JP2004242522A - 糖化タンパク質割合の測定方法 - Google Patents

糖化タンパク質割合の測定方法 Download PDF

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Abstract

【課題】特定タンパク質中の糖化タンパク質割合を、酵素を用いて測定する方法に於いて、別途特定タンパク質を測定することなく簡便に糖化タンパク質割合を測定する方法及キットを提供する。
【解決手段】試料を、固相と接触させ、特定タンパク質の一定量を分離し、該タンパク質中の糖化タンパク質を酵素を用いて測定する。
【効果】特定タンパク質中の糖化タンパク質割合を、酵素を用いて測定する場合に、別途特定タンパク質を定量する事無く、正確、簡便、安価に糖化タンパク質割合を測定することが可能になる。
【選択図】 選択図なし

Description

【0001】
【発明の属する技術分野】
本発明は、特定タンパク質中の糖化タンパク質割合を、酵素を用いて測定する場合に有用な測定方法、及びキットに関する。より詳細には、ヘモグロビン中の糖化ヘモグロビン割合、アルブミン中の糖化アルブミン割合のごとき特定タンパク質中の糖化タンパク質割合の測定に有用な測定方法、及びキットに関する。本発明は臨床検査の分野において有用である。
【0002】
【従来の技術】
近年、糖尿病患者は爆発的に増加しており、ヘモグロビンA1c(HbA1c)、グリコアルブミン、フルクトサミン、1,5−アンヒドログルシトールなどの血糖コントロールマーカー測定の需要が増加している。なかでもタンパク質中の糖化タンパク質割合で示されるHbA1c、グリコアルブミンは、個人差が少なく、タンパク質濃度の影響を受けないことから、多用されている。HbA1c、グリコアルブミンはこれまで高速液体クロマトグラフ法(HPLC法;特許文献1〜3)や免疫法で測定されてきたが、最近、大量の検体を迅速に処理することが可能であり、かつ正確な酵素法が開発されてきた(特許文献4、5等)。また、本発明者らも正確に糖化タンパク質を測定する目的で、プロテアーゼのグロブリン成分への作用を選択的に阻害する方法(特許文献6)、糖化タンパク質割合の測定方法(特許文献7)を開発してきた。
【0003】
これらの方法では、別途もしくは同時に特定タンパク質量と糖化タンパク質量を測定し、割合換算をすることから、測定操作が2度必要であり操作が煩雑になる。そこで特定タンパク質中の修飾タンパク質割合に関する方法として、特定タンパク質の一定量を、抗体を用いて固相に吸着させ、その一定量中の修飾タンパク質を測定することにより、別途特定タンパク質を定量することなく修飾タンパク質割合を算出する方法が開発された。(特許文献8、9)。しかしこれらは全て免疫化学的な測定法における修飾タンパク質割合を算出する方法であって、前述の酵素法に適用するには感度不足となり使用することが出来ない。
【0004】
【特許文献1】
特願昭60−228967号公報
【特許文献2】
特開平1−257257号公報
【特許文献3】
特開平3−255360号公報
【特許文献4】
特開平6−46846号公報
【特許文献5】
特開平5−192193号公報
【特許文献6】
特開2001−54398号公報
【特許文献7】
特開2001−204495号公報
【特許文献8】
特開昭64−16964号公報
【特許文献9】
特開平5−87809号公報
【0005】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の課題は酵素を用いて糖化タンパク質割合を正確に測定するに当たり、別途、特定タンパク質を定量することなしに簡便に糖化タンパク質割合を測定する方法およびキットを提供することにある。
さらに具体的には臨床生化学検査における有用な糖化タンパク質割合の測定方法、キットを提供することにある。
【0006】
【課題を解決するための手段】
上記の課題を解決するためには、特定タンパク質の一定量を固相に吸着させ、その中の糖化タンパク質量を測定すればよい。最も簡便な固定化方法は前述の抗体を用いた固定化方法であるが、酵素法で測定するには十分な量の特定タンパク質を分離することは困難であった。
そこで本発明者は、鋭意検討した結果、固相上に酵素法で検出しうる十分量の糖化された特定タンパク質を吸着すべく、特定タンパク質に親和性を有する基を導入することにより、酵素で定量可能な量の糖化された特定タンパク質を含む特定タンパク質を結合できること、またその導入量をコントロールすることにより、さまざまな試料においても一定量の特定タンパク質を分離できること、さらに条件によっては吸着液と溶出液を変えずに一定時間後に特定タンパク質の一定量を溶離できることを見出し、本発明の完成に至った。
【0007】
即ち、本発明は
1)試料を、固相と接触させ、特定タンパク質の一定量を分離し、該タンパク質中の糖化タンパク質量を、酵素を用いて測定することを特徴とする糖化タンパク質割合の測定方法、
2)固相がイオン交換基を導入した固相であり、かつその導入量が試料中の特定タンパク質量より少なく、かつ酵素を用いて測定するに十分感度が取れる量であることを特徴とする上記1)記載の方法、
3)特定タンパク質がアルブミンであり、イオン交換基が弱陰イオン交換基であることを特徴とする上記2)に記載の方法、
4)特定タンパク質がヘモグロビンであり、イオン交換基が弱陽イオン交換基であることを特徴とする上記2)に記載の方法、
5)酵素を用いて測定する方法がプロテアーゼ及び少なくとも糖化アミノ酸に作用する酵素を用いることを特徴とする上記1)〜4)いずれかに記載の方法、
6)試料の中の特定タンパク質に親和性を有し、試料中の特定タンパク質の一定量を分離できる固相、及び該タンパク質中の糖化タンパク質測定用酵素よりなる糖化タンパク質割合測定用キット、
7)固相がイオン交換基を導入した固相であり、かつその導入量が試料中の特定タンパク質量より少なく、かつ酵素を用いて測定するに十分感度が取れる量である上記6)記載のキット、
8)特定タンパク質がアルブミンであり、イオン交換基が弱陰イオン交換基であることを特徴とする上記7)に記載のキット、
9)特定タンパク質がヘモグロビンであり、イオン交換基が弱陽イオン交換基であることを特徴とする上記7)に記載のキット、
10)糖化タンパク質測定用酵素がプロテアーゼ及び少なくとも糖化アミノ酸に作用する酵素である上記6)〜9)いずれかに記載のキット、
に関する。
さらに詳しくは、臨床生化学検査における糖化タンパク質の測定に有用な試薬、キット及び方法に関する。
【0008】
【発明の実施の形態】
以下この発明の構成及び好ましい形態について更に詳しく説明する。
本発明に使用しうる試料としては、糖化タンパク質を含有するものであればいかなる試料を用いてもよいが、たとえば血液(全血、血漿、血清、赤血球、溶血液等)、尿、体液、食品、タンパク質製剤などの医薬品などが挙げられ、血液、尿、体液、タンパク質製剤などの医薬品が好ましく、血液、尿、体液が特に好ましく、血液が大変に好ましい。
【0009】
本発明に使用しうる特定タンパク質としては、試料に含まれるいかなるタンパク質でもその糖化タンパク質割合を測定する意味があるタンパク質であれば測定対象となるが、たとえば、アルブミン、グロブリン成分(α1酸性糖タンパク質、α1アンチトリプシン、αリポタンパク質、ハプトグロビン、α2マクログロブリン、ヘモぺキシン、トランスフェリン、βリポタンパク、フィブリノーゲン、免疫グロブリン等)、ヘモグロビンなどが好ましく、アルブミン、ヘモグロビンが特に好ましい。
本発明に使用しうる固相としては、特定タンパク質に親和性を示し、試料中の特定タンパク質を吸着しうるものであれば如何なる固相を用いてもよい。特定タンパク質に親和性を持たせるには、イオン交換基を導入した固相が、特定タンパク質を吸着できる量が多く、また価格も安い点で好ましい。
【0010】
イオン交換基を導入する際の固相の材質としては、セルロース、セファロース、シリカゲル、各種ポリマー(たとえばポリスチレンやポリビニルアルコール、ポリアクリロニトリル)、共重合体(例えばメタクリル酸やアクリル酸などを架橋剤(例えばジビニルベンゼンやジビニルトルエン)で架橋させて重合したものなど))、ラテックス、磁性体、または紙等が好ましい。
固相の形状としては、粒状、膜状、シート状及び繊維状などが好ましく、粒状及び膜状が特に好ましく、粒状が大変に好ましい。また、測定用装置の一部となった形状も大変に好ましい。
【0011】
測定用装置における固相の形態としては、通常の生化学測定と同様に液体をセルに入れて測定を行う場合には、前処理カラムのような形態が大変に好ましく、イオン交換基を導入したセルロース、セファロース、シリカゲル、各種ポリマー、ラテックスや磁性体の粒状、膜状または繊維状物、あるいはシート状の紙を固相としてカラム内に充填して用いればよい。ラテックスの場合、検体測定用の汎用機器を用いた場合にプレートが不要となり、簡便となる点で好ましい。また、磁性体の場合、イオン交換基を導入した超微粒子磁性ビーズと強力磁気による分離システムが、洗浄操作が簡便になる点、分離精度が向上するために測定精度が向上する点で好ましい。また、微小流路が形成されているチップ(例えばマイクロチップ等)を用いたポイントオブケア用の簡便装置の場合には、チップ内の溝を液体が流れていくタイプのものであればその流路壁に直接イオン交換基を導入してもよい。
【0012】
電極を用いて検出したり、発色を検出する場合には、前述の材質の中で、通常、電極用や比色計用に用いられる材質であれば何を用いてもよいが、膜やろ紙などにイオン交換基を導入しても良い。また公知の方法であればこれ以外の方法も用いることが出来る。
固相へ導入する交換基の量は、試料中の特定タンパク質量より少なく、かつ酵素を用いて測定するに十分感度が取れる量であればいかなる量を用いてもよいが、特定タンパク質がアルブミン若しくはヘモグロビンである場合にはイオン交換基の量として0.01〜100nmolが好ましい。また、イオン交換基の量を試料中の特定タンパク質より少なくする方法として、試料の量を増減することで調節する方法も好ましい。
【0013】
導入するイオン交換基としては、陰イオン交換基と陽イオン交換基が挙げられる。特定タンパク質がアルブミンである場合には弱陰イオン交換基や弱陽イオン交換基が好ましく、特定タンパク質がヘモグロビンである場合には弱陽イオン交換基が好ましい。弱陰イオン交換基の好ましい例としては、ジエチルアミノ基、ジエチルアミノエチル基やピリジン基などの弱塩基およびその誘導体が好ましく、弱陽イオン交換基としてはカルボキシメチル基やカルボキシル基(アクリル酸やメタクリル酸の共重合体)等の弱酸基が好ましいが、特定タンパク質の吸着に特異性を有するイオン交換基であれば、それ以外の交換基を用いてもよい。交換基の導入方法は公知の方法を用いれば良い。
【0014】
本発明に用いることの出来る洗浄液としては、陰イオン交換基を導入した固相の場合は酸性〜中性の緩衝液、陽イオン交換基を導入した固相の場合は中性〜塩基性の緩衝液が挙げられる。交換基の性状に合わせて、緩衝剤の種類や濃度を適宜調製して用いればよい。例えば、弱陰イオン交換基を導入した固相の場合は、1〜50mM程度の酸性〜中性の緩衝液を用いればよく、弱陽イオン交換基を導入した固相の場合は、1〜50mM程度の中性〜塩基性の緩衝液を用いればよい。
洗浄後、通常は後述の溶出液を用いて特定タンパク質を溶離するが、特定タンパク質を固相上に吸着したまま、酵素反応による糖化タンパク質量の測定を行なってもよい。
【0015】
本発明に用いることの出来る溶出液としては、イオン交換樹脂で用いられているの公知の溶出方法を用いればよい。例えば、陰イオン交換基を導入した固相においてはアルカリ性、陽イオン交換基を導入した固相においては酸性の緩衝液を用いるか、陰イオン交換基及び陽イオン交換基において、イオン強度を上げた緩衝液を用いるか、塩を添加してイオン強度を上げた溶液を用いればよく、またこれらを単独で用いても同時に組みあわせて用いても良い。緩衝液の具体例としては、弱陰イオン交換基を導入した固相の場合は、アルカリ性の緩衝液、弱陽イオン交換基を導入した固相の場合は、酸性の緩衝液が好ましい例として挙げられる。イオン強度を上げた溶液の具体例としては、0.1〜10M程度の緩衝液にしてイオン強度を上げた溶液、洗浄液に0.1〜10M程度の塩を添加してイオン強度を上げた溶液などが挙げられる。尚、本明細書では、特定タンパク質を溶出液で溶離して得た液を『溶出溶離液』ということがある。
【0016】
本発明に使用しうる糖化タンパク測定用酵素としては、糖化タンパク質を測定できる酵素であれば何でもよく、1種又は2種以上の酵素の組み合わせであってもよい。こ(れら)の酵素は目的の活性が発現すれば、精製物であっても非精製物であってもよい。好ましい一例として、プロテアーゼおよび少なくとも糖化アミノ酸に作用する酵素の組み合わせが挙げられる。
プロテアーゼおよび少なくとも糖化アミノ酸に作用する酵素を用いて糖化タンパク質を測定するには、まず糖化タンパク質をプロテアーゼにより糖化アミノ酸若しくは糖化ペプチドレベルまで分解し、少なくとも糖化アミノ酸に作用する酵素を作用させ、糖化アミノ酸を酸化し、生成するグルコソン若しくは過酸化水素を測定すれば良く、また減少する酸素を公知の方法で測定すればよい。
【0017】
本発明に使用し得るプロテアーゼとしては、臨床検査に使用できるものであればいかなるプロテアーゼを用いても良いが、試料中の糖化タンパク質に有効に作用し、かつ当該タンパク質由来の糖化アミノ酸及び/若しくは糖化ペプチドを有効に生成するものが好ましく、例えばトリプシン(Tripsin)、キモトリプシン(Chymotripsin)等の動物由来のプロテアーゼ、パパイン(Papain)、ブロメライン(Bromelain)等の植物由来のプロテアーゼ、微生物由来のプロテアーゼ等が挙げられる。
【0018】
微生物由来のプロテアーゼの例としては、ズブチリシン(Subtilisin)等に代表されるバチルス(Bacillus)属由来プロテアーゼ、プロテアーゼタイプ−XIII(シグマ社製)等に代表されるアスペルギルス(Aspergillus)由来プロテアーゼ、PD酵素(キッコーマン社製)等に代表されるペニシリウム(Penicillium)由来プロテアーゼ、プロナーゼ(Pronase) 等に代表されるストレプトマイセス(Streptomyces)由来プロテアーゼ、エンドプロテイナーゼLys−c(シグマ社製)等に代表されるリソバクター(Lysobacter)由来プロテアーゼ、プロテイナーゼA(Proteinase A;シグマ社製) 等に代表される酵母(Yeast)由来プロテアーゼ、プロテイナーゼK(Proteinase K;シグマ社製)等に代表されるトリチラチウム(Tritirachium)由来プロテアーゼ、アミノペプチダーゼT(Aminopeptidase T;ベーリンガー・マンハイム社製)等に代表されるサーマス(Thermus)由来プロテアーゼ、エンドプロテイナーゼAsp−N(EndoproteinaseAsp−N;和光純薬社製)等に代表されるシュードモナス(Pseudomonus)由来、リジルエンドペプチダーゼ(Lysylendopeputidase和光純薬社製)等に代表されるアクロモバクター(Achromobacter)由来プロテアーゼが挙げられる。これらの具体的な例は単なる1例に過ぎず、なんら限定されるものではない。
【0019】
本発明に用いることの出来るプロテアーゼの活性測定法としては、カゼインフォリン法が挙げられる。活性の定義は、1分間、37℃において1μgのチロシンに相当する発色を1Uとした。
本発明に使用しうる少なくとも糖化アミノ酸に作用する酵素の例としては、糖化アミノ酸及び/または糖化ペプチドに良好に作用する酵素であれば、いかなる酵素を用いてもよく、例えば、αアミノ基が糖化された糖化アミノ酸及び/又は糖化ペプチドに作用する酵素、αアミノ基が糖化された糖化アミノ酸若しくはペプチドに特異的に作用し、実質的にεアミノ基が糖化された糖化アミノ酸には作用しない酵素、αアミノ基が糖化された糖化アミノ酸若しくはペプチドに特異的に作用し、実質的にαアミノ基が糖化された糖化アミノ酸には作用しない酵素、αアミノ基及びεアミノ基が糖化された糖化アミノ酸若しくはペプチドに作用し、プロテアーゼと共存させた状態でも充分な活性を有する酵素などが挙げられる。具体的な酵素種としては、ケトアミンオキシダーゼが好ましい一例として挙げられる。また、糖化アルブミンを測定対象とする場合には、εアミノ基が糖化されたε糖化アミノ酸若しくは糖化ペプチドに作用する酵素が好ましく、糖化ヘモグロビンを測定対象とする場合には、αアミノ基が糖化されたα糖化アミノ酸若しくは糖化ペプチドに作用する酵素が好ましい。
【0020】
εアミノ基が糖化された糖化アミノ酸に作用する酵素の例としては、ギベレラ(Gibberella)属、アスペルギルス(Aspergillus)属、カンジダ(Candida)属、ペニシリウム(Penicillium)属、フサリウム(Fusarium)属、アクレモニウム(Acremonium)属又はデバリオマイゼス(Debaryomyces)属由来のケトアミンオキシダーゼ等、が挙げられる。
αアミノ基が糖化された糖化アミノ酸若しくはペプチドに作用する酵素の例としては、上記εアミノ基が糖化された糖化アミノ酸に作用する酵素及びコリネバクテリウム(Corynebacterium)由来の酵素が挙げられる。
【0021】
また、αアミノ基が糖化された糖化アミノ酸若しくはペプチドに特異的に作用し、実質的にεアミノ基が糖化された糖化アミノ酸には作用しない酵素としてはコリネバクテリウム(Corynebacterium)由来の酵素が知られている。一方εアミノ基が糖化された糖化アミノ酸若しくはペプチドに特異的に作用し、実質的にαアミノ基が糖化された糖化アミノ酸には作用しない酵素としては遺伝子操作フルクトサミンオキシダーゼ(FODVII;旭化成社製;PCT/JP02/0072)が知られている。
【0022】
さらに、αアミノ基及びεアミノ基が糖化された糖化アミノ酸若しくはペプチドに作用し、プロテアーゼと共存させた状態でも充分な活性を有する酵素の例としては、遺伝子組み替え型フルクトサミンオキシダーゼ(FODII;旭化成社製)が挙げられる。
糖化アミノ酸に作用する酵素の活性は特開2001−204495(糖化タンパク質割合測定方法)記載の方法にて測定し、37℃で1分間に1μmolの過酸化水素を生成する酵素量を1Uと定義した。
【0023】
さらに本発明に基づく酵素を用いた糖化タンパク質の検出には、例えば、発色成分、妨害物質の消去系成分、界面活性剤、塩類、緩衝剤、pH調製剤や防腐剤などを適宜選択して添加しても良い。
本発明に使用しうる試料を、固相と接触させ、特定タンパク質の一定量を分離し、該タンパク質中の糖化タンパク質を、酵素を用いて測定するキットとしては、前述の固相の形状、材質を適宜選択し、やはり前述の適当な濃度のイオン交換基を導入した固相を適時選択すればよく、用いる酵素としては、分離した一定量の特定タンパク質を定量できるように組成を決定すれば良い。
【0024】
また妨害物質の消去系を組み込む場合、例えば生化学的な測定、マイクロチップ、電極、ラテックスや磁気ビーズのように段階的に試薬を添加できる場合には、糖化アミノ酸を消去した後に糖化タンパク質を測定する場合は、第一試薬にケトアミンオキシダーゼ含有試薬を用い、第二試薬にプロテアーゼ及びカップラーを処方すれば良い。アスコルビン酸、過酸化水素の消去系を組み込む場合には、第一試薬のケトアミンオキシダーゼ含有試薬に例えばアスコルビン酸オキシダーゼ、パーオキシダーゼ等を処方すれば良い。また膜を用いる場合には第一の層に消去系の酵素を固定化し、第二の層に検出系の酵素を固定化するなど適宜工夫すればよい。電極を検出に用いる場合は消去系の試薬を被検液(試料、溶出溶離液、溶出溶離液を適当な酵素で処理した液等)と混合し処理を行った後検出を行えばよい。また、これらの方法以外の組み合わせを用いても良い。
また、消去反応は被検液(試料、溶出溶離液、溶出溶離液を適当な酵素で処理した液等)から特定タンパク質を吸着する前に行なっても良く、被検液から特定タンパク質を吸着し、その固相上で行なってもよく、特定タンパク質を吸着し、洗浄、溶出して得た溶出溶離液に対して行なっても良い。
【0025】
本発明に使用し得るケトアミンオキシダーゼ及びプロテアーゼの濃度としては、液状で使用する場合にはケトアミンオキシダーゼ濃度として0.1〜500U/mlの濃度で使用すれば良く、好ましくは0.5〜200U/ml、最も好ましくは1.0〜100U/mlであるがこれ以外の量を用いても良い。またプロテアーゼの濃度としては0.1U〜1MU/mlの濃度で使用すれば良く、好ましくは1U〜500KU/ml、最も好ましくは5U〜100KU/mlであるがこれ以外の量を用いても良い。酵素類を膜やビーズ、流路壁に固定化する場合には、試料との接触時間、接触量、温度、検出器の感度によって、液状で使用したの濃度から換算して、十分に反応が検出できる量が固定化できていれば良い。
【0026】
本発明を用いて、たとえば被検液中の糖化アミノ酸を消去した後に糖化タンパク質中の糖化アミノ酸を測定する場合には、まず、一定量の被検液0.01〜1000μl程度に、ケトアミンオキシダーゼ含有試薬、例えば0.1〜5000μl程度を1〜60分程度作用させれば良く、これ以外の量や時間を選択しても良い。また、前述のように試薬の作用は膜上等で行ってもよく、分離された一定量の特定タンパク質中の糖化アミノ酸を十分消去できる量であればよい。次に前記反応後にプロテアーゼ試薬を作用させ、定量を行えば良い。
【0027】
また、当然プロテアーゼを先に作用させ、被検液中の特定タンパク質をアミノ酸、ペプチドレベルまで分解した後にケトアミンオキシダーゼを作用させてもよい。
以上のことから、本発明に於ける、試料を、固相と接触させ、特定タンパク質の一定量を分離し、該タンパク質中の糖化タンパク質を酵素を用いて測定するキットとしては、分離部分は前処理カラムのような形状で提供されても良く、磁性ビーズやラテックスの状態で提供されてもよく、マイクロチップの流路壁に固定化されても良く、膜やろ紙上に固定化されて提供されても良い。酵素を用いて糖化タンパク質を測定する部分は、例えば液状品及び液状品の凍結物あるいは凍結乾燥品として提供でき、また、膜や電極上、マイクロチップの流路壁上に固定化された状態で提供されてもよい。
【0028】
【実施例】
以下に、本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明は以下の例によって何ら限定されるものではない。
【0029】
[実施例1]
特定タンパク質を一定量分離する固相の合成、性能評価
1)ジエチルアミノ基の固相への導入
水酸基にエポキシ基を導入することにより活性化し、イオン交換基を導入する。水酸基密度8.0meq/g、比表面積81m/gのポリビニルアルコール樹脂(粒状:昭和電工社製)に、エピクロルヒドリン50meq/g、ジメチルスルホキシド10ml/g樹脂、水酸化ナトリウム5meq/g樹脂を添加し30℃で20時間反応させ、純水で洗浄しエポキシ活性化樹脂を得た。次にジエチルアミン3.5meq/g樹脂をpH10、30℃で20時間反応させ、純水で洗浄しジエチルアミノ基を導入し、ジエチルアミノ基を導入したポリマー(粒状)を得た。ジエチルアミノ基を導入したポリマーの水酸基密度は4.9meq/gジエチルアミノ基0.5meq/gであった。
【0030】
2)カルボキシメチル基の固相への導入
1)と同様の操作を行ってエポキシ活性化樹脂を作成し、ジエチルアミンのかわりにクロロ酢酸ナトリウムを反応させカルボキシメチル基を導入したポリマー(粒状)を得た。ポリマーの水酸基密度は4.5meq/gジエチルアミノ基0.48meq/gであった。
【0031】
3)ジエチルアミノ基を導入したポリマーの性能評価
実施例1の1)で得たジエチルアミノ基を導入したポリマー10mgをキャピラリーに詰め、段階希釈したアルブミン水溶液10μlを注入し、洗浄液(50mM Tris緩衝液 pH8.5)50μlで余分なアルブミンを洗浄除去し、溶出溶離液(50mM Tris緩衝液 pH8.5、220mM MgCl)20μlで吸着したアルブミンを溶出した。溶出した溶液中のアルブミン量は市販のアルブミン測定試薬(BCG法;和光純薬社製)にてアルブミン量を定量した。結果を表1に示す。
表1から分かるように、20g/L以上で常に一定のアルブミンを吸着していることが明白である。
【0032】
【表1】
Figure 2004242522
【0033】
[実施例2]
糖化アルブミン割合の測定
実施例1の“3)ジエチルアミノ基を導入したポリマーの性能評価”において、段階希釈したアルブミン水溶液の代わりに、健常者及び患者の血清を用いる以外は同様の方法を実施し、回収した一定量のアルブミンを含む試料を、酵素を用いて測定した。別途HPLC法でGA値を求め、値を比較した。
【0034】
<ケトアミンオキシダーゼ含有試薬>
30mM トリス緩衝液(和光純薬社製)pH7.5
10U/ml ケトアミンオキシダーゼII(KAODII;旭化成社製)
10U/ml アスコルビン酸オキシダーゼ(ロシュ社製;カボチャ由来)
0.5mM EDTA(和光純薬社製)
1.3mM TOOS(同人化学研究所社製)
<発色試薬>
150mM トリス緩衝液(和光純薬社製)pH7.5
4000U/ml バチルス属由来プロテアーゼ(プロテアーゼタイプ XXVII;シグマ社製)
5mM 4−アミノアンチピリン(和光純薬社製)
20U/ml パーオキシダーゼ(シグマ社製)
<HPLC法>
グリコアルブミン計(GAA−2000;アークレイ社製)使用
<試料> 健常者血清5検体、患者血清5検体
【0035】
<反応手順>
上記ケトアミンオキシダーゼ含有試薬180μlおよび回収した一定量のアルブミンを含有する試料20μ1をセルに分注し37℃で5分間インキュベーションし555nmを測光した(A0)。続いて発色試薬180μlを添加し37℃で5分間インキュベーションし555nmを測光し(A1)、試料の吸光度変化(ΔA=A1−A0)を求めた。一方、試料の代わりに蒸留水を用いてブランクの吸光度変化(ブランクΔA=A1ブランク−A0ブランク)を測定し、ブランク引きの試料の感度(ΔA−ブランクΔA)を求めた。その結果を図1に示す。図1から分かるように、一定量のアルブミンを分離した試料中から得られる糖化アルブミン測定試薬の感度はHPLC法と良く一致していた。このことから、試料を、固相と接触させ、特定タンパク質の一定量を分離し、該タンパク質中の糖化タンパク質を、酵素を用いて測定することにより、別途アルブミンを測定することなく簡便に糖化アルブミン割合を測定可能である。
【0036】
[実施例3]
糖化ヘモグロビン割合の測定
実施例1で得たカルボキシメチル基を導入したポリマー50mgをキャピラリーに詰め、以下の方法で糖化ヘモグロビンを測定した。測定は、試料中のヘモグロビンを吸着後、該ポリマーを洗浄液(50mM Tris緩衝液 pH6.9)250μlで洗浄して余分なヘモグロビンを洗浄除去し、溶出溶離液(50mM Tris緩衝液 pH6.9、220mM MgCl)100μlで吸着したヘモグロビンを溶出した。溶出した溶液中のヘモグロビン量は赤色の吸収を利用して定量した。別途HPLC法で糖化ヘモグロビン(HbA1c)値を求め、値を比較した。
【0037】
<R1;ケトアミンオキシダーゼ含有試薬>
30mM トリス緩衝液(和光純薬社製)pH7.5
10U/ml ケトアミンオキシダーゼII(KAODII;旭化成社製)
10U/ml アスコルビン酸オキシダーゼ(ロシュ社製;カボチャ由来)
0.5mM EDTA(和光純薬社製)
1.3mM TOOS(同人化学研究所社製)
<R2;プロテアーゼ試薬>
150mM トリス緩衝液(和光純薬社製)pH7.5
4000U/ml ストレプトマイセス属由来プロテアーゼ(プロテアーゼタイプXIV;シグマ社製)
<R3;発色試薬>
150mM トリス緩衝液(和光純薬社製)pH8.0
5mM 4−アミノアンチピリン(和光純薬社製)
0.12% TOOS(同人化学研究所社製)
24U/ml ケトアミンオキシダーゼII(旭化成社製)
20U/ml POD(シグマ社製)
<試料> 健常者全血5検体、患者全血5検体
HbA1c値はHbA1c測定装置(アークレイ社製)にて測定した。
【0038】
<反応手順>
上記R1試薬0.9mlおよび試料90μlを混合し、37℃で10分反応を行う。続いて、分子量1万カットの膜で濾過し、ろ液にR2試薬0.9mlを混合し、37℃で2時間反応させた。分子量1万カットの膜で濾過し、ろ液をプロテアーゼ反応溶液とした。プロテアーゼ反応溶液189μlをセルに分注し555nmを測光した(A0)。続いてR3試薬180μlを添加し37℃で5分間インキュベーションし555nmを測光した(A1)。ブランクの測定は、試料に蒸留水を用いてブランクの吸光度変化(ブランクΔA=A1ブランク−A0ブランク)を測定した。その結果を図2に示す。
図2から分かるように、一定量のヘモグロビンを分離した試料中から得られる糖化ヘモグロビン測定試薬の感度はHPLC法と良く一致していた。このことから,試料を、固相と接触させ、特定タンパク質の一定量を分離し、該タンパク質中の糖化タンパク質を酵素を用いて測定することにより、別途ヘモグロビンを測定することなく簡便に糖化ヘモグロビン割合を測定可能である。
【0039】
【発明の効果】
本発明の糖化タンパク質割合の測定方法は、特定タンパク質を一定量吸着すること、及び吸着した特定タンパク質中の糖化タンパク質量を酵素を用いて測定することにより、簡便且つ安価に糖化タンパク質割合の測定方法を提供する効果を有する。
また、本発明の糖化タンパク質割合の測定用キットは、糖化タンパク質割合の測定を簡便且つ安価に行なうためのキットを提供する効果を有する。
【図面の簡単な説明】
【図1】本発明の実施例2に基づき得られた酵素法とHPLC法の相関である。
【図2】本発明の実施例3に基づき得られた酵素法とHPLC法の相関である。

Claims (10)

  1. 試料を、固相と接触させ、特定タンパク質の一定量を分離し、該タンパク質中の糖化タンパク質量を、酵素を用いて測定することを特徴とする糖化タンパク質割合の方法。
  2. 固相がイオン交換基を導入した固相であり、かつその導入量が試料中の特定タンパク質量より少なく、かつ酵素を用いて測定するに十分感度が取れる量であることを特徴とする請求項1記載の方法。
  3. 特定タンパク質がアルブミンであり、イオン交換基が弱陰イオン交換基であることを特徴とする請求項2に記載の方法。
  4. 特定タンパク質がヘモグロビンであり、イオン交換基が弱陽イオン交換基であることを特徴とする請求項2に記載の方法。
  5. 酵素を用いて測定する方法がプロテアーゼ及び少なくとも糖化アミノ酸に作用する酵素を用いることを特徴とする請求項1〜4いずれかに記載の方法。
  6. 試料の中の特定タンパク質に親和性を有し、試料中の特定タンパク質の一定量を分離できる固相、及び該タンパク質中の糖化タンパク質測定用酵素よりなる糖化タンパク質割合測定用キット。
  7. 固相がイオン交換基を導入した固相であり、かつその導入量が試料中の特定タンパク質量より少なく、かつ酵素を用いて測定するに十分感度が取れる量である請求項6記載のキット。
  8. 特定タンパク質がアルブミンであり、イオン交換基が弱陰イオン交換基であることを特徴とする請求項7に記載のキット。
  9. 特定タンパク質がヘモグロビンであり、イオン交換基が弱陽イオン交換基であることを特徴とする請求項7に記載のキット。
  10. 糖化タンパク質測定用酵素がプロテアーゼ及び少なくとも糖化アミノ酸に作用する酵素である請求項6〜9いずれかに記載のキット。
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