブランクの測定は、試料に蒸留水を用いてブランクの吸光度変化（ブランクΔＡ=Ａ１ブランク-Ａ０ブランク）を測定した。その結果を図２に示す。
図２から分かるように、一定量のヘモグロビンを分離した試料中から得られる糖化ヘモグロビン測定試薬の感度はＨＰＬＣ法と良く一致していた。このことから，試料を、固相と接触させ、特定タンパク質の一定量を分離し、該タンパク質中の糖化タンパク質を酵素を用いて測定することにより、別途ヘモグロビンを測定することなく簡便に糖化ヘモグロビン割合を測定可能である。
【００３９】
【発明の効果】
本発明の糖化タンパク質割合の測定方法は、特定タンパク質を一定量吸着すること、及び吸着した特定タンパク質中の糖化タンパク質量を酵素を用いて測定することにより、簡便且つ安価に糖化タンパク質割合の測定方法を提供する効果を有する。
また、本発明の糖化タンパク質割合の測定用キットは、糖化タンパク質割合の測定を簡便且つ安価に行なうためのキットを提供する効果を有する。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の実施例２に基づき得られた酵素法とＨＰＬＣ法の相関である。
【図２】本発明の実施例３に基づき得られた酵素法とＨＰＬＣ法の相関である。
【発明の属する技術分野】
本発明は、特定タンパク質中の糖化タンパク質割合を、酵素を用いて測定する場合に有用な測定方法、及びキットに関する。より詳細には、ヘモグロビン中の糖化ヘモグロビン割合、アルブミン中の糖化アルブミン割合のごとき特定タンパク質中の糖化タンパク質割合の測定に有用な測定方法、及びキットに関する。本発明は臨床検査の分野において有用である。
【０００２】
【従来の技術】
近年、糖尿病患者は爆発的に増加しており、ヘモグロビンＡ１ｃ（ＨｂＡ１ｃ）、グリコアルブミン、フルクトサミン、１，５−アンヒドログルシトールなどの血糖コントロールマーカー測定の需要が増加している。なかでもタンパク質中の糖化タンパク質割合で示されるＨｂＡ１ｃ、グリコアルブミンは、個人差が少なく、タンパク質濃度の影響を受けないことから、多用されている。ＨｂＡ１ｃ、グリコアルブミンはこれまで高速液体クロマトグラフ法（ＨＰＬＣ法；特許文献１〜３）や免疫法で測定されてきたが、最近、大量の検体を迅速に処理することが可能であり、かつ正確な酵素法が開発されてきた（特許文献４、５等）。また、本発明者らも正確に糖化タンパク質を測定する目的で、プロテアーゼのグロブリン成分への作用を選択的に阻害する方法（特許文献６）、糖化タンパク質割合の測定方法（特許文献７）を開発してきた。
【０００３】
これらの方法では、別途もしくは同時に特定タンパク質量と糖化タンパク質量を測定し、割合換算をすることから、測定操作が２度必要であり操作が煩雑になる。そこで特定タンパク質中の修飾タンパク質割合に関する方法として、特定タンパク質の一定量を、抗体を用いて固相に吸着させ、その一定量中の修飾タンパク質を測定することにより、別途特定タンパク質を定量することなく修飾タンパク質割合を算出する方法が開発された。（特許文献８、９）。しかしこれらは全て免疫化学的な測定法における修飾タンパク質割合を算出する方法であって、前述の酵素法に適用するには感度不足となり使用することが出来ない。
【０００４】
【特許文献１】
特願昭６０−２２８９６７号公報
【特許文献２】
特開平１−２５７２５７号公報
【特許文献３】
特開平３−２５５３６０号公報
【特許文献４】
特開平６−４６８４６号公報
【特許文献５】
特開平５−１９２１９３号公報
【特許文献６】
特開２００１−５４３９８号公報
【特許文献７】
特開２００１−２０４４９５号公報
【特許文献８】
特開昭６４−１６９６４号公報
【特許文献９】
特開平５−８７８０９号公報
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の課題は酵素を用いて糖化タンパク質割合を正確に測定するに当たり、別途、特定タンパク質を定量することなしに簡便に糖化タンパク質割合を測定する方法およびキットを提供することにある。
さらに具体的には臨床生化学検査における有用な糖化タンパク質割合の測定方法、キットを提供することにある。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
上記の課題を解決するためには、特定タンパク質の一定量を固相に吸着させ、その中の糖化タンパク質量を測定すればよい。最も簡便な固定化方法は前述の抗体を用いた固定化方法であるが、酵素法で測定するには十分な量の特定タンパク質を分離することは困難であった。
そこで本発明者は、鋭意検討した結果、固相上に酵素法で検出しうる十分量の糖化された特定タンパク質を吸着すべく、特定タンパク質に親和性を有する基を導入することにより、酵素で定量可能な量の糖化された特定タンパク質を含む特定タンパク質を結合できること、またその導入量をコントロールすることにより、さまざまな試料においても一定量の特定タンパク質を分離できること、さらに条件によっては吸着液と溶出液を変えずに一定時間後に特定タンパク質の一定量を溶離できることを見出し、本発明の完成に至った。
【０００７】
即ち、本発明は
１）試料を、固相と接触させ、特定タンパク質の一定量を分離し、該タンパク質中の糖化タンパク質量を、酵素を用いて測定することを特徴とする糖化タンパク質割合の測定方法、
２）固相がイオン交換基を導入した固相であり、かつその導入量が試料中の特定タンパク質量より少なく、かつ酵素を用いて測定するに十分感度が取れる量であることを特徴とする上記１）記載の方法、
３）特定タンパク質がアルブミンであり、イオン交換基が弱陰イオン交換基であることを特徴とする上記２）に記載の方法、
４）特定タンパク質がヘモグロビンであり、イオン交換基が弱陽イオン交換基であることを特徴とする上記２）に記載の方法、
５）酵素を用いて測定する方法がプロテアーゼ及び少なくとも糖化アミノ酸に作用する酵素を用いることを特徴とする上記１）〜４）いずれかに記載の方法、
６）試料の中の特定タンパク質に親和性を有し、試料中の特定タンパク質の一定量を分離できる固相、及び該タンパク質中の糖化タンパク質測定用酵素よりなる糖化タンパク質割合測定用キット、
７）固相がイオン交換基を導入した固相であり、かつその導入量が試料中の特定タンパク質量より少なく、かつ酵素を用いて測定するに十分感度が取れる量である上記６）記載のキット、
８）特定タンパク質がアルブミンであり、イオン交換基が弱陰イオン交換基であることを特徴とする上記７）に記載のキット、
９）特定タンパク質がヘモグロビンであり、イオン交換基が弱陽イオン交換基であることを特徴とする上記７）に記載のキット、
１０）糖化タンパク質測定用酵素がプロテアーゼ及び少なくとも糖化アミノ酸に作用する酵素である上記６）〜９）いずれかに記載のキット、
に関する。
さらに詳しくは、臨床生化学検査における糖化タンパク質の測定に有用な試薬、キット及び方法に関する。
【０００８】
【発明の実施の形態】
以下この発明の構成及び好ましい形態について更に詳しく説明する。
本発明に使用しうる試料としては、糖化タンパク質を含有するものであればいかなる試料を用いてもよいが、たとえば血液（全血、血漿、血清、赤血球、溶血液等）、尿、体液、食品、タンパク質製剤などの医薬品などが挙げられ、血液、尿、体液、タンパク質製剤などの医薬品が好ましく、血液、尿、体液が特に好ましく、血液が大変に好ましい。
【０００９】
本発明に使用しうる特定タンパク質としては、試料に含まれるいかなるタンパク質でもその糖化タンパク質割合を測定する意味があるタンパク質であれば測定対象となるが、たとえば、アルブミン、グロブリン成分（α１酸性糖タンパク質、α１アンチトリプシン、αリポタンパク質、ハプトグロビン、α２マクログロブリン、ヘモぺキシン、トランスフェリン、βリポタンパク、フィブリノーゲン、免疫グロブリン等）、ヘモグロビンなどが好ましく、アルブミン、ヘモグロビンが特に好ましい。
本発明に使用しうる固相としては、特定タンパク質に親和性を示し、試料中の特定タンパク質を吸着しうるものであれば如何なる固相を用いてもよい。特定タンパク質に親和性を持たせるには、イオン交換基を導入した固相が、特定タンパク質を吸着できる量が多く、また価格も安い点で好ましい。
【００１０】
イオン交換基を導入する際の固相の材質としては、セルロース、セファロース、シリカゲル、各種ポリマー（たとえばポリスチレンやポリビニルアルコール、ポリアクリロニトリル）、共重合体（例えばメタクリル酸やアクリル酸などを架橋剤（例えばジビニルベンゼンやジビニルトルエン）で架橋させて重合したものなど））、ラテックス、磁性体、または紙等が好ましい。
固相の形状としては、粒状、膜状、シート状及び繊維状などが好ましく、粒状及び膜状が特に好ましく、粒状が大変に好ましい。また、測定用装置の一部となった形状も大変に好ましい。
【００１１】
測定用装置における固相の形態としては、通常の生化学測定と同様に液体をセルに入れて測定を行う場合には、前処理カラムのような形態が大変に好ましく、イオン交換基を導入したセルロース、セファロース、シリカゲル、各種ポリマー、ラテックスや磁性体の粒状、膜状または繊維状物、あるいはシート状の紙を固相としてカラム内に充填して用いればよい。ラテックスの場合、検体測定用の汎用機器を用いた場合にプレートが不要となり、簡便となる点で好ましい。また、磁性体の場合、イオン交換基を導入した超微粒子磁性ビーズと強力磁気による分離システムが、洗浄操作が簡便になる点、分離精度が向上するために測定精度が向上する点で好ましい。また、微小流路が形成されているチップ（例えばマイクロチップ等）を用いたポイントオブケア用の簡便装置の場合には、チップ内の溝を液体が流れていくタイプのものであればその流路壁に直接イオン交換基を導入してもよい。
【００１２】
電極を用いて検出したり、発色を検出する場合には、前述の材質の中で、通常、電極用や比色計用に用いられる材質であれば何を用いてもよいが、膜やろ紙などにイオン交換基を導入しても良い。また公知の方法であればこれ以外の方法も用いることが出来る。
固相へ導入する交換基の量は、試料中の特定タンパク質量より少なく、かつ酵素を用いて測定するに十分感度が取れる量であればいかなる量を用いてもよいが、特定タンパク質がアルブミン若しくはヘモグロビンである場合にはイオン交換基の量として０．０１〜１００ｎｍｏｌが好ましい。また、イオン交換基の量を試料中の特定タンパク質より少なくする方法として、試料の量を増減することで調節する方法も好ましい。
【００１３】
導入するイオン交換基としては、陰イオン交換基と陽イオン交換基が挙げられる。特定タンパク質がアルブミンである場合には弱陰イオン交換基や弱陽イオン交換基が好ましく、特定タンパク質がヘモグロビンである場合には弱陽イオン交換基が好ましい。弱陰イオン交換基の好ましい例としては、ジエチルアミノ基、ジエチルアミノエチル基やピリジン基などの弱塩基およびその誘導体が好ましく、弱陽イオン交換基としてはカルボキシメチル基やカルボキシル基（アクリル酸やメタクリル酸の共重合体）等の弱酸基が好ましいが、特定タンパク質の吸着に特異性を有するイオン交換基であれば、それ以外の交換基を用いてもよい。交換基の導入方法は公知の方法を用いれば良い。
【００１４】
本発明に用いることの出来る洗浄液としては、陰イオン交換基を導入した固相の場合は酸性〜中性の緩衝液、陽イオン交換基を導入した固相の場合は中性〜塩基性の緩衝液が挙げられる。交換基の性状に合わせて、緩衝剤の種類や濃度を適宜調製して用いればよい。例えば、弱陰イオン交換基を導入した固相の場合は、１〜５０ｍＭ程度の酸性〜中性の緩衝液を用いればよく、弱陽イオン交換基を導入した固相の場合は、１〜５０ｍＭ程度の中性〜塩基性の緩衝液を用いればよい。
洗浄後、通常は後述の溶出液を用いて特定タンパク質を溶離するが、特定タンパク質を固相上に吸着したまま、酵素反応による糖化タンパク質量の測定を行なってもよい。
【００１５】
本発明に用いることの出来る溶出液としては、イオン交換樹脂で用いられているの公知の溶出方法を用いればよい。例えば、陰イオン交換基を導入した固相においてはアルカリ性、陽イオン交換基を導入した固相においては酸性の緩衝液を用いるか、陰イオン交換基及び陽イオン交換基において、イオン強度を上げた緩衝液を用いるか、塩を添加してイオン強度を上げた溶液を用いればよく、またこれらを単独で用いても同時に組みあわせて用いても良い。緩衝液の具体例としては、弱陰イオン交換基を導入した固相の場合は、アルカリ性の緩衝液、弱陽イオン交換基を導入した固相の場合は、酸性の緩衝液が好ましい例として挙げられる。イオン強度を上げた溶液の具体例としては、０．１〜１０Ｍ程度の緩衝液にしてイオン強度を上げた溶液、洗浄液に０．１〜１０Ｍ程度の塩を添加してイオン強度を上げた溶液などが挙げられる。尚、本明細書では、特定タンパク質を溶出液で溶離して得た液を『溶出溶離液』ということがある。
【００１６】
本発明に使用しうる糖化タンパク測定用酵素としては、糖化タンパク質を測定できる酵素であれば何でもよく、１種又は２種以上の酵素の組み合わせであってもよい。こ（れら）の酵素は目的の活性が発現すれば、精製物であっても非精製物であってもよい。好ましい一例として、プロテアーゼおよび少なくとも糖化アミノ酸に作用する酵素の組み合わせが挙げられる。
プロテアーゼおよび少なくとも糖化アミノ酸に作用する酵素を用いて糖化タンパク質を測定するには、まず糖化タンパク質をプロテアーゼにより糖化アミノ酸若しくは糖化ペプチドレベルまで分解し、少なくとも糖化アミノ酸に作用する酵素を作用させ、糖化アミノ酸を酸化し、生成するグルコソン若しくは過酸化水素を測定すれば良く、また減少する酸素を公知の方法で測定すればよい。
【００１７】
本発明に使用し得るプロテアーゼとしては、臨床検査に使用できるものであればいかなるプロテアーゼを用いても良いが、試料中の糖化タンパク質に有効に作用し、かつ当該タンパク質由来の糖化アミノ酸及び／若しくは糖化ペプチドを有効に生成するものが好ましく、例えばトリプシン（Tripsin）、キモトリプシン（Chymotripsin）等の動物由来のプロテアーゼ、パパイン（Papain）、ブロメライン（Bromelain）等の植物由来のプロテアーゼ、微生物由来のプロテアーゼ等が挙げられる。
【００１８】
微生物由来のプロテアーゼの例としては、ズブチリシン（Subtilisin）等に代表されるバチルス（Bacillus）属由来プロテアーゼ、プロテアーゼタイプ-XIII（シグマ社製）等に代表されるアスペルギルス（Aspergillus）由来プロテアーゼ、ＰＤ酵素（キッコーマン社製）等に代表されるペニシリウム（Penicillium）由来プロテアーゼ、プロナーゼ(Pronase) 等に代表されるストレプトマイセス（Streptomyces）由来プロテアーゼ、エンドプロテイナーゼLys-c（シグマ社製）等に代表されるリソバクター（Lysobacter）由来プロテアーゼ、プロテイナーゼA（Proteinase A;シグマ社製） 等に代表される酵母（Yeast）由来プロテアーゼ、プロテイナーゼK（Proteinase K;シグマ社製）等に代表されるトリチラチウム（Tritirachium）由来プロテアーゼ、アミノペプチダーゼT（Aminopeptidase T;ベーリンガー・マンハイム社製）等に代表されるサーマス（Thermus）由来プロテアーゼ、エンドプロテイナーゼAsp-N（EndoproteinaseAsp-N;和光純薬社製）等に代表されるシュードモナス（Pseudomonus）由来、リジルエンドペプチダーゼ（Lysylendopeputidase和光純薬社製）等に代表されるアクロモバクター（Achromobacter）由来プロテアーゼが挙げられる。これらの具体的な例は単なる１例に過ぎず、なんら限定されるものではない。
【００１９】
本発明に用いることの出来るプロテアーゼの活性測定法としては、カゼインフォリン法が挙げられる。活性の定義は、１分間、３７℃において１μｇのチロシンに相当する発色を１Ｕとした。
本発明に使用しうる少なくとも糖化アミノ酸に作用する酵素の例としては、糖化アミノ酸及び／または糖化ペプチドに良好に作用する酵素であれば、いかなる酵素を用いてもよく、例えば、αアミノ基が糖化された糖化アミノ酸及び／又は糖化ペプチドに作用する酵素、αアミノ基が糖化された糖化アミノ酸若しくはペプチドに特異的に作用し、実質的にεアミノ基が糖化された糖化アミノ酸には作用しない酵素、αアミノ基が糖化された糖化アミノ酸若しくはペプチドに特異的に作用し、実質的にαアミノ基が糖化された糖化アミノ酸には作用しない酵素、αアミノ基及びεアミノ基が糖化された糖化アミノ酸若しくはペプチドに作用し、プロテアーゼと共存させた状態でも充分な活性を有する酵素などが挙げられる。具体的な酵素種としては、ケトアミンオキシダーゼが好ましい一例として挙げられる。また、糖化アルブミンを測定対象とする場合には、εアミノ基が糖化されたε糖化アミノ酸若しくは糖化ペプチドに作用する酵素が好ましく、糖化ヘモグロビンを測定対象とする場合には、αアミノ基が糖化されたα糖化アミノ酸若しくは糖化ペプチドに作用する酵素が好ましい。
【００２０】
εアミノ基が糖化された糖化アミノ酸に作用する酵素の例としては、ギベレラ（Gibberella）属、アスペルギルス（Aspergillus）属、カンジダ（Candida）属、ペニシリウム（Penicillium）属、フサリウム（Fusarium）属、アクレモニウム（Acremonium）属又はデバリオマイゼス（Debaryomyces）属由来のケトアミンオキシダーゼ等、が挙げられる。
αアミノ基が糖化された糖化アミノ酸若しくはペプチドに作用する酵素の例としては、上記εアミノ基が糖化された糖化アミノ酸に作用する酵素及びコリネバクテリウム（Corynebacterium）由来の酵素が挙げられる。
【００２１】
また、αアミノ基が糖化された糖化アミノ酸若しくはペプチドに特異的に作用し、実質的にεアミノ基が糖化された糖化アミノ酸には作用しない酵素としてはコリネバクテリウム（Corynebacterium）由来の酵素が知られている。一方εアミノ基が糖化された糖化アミノ酸若しくはペプチドに特異的に作用し、実質的にαアミノ基が糖化された糖化アミノ酸には作用しない酵素としては遺伝子操作フルクトサミンオキシダーゼ（FODVII；旭化成社製；PCT/JP02/0072）が知られている。
【００２２】
さらに、αアミノ基及びεアミノ基が糖化された糖化アミノ酸若しくはペプチドに作用し、プロテアーゼと共存させた状態でも充分な活性を有する酵素の例としては、遺伝子組み替え型フルクトサミンオキシダーゼ（FODII；旭化成社製）が挙げられる。
糖化アミノ酸に作用する酵素の活性は特開２００１−２０４４９５（糖化タンパク質割合測定方法）記載の方法にて測定し、３７℃で１分間に１μｍｏｌの過酸化水素を生成する酵素量を１Ｕと定義した。
【００２３】
さらに本発明に基づく酵素を用いた糖化タンパク質の検出には、例えば、発色成分、妨害物質の消去系成分、界面活性剤、塩類、緩衝剤、ｐＨ調製剤や防腐剤などを適宜選択して添加しても良い。
本発明に使用しうる試料を、固相と接触させ、特定タンパク質の一定量を分離し、該タンパク質中の糖化タンパク質を、酵素を用いて測定するキットとしては、前述の固相の形状、材質を適宜選択し、やはり前述の適当な濃度のイオン交換基を導入した固相を適時選択すればよく、用いる酵素としては、分離した一定量の特定タンパク質を定量できるように組成を決定すれば良い。
【００２４】
また妨害物質の消去系を組み込む場合、例えば生化学的な測定、マイクロチップ、電極、ラテックスや磁気ビーズのように段階的に試薬を添加できる場合には、糖化アミノ酸を消去した後に糖化タンパク質を測定する場合は、第一試薬にケトアミンオキシダーゼ含有試薬を用い、第二試薬にプロテアーゼ及びカップラーを処方すれば良い。アスコルビン酸、過酸化水素の消去系を組み込む場合には、第一試薬のケトアミンオキシダーゼ含有試薬に例えばアスコルビン酸オキシダーゼ、パーオキシダーゼ等を処方すれば良い。また膜を用いる場合には第一の層に消去系の酵素を固定化し、第二の層に検出系の酵素を固定化するなど適宜工夫すればよい。電極を検出に用いる場合は消去系の試薬を被検液（試料、溶出溶離液、溶出溶離液を適当な酵素で処理した液等）と混合し処理を行った後検出を行えばよい。また、これらの方法以外の組み合わせを用いても良い。
また、消去反応は被検液（試料、溶出溶離液、溶出溶離液を適当な酵素で処理した液等）から特定タンパク質を吸着する前に行なっても良く、被検液から特定タンパク質を吸着し、その固相上で行なってもよく、特定タンパク質を吸着し、洗浄、溶出して得た溶出溶離液に対して行なっても良い。
【００２５】
本発明に使用し得るケトアミンオキシダーゼ及びプロテアーゼの濃度としては、液状で使用する場合にはケトアミンオキシダーゼ濃度として０．１〜５００Ｕ／ｍｌの濃度で使用すれば良く、好ましくは０．５〜２００Ｕ／ｍｌ、最も好ましくは１．０〜１００Ｕ／ｍｌであるがこれ以外の量を用いても良い。またプロテアーゼの濃度としては０．１Ｕ〜１ＭＵ／ｍｌの濃度で使用すれば良く、好ましくは１Ｕ〜５００ＫＵ／ｍｌ、最も好ましくは５Ｕ〜１００ＫＵ／ｍｌであるがこれ以外の量を用いても良い。酵素類を膜やビーズ、流路壁に固定化する場合には、試料との接触時間、接触量、温度、検出器の感度によって、液状で使用したの濃度から換算して、十分に反応が検出できる量が固定化できていれば良い。
【００２６】
本発明を用いて、たとえば被検液中の糖化アミノ酸を消去した後に糖化タンパク質中の糖化アミノ酸を測定する場合には、まず、一定量の被検液０．０１〜１０００μｌ程度に、ケトアミンオキシダーゼ含有試薬、例えば０．１〜５０００μｌ程度を１〜６０分程度作用させれば良く、これ以外の量や時間を選択しても良い。また、前述のように試薬の作用は膜上等で行ってもよく、分離された一定量の特定タンパク質中の糖化アミノ酸を十分消去できる量であればよい。次に前記反応後にプロテアーゼ試薬を作用させ、定量を行えば良い。
【００２７】
また、当然プロテアーゼを先に作用させ、被検液中の特定タンパク質をアミノ酸、ペプチドレベルまで分解した後にケトアミンオキシダーゼを作用させてもよい。
以上のことから、本発明に於ける、試料を、固相と接触させ、特定タンパク質の一定量を分離し、該タンパク質中の糖化タンパク質を酵素を用いて測定するキットとしては、分離部分は前処理カラムのような形状で提供されても良く、磁性ビーズやラテックスの状態で提供されてもよく、マイクロチップの流路壁に固定化されても良く、膜やろ紙上に固定化されて提供されても良い。酵素を用いて糖化タンパク質を測定する部分は、例えば液状品及び液状品の凍結物あるいは凍結乾燥品として提供でき、また、膜や電極上、マイクロチップの流路壁上に固定化された状態で提供されてもよい。
【００２８】
【実施例】
以下に、本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明は以下の例によって何ら限定されるものではない。
【００２９】
［実施例１］
特定タンパク質を一定量分離する固相の合成、性能評価
１）ジエチルアミノ基の固相への導入
水酸基にエポキシ基を導入することにより活性化し、イオン交換基を導入する。水酸基密度８．０ｍｅｑ／ｇ、比表面積８１ｍ2／ｇのポリビニルアルコール樹脂（粒状：昭和電工社製）に、エピクロルヒドリン５０ｍｅｑ／ｇ、ジメチルスルホキシド１０ｍｌ／ｇ樹脂、水酸化ナトリウム５ｍｅｑ／ｇ樹脂を添加し３０℃で２０時間反応させ、純水で洗浄しエポキシ活性化樹脂を得た。次にジエチルアミン３．５ｍｅｑ／ｇ樹脂をｐＨ１０、３０℃で２０時間反応させ、純水で洗浄しジエチルアミノ基を導入し、ジエチルアミノ基を導入したポリマー（粒状）を得た。ジエチルアミノ基を導入したポリマーの水酸基密度は４．９ｍｅｑ／ｇジエチルアミノ基０．５ｍｅｑ／ｇであった。
【００３０】
２）カルボキシメチル基の固相への導入
１）と同様の操作を行ってエポキシ活性化樹脂を作成し、ジエチルアミンのかわりにクロロ酢酸ナトリウムを反応させカルボキシメチル基を導入したポリマー（粒状）を得た。ポリマーの水酸基密度は４．５ｍｅｑ／ｇジエチルアミノ基０．４８ｍｅｑ／ｇであった。
【００３１】
３）ジエチルアミノ基を導入したポリマーの性能評価
実施例１の１）で得たジエチルアミノ基を導入したポリマー１０ｍｇをキャピラリーに詰め、段階希釈したアルブミン水溶液１０μｌを注入し、洗浄液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ緩衝液 ｐＨ８．５）５０μｌで余分なアルブミンを洗浄除去し、溶出溶離液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ緩衝液 ｐＨ８．５、２２０ｍＭ ＭｇＣｌ2）２０μｌで吸着したアルブミンを溶出した。溶出した溶液中のアルブミン量は市販のアルブミン測定試薬（ＢＣＧ法；和光純薬社製）にてアルブミン量を定量した。結果を表１に示す。
表１から分かるように、２０ｇ／Ｌ以上で常に一定のアルブミンを吸着していることが明白である。
【００３２】
【表１】
［実施例２］
糖化アルブミン割合の測定
実施例１の“３）ジエチルアミノ基を導入したポリマーの性能評価”において、段階希釈したアルブミン水溶液の代わりに、健常者及び患者の血清を用いる以外は同様の方法を実施し、回収した一定量のアルブミンを含む試料を、酵素を用いて測定した。別途ＨＰＬＣ法でＧＡ値を求め、値を比較した。
【００３４】
＜ケトアミンオキシダーゼ含有試薬＞
３０ｍＭ トリス緩衝液（和光純薬社製）ｐＨ７．５
１０Ｕ／ｍｌ ケトアミンオキシダーゼII（ＫＡＯＤII；旭化成社製）
１０Ｕ／ｍｌ アスコルビン酸オキシダーゼ（ロシュ社製；カボチャ由来）
０．５ｍＭ ＥＤＴＡ（和光純薬社製）
１．３ｍＭ ＴＯＯＳ(同人化学研究所社製)
＜発色試薬＞
１５０ｍＭ トリス緩衝液（和光純薬社製）ｐＨ７．５
４０００Ｕ／ｍｌ バチルス属由来プロテアーゼ（プロテアーゼタイプ XXVII；シグマ社製）
５ｍＭ ４−アミノアンチピリン(和光純薬社製)
２０Ｕ／ｍｌ パーオキシダーゼ(シグマ社製)
＜ＨＰＬＣ法＞
グリコアルブミン計（ＧＡＡ−２０００；アークレイ社製）使用
＜試料＞ 健常者血清５検体、患者血清５検体
【００３５】
＜反応手順＞
上記ケトアミンオキシダーゼ含有試薬１８０μｌおよび回収した一定量のアルブミンを含有する試料２０μ１をセルに分注し３７℃で５分間インキュベーションし５５５ｎｍを測光した（Ａ０）。続いて発色試薬１８０μｌを添加し３７℃で５分間インキュベーションし５５５ｎｍを測光し（Ａ１）、試料の吸光度変化（ΔＡ＝Ａ１−Ａ０）を求めた。一方、試料の代わりに蒸留水を用いてブランクの吸光度変化（ブランクΔＡ＝Ａ１ブランク−Ａ０ブランク）を測定し、ブランク引きの試料の感度（ΔＡ−ブランクΔＡ）を求めた。その結果を図１に示す。
図１から分かるように、一定量のアルブミンを分離した試料中から得られる糖化アルブミン測定試薬の感度はＨＰＬＣ法と良く一致していた。このことから、試料を、固相と接触させ、特定タンパク質の一定量を分離し、該タンパク質中の糖化タンパク質を、酵素を用いて測定することにより、別途アルブミンを測定することなく簡便に糖化アルブミン割合を測定可能である。
【００３６】
［実施例３］
糖化ヘモグロビン割合の測定
実施例１で得たカルボキシメチル基を導入したポリマー５０ｍｇをキャピラリーに詰め、以下の方法で糖化ヘモグロビンを測定した。測定は、試料中のヘモグロビンを吸着後、該ポリマーを洗浄液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ緩衝液 ｐＨ６．９）２５０μｌで洗浄して余分なヘモグロビンを洗浄除去し、溶出溶離液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ緩衝液 ｐＨ６．９、２２０ｍＭ ＭｇＣｌ2）１００μｌで吸着したヘモグロビンを溶出した。溶出した溶液中のヘモグロビン量は赤色の吸収を利用して定量した。別途ＨＰＬＣ法で糖化ヘモグロビン（ＨｂＡ１ｃ）値を求め、値を比較した。
【００３７】
＜Ｒ１;ケトアミンオキシダーゼ含有試薬＞
３０ｍＭ トリス緩衝液（和光純薬社製）ｐＨ７．５
１０Ｕ／ｍｌ ケトアミンオキシダーゼII（ＫＡＯＤII；旭化成社製）
１０Ｕ／ｍｌ アスコルビン酸オキシダーゼ（ロシュ社製；カボチャ由来）
０．５ｍＭ ＥＤＴＡ（和光純薬社製）
１．３ｍＭ ＴＯＯＳ(同人化学研究所社製)
＜Ｒ２;プロテアーゼ試薬＞
１５０ｍＭ トリス緩衝液（和光純薬社製）ｐＨ７．５
４０００Ｕ／ｍｌ ストレプトマイセス属由来プロテアーゼ（プロテアーゼタイプXIV；シグマ社製）
＜Ｒ３;発色試薬＞
１５０ｍＭ トリス緩衝液（和光純薬社製）ｐＨ８．０
５ｍＭ ４−アミノアンチピリン(和光純薬社製)
０．１２％ ＴＯＯＳ(同人化学研究所社製)
２４Ｕ／ｍｌ ケトアミンオキシダーゼII（旭化成社製）
２０Ｕ／ｍｌ ＰＯＤ(シグマ社製)
＜試料＞ 健常者全血５検体、患者全血５検体
ＨｂＡ１ｃ値はＨｂＡ１ｃ測定装置（アークレイ社製）にて測定した。
【００３８】
＜反応手順＞
上記Ｒ１試薬０．９ｍｌおよび試料９０μlを混合し、３７℃で１０分反応を行う。続いて、分子量１万カットの膜で濾過し、ろ液にＲ２試薬０．９ｍｌを混合し、３７℃で２時間反応させた。分子量１万カットの膜で濾過し、ろ液をプロテアーゼ反応溶液とした。プロテアーゼ反応溶液１８９μｌをセルに分注し５５５ｎｍを測光した（Ａ０）。続いてＲ３試薬１８０μｌを添加し３７℃で５分間インキュベーションし５５５ｎｍを測光した（Ａ１）。ブランクの測定は、試料に蒸留水を用いてブランクの吸光度変化（ブランクΔＡ=Ａ１ブランク-Ａ０ブランク）を測定した。その結果を図２に示す。
図２から分かるように、一定量のヘモグロビンを分離した試料中から得られる糖化ヘモグロビン測定試薬の感度はＨＰＬＣ法と良く一致していた。このことから，試料を、固相と接触させ、特定タンパク質の一定量を分離し、該タンパク質中の糖化タンパク質を酵素を用いて測定することにより、別途ヘモグロビンを測定することなく簡便に糖化ヘモグロビン割合を測定可能である。
【００３９】
【発明の効果】
本発明の糖化タンパク質割合の測定方法は、特定タンパク質を一定量吸着すること、及び吸着した特定タンパク質中の糖化タンパク質量を酵素を用いて測定することにより、簡便且つ安価に糖化タンパク質割合の測定方法を提供する効果を有する。
また、本発明の糖化タンパク質割合の測定用キットは、糖化タンパク質割合の測定を簡便且つ安価に行なうためのキットを提供する効果を有する。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の実施例２に基づき得られた酵素法とＨＰＬＣ法の相関である。
【図２】本発明の実施例３に基づき得られた酵素法とＨＰＬＣ法の相関である。
Claims (10)
- 試料を、ジエチルアミノ基を導入したポリビニルアルコール樹脂からなる固相と接触させ、アルブミンの一定量を分離し、該アルブミン中の糖化アルブミン量を、糖化アルブミン測定用酵素を用いて測定することを特徴とする、糖化アルブミン割合の測定方法。
- 糖化アルブミン測定用酵素を用いて測定する方法がプロテアーゼ及び少なくとも糖化アミノ酸に作用する酵素を用いることを特徴とする、請求項１に記載の測定方法。
- ジエチルアミノ基を、０．０１〜１０ｎｍｏｌ導入した粒状ポリビニルアルコール樹脂であることを特徴とする請求項１又は２に記載の測定方法。
- 試料中のアルブミンの一定量を分離するためのジエチルアミノ基を導入したポリビニルアルコール樹脂からなる固相、及び糖化アルブミン測定用酵素を含む糖化アルブミン割合測定用キット。
- 糖化アルブミン測定用酵素がプロテアーゼ及び少なくとも糖化アミノ酸に作用する酵素である請求項４に記載のキット。
- 試料を、カルボキシメチル基を導入したポリビニルアルコール樹脂からなる固相と接触させ、ヘモグロビンの一定量を分離し、該ヘモグロビン中の糖化ヘモグロビン量を、糖化ヘモグロビン測定用酵素を用いて測定することを特徴とする、糖化ヘモグロビン割合の測定方法。
- 糖化ヘモグロビン測定用酵素を用いて測定する方法がプロテアーゼ及び少なくとも糖化アミノ酸に作用する酵素を用いることを特徴とする、請求項６に記載の測定方法。
- カルボキシメチル基を０．０１〜１０ｎｍｏｌ導入した粒状ポリビニルアルコール樹脂であることを特徴とする、請求項６又は７に記載の測定方法。
- 試料中のヘモグロビンの一定量を分離するためのカルボキシメチル基を導入したポリビニルアルコール樹脂からなる固相、及び糖化ヘモグロビン測定用酵素を含む糖化ヘモグロビン割合測定用キット。
- 糖化ヘモグロビン測定用酵素がプロテアーゼ及び少なくとも糖化アミノ酸に作用する酵素である請求項９に記載のキット。
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