JP2014530367A - 酵素誘発レドックス変化化学的脱離（ｅ−ｔｒａｃｅ）イムノアッセイを使用する、ヘモグロビンａ１ｃのパーセンテージの単回直接検出 - Google Patents

酵素誘発レドックス変化化学的脱離（ｅ−ｔｒａｃｅ）イムノアッセイを使用する、ヘモグロビンａ１ｃのパーセンテージの単回直接検出 Download PDF

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Abstract

本開示は、２つのユニークな電位、Ｅｏ１およびＥｏ２において定量可能な電気化学的信号をもたらす、遷移金属錯体に付着した官能基の変換を使用する、試料中のヘモグロビンＡ１ｃのパーセンテージを単回直接検出するための新規構成物および方法にも関する。【選択図】図１

Description

本発明は、遷移金属錯体のＥ０の変化を使用して標的分析物を検出するための新規構成物および方法に関する。本発明は、２つのユニークな電位、ＥＯ １およびＥＯ ２で定量可能な電気化学的信号をもたらす、遷移金属錯体に付着した官能基の変換を使用してヘモグロビンＡ１ｃを検出するための新規構成物および方法にも関する。
起電力（ＥＭＦ）は、ガルバーニ電池またはボルタ電池の２つの電極間の最大電位差であり、この場合、標準水素電極は、以下の電池については左側にある：
Figure 2014530367
ＥＭＦは、電池の図式的スキームにおいて右側に配置された電極の電極電位と呼ばれるが、溶液間の液界を無視もしくは計算することができるとき、または液界がまったく存在しない場合にのみそう呼ばれる。
右側の電極の電極電位（酸化−還元電位と呼ばれることが多い）は、ネルンストの式によって与えられる。
Figure 2014530367
この関係は、
Figure 2014530367
が
Figure 2014530367
に等しく設定され、ｐＨおよび
Figure 2014530367
がゼロに等しいとき、式（２．２１）に従う。電極電位の記号の下付き文字では、酸化還元系の酸化成分および還元成分の記号が示されている。より複雑な反応では、特に、記号Ｅの後に電池の右半分で起こる全反応（「半電池」反応）を書くことが推奨され、今回のケースでは、
Figure 2014530367
である。
量
Figure 2014530367
は、標準電極電位と呼ばれる。これは、酸化還元系の成分の酸化能力または還元能力を特徴付ける。より正の標準電極電位で、系の酸化型は、より強い酸化剤であり、還元型は、より弱い還元剤である。同様に、より負の標準電位で、酸化還元系の還元成分は、より強い還元剤であり、酸化型は、より弱い酸化剤である。
標準電極Ｅ０は、ネルンストの式、式（１−２）におけるその標準的な使用法において、
Figure 2014530367
と記載される。
Ｅ０がレドックス反応の標準電位である場合、Ｒは、一般気体定数（８．３１４ＪＫ−１ｍｏｌ−１）であり、Ｔは、ケルビン温度であり、ｎは、反応内に移される電子の数であり、Ｆは、ファラデー定数（９６，４８７クーロン）である。Ｅ０の負の側で、したがって酸化型は、還元される傾向があり、順反応（すなわち、還元）がより好都合である。電気活性種の酸化状態の変化から生じる電流は、ファラデー電流と呼ばれる。
以前の研究では、２つのユニークな電位、Ｅｏ １およびＥｏ ２で定量可能な電気化学的信号をもたらす、遷移金属錯体に付着した官能基の変換を使用することが記載されている。例えば、すべてその全体が参照により本明細書に組み込まれている、米国特許第１１−１００５−ＵＳ号、および同第１１−１００５−ＵＳ２号を参照。この方法は一般に、電極以外の固体支持体上に、機能タグを有し得る結合リガンドのサンドイッチ内の分析物を結合するステップを含む。標的を結合した後、過酸化物生成部分または中間酵素および基質を添加し、それにより過酸化水素が生成する。レドックス活性複合体は、電極に結合され、過酸化物感受性部分（ＰＳＭ）を含む。酵素系から生成される過酸化物は、ＰＳＭと反応し、自壊的（self-immolative）部分（ＳＩＭ）を除去し、遷移金属錯体に付着した官能基を変換し、２つのユニークな電位、Ｅｏ １およびＥｏ ２で定量可能な電気化学的信号をもたらす。
糖尿病罹患患者は、通常の様式でグルコースを代謝することができないため、患者の血液および尿中にグルコースが蓄積する。慣例的に、このような体液中のグルコースレベルは、糖尿病症状の状態の尺度として採用され、それは次に、摂取すべきインスリンもしくは他の作用物質の量、または患者の食事を変更する必要性の指針として使用される。グルコースレベルが最後の食事、最後のインスリン注射などの時間および内容に応じて広く変動し得ることを除いて、これは、適度にうまく機能する。したがって、読みは、瞬間的な症状を反映することになり、それは、糖尿病症状のより長い期間の状態を真に識別しない場合がある。単回のグルコース判定を回避するために、経口投与後のグルコースの血中レベルを測定するのに、より入念な測定（例えば、４〜８時間のグルコース負荷試験）が使用される。これらの後者の検査は、時間がかかり、高価であり、個人は、アッセイの過程中、絶食しなければならない。糖尿病症状の別の作用は、糖尿病患者の血液中の糖化ヘモグロビン（Ｈｂ）の量の増加であることが公知である。ヘモグロビンの糖化は、グルコースおよびバリンのα−アミノ基を伴う非酵素反応によって起こる。糖化反応は、反応物、例えば、ヘモグロビンおよびグルコースの濃度によって支配される。正常な（非糖尿病の）個人では、総ヘモグロビンの約３％が糖化されている。β鎖のＮ末端に１−デオキシフルクト−バリンを有するヘモグロビン四量体は、糖化またはＡ１ｃヘモグロビンであると同定されている。ヘモグロビンに対して、Ａ１ｃレベルは、５〜１２％上昇される。ヘモグロビンの循環寿命は約１２０日であるので、糖化ヘモグロビンを測定すると、その期間の平均グルコースレベルを反映する値を得ることになる。特に、グルコースが高い食事は、高い糖化ヘモグロビンまたは血清アルブミンレベルに反映されない。したがって、糖化ヘモグロビン含量を測定すると、平均循環グルコースレベルのより真の状況、したがって、患者の長期間の症状のより真の状況が得られる。糖化Ｈｂ（％ＨｂＡ１ｃ）の１％の変化は、先の１２０日にわたる血中グルコースレベルの３００ｍｇ／ｍＬの平均変化を代表することが報告されている。
一方が糖化ヘモグロビンの濃度について、他方が総ヘモグロビンの濃度についての２つの別々の測定を実施するために抗体を利用するＡ１Ｃ％の測定を記載する多くの文献および特許参考文献がある。Ａ１Ｃ％は、［ヘモグロビンＡ１ｃ］／［ヘモグロビン］の比として計算される。例としては、米国特許第４，７２７，０３６号、米国特許第４，２４７，５３３号、米国特許第５，２０６，１４４号、および米国特許第４，８０６，４６８号がある。これらの特許には、２つの異なる分析物について２つの別々のアッセイを実施し、次いで［ヘモグロビンＡ１ｃ］／［ヘモグロビン］の比としてＡ１Ｃ％を計算することが困難で不正確であることが記載されている。この方法を使用すると、測定誤差の作用が増幅され、それによって、報告されるＡ１Ｃ％の不正確さが増す。
さらに、米国特許第５，４０７，７５９号および米国特許第６，１６２，６４５号では、これらの方法が単回測定のＡ１Ｃ％検出に基づくことが暗示されている。しかし、これらの方法では、用語「単回測定」が、紛らわしい様式で使用されており、または臨床試料を正確に測定するために普遍的に適用することができる手法が記載されていない。特に、これらの特許の中の特許請求の範囲にも詳細な説明にも、総ヘモグロビンの濃度が試料同士間で有意に変化する場合に、これらの「単回測定」手法をどのように正確に適用することができるかが明確に提示されていない。ヘモグロビン濃度の生理的範囲は、５ｇ／ｄＬ〜２０ｇ／ｄＬに及び、４倍の差異がある。
米国特許第１１−１００５−ＵＳ号 米国特許第１１−１００５−ＵＳ２号 米国特許第４，７２７，０３６号 米国特許第４，２４７，５３３号 米国特許第５，２０６，１４４号 米国特許第４，８０６，４６８号 米国特許第５，４０７，７５９号 米国特許第６，１６２，６４５号 ＰＣＴ／ＵＳ２００８／０８０３７９ 米国特許出願第１２／２５３，８２８号 米国特許出願第１２／２５３，８７５号 米国特許出願第１２／８５３，２０４号 米国仮特許出願第６１／３３２，５６５号 米国仮特許出願第６１／３４７，１２１号 米国仮特許出願第６１／３９４，４５８号 米国仮特許出願第６１／３６６，０１３号 米国仮特許出願第６１／４０７，８２８号 米国仮特許出願第６１／５４７，８２４号 米国特許第７，５９５，１５３号 米国特許第７，７５９，０７３号 米国特許第７，７１３，７１１号 米国特許出願第１３／３５４，２００号 ［特許文献２３］米国仮出願第６１／４３４，１２２号 米国仮出願第６１／５２３，６７９号 米国仮出願第６１／２３２，３３９号 米国特許第６，９４２，７７１号 米国特許第７，３１２，０８７号 米国特許第６，７４０，５１８号 米国特許第７，３１２，０８７号 ＷＯ／１９９９／５７３１７ 米国公開第２００９００４１７９１号 米国公開第２０１００１４５０３６号 米国特許第７，７０５，０４５号 米国特許第７，２２３，８３７号 ＰＣＴ／ＵＳ２００８／０８０３６３ 米国特許第５，２７０，１６３号 米国特許第５，４７５，０９６号 米国特許第５，５６７，５８８号 米国特許第５，５９５，８７７号 米国特許第５，６３７，４５９号 米国特許第５，６８３，８６７号 米国特許第５，７０５，３３７号 米国特許出願公開第２００８０２４８５９２号 米国特許第６，０１３，４５９号 米国特許第６，２４８，２２９号 米国特許第７，０１８，５２３号 米国特許第第７，２６７，９３９号 米国特許出願第０９／０９６５９３号 米国特許出願第６０／９８０，７３３ 米国仮出願第６１／０８７，１０２号 ＰＣＴ／ＵＳ２００８／０８０３７９
Ｇａｒｄｎｅｒら、Ｓｅｎｓｏｒｓ ａｎｄ Ａｃｔｕａｔｏｒｓ Ａ ５１（１９９５）５７〜６６頁 Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ Ｃｏｏｒｄｉｎａｔｉｏｎ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、Ｗｉｌｋｉｎｓｏｎら編、Ｐｅｒｇａｍｍｏｎ Ｐｒｅｓｓ、１９８７、１３．２章（７３〜９８頁）、２１．１章（８１３〜８９８頁）、および２１．３章（９１５〜９５７頁） ＣｏｔｔｏｎおよびＷｉｌｋｅｎｓｏｎ、Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、５版、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ、１９８８ Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｉｎｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、５版、Ｃｏｔｔｏｎ＆Ｗｉｌｋｉｎｓｏｎ、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ、１９８８、２６章 Ｏｒｇａｎｏｍｅｔａｌｌｉｃｓ，Ａ Ｃｏｎｃｉｓｅ Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ、Ｅｌｓｃｈｅｎｂｒｏｉｃｈら、２版、１９９２、ＶＣＨ Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ Ｏｒｇａｎｏｍｅｔａｌｌｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ＩＩ，Ａ Ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ ｔｈｅ Ｌｉｔｅｒａｔｕｒｅ １９８２−１９９４、Ａｂｅｌら編、７巻、７、８、１０＆１１章、Ｐｅｒｇａｍｏｎ Ｐｒｅｓｓ Ｒｏｂｉｎｓら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１０４：１８８２〜１８９３頁（１９８２） Ｇａｓｓｍａｎら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１０８：４２２８〜４２２９頁（１９８６） Ｃｏｎｎｅｌｌｙら、Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．９６：８７７〜９１０頁（１９９６） Ｇｅｉｇｅｒら、Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｏｒｇａｎｏｍｅｔａｌｌｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２３：１〜９３頁 Ｇｅｉｇｅｒら、Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｏｒｇａｎｏｍｅｔａｌｌｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２４：８７頁 Ｓｅｌｌａ，Ｅ．；Ｓｈａｂａｔ，Ｄ．Ｓｅｌｆ−ｉｍｍｏｌａｔｉｖｅ ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ ｐｒｏｂｅ ｆｏｒ ｔｈｅ ｄｉｒｅｃｔ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｔｒｉａｃｅｔｏｎｅ ｔｒｉｐｅｒｏｘｉｄｅ．、Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍｕｎ．２００８、５７０１〜５７０３頁 Ｌｏ，Ｌ．−Ｃｌ；Ｃｈｕ，Ｃ．−Ｙ．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ｈｉｇｈｌｙ ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ａｎｄ ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ｐｒｏｂｅｓ ｆｏｒ ｈｙｄｒｏｇｅｎ ｐｅｒｏｘｉｄｅ．、Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍｕｎ．２００３、２７２８〜２７２９頁 Ｓａｇｉら、Ａｍｐｅｒｏｍｅｔｒｉｃ Ａｓｓａｙ ｆｏｒ Ａｌｄｏｌａｓｅ Ａｃｔｉｖｉｔｙ；Ａｎｔｉｂｏｄｙ−Ｃａｔａｌｙｚｅｄ Ｆｅｒｒｏｃｅｎｙｌａｍｉｎｅ Ｆｏｒｍａｔｉｏｎ．、Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．２００６、７８、１４５９〜１４６１頁 Ｃｈｅｎら、Ｌａｎｇｍｕｉｒ １０：３３３２〜３３３７頁（１９９４） Ｌａｎｈａｒｄら、Ｊ．Ｅｌｅｃｔｒｏａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．７８：１９５〜２０１頁（１９７７） Ｄｅｉｎｈａｍｍｅｒら、Ｌａｎｇｍｕｉｒ １０：１３０６〜１３１３頁（１９９４） Ｎａｐｉｅｒら、Ｌａｎｇｍｕｉｒ、１９９７ Ｈ．Ｈｏｌｄｅｎ Ｔｈｏｒｐｅ、ＣＨＩ ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ、１９９８年５月４〜５日 Ｌｉら、Ｏｒｇ．Ｌｅｔｔ．４：３６３１〜３６３４頁（２００２） Ｗｅｉら、Ｊ．Ｏｒｇ，Ｃｈｅｍ．６９：１４６１〜１４６９頁（２００４） Ｋａｄｉｄａｔｅら、Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．２００６、７８：３３７〜３４２頁 Ｗａｎｇら、Ｂｉｏｓｅｎｓ．Ｂｉｏｅｌｅｃｔｒｏｎ．２０１０、２５：２１０１〜２１０６頁 Ｂｅｃｋｅｔｔら、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉ．１９９９ ８：９２１〜９２９頁 Ｃｒｏｎａｎ、Ｃｅｌｌ、１９８９、５８：４２７〜４２９頁 Ｇｒａｙら、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６５：５３７頁（１９９６） Ｂｅｒｔｉｎ，Ｐ．Ａ．；Ｍｅａｄｅ，Ｔ．Ｊ． Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．２００９、５０、５４０９〜５４１２頁 Ｍｕｒｐｈｙ，Ｌ．Ｊ．ら、Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．１９９４、６６、４３４５〜４３５３頁 Ｌｌａｕｄｅｔ，Ｅ．ら、Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．２００５、７７、３２６７〜３２７３頁
本明細書に開示の発明は、生理的総ヘモグロビン濃度にかかわらずＡ１Ｃ％を測定し、ヘモグロビンＡ１Ｃ％の正確な判定を生じさせるための、試料間で普遍的に利用することができる真の単回測定手法である。ヘモグロビンＡ１Ｃと総ヘモグロビンの比を直接検出する単回測定手法の利点を以下に記載する。本明細書の定義では、用語「単回測定」および「単回直接測定」は、１つが糖化タンパク質（例えば、ヘモグロビンＡ１Ｃ）の濃度について、１つが総タンパク質（例えば、総ヘモグロビン）の濃度についての２つの別々の測定を実施しない、糖化タンパク質（例えば、ヘモグロビンＡ１Ｃ）と総タンパク質（例えば、総ヘモグロビン）の比の単回測定を意味する。
したがって、本発明は、レドックス活性分子のＥ０に対応する溶媒再配置エネルギーを使用して標的分析物を検出するための構成物および方法を提供する。
本発明は、２つのユニークな電位、Ｅｏ １およびＥｏ ２で定量可能な電気化学的信号をもたらす、遷移金属錯体に付着した官能基の変換を使用して標的分析物を検出するための構成物および方法も提供する。
一態様では、本発明は、検査試料中の標的分析物を検出するための構成物および方法を提供する。したがって、本発明は、任意選択の自己組織化単分子層（ＳＡＭ）、（ｉｉ）自壊的部分（ＳＩＭ）および過酸化物感受性部分（ＰＳＭ）を含む遷移金属錯体を含む共有結合的に付着した電気活性活性部分（ＥＡＭ）を備える電極を備える第１の固体支持体であって、前記ＥＡＭは、第１のＥ０および自己組織化単分子層（ＳＡＭ）を有する、固体支持体を提供する。分析物に結合する捕捉結合リガンドは、電極以外の第２の固体支持体上にある。
本明細書に記載の発明は一般に、総タンパク質の分率としての糖化タンパク質を判定するための方法である。本方法は、特定の実施形態、すなわち、糖化ヘモグロビンと総ヘモグロビンの比の単回測定検出によって例示される。しかし、例示した方法を拡張して、広範囲の糖化血清タンパク質（例えば、フルクトサミン）、または糖化アルブミンに適用することができ、３種すべては可能性がある糖尿病マーカーとして使用される。しかし、これは、すべての他の可能性がある糖化タンパク質、例えば、アルブミン、免疫グロブリン、リポタンパク質、フィブリノーゲン、調節タンパク質、および凝固因子などを含むように拡張することもできる。より詳細には、これらのタンパク質として、α２−マクログロブリン、３つのタイプ−α、β、およびγのものである他のグロブリン、αアンチトリプシン、トランスフェリン、プロトロンビン、ＭＢＬまたはＭＢＰ、プレアルブミン、α１アンチトリプシン、α１酸性糖タンパク質、α１フェトプロテイン、ハプトグロビン、α２マクログロブリン、セルロプラスミン、転移Ｃ３／Ｃ４β２ミクログロブリン（Transferring C3/C4 Beta 2 microglobulin）、βリポタンパク質、γグロブリンタンパク質、Ｃ反応性タンパク質（ＣＲＰ）を挙げることができる。
一実施形態では、本方法は、標的分析物および捕捉結合リガンドを含む第２の固体支持体を、標的分析物が捕捉結合リガンドに結合する条件下で接触させて、第１の複合体を形成することと、第１の複合体を、標的分析物に結合する可溶性タグ付き結合リガンドと接触させて、第２の複合体を形成することであって、可溶性タグ付き結合リガンドは過酸化物生成系の中間酵素成分を含むこととによって進行する。基質を、過酸化物が生成される条件下で第２の複合体に添加して、アッセイ混合物を形成する。次いで、過酸化物含有アッセイ混合物は、第１のＥ０を有する共有結合的に付着した電気活性活性部分（ＥＡＭ）を備える電極を備える前記第１の固体支持体と接触し、ここで、前記ＥＡＭは自壊的部分（ＳＩＭ）および過酸化物感受性部分（ＰＳＭ）を含む遷移金属錯体を含む。前記過酸化物は、前記ＰＳＭと反応し、それによって前記ＥＡＭからの前記ＳＩＭの除去を誘発して、前記第１のＥ０と異なる第２のＥ０を有する第２のＥＡＭを形成する。次いで、２つのユニークな電位、Ｅｏ １およびＥｏ ２での定量可能な電気化学的信号に基づいて、総ヘモグロビンに対する糖化ヘモグロビンのパーセンテージが測定される。
好適な実施形態では、本方法は、標的分析物を、標的分析物が過酸化物生成部分を含む可溶性タグ付き結合リガンドに結合する条件下で接触させて、第１の複合体を形成することと、第１の複合体を、標的分析物に結合する捕捉結合リガンドを含む第２の固体支持体と接触させて、第２の複合体を形成することとによって進行する。基質を、過酸化物が生成される条件下で第２の複合体に添加して、アッセイ混合物を形成する。次いで、過酸化物含有アッセイ混合物は、第１のＥ０を有する共有結合的に付着した電気活性活性部分（ＥＡＭ）を備える電極を備える前記第１の固体支持体と接触し、ここで、前記ＥＡＭは自壊的部分（ＳＩＭ）および過酸化物感受性部分（ＰＳＭ）を含む遷移金属錯体を含む。前記過酸化物は、前記ＰＳＭと反応し、それによって前記ＥＡＭからの前記ＳＩＭの除去を誘発して、前記第１のＥ０と異なる第２のＥ０を有する第２のＥＡＭを形成する。次いで、２つのユニークな電位、Ｅｏ １およびＥｏ ２での定量可能な電気化学的信号に基づいて総ヘモグロビンに対する糖化ヘモグロビンのパーセンテージが測定される。
一実施形態では、本方法は、標的分析物および捕捉結合リガンドを含む第２の固体支持体を、標的分析物が捕捉結合リガンドに結合する条件下で接触させて、第１の複合体を形成することと、第１の複合体を、標的分析物に結合する可溶性タグ付き結合リガンドと接触させて、第２の複合体を形成することであって、タグ付き結合リガンドは過酸化物生成系の中間酵素成分を含むこととによって進行する。基質を、過酸化物が生成される条件下で第２の複合体に添加して、アッセイ混合物を形成する。次いで、過酸化物含有アッセイ混合物は、第１のＥ０を有する共有結合的に付着した電気活性活性部分（ＥＡＭ）を備える電極を備える前記第１の固体支持体と接触し、ここで、前記ＥＡＭは自壊的部分（ＳＩＭ）および過酸化物感受性部分（ＰＳＭ）を含む遷移金属錯体を含む。前記過酸化物は、前記ＰＳＭと反応し、それによって前記ＥＡＭからの前記ＳＩＭの除去を誘発して、前記第１のＥ０と異なる第２のＥ０を有する第２のＥＡＭを形成する。次いで、２つのユニークな電位、Ｅｏ １およびＥｏ ２での定量可能な電気化学的信号に基づいて、総ヘモグロビンに対する糖化ヘモグロビンのパーセンテージが測定される。
別の実施形態では、本方法は、標的分析物を、標的分析物が可溶性タグ付き結合リガンドに結合する条件下で接触させて、第１の複合体を形成することであって、可溶性タグ付き結合リガンドは過酸化物生成系の中間酵素成分を含むことと、第１の複合体を、標的分析物に結合する捕捉結合リガンドを含む第２の固体支持体と接触させて、第２の複合体を形成することとによって進行する。基質を、過酸化物が生成される条件下で第２の複合体に添加して、アッセイ混合物を形成する。次いで、過酸化物含有アッセイ混合物は、ここで第１のＥ０を有する共有結合的に付着した電気活性活性部分（ＥＡＭ）を備える電極を備える前記第１の固体支持体と接触し、ここで、前記ＥＡＭは自壊的部分（ＳＩＭ）および過酸化物感受性部分（ＰＳＭ）を含む遷移金属錯体を含む。前記過酸化物は、前記ＰＳＭと反応し、それによって前記ＥＡＭからの前記ＳＩＭの除去を誘発して前記第１のＥ０と異なる第２のＥ０を有する第２のＥＡＭを形成する。次いで、２つのユニークな電位、Ｅｏ １およびＥｏ ２での定量可能な電気化学的信号に基づいて、総ヘモグロビンに対する糖化ヘモグロビンのパーセンテージが測定される。
標的分析物（すなわち、糖化ヘモグロビン）を検出するための方法のある特定の実施形態では、試料を添加する前に、第１のＥ０を有する電気活性活性部分（ＥＡＭ）が存在し、ここで、ＥＡＭ、自壊的部分（ＳＩＭ）および過酸化物感受性部分（ＰＳＭ）を含む遷移金属錯体を含む。前記過酸化物は、前記ＰＳＭと反応し、それによって前記ＥＡＭからの前記ＳＩＭの除去を誘発して前記第１のＥ０と異なる第２のＥ０を有する第２のＥＡＭを形成する。次いで、２つのユニークな電位、Ｅｏ １およびＥｏ ２での定量可能な電気化学的信号に基づいて、総ヘモグロビンに対する糖化ヘモグロビンのパーセンテージが測定される。異なる電位、Ｅ０でのこれらの２つの応答からの様々な分析および得られる比を使用して分析物を定量化することができる。これらの比として、それだけに限らないが、これらの２つの電位に関連する総ピーク電流、ファラデーピーク電流、またはピーク電荷の比を挙げることができる。
別の態様では、本発明は、（ａ）（ｉ）自己組織化単分子層（ＳＡＭ）、（ｉｉ）自壊的部分および過酸化物感受性部分（ＰＳＭ）を含む遷移金属錯体を含む共有結合的に付着した電気活性活性部分（ＥＡＭ）であって、前記第１のＥＡＭが第１のＥ０を有する、ＥＡＭを備える電極を備える第１の固体支持体と、（ｂ）過酸化物生成酵素であって、前記過酸化物生成酵素の基質の存在下で過酸化物を生成する過酸化物生成酵素を含む第２の固体支持体とを含む構成物を提供する。
一実施形態では、見かけ上の式量電位の過酸化物誘発変化（Ｅ−ＴＲＡＣＥ）を起こす代表的なフェロセン系ＥＡＭの反応機構は、以下のステップに従う：
（ａ）電子求引性カルバメート連結ボロン酸エステル置換リガンドを含有する出発フェロセニルＥＡＭ。
（ｂ）出発化学種と別個のレドックス電位を生じさせる、フェロセン上に電子供与性アミノリガンドをもたらす過酸化物との反応。
一態様では、本開示は、タンパク質および糖化タンパク質を含む検査試料中において、前記タンパク質の前記糖化タンパク質である分率を測定するための単回直接測定法、
（ａ）第１の結合リガンドを前記検査試料と、前記第１の結合リガンドが前記検査試料中の前記糖化タンパク質の分率に正比例して、前記タンパク質および前記糖化タンパク質に選択的および同等に結合する条件下で接触させて、第１の複合体を形成するステップと、
（ｂ）第１の複合体を含有する前記試料を第２の結合リガンドと、前記第１の複合体および前記第２の結合リガンドが結合する条件下で接触させて、第２の複合体を形成するステップであって、前記第２の結合リガンドは、過酸化物生成系を含み、前記第１の複合体の前記糖化タンパク質に特異的に結合する、ステップと、
（ｃ）前記第２の複合体を単離するステップと、
（ｄ）前記第２の複合体を前記過酸化物生成系の基質と、過酸化物が生成される条件下で接触させて、アッセイ混合物を形成するステップと、
（ｅ）アッセイ混合物を、第１のＥ０を有する共有結合的に付着した電気活性部分（ＥＡＭを備える電極を備える第１の固体支持体と接触させるステップであって、前記ＥＡＭは自壊的部分（ＳＩＭ）および過酸化物感受性部分（ＰＳＭ）を含む遷移金属錯体を含み、前記過酸化物は、前記ＰＳＭと反応して、前記ＥＡＭから前記ＳＩＭを放出し、第２のＥ０を有する前記ＥＡＭをもたらすステップと、
（ｆ）第１のＥ０および第２のＥ０で前記ＥＡＭの電気化学特性を測定するステップと、
（ｇ）前記電気化学特性から前記糖化タンパク質の分率を判定するステップと
を含む方法を提供する。
本明細書において、用語「前記糖化タンパク質の分率に正比例」は、総タンパク質（例えば、総ヘモグロビン）に対する糖化タンパク質（例えば、ヘモグロビンＡ１Ｃ）の分率を意味する。
別の態様では、本開示は、タンパク質および糖化タンパク質を含む検査試料中において、前記タンパク質の前記糖化タンパク質である分率を測定するための単回直接測定法であって、
（ａ）過酸化物生成系を含む第１の結合リガンドを検査試料と、第１の結合リガンドが前記糖化タンパク質に特異的に結合する条件下で接触させて、第１の複合体を形成するステップと、
（ｂ）第１の複合体を含有する前記試料を第２の結合リガンドと、前記第２の結合リガンドが前記検査試料中の前記糖化タンパク質の分率に正比例して、前記タンパク質、および前記第１の複合体の前記糖化タンパク質に選択的および同等に結合する条件下で接触させて、第２の複合体を形成するステップと、
（ｃ）前記第２の複合体を単離するステップと、
（ｄ）前記第２の複合体を前記過酸化物生成系の基質と、過酸化物が生成する条件下で接触させて、アッセイ混合物を形成するステップと、
（ｅ）アッセイ混合物を、第１のＥ０を有する共有結合的に付着した電気活性部分（ＥＡＭ）を備える電極を備える第１の固体支持体と接触させるステップであって、前記ＥＡＭは自壊的部分（ＳＩＭ）および過酸化物感受性部分（ＰＳＭ）を含む遷移金属錯体を含み、前記過酸化物は、前記ＰＳＭと反応して、前記ＥＡＭから前記ＳＩＭを放出し、第２のＥ０を有する前記ＥＡＭをもたらすステップと、
（ｆ）第１のＥ０および第２のＥ０で前記ＥＡＭの電気化学特性を測定するステップと、
（ｇ）前記電気化学特性から前記糖化タンパク質の分率を判定するステップと
を含む方法を提供する。
ある特定の実施形態では、上述した方法は、電極が自己組織化単分子層（ＳＡＭ）をさらに備えるものである。
ある特定の実施形態では、上述した方法は、第１の結合リガンドが第２の固体支持体に付着しているものである。
ある特定の実施形態では、上述した方法は、第２の結合リガンドが第２の固体支持体に付着しているものである。
他の実施形態では、上述した方法は、第２の固体支持体が、微粒子、磁性微粒子、ビーズ、およびマイクロチャネルからなる群から選ばれるものである。
他の実施形態では、上述した方法は、過酸化物生成系がオキシダーゼ酵素であるものである。
ある特定の実施形態では、上述した方法は、過酸化物生成酵素が、グルコースオキシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、アシルＣｏＡオキシダーゼ、アルコールオキシダーゼ、アルデヒドオキシダーゼ、Ｄ−アミノ酸オキシダーゼ（ＤＡＡＯ）、コリンオキシダーゼ、およびアシルＣｏＡオキシダーゼからなる群から選択されるものである。
他の実施形態では、上述した方法は、過酸化物生成系が、過酸化物生成系の中間酵素成分、例えば、アルカリホスファターゼまたは任意の他のホスファターゼなどであるものである。
他の実施形態では、上述した方法は、第１の結合リガンドおよび第２の結合リガンドが独立して、モノクローナル抗体、モノクローナル抗体の断片、ポリクローナル抗体、ポリクローナル抗体の断片、タンパク質、およびペプチドからなる群から選ばれるものである。
ある特定の実施形態では、上述した方法は、ＥＡＭが遷移金属を含むものである。他の実施形態では、遷移金属は、鉄、ルテニウム、およびオスミウムからなる群から選ばれる。別の実施形態では、ＥＡＭは、フェロセンおよび置換フェロセンからなる群から選ばれる。
他の実施形態では、上述した方法は、タンパク質がヘモグロビンであり、糖化タンパク質が糖化ヘモグロビンであるものである。別の実施形態では、タンパク質はヘモグロビンであり、糖化タンパク質はヘモグロビンＡ１ｃである。さらに別の実施形態では、糖化タンパク質は、糖化血清タンパク質、フルクトサミン、および糖化アルブミンである。
一態様では、本開示は、
（ａ）
（ｉ）自壊的部分（ＳＩＭ）および過酸化物感受性部分（ＰＳＭ）を含む遷移金属錯体を含む共有結合的に付着した電気活性活性部分（ＥＡＭ）であって、前記ＳＩＭが前記ＥＡＭに共有結合的に付着しているとき第１のＥＯを有し、前記ＳＩＭが存在しないとき第２のＥＯを有する、ＥＡＭ、
（ｉｉ）任意選択の自己組織化単分子層（ＳＡＭ）
を備える第１の固体支持体と、
（ｂ）検査試料中の糖化タンパク質の分率に正比例して、タンパク質および糖化タンパク質に選択的および同等に結合する第１の結合リガンドと、
（ｃ）前記糖化タンパク質に特異的に結合する第２の結合リガンドであって、過酸化物生成系を含み、第２の固体支持体に任意選択により結合している第２の結合リガンドと、
（ｄ）前記過酸化物生成系の任意選択の基質と
を含む構成物を提供する。
一態様では、本発明は、検査試料中の標的分析物を検出するための構成物および方法を提供する。したがって、本発明は、自己組織化単分子層（ＳＡＭ）、（ｉｉ）自壊的部分（ＳＩＭ）および過酸化物感受性部分（ＰＳＭ）を含む遷移金属錯体を含む共有結合的に付着した電気活性活性部分（ＥＡＭ）を備える電極を備える固体支持体であって、前記ＥＡＭは、第１のＥ０、および分析物に結合する捕捉結合リガンド、および自己組織化単分子層（ＳＡＭ）を有する、固体支持体を提供する。
本方法は、標的分析物および固体支持体を、標的分析物が捕捉結合リガンドに結合して第１の複合体を形成する条件下で接触させ、第１の複合体を、標的分析物に結合する可溶性捕捉リガンドであって、第２の複合体を形成するための過酸化物生成部分を含むリガンドと接触させることによって進行する。過酸化物基質は、過酸化物が生成され、自壊的部分が除去される結果、ＥＡＭが第２のＥ０を有する条件下で第２の複合体に添加される。次いで第２のＥ０は、前記標的の存在の指標として検出される。
別の態様では、本発明は、検査試料中の標的分析物を検出するための方法であって、（ｉ）自己組織化単分子層（ＳＡＭ）；（ｉｉ）自壊的部分および過酸化物感受性部分（ＰＳＭ）を含む遷移金属錯体を含む共有結合的に付着した電気活性活性部分（ＥＡＭ）であって、第１のＥ０を有する、ＥＡＭ、（ｉｉｉ）前記標的分析物の存在下で過酸化物を生成する過酸化物生成酵素、を備える電極を備える固体支持体を準備するステップと、（ｂ）前記標的分析物および前記固体支持体を、前記標的分析物が前記酵素と反応して過酸化物を生成し、前記自壊的部分が除去される結果、前記ＥＡＭが第２のＥ０を有する条件下で接触させるステップと、（ｃ）前記標的分析物の存在の指標として前記第２のＥ０を検出するステップとを含む方法を提供する。
別の態様では、本発明は、検査試料中の標的分析物を検出するための方法であって、（ｉ）自己組織化単分子層（ＳＡＭ）；（ｉｉ）自壊的部分および過酸化物感受性部分（ＰＳＭ）を含む遷移金属錯体を含む共有結合的に付着した電気活性活性部分（ＥＡＭ）であって、第１のＥ０を有する、ＥＡＭ；を備える電極を備える固体支持体を準備するステップと、（ｂ）前記標的分析物および前記固体支持体を、酵素および任意選択により前記酵素の追加の基質の存在下で、前記分析物が存在する場合に第１の複合体が形成される条件下で接触させるステップと、（ｃ）前記第１の複合体を過酸化物生成酵素と、前記第１の複合体が形成される場合に前記酵素が前記電極に付着される条件下で接触させるステップと、（ｄ）過酸化物が生成され、前記自壊的部分が除去される結果、前記ＥＡＭが第２のＥ０を有するように前記酵素の基質を準備するステップと、（ｅ）前記標的分析物の存在の指標として前記第２のＥ０を検出するステップとを含む方法を提供する。
別の態様では、本発明は、検査試料中の標的分析物を検出するための方法であって、（ｉ）自己組織化単分子層（ＳＡＭ）；（ｉｉ）自壊的部分および過酸化物感受性部分（ＰＳＭ）を含む遷移金属錯体を含む共有結合的に付着した電気活性活性部分（ＥＡＭ）であって、第１のＥ０を有する、ＥＡＭ；（ｉｉｉ）過酸化物生成酵素であって、前記過酸化物生成酵素の基質の存在下で過酸化物を生成する過酸化物生成酵素；を備える電極を備える固体支持体を準備するステップと、（ｂ）前記標的分析物および前記固体支持体を、酵素および前記酵素の追加の基質の存在下で、前記分析物が存在する場合に前記過酸化物生成酵素の基質が形成され、前記過酸化物が生成され、前記自壊的部分が除去される結果、前記ＥＡＭが第２のＥ０を有する条件下で接触させるステップと、（ｃ）前記標的分析物の存在の指標として前記第２のＥ０を検出するステップとを含む方法を提供する。
別の態様では、本発明は、検査試料中の標的分析物を検出するための方法であって、（ｉ）自己組織化単分子層（ＳＡＭ）；（ｉｉ）自壊的部分および過酸化物感受性部分（ＰＳＭ）を含む遷移金属錯体を含む共有結合的に付着した電気活性活性部分（ＥＡＭ）であって、第１のＥ０を有する、ＥＡＭを備える電極を備える固体支持体を準備するステップと、（ｂ）前記標的分析物および前記固体支持体を、酵素および前記酵素の追加の基質の存在下で、前記分析物が存在する場合に過酸化物生成酵素の基質が形成される条件下で接触させるステップと、（ｃ）過酸化物生成酵素の前記基質を過酸化物生成性酵素と、過酸化物生成酵素の前記基質が形成される場合に過酸化物が生成され、前記自壊的部分が除去される結果、前記ＥＡＭが第２のＥ０を有する条件下で接触させるステップと、（ｄ）前記標的分析物の存在の指標として前記第２のＥ０を検出するステップとを含む方法を提供する。一実施形態では、ステップ（ｂ）の前に、ステップ（ｂ）および（ｃ）が同時に行われる。ある特定の実施形態では、固体支持体は、電極のアレイを備える。別の実施形態では、本方法は、標的分析物がＡＴＰであるものである。別の実施形態では、本方法は、過酸化物生成酵素がグリセロール−３−リン酸オキシダーゼ（Ｇ３ＰＯ）であり、過酸化物生成酵素の基質がグリセロール−３−リン酸であるものである。本方法のさらに別の実施形態では、酵素はグリセロールキナーゼ（ＧＫ）であり、前記酵素の追加の基質はグリセロールである。
別の態様では、本発明は、（ａ）（ｉ）自己組織化単分子層（ＳＡＭ）；（ｉｉ）自壊的部分および過酸化物感受性部分（ＰＳＭ）を含む遷移金属錯体を含む共有結合的に付着した電気活性活性部分（ＥＡＭ）であって、前記自壊的部分が前記ＥＡＭに共有結合的に付着しているとき第１のＥ０を有し、前記自壊的部分が存在しないとき第２のＥ０を有する、ＥＡＭ；（ｉｉｉ）過酸化物生成酵素であって、前記過酸化物生成酵素の基質の存在下で過酸化物を生成する酵素；を備える電極と、（ｂ）可溶性酵素であって、標的分析物および追加の基質または前記可溶性酵素の存在下で前記過酸化物生成酵素の前記基質を生成する可溶性酵素とを備える固体支持体を含む構成物を提供する。
別の態様では、本発明は、（ａ）（ｉ）自己組織化単分子層（ＳＡＭ）；（ｉｉ）自壊的部分および過酸化物感受性部分（ＰＳＭ）を含む遷移金属錯体を含む共有結合的に付着した電気活性活性部分（ＥＡＭ）であって、前記自壊的部分が前記ＥＡＭに共有結合的に付着しているとき第１のＥ０を有し、前記自壊的部分が存在しないとき第２のＥ０を有する、ＥＡＭ；を備える電極と（ｂ）可溶性過酸化物生成酵素であって、前記過酸化物生成酵素の基質の存在下で過酸化物を生成する可溶性過酸化物生成酵素と、（ｃ）可溶性酵素であって、標的分析物および前記可溶性酵素の追加の基質の存在下で前記過酸化物生成酵素の前記基質を生成する可溶性酵素とを備える固体支持体を含む構成物を提供する。
別の態様では、本発明は、検査試料中の標的分析物（一実施形態では、糖化ヘモグロビン）を検出するための方法であって、（ａ）（ｉ）自己組織化単分子層（ＳＡＭ）；（ｉｉ）自壊的部分および過酸化物感受性部分（ＰＳＭ）を含む遷移金属錯体を含む共有結合的に付着した電気活性活性部分（ＥＡＭ）であって、第１のＥ０を有する、ＥＡＭ；（ｉｉｉ）前記標的分析物（例えば、糖化ヘモグロビン）に結合する捕捉結合リガンド；を備える電極を備える固体支持体を準備するステップと、（ｂ）前記標的分析物（例えば、糖化ヘモグロビン）および前記固体支持体を、前記標的分析物（例えば、糖化ヘモグロビン）が前記捕捉結合リガンドに結合して第１の複合体を形成する条件下で接触させるステップと、（ｃ）前記第１の複合体を、前記標的分析物（例えば、糖化ヘモグロビン）に結合する可溶性捕捉リガンドと接触させるステップであって、前記可溶性捕捉リガンドは、第２の複合体を形成するための過酸化物生成部分を含むステップと、（ｄ）過酸化物が生成され、前記自壊的部分が除去される結果、前記ＥＡＭが第２のＥ０を有する条件下で、過酸化物基質を前記第２の複合体に添加するステップと、（ｅ）前記標的分析物（例えば、糖化ヘモグロビン）の存在の指標として前記第２のＥ０を検出するステップとを含む方法を提供する。一実施形態では、ステップ（ｂ）の前に、洗浄ステップが実施される。別の実施形態では、ステップ（ｃ）の前に、洗浄ステップが実施される。さらに別の実施形態では、ステップ（ｂ）および（ｃ）が同時に行われる。ある特定の実施形態では、過酸化物生成部分は、グルコースオキシダーゼ酵素である。ある特定の実施形態では、固体支持体は、電極のアレイを備える。ある特定の実施形態では、本方法は、前記第２のＥ０の前記検出ステップに基づいて、試料中の糖化ヘモグロビンのパーセンテージを求めるステップをさらに含むことができる。
検査試料中の標的分析物（例えば、糖化ヘモグロビン）を検出するための方法のある特定の実施形態では、分析物が添加される前に、第１のＥ０に関する主に１つのピークが存在する。分析物を添加すると、第１のＥ０に関する第１のピークは減少し、第２のＥ０に関する第２のピークが成長する。異なる電位Ｅ０におけるこれらの２つのピークからの様々な比を使用して、分析物を定量化することができる。これらの比として、それだけに限らないが、これらの２つの電位に関連する総ピーク電流、ファラデーピーク電流、またはピーク電荷の比を挙げることができる。
別の態様では、本発明は、（ａ）（ｉ）自己組織化単分子層（ＳＡＭ）；（ｉｉ）自壊的部分および過酸化物感受性部分（ＰＳＭ）を含む遷移金属錯体を含む共有結合的に付着した電気活性活性部分（ＥＡＭ）であって、前記自壊的部分が前記ＥＡＭに共有結合的に付着しているとき第１のＥ０を有し、前記自壊的部分が存在しないとき第２のＥ０を有する、ＥＡＭ；（ｉｉｉ）標的分析物（例えば、糖化ヘモグロビン）に結合する捕捉結合リガンド；を備える電極と、（ｂ）前記標的分析物（例えば、糖化ヘモグロビン）に結合する可溶性捕捉結合リガンドであって、過酸化物生成部分を含むリガンドとを備える固体支持体を含む構成物を提供する。
電気活性活性分子（ＥＡＭ）１の構造、および過酸化物誘導リガンド解離の機構を示す図である。リガンドエレクトロニクスの変化は、レドックス電位のシフトの原因となる。 図１に表した本発明の実施形態の１つの合成スキームを示す図である。 ＰＯＭリガンドのＨ２Ｏ２誘導切断後のＥＡＭ１および対照化合物の溶液ＣＶデータを示す図である。自壊的プロセス後のＥ０の変化は、３３１ｍＶである。実験は、炭素作用電極、Ａｇ／ＡｇＣｌ参照電極、およびＰｔワイヤー対電極を使用して、ＴＢＡＣｌＯ４（１５０ｍＭ）支持電解質を含むＴＨＦ中で実行した。 ＮａＨＣＯ３緩衝液（ｐＨ８．５）中の１ｍＭの過酸化水素とともに１０分間、堅調にインキュベートし（solid incubation）、その後Ｎａ２ＣＯ３緩衝液（ｐＨ１０．１；より低いピーク）中で５分洗浄する前（点線）および後のＥＡＭ１のＳＡＭからの重ね合わせたサイクリックボルタモグラムである。支持電解質は、１ＭのＬｉＣｌＯ４、銀疑似参照電極、白金ワイヤー対電極であった。スキャン速度は、１００００ｍＶ／ｓであった。 ＮａＨＣＯ３緩衝液（ｐＨ８．５）中の１ｍＭのグルコースおよび１００μＭのグルコースオキシダーゼとともに１０分間、（堅調に）インキュベートし、その後Ｎａ２ＣＯ３緩衝液（ｐＨ１０．１）中で５分洗浄する前（点線）および後のＥＡＭ１のＳＡＭからの重ね合わせたサイクリックボルタモグラムである。支持電解質は、１ＭのＬｉＣｌＯ４、銀疑似参照電極、白金ワイヤー対電極であった。スキャン速度は、１００００ｍＶ／ｓであった。 置換キノンメチドに基づく見本の自壊的スペーサー基を示す図である。 グルコースとともに１０分間、（堅調に）インキュベートする前（点線）および後の、ヒト心臓トロポニンＩ（１０ｎｇ／ｍＬ）で抗体サンドイッチ形成した後のＥＡＭ１のＳＡＭについてのサイクリックボルタモグラムである。挿入図は、拡大した−０．１０Ｖにおけるピークである。 本発明において用途を見出す様々な自壊的部分を表す図である。「ＰＳＭ」は、「過酸化物感受性部分」を意味し、「ＥＡＭ」は、「電気活性部分」を意味する。図に示すように、様々な単量体の自壊的部分（時に「ＳＩＭ」と本明細書で呼ぶ）を使用することができる。図ＸＡは、第１のタイプの自壊的部分を表し、これは、過酸化物と接触すると−ＯＨ基に寄与し、ＥＡＭから放出するフェノール系リンカーをもたらすＰＳＭを利用する。ｎは、１以上の整数とすることができ、１〜５が本発明において特定の用途を見出す。ｍは、当業者が理解するように、少なくとも１の整数である。ｍは、使用される遷移金属錯体、およびＥＡＭ中の位置の数に依存することになる。例えば、フェロセンなどのメタロセンが使用される場合、シクロペンタジエニル環１つ当たり最大５つのＰＳＭ−ＳＩＭが存在し得、環の１つ上の位置の少なくとも１つは、電極への付着に使用される。図Ｂ、図Ｃ、および図Ｄは、ＳＩＭの多量体を示す。Ｘは、−ＮＨ−または−Ｏ−であり得る。 追加の過酸化物感受性部分を表す図である。図Ａは、ＰＳＢエーテル（パラシレタニルベンジル（parasiletanylbenzyl））部分を表し、図Ｂは、ペンタフルオロフェニルスルホネート（ＰＦＰＳ）部分を表す。図（次の）に示すように、ＥＡＭ１つ当たり１つを超える自壊的分、および／またはＥＡＭ１つ当たり１つを超えるＰＳＭ−ＳＩＭが存在し得る。ホウ素含有ＰＳＭについては、ＥＡＭ１つ当たり複数のＰＳＢエーテルまたはＰＦＰＳ部分が同様に存在し得る。 Ｒ基を有するフェロセンを表す図である。示した部分は、異なる環上に付着リンカー、および自壊的部分、および過酸化物感受性部分を有するが、本明細書に記載するように、これらは、同じ環上にあることができる。さらに、Ｒ基のいずれか、またはすべては、追加の−ＳＩＭ−ＰＳＭ置換基、ならびに伝統的な置換基（アルキル（置換アルキル、ヘテロアルキル、環式アルキルなどを含む））、アリール（置換アリールおよびヘテロアリールを含む）など）とすることができる。 見かけ上の式量電位の過酸化物誘発変化を起こす代表的なフェロセン系ＥＡＭの反応機構を示すことにおいて図１と同様の図である。（Ａ）は、電子求引性カルバメート連結ボロン酸エステル置換リガンドを含有する出発フェロセニルＥＡＭである。（Ｂ）は、過酸化物と反応するとフェロセン上に電子供与性アミノリガンドがもたらされ、それによりレドックス電位（Ｅ０）が変化することを示す。 試料中のＮＡＤＨを検出するための代表的な代謝産物アッセイを表す図である。この特定の実施形態では、ＮＡＤＨオキシダーゼ（ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸−オキシダーゼ）は、ビオチン−ストレプトアビジン系を使用して電極に付着されるが、当業者が理解することになるように、その全体が参照により本明細書に組み込まれているＰＣＴ／ＵＳ２００８／０８０３７９に概説されたＮＨＳまたはマレイミド系の使用を含めて、任意の数の追加の方法を使用することができる。この実施形態では、ＮＡＤＨオキシダーゼは、活性化化学を使用して、アミン、またはＮ末端などの他の官能基を介して付着される。 試料中の代謝産物としてのＡＴＰの電気化学的検出の一実施形態を表す図である。この実施形態では、センサーは、過酸化物誘発電気活性分子（ＥＡＭ、「レドックス活性部分」（ＲＡＭ）と本明細書で時に代わりに呼ばれる）およびＢｉｒＡ（この場合、Ｅ．ｃｏｌｉ由来のビオチンリガーゼ）のアクセプターペプチド（ＡＰ）基質を物理吸着ビオチンおよびＢｉｒＡとともに含有するＳＡＭ修飾金電極に基づく（図１３Ａ）。図１３Ｂは、ＢｉｒＡはＡのビオチン化を触媒することを表す。洗浄後、グルコースオキシダーゼ−ストレプトアビジンコンジュゲートは、ＡＰに付着したビオチンにさらにコンジュゲートされる。図１３Ｃは、グルコースが添加され、生成される過酸化物が自壊的部分を有するＥＡＭと反応し、Ｅ０の変化をもたらすときの反応を表す。 電気化学的ＡＴＰアッセイの略図である。Ｇ３ＰＯは、溶液中にあっても、ビオチン−ストレプトアビジンを介してＳＡＭ界面で固定されていてもよい。 見かけ上の式量電位の過酸化物誘発変化（Ｅ−ＴＲＡＣＥ）を起こす代表的なフェロセン系ＥＡＭの反応機構を示す図である。（Ａ．）電子求引性カルバメート連結ボロン酸エステル置換リガンドを含有する出発フェロセニルＥＡＭ。（Ｂ．）過酸化物と反応するとフェロセン上に電子供与性アミノリガンドがもたらされ、それによりレドックス電位が変化する。 ＡＴＰ検出のための電気化学的データを示す図である。電流は、フェロセンの過酸化物反応性ＳＡＭを、１．３３Ｕ／ｍＬのＧＫおよびＧ３ＰＯを含有する緩衝液（１０ｍＭのＰＢＳ、ｐＨ＝８．５、１ｍＭのＭｇＣｌ２）中の１ｍＭのＡＴＰに曝露した後、Ｅ０’＝−２２０ｍＶで、ＣＶ（１ＭのＬｉＣｌＯ４対ＡｇＱＲＥ、Ｐｔ対電極、１０Ｖ／秒）によって測定した。データは、陽性対照および陰性対照とともに提示されている。 Ｓ−ＭＡＤアッセイコンポーネントおよびプロセスの模式図である。ＨｂＡ１ｃは、両抗体によって結合されており、この場合、非糖化Ｈｂは、ＧＯｘ標識抗体によって結合されておらず、生成されている過酸化水素に寄与しない。 マイクロプレート上の光学レポーター系で実施した実現可能性調査からの結果のプロットである。総ヘモグロビンの捕捉抗体を５０μｇ／ｍＬでマイクロプレート上に最初に固定した後、様々な比率のすべて固定された１μＭの総ヘモグロビン濃度を有するＡ１ｃ／総ヘモグロビンを含有する試料とともにインキュベートした。 異なる捕捉抗体密度で３．２、５．９、１０．２、および１９％のヘモグロビンＡ１ｃを含有する試料を使用した結果のプロットである。試料の総ヘモグロビン濃度は、それぞれ１３．４３、１２．８、１０．０６、および１０．１１ｇ／ｄＬであった（１．９８、１．８９、１．４８、１．４９ｍＭ）。 全血試料の４つの異なる希釈液、すなわち、固定Ａ１ｃ％を有する総ヘモグロビンの異なる量からの結果の速度論的プロットである。捕捉抗体がまったく存在しない状態でインキュベートしたこれらの希釈液のそれぞれから測定した信号に対してＯ．Ｄ．を正規化した。 総ヘモグロビン（例えば、ＨｂＡ１ｃおよびＨｂＡ０を含む）を結合している固体支持体上の結合捕捉リガンドとの上述した第２の複合体の代表例を表す図である。非優先的捕捉に起因して、ＨｂＡ１ｃは、試料中の糖化ヘモグロビンのパーセンテージと同じ比率で捕捉される。可溶性結合リガンドは、オキシダーゼ、特にこの例では過酸化物を生成するグルコースオキシダーゼであるタグを有する。 総ヘモグロビン（例えば、ＨｂＡ１ｃおよびＨｂＡ０を含む）を結合している固体支持体上の結合捕捉リガンドとの上述した第２の複合体の代表例を表す図である。非優先的捕捉に起因して、ＨｂＡ１ｃは、試料中の糖化ヘモグロビンのパーセンテージと同じ比率で捕捉される。可溶性結合リガンドは、過酸化物を生成する系内で中間酵素として作用するアルカリホスファターゼであるタグを有する。 電気化学的Ａ１Ｃアッセイの略図である。第１の固体支持体は、自壊的部分（ＳＩＭ）および過酸化物感受性部分（ＰＳＭ）を含む遷移金属錯体を含む共有結合的に付着した電気活性活性部分（ＥＡＭ）とともに、自己組織化単分子層（ＳＡＭ）を備える電極である。標的は、第２の固体支持体上の捕捉結合リガンドを含む第２の複合体、および中間酵素でタグ付けされた可溶性結合リガンドに結合している。過酸化物が生成される条件下で前記第２の複合体にタグ付き酵素の基質を付加した後、前記過酸化物は過酸化物感受性部分（ＰＳＭ）と反応し、それによって前記自壊的部分（ＳＩＭ）を除去し、定量可能な電気化学的信号を生成する。 過酸化水素が自己組織化単分子層上の電気活性部分（ＥＡＭ）と反応する前後の一般的な応答の例示的なサイクリックボルタモグラムの図である。 Ｅ−ＴＲＡＣＥ変性自己組織化単分子層（ＳＡＭ）上の過酸化水素滴定反応に対する一般的な用量応答を示す図である。 ４つのＨｂＡ１ｃ較正試料で実施した単回測定アッセイから生成された過酸化水素の反応後の自己組織化単分子層上の電気活性部分（ＥＡＭ）の一般的なサイクリックボルタモグラム応答を示す図である。 ２５分のアッセイ手順についての２．７％、５．５％、１０．８％、および１９．８％のＡ１ｃでの４つのＨｂＡ１ｃ較正試料に対する用量応答から生じる較正曲線を示す図である。 ＢｉｏＲａｄ ＴｕｒｂｏＶａｒｉａｎｔ ＩＩ臨床イムノアナライザー（clinical immunoanalyzer）から収集した％Ａ１Ｃ測定との強い相関を実証する１００臨床試料からのデータを示す図である。データは、２５分のアッセイ手順後に収集した。 ９分のアッセイ手順についての５．５％、１０．８％、および１９．８％のＡ１ｃでの３つのＨｂＡ１ｃ較正試料に関する用量応答を示す図である。 ＢｉｏＲａｄ ＴｕｒｂｏＶａｒｉａｎｔ ＩＩ臨床イムノアナライザーから収集した％Ａ１Ｃ測定との強い相関を実証する１００臨床試料からのデータを示す図である。データは、９分のアッセイ手順後に収集した。 Ａ．４つの異なるＡ１Ｃキャリブレーター（２．７％、５．５％、１０．８％、および１９．８％のＡ１ｃ）の３つの異なる標的希釈液（３０％、５０％、および１００％）について示されたデータ。結果は、総ヘモグロビンの濃度が異なっても、この単回測定手法を使用するＡ１Ｃのパーセンテージの直接測定に影響しないことを実証する。データは、２５分のアッセイ後に収集した。Ｂ．２つのＡ１Ｃ較正試料（５％および１０．８％）の３つの異なる希釈液（５０％、２０％、および５％）について示したデータ。結果は、総ヘモグロビンの濃度が異なっても、９分のアッセイ後に収集したこの単回測定手法データを使用するＡ１Ｃのパーセンテージの直接測定に影響しないことを実証する。 一方が％Ａ１Ｃを直接検出するための新規単回測定手法であり、他方が糖化ヘモグロビン（Ａ１Ｃ）および総ヘモグロビンについての２つの別々の測定値に基づく％Ａ１ｃの計算である２つのアッセイフォーマットを用いて測定した４つのＡ１ｃ較正試料（２．７％、５．５％、１０．８％、および１９．８％）についてのデータを示す図である。データは、２つの異なる方法を使用して同じＡ１Ｃ測定値に到達することを示す。
米国特許出願第１２／２５３，８２８号、同第１２／２５３，８７５号、同第１２／８５３，２０４号、同第６１／３３２，５６５号、同第６１／３４７，１２１号、同第６１／３９４，４５８号、同第６１／３６６，０１３号、同第６１／４０７，８２８号、および同第６１／５４７，８２４号はすべて、その全体が参照により組み込まれている。
概要
本発明は、標的分析物が結合すると、電気化学的電位のシフトが見られるように標的分析物を検出する電子的方法を対象とする。この機構は一般に、米国特許第７，５９５，１５３号、同第７，７５９，０７３号、および同第７，７１３，７１１号、ならびに２００８年１０月１７日に出願された米国特許出願第１２／２５３，８２８号、２００８年１０月１７日に出願された米国特許出願第１２／２５３，８７５号、２０１０年５月７日に出願された米国仮特許出願第６１／３３２，５６５号、２０１０年５月２１日に出願された米国仮特許出願第６１／３４７，１２１号、および２０１０年７月２０日に出願された米国仮特許出願第６１／３６６，０１３号に記載されており、これらのすべては、その全体が参照により明白に組み込まれている。本発明は、標的分析物が結合すると、遷移金属錯体に付着した官能基が変換されて２つのユニークな電位、Ｅｏ １およびＥｏ ２で定量的な電気化学的信号がもたらされるように標的分析物Ａ１Ｃを検出する電子的方法も対象とする。
このアッセイは、電極に付着され、自壊的部分を含む電気活性部分（「ＥＡＭ」）の使用を利用し、自壊的部分が存在すると、ＥＡＭに第１のＥ０を与え、非可逆性に切断されて存在しなくなるとＥＡＭに第２のＥ０を与える。電極は、導入されると標的分析物に結合する捕捉結合リガンドも含有する。やはり標的分析物に結合し、グルコースオキシダーゼ酵素などの過酸化物生成部分を含む可溶性捕捉リガンドが導入される。酸素およびペルオキシダーゼ生成部分の基質（例えば、ペルオキシダーゼ生成部分としてグルコースオキシダーゼ酵素の場合では、酸素飽和緩衝液およびグルコース）を添加すると、過酸化物が生成され、自壊的部分を攻撃し、ＥＡＭから自壊的部分が除去され、それによりＥＡＭのＥ０が変化する。この差異が検出され、このような変化が起こる場合、それは、標的分析物の存在の指標である。
したがって、試料中に標的分析物が存在するか否かを判定するために、試料が検出電極表面に加えられ、任意選択により洗浄され、標的分析物の代替のエピトープに結合するオキシダーゼ酵素コンジュゲート二次結合リガンド（例えば、抗体）が添加され、標的との「サンドイッチアッセイ」フォーマットが創製される。表面は、高濃度のグルコースを含有する酸素飽和緩衝液で任意選択により洗浄され、これで処理される。表面上に基質オキシダーゼ酵素（時に「ＳＯＸ」と本明細書で呼ばれる）が存在すると、溶液中で過酸化水素が酵素的に創製され、これは、単分子層表面に拡散し、固定されたＥＡＭ内で化学的脱離反応（「自壊的」反応）を誘発する。この非可逆性脱離反応は、例えば、遷移金属錯体の「Ｒ」基（例えば、置換基）を変えることによってＥＡＭの電子環境を変化させ、こうしてＥＡＭの見かけ上の式量電位を第２のＥ０にシフトして標的の存在を知らせる。
したがって、本発明は、試料中の標的分析物を検出するための方法および構成物を提供する。糖化ヘモグロビンのパーセンテージを直接検出するための単回測定手法は、試料中に存在する総ヘモグロビンの量によって影響されない。総ヘモグロビンは、生理学的に、５〜２０ｇ／ｄＬに変化し得るので、この範囲にわたる糖化ヘモグロビンの同じパーセンテージの直接測定がこの手法で実現可能である。
標的分析物
本明細書で「標的分析物」もしくは「分析物」または文法的均等物とは、検出されるべき任意の分子、化合物、または粒子を意味する。標的分析物は、以下により完全に記載するように、結合リガンド（捕捉リガンドおよび可溶性結合リガンドの両方）に結合する。当業者が理解することになるように、本方法を使用して多数の分析物を検出することができ、基本的に、以下に記載される結合リガンドを作製することができる任意の標的分析物を、本発明の方法を使用して検出することができる。
適当な分析物として、生体分子を含めた有機分子および無機分子が含まれる。好適な実施形態では、分析物は、環境汚染物質（農薬、殺虫剤、毒素などを含む）；化学物質（溶媒、ポリマー、有機材料などを含む）；治療用分子（治療薬および乱用薬物、抗生物質などを含む）；生体分子（ホルモン、サイトカイン、タンパク質、脂質、炭水化物、細胞膜抗原、および受容体（神経受容体、ホルモン受容体、栄養受容体、および細胞表面受容体）またはこれらのリガンドなどを含む）；全細胞（原核細胞（病原性細菌など）および哺乳動物腫瘍細胞を含めた真核細胞を含む）；ウイルス（レトロウイルス、ヘルペスウイルス、アデノウイルス、レンチウイルスなどを含む）；ならびに胞子；などであり得る。
いくつかの実施形態では、標的分析物はタンパク質である。当業者が理解することになるように、本発明を使用して検出され得る多数の可能なタンパク質性標的分析物が存在する。本明細書で「タンパク質」または文法的均等物とは、天然に存在しないアミノ酸およびアミノ酸類似体、ならびにペプチド模倣構造を含有するタンパク質を含めた、タンパク質、オリゴペプチドならびにペプチド、誘導体ならびに類似体を意味する。側鎖は、（Ｒ）配置であっても、（Ｓ）配置であってもよい。好適な実施形態では、アミノ酸は、（Ｓ）またはＬ配置にある。以下に論じるように、タンパク質が結合リガンドとして使用される場合、試料混入物による分解を遅延させるためにタンパク質類似体を利用することが望ましい場合がある。
適当なタンパク質標的分析物としては、それだけに限らないが、（１）それだけに限らないが、例えば、ヒトアルブミン、アポリポタンパク質（アポリポタンパク質Ｅを含む）、ヒト絨毛性ゴナドトロピン、コルチゾール、α−フェトプロテイン、チロキシン、甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）、抗トロンビンに対する抗体、医薬品（抗てんかん薬（フェニトイン、プリミドン、カルバリエゼピン、エトスクシミド、バルプロ酸、およびフェノバルビトール）、心臓作用薬（ジゴキシン、リドカイン、プロカインアミド、およびジソピラミド）、気管支拡張剤（テオフィリン）、抗生物質（クロラムフェニコール、スルホンアミド）、抗うつ剤、免疫抑制剤、乱用薬物（アンフェタミン、メタンフェタミン、カンナビノイド、コカイン、およびオピエート）を含む）に対する抗体、ならびに任意の数のウイルス（オルソミクソウイルス（例えば、インフルエンザウイルス）、パラミクソウイルス（例えば、呼吸器合胞体ウイルス、流行性耳下腺炎ウイルス、麻疹ウイルス）、アデノウイルス、ライノウイルス、コロナウイルス、レオウイルス、トガウイルス（例えば、風疹ウイルス）、パルボウイルス、ポックスウイルス（例えば、痘瘡ウイルス、ワクシニアウイルス）、エンテロウイルス（例えば、ポリオウイルス、コクサッキーウイルス）、肝炎ウイルス（Ａ、Ｂ、およびＣを含む）、ヘルペスウイルス（例えば、単純ヘルペスウイルス、水痘帯状疱疹ウイルス、サイトメガロウイルス、エプスタインバーウイルス）、ロタウイルス、ノーウォークウイルス、ハンタウイルス、アレナウイルス、ラブドウイルス（例えば、狂犬病ウイルス）、レトロウイルス（ＨＩＶ、ＨＴＬＶ ＩおよびＩＩを含む）、パポバウイルス（例えば、パピローマウイルス）、ポリオーマウイルス、およびピコルナウイルスなどを含む）ならびに細菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ；Ｖｉｂｒｉｏ、例えば、Ｖ．ｃｈｏｌｅｒａｅ；Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ、例えば、腸内毒素原性Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｓｈｉｇｅｌｌａ、例えば、Ｓ．ｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅ；Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ、例えば、Ｓ．ｔｙｐｈｉ；マイコバクテリウム、例えば、Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ、Ｍ．ｌｅｐｒａｅ；Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ、例えば、Ｃ．ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ、Ｃ．ｔｅｔａｎｉ、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ、Ｃ．ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ；コリネバクテリウム、例えば、Ｃ．ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅ；Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ、Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ；Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ、例えば、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ；Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ、例えば、Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ；Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ、例えば、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ、Ｎ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ；Ｙｅｒｓｉｎｉａ、例えば、Ｙ．ｐｅｓｔｉｓ；Ｇ．ｌａｍｂｌｉａ；Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、例えば、Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、Ｐ．ｐｕｔｉｄａ；Ｃｈｌａｍｙｄｉａ、例えば、Ｃ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ；Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ、例えば、Ｂ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ；Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ、例えば、Ｔ．ｐａｌｌａｄｉｕｍ；などを含めた対象とする多種多様な病原性および非病原性原核生物を含む）に対する抗体を含めた免疫グロブリン、特にＩｇＥｓ、ＩｇＧ、およびＩｇＭ、ならびに特に治療的または診断的に関連した抗体；（２）それだけに限らないが、クレアチンキナーゼ、乳酸脱水素酵素、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ、トロポニンＴ、ミオグロビン、フィブリノーゲン、コレステロール、トリグリセリド、トロンビン、組織プラスミノゲンアクチベーター（ｔＰＡ）を含めた心疾患のインジケータまたは処置として使用される酵素；アミラーゼ、リパーゼ、キモトリプシン、およびトリプシンを含めた膵臓病インジケータ；コリンエステラーゼ、ビリルビン、およびアルカリホスファターゼを含めた肝機能酵素およびタンパク質；アルドラーゼ、前立腺酸性ホスファターゼ、ターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ、ならびにＨＩＶプロテアーゼなどの細菌酵素およびウイルス酵素を含めた酵素（および他のタンパク質）；（３）ホルモンおよびサイトカイン（これらの多くは、細胞受容体のリガンドとして機能を果たす）、例えば、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、トロンボポエチン（ＴＰＯ）、インターロイキン（ＩＬ−１〜ＩＬ−１７を含む）、インスリン、インスリン様増殖因子（ＩＧＦ−１および−２を含む）、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、トランスフォーミング増殖因子（ＴＧＦ−αおよびＴＧＦ−βを含む）、ヒト成長ホルモン、トランスフェリン、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、低密度リポタンパク質、高密度リポタンパク質、レプチン、ＶＥＧＦ、ＰＤＧＦ、繊毛様神経栄養因子、プロラクチン、副腎皮質刺激ホルモン（ＡＣＴＨ）、カルシトニン、ヒト絨毛性ゴナドトロピン、コルチゾール、エストラジオール、卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）、甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）、黄体形成ホルモン（ＬＨ）、プロゲステロン、テストステロンなど；ならびに（４）他のタンパク質（α−フェトプロテイン、癌胎児性抗原ＣＥＡを含む）がある。
さらに、抗体が検出され得る生体分子のいずれも同様に直接検出することができ、すなわち、ウイルスまたは細菌性細胞、治療薬、および乱用薬物などの検出を直接行うことができる。
適当な標的分析物には、それだけに限らないが、乳癌（ＣＡ１５−３、ＣＡ５４９、ＣＡ２７．２９）、ムチン様癌関連抗原（ＭＣＡ）、卵巣癌（ＣＡ１２５）、膵癌（ＤＥ−パン−２）、ならびに結腸直腸癌および膵癌（ＣＡ１９、ＣＡ５０、ＣＡ２４２）のマーカーを含めた炭水化物が含まれる。
トロポニンおよびＨｂＡ１ｃなどの標的分析物は、特定の実施形態および適用に用途がある。一実施形態では、標的分析物は、糖化ヘモグロビン（例えばＨｂＡ１ｃ）、糖化血清タンパク質、フルクトサミン、および糖化アルブミンなどの糖化タンパク質を含む。
糖化ヘモグロビン、一実施形態では、ヘモグロビンＡ１ｃ（Ａ１ｃ）は、長期的な血糖コントロールの有益なマーカーとして広く承認されている。実際に、米国糖尿病協会は、糖尿病（Ｉ型＆ＩＩ型）の必要な診断基準としてＡ１ｃを承認している。Ａ１ｃは、レベルが血中グルコース濃度の短い大きな変動によってごくわずかしか影響されないので、２〜３か月の期間にわたる平均血中グルコースレベルを評価するための有益な情報を提供し、特定の臨床的有用性を有する。Ａ１ｃレベルは、新しい血糖コントロールレジメンの有効性の評価における重要なツールでもある。一般に、ヘモグロビンＡ１Ｃ検査は、２つの測定、すなわち、ヘモグロビンＡ１ｃの測定および総ヘモグロビンの測定を伴う。これらの独立した測定は、Ａ１ｃと総ヘモグロビンの比を計算するのに使用され、パーセンテージ（健康なレベルは、４〜６．５％のＡ１ｃの範囲である）として一般に報告される、糖化の程度の数値的評価をもたらす。
一実施形態では、Ａ１ｃレベルを判定するための単回測定は、酵素誘発レドックス変化化学的脱離（enzyme-triggered redox altering chemical elimination）（Ｅ−ＴＲＡＣＥ）反応、または溶液中でＨ２Ｏ２を検出する標準的なイムノアッセイ光学検査を使用して、電気化学的測定によって、本明細書に記載の方法に従って実施することができる。
例えば、血液試料中のヘモグロビンＡ１ｃと総ヘモグロビンの比率を検出するための方法は、以下のように記述することができる。電気化学的プラットフォームの表面を、上述した、過酸化物のＥ−ＴＲＡＣＥ検出用センシング分子（ＥＡＭ）、および総ヘモグロビンのユニバーサル捕捉分子を含むように修飾することができる。捕捉プローブ（例えば、抗体）は、ヘモグロビンのすべてのバリアント型に非選択的に結合することができる。プローブは、自己組織化単分子層（ＳＡＭ）に繋ぎ止め、または二次固体支持体、例えば、微粒子、磁性微粒子、ビーズ、およびマイクロチャネルなどに他の方法で局所的に固定することができる。血液中のヘモグロビンの高い生理的濃度、（ｇ／ｄＬ）を考慮すると、一次結合により、表面上のほとんどすべての結合部位が飽和する。したがって、異なる総ヘモグロビン濃度を有する試料は、表面に結合したヘモグロビンＡ１ｃの代表的な比率を依然として生じ得る。
固定されたＡ１ｃ（抗Ａ１ｃ）に結合する二次抗体を、表面に導入することができる。ある特定の実施形態では、二次抗体は、本質的に固定されたＡ１ｃのみに結合する。このような実施形態では、ＥＬＩＳＡ様サンドイッチ複合体は、Ａ１ｃによって占有された部位にのみ形成し、非糖化ヘモグロビンによって占有された部位には形成しない。
抗Ａ１ｃ抗体がオキシダーゼ酵素（ＳＯｘ）で標識される場合、オキシダーゼ標識は、基質を酸化し、過酸化水素を生成することができる。生成される過酸化水素は、電気化学的な表面と反応して電気化学的信号をもたらすことができる。
信号の量を求めることができ、表面上に固定されたＡ１ｃの量に依存するサンドイッチ複合体の数に直接相関させることができる。固定されたＡ１ｃの量が、元の試料中の総ヘモグロビンに対するＡ１ｃのパーセンテージに直接依存する場合、観察される信号は、ヘモグロビンＡ１ｃと総ヘモグロビンの比の評価をもたらす。
ＨｂＡ１ｃについて、結合リガンドの１つ、すなわち、捕捉結合リガンドまたは可溶性結合リガンドのいずれかは、糖化形態のヘモグロビンに対する特異性を有する。すなわち、一実施形態では、捕捉結合リガンドは、いずれかの形態のヘモグロビンに結合することができ、表面を洗浄した後、過酸化物生成部分を有するグリコシル化形態（例えば、ＨｂＡ１ｃ）に対してのみ特異性を有する可溶性結合リガンドが添加される。あるいは、捕捉結合リガンドは、ヘモグロビンの他の形態に対してＨｂ１Ａｃに特異性を有し、表面を適切に洗浄した後、このような特異性を有さない可溶性捕捉リガンドを使用することができる。グリコシル化形態または非グリコシル化形態のいずれかの検出が望まれる他の標的分析物にこの手法を使用することができる。当業者が理解することになるように、両形態の検出が望まれる標的分析物も存在し、このような実施形態では、一方または他方に特異性を有さない結合リガンドの使用が使用される。
本発明で特に対象とするのは、ＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓエンテロトキシンＢ、Ｐ−セレクチン、Ｄ−二量体、Ｂ型ナトリウム利尿ペプチド（ＢＮＰ）、Ｃ反応性タンパク質、ミオグロビン、およびＣＫ−ＭＢについてのアッセイである。
いくつかの実施形態では、本明細書に概説するように、いくつかの異なる代謝産物が標的分析物として機能を果たすことができる。例えば、ＡＴＰおよび／またはＮＡＤＨを、本明細書のシステムを使用して検出および／または定量化することができる。さらに、それだけに限らないが、ＮＡＤＨ、グルコース、スクロース、ラクトース、ラクテート、ガラクトース、グルタミン酸、コリン、エタノール、クレアチニンなどを含めた、過酸化物生成酵素が存在する他の代謝産物を、本明細書に概説した一般的な機構を使用して検出することができる。
特に有用な一実施形態では、Ｓ−ＭＡＤ（単回測定Ａ１ｃ）アッセイが提供される。Ｓ−ＭＡＤアッセイは、単回電気化学的測定でＡ１ｃと総ヘモグロビンの比をもたらす新規手法を提供し、２０１１年１月１９日に出願された米国仮出願第６１／４３４，１２２号および２０１１年８月１５日に出願された同第６１／５２３，６７９号の優先権の利益を主張する、２０１２年１月１９日に出願されたＯｈｍｘの米国特許出願第１３／３５４，２００号、ならびに２００９年８月７日に出願された米国仮出願第６１／２３２，３３９号の優先権を主張する、２０１０年８月９日に出願された米国特許出願第１２／８５３，２０４号に記載されたＥ−ＴＲＡＣＥアッセイに部分的に基づく。これらの出願はすべて、その全体が参照により組み込まれている。Ｅ−ＴＲＡＣＥアッセイは基本的に、電気化学的検出の基質として過酸化物を生成するオキシダーゼ−タグ付き二次抗体を用いた電気化学的プラットフォームでのサンドイッチアッセイである。
一実施形態では、血液試料中のヘモグロビンＡ１ｃと総ヘモグロビンの比率を求めるための単回測定法は、酵素誘発レドックス変化化学的脱離（Ｅ−ＴＲＡＣＥ）反応、または溶液中でＨ２Ｏ２を検出する標準的なイムノアッセイ光学検査を使用して、電気化学的測定によって、本明細書に記載の方法に従って実施することができ、以下のステップで記述される：
ステップ１：一次抗体を用いた修飾：電気化学的プラットフォームの表面を、過酸化物のＥ−ＴＲＡＣＥ検出用センシング分子（ＥＡＭ）を含むように修飾する。さらに、第２の固体支持体を捕捉プローブで修飾する。この捕捉プローブ、例えば、抗体は、ヘモグロビンおよび糖化ヘモグロビンを含めたヘモグロビンのすべてのバリアント型に選択的および同等に結合する。本明細書の定義では、用語「選択的に結合する」は、所定の標的（例えば、ヘモグロビンＡ１ｃを含む総ヘモグロビン）に結合することを意味し、「同等に結合する」は、タンパク質（例えば、ヘモグロビン）および糖化タンパク質（例えば、ヘモグロビンＡ１ｃ）の両方に非選択的に、を意味する。
ステップ２：標的（総ヘモグロビン、Ａ１ｃを含む）の添加：血液中のヘモグロビンの高い生理的濃度（ｇ／ｄＬ）を考慮すると、この一次結合が起こり、二次支持体の表面上のほとんどすべての結合部位を飽和させると仮定される。このことの重要性は、異なる総ヘモグロビン濃度を有する試料は、表面に結合したヘモグロビンＡ１ｃの代表的な比率を依然として生じることになることである。
ステップ３：検出抗体（Ａ１ｃに特異的）の添加：ある特定の実施形態では、二次抗体が表面に導入され、固定されたＡ１ｃにのみ結合する。これは、ＥＬＩＳＡ様サンドイッチ複合体は、Ａ１ｃによって占有された部位にのみ形成し、非糖化ヘモグロビンによって占有された部位には形成しないことを意味する。
ステップ４：信号伝達および検出：Ａ１ｃに選択的に結合する抗Ａ１ｃ抗体を、過酸化物生成系、例えば、オキシダーゼ酵素（ＳＯｘ）で標識する。オキシダーゼ標識は、基質を酸化し、過酸化水素を生成する。生成される過酸化水素は、固体状態プラットフォームの電気化学的な表面と反応して電気化学的信号をもたらす。
信号の量は、サンドイッチ複合体の数に直接相関し、これはひいてはどのぐらいのＡ１ｃが表面上に固定されているかに依存する。固定されたＡ１ｃの量は、元の試料中の総ヘモグロビンに対するＡ１ｃのパーセンテージに直接依存するので、観察される信号は、ヘモグロビンＡ１ｃと総ヘモグロビンの比（パーセンテージ）の評価をもたらす。
ＨｂＡ１ｃについて、結合リガンドの１つ、すなわち、捕捉結合リガンドまたは可溶性結合リガンドのいずれかは、糖化形態のヘモグロビンに対する特異性を有する。すなわち、一実施形態では、捕捉結合リガンドは、いずれかの形態のヘモグロビンに結合することができ、表面を洗浄した後、過酸化物生成部分を有する糖化形態（例えば、ＨｂＡ１ｃ）に対してのみ特異性を有する可溶性結合リガンドが添加される。あるいは、捕捉結合リガンドは、ヘモグロビンの他の形態に対してＨｂ１Ａｃに特異性を有し、表面を適切に洗浄した後、このような特異性を有さない可溶性捕捉リガンドを使用することができる。糖化形態または非糖化形態のいずれかの検出が望まれる他の標的分析物にこの手法を使用することができる。当業者が理解することになるように、両形態の検出が望まれる標的分析物も存在し、このような実施形態では、一方または他方に特異性を有さない結合リガンドの使用が使用される。
電気活性ＳＡＭにカップリングしたＡ１ｃの本発明の単回測定検出は、試料中のＡ１ｃと総ヘモグロビンの比率を求めるためのあまり複雑でない手段を提供する。これは、２つの測定を実施する必要がないこと、ならびに光学的測定、複数の抗体対、またはＡ１ｃおよび総ヘモグロビンの２つの別々の測定に基づいてさらなる誤差を取り込むパーセンテージ計算アルゴリズムを排除することという利点を提供する。
試料
標的分析物は一般に、試料中に存在する。当業者が理解することになるように、試料溶液は、それだけに限らないが、体液（それだけに限らないが、実質的に任意の生物の血液、尿、血清、リンパ、唾液、肛門分泌物および膣分泌物、汗および精液を含み、哺乳動物試料が好適であり、ヒト試料が特に好適である）；環境試料（それだけに限らないが、空気、農業、水、および土壌の試料を含む）；植物材料；生物兵器剤試料；研究試料、精製試料、生の試料などを含めた任意の数のものを含むことができる。当業者が理解することになるように、実質的に任意の実験的操作を試料に対して行うことができる。いくつかの実施形態では、貯蔵された（例えば、凍結および／またはアーカイブされた）またはフレッシュな組織からの標的試料を利用する。パラフィン包埋試料は、多くの実施形態で特に有用であり、その理由は、これらの試料が診断および予後などの試料と関連した追加のデータの存在に起因して非常に有用であり得るためである。本明細書に記載の固定組織試料およびパラフィン包埋組織試料は、貯蔵可能またはアーカイバル組織試料を指す。ほとんどの患者由来病理標本は、組織分析および後続のアーカイバル貯蔵が可能になるように日常的に固定またはパラフィン包埋される。
固体支持体
標的分析物は、電極を備える固体支持体を使用して検出される。本明細書で「基板」もしくは「固体支持体」または他の文法的均等物とは、捕捉リガンドの付着または会合に適切な別個の個々の部位を含有するように修飾することができる任意の材料を意味する。適当な基板としては、金などの金属表面、以下に定義される電極、ガラスおよび改質ガラスまたは機能化ガラス、繊維ガラス、テフロン、セラミック、雲母、プラスチック（アクリル樹脂、ポリスチレン、およびスチレンと他の材料のコポリマー、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリブチレン、ポリイミド、ポリカーボネート、ポリウレタン、テフロン（商標）、およびこれらの誘導体などを含む）、ＧＥＴＥＫ（ポリプロピレンオキシドと繊維ガラスのブレンド）など、多糖、ナイロンまたはニトロセルロース、樹脂、ケイ素および変性ケイ素を含めたシリカまたはシリカ系材料、炭素、金属、無機ガラス、ならびに様々な他のポリマーがあり、プリント回路ボード（ＰＣＢ）材料が特に好適である。
本システムは、アレイフォーマット、すなわち、アドレス可能な検出電極（本明細書で一般に、「パッド」「アドレス」、または「マイクロロケーション」と呼ばれる）のマトリックスが存在するアレイフォーマットにおいて特定の有用性を見出す。本明細書で「アレイ」とは、アレイフォーマット内の複数の捕捉リガンドを意味し、アレイのサイズは、アレイの組成および最終用途に依存することになる。約２つの異なる捕捉基板〜何千を含有するアレイを作製することができる。
好適な実施形態では、検出電極は、基板上に形成される。さらに、本明細書での考察は一般に、金電極の使用を対象とするが、当業者が理解することになるように、他の電極も同様に使用することができる。基板は、本明細書に概説する、および引用参考文献における多種多様な材料を含むことができる。
一般に、好適な材料は、プリント回路ボード材料を含む。回路ボード材料は、導電層で被覆され、リソグラフィー技法、特にフォトリソグラフィー技法を使用して処理されて、電極およびインターコネクト（時にインターコネクションまたはリードと当技術分野で呼ばれる）のパターンが形成された絶縁基板を含むものである。絶縁基板は一般に、常にではないが、ポリマーである。当技術分野で知られているように、１つまたは複数の層を使用して「２次元」（例えば、一面内にすべての電極およびインターコネクション）、または「三次元」（電極が一表面上にあり、インターコネクトが反対側へとボードを通過する場合がある、もしくは電極が複数の表面上にある）ボードを作製することができる。三次元システムは、「スルーボード」インターコネクションが作製されるように、ドリル加工またはエッチング、その後の銅などの金属での電気めっきの使用をしばしば利用する。回路ボード材料は、銅箔などの基板に既に付着した箔が備わっていることが多く、追加の銅が必要に応じ（例えば、インターコネクション用に）、例えば、電気めっきによって加えられている。次いで銅表面は、接着層を付着させるために、例えばエッチングによって粗面化される必要がある場合がある。
したがって、好適な実施形態では、本発明は、複数の電極、好ましくは金電極を備える基板を含むバイオチップ（時に「チップ」と本明細書で呼ばれる）を提供する。電極の数は、アレイについて概説した通りである。各電極は、好ましくは本明細書に概説した自己組織化単分子層を備える。好適な実施形態では、単分子層形成化学種の１つは、本明細書に概説した捕捉リガンドを含む。さらに、各電極は、一端で電極に取り付けられ、電極を制御することができるデバイスに最終的に取り付けられたインターコネクションを有する。すなわち、各電極は、独立してアドレス可能である。
最後に、本発明の構成物は、マイクロ流体コンポーネントおよびロボットコンポーネントを含めた多種多様な追加のコンポーネント（例えば、米国特許第６，９４２，７７１号および同第７，３１２，０８７号、および関連ケースを参照。これらの両方は、その全体が参照により本明細書に組み込まれている）、ならびに信号処理技法を利用するコンピューターを含む検出システム（例えば、その全体が参照により本明細書に組み込まれている米国特許第６，７４０，５１８号を参照）を含むことができる。
Ｓ−ＭＡＤ法について、タンパク質およびこれらの糖化された対応するタンパク質に非選択的に結合する結合リガンドは、第２の固体支持体に任意選択により結合していてもよい。限定することなく、微粒子、磁性微粒子、ビーズ、およびマイクロチャネルを含めた任意の適当な第２の固体支持体を使用することができる。
電極
本発明の固体支持体は、電極を備える。本明細書で「電極」とは、電子デバイスに接続されているとき、電流または電荷を検知し、それを信号に変換することができる構成物を意味する。好適な電極は、当技術分野で公知であり、これらとして、それだけに限らないが、金；白金；パラジウム；ケイ素；アルミニウムを含めたある特定の金属およびこれらの酸化物；酸化白金、酸化チタン、酸化スズ、インジウムスズ酸化物、酸化パラジウム、酸化ケイ素、酸化アルミニウム、酸化モリブデン（Ｍｏ２Ｏ６）、酸化タングステン（ＷＯ３）、および酸化ルテニウムを含めた金属酸化物電極；ならびに炭素（ガラス状炭素電極、グラファイト、および炭素ペーストを含む）がある。好適な電極には、金、ケイ素、炭素、および金属酸化物電極が含まれ、金が特に好適である。
本明細書に記載の電極は、平面として表されており、これは、電極の可能なコンホメーションのうちの１つであるだけであり、概略的な目的のためだけである。電極のコンホメーションは、使用される検出方法によって変化することになる。
本発明の電極は一般に、バイオチップカートリッジ内に組み込まれており、多種多様な配置をとることができ、作用電極および参照電極、インターコネクト（「スルーボード」インターコネクトを含む）、ならびにマイクロ流体コンポーネントを含むことができる。例えば、その全体が参照により本明細書に組み込まれている米国特許第７，３１２，０８７号を参照。さらに、バイオチップは一般に、本明細書に記載のコンポーネントを有する作用電極や、参照電極、および対電極／補助電極を含む。
バイオチップカートリッジは、生体分子のアレイを含む基板を含み、様々な方法で配置することができる。例えば、チップは、試薬を導入および除去するための入口ポートおよび出口ポートを有する反応チャンバーを含むことができる。さらに、カートリッジは、試料を導入し、試薬を添加し、反応を行うことができるように、マイクロ流体コンポーネントを有するキャップまたは蓋を含むことができ、次いで試料は、検出用アレイを備える反応チャンバーに添加される。
自己組織化単分子層
電極は、自己組織化単分子層（「ＳＡＭ」）を備える。本明細書で「単分子層」または「自己組織化単分子層」または「ＳＡＭ」は、表面上に自発的に化学吸着された分子の相対的に秩序あるアセンブリーを意味し、ここで分子は、互いにほぼ平行に、かつ表面に対しておおよそ垂直に配向している。分子のそれぞれは、表面に接着する官能基、および単分子層内で隣接分子と相互作用して相対的に秩序あるアレイを形成する部分を含む。「混合」単分子層は、異種の単分子層を含み、すなわちこの場合、少なくとも２種の異なる分子が単分子層を構成する。本明細書に概説したように、単分子層を使用すると、表面への生体分子の非特異的結合の量が低減し、核酸の場合では、電極からのオリゴヌクレオチドの距離の結果としてオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションの効率が増大する。したがって、単分子層は、電極表面から離して標的酵素を維持することを促進する。さらに、単分子層は、電極の表面から離して電荷担体を保持する機能を果たす。したがって、この層は、電極とＲｅＡＭとの間、または電極と溶媒内の荷電種との間の電気的接触を防止するのに役立つ。このような接触は、直接「短絡」または試料中に存在し得る荷電種を介した間接短絡をもたらし得る。したがって、単分子層は、存在する「ホール」が最小限であるように、電極表面上で、均一層でしっかりとパックされていることが好ましい。したがって、単分子層は、電極への溶媒接近性を遮断する物理的バリアとして機能を果たす。
いくつかの実施形態では、単分子層は、導電性オリゴマーを含み、特に、導電性オリゴマーは一般に、以下に記載するように電極表面にＥＡＭを付着させるのに使用される。本明細書で「導電性オリゴマー」とは、好ましくは線状の、実質的に導電性のオリゴマーを意味し、これらのうちのいくつかの実施形態は、「分子ワイヤー」と文献において呼ばれている。本明細書で「実質的に導電性の」とは、オリゴマーが１００Ｈｚで電子を移動させることができることを意味する。一般に、導電性オリゴマーは、導電性オリゴマーの単量体ユニット同士間のように、実質的に重なり合うπ軌道、すなわち、共役π軌道を有するが、導電性オリゴマーは、１つまたは複数のシグマ（σ）結合も含有することができる。さらに、導電性オリゴマーは、付随するＥＡＭ内に電子を注入し、または付随するＥＡＭから電子を受け取るその能力によって機能的に定義することができる。さらに、導電性オリゴマーは、本明細書に定義される絶縁体より導電性である。さらに、本発明の導電性オリゴマーは、それ自体電子を供与または受容することができる電気活性ポリマーと区別されるべきである。
導電性オリゴマーのより詳細な説明は、その全体が参照により本明細書に組み込まれているＷＯ／１９９９／５７３１７に見つかる。特に、ＷＯ／１９９９／５７３１７の１４〜２１頁の構造１〜９に示された導電性オリゴマーは、本発明において用途を見出す。いくつかの実施形態では、導電性オリゴマーは、以下の構造を有する：
Figure 2014530367
さらに、単分子層中の導電性オリゴマーの少なくともいくつかの末端は、電子的に露出している。本明細書で「電子的に露出している」とは、末端にごく接近してＥＡＭを配置した際、かつ適切な信号で開始した後、ＥＡＭの存在に依存する信号が検出され得ることを意味する。導電性オリゴマーは、末端基を有していても、有していなくてもよい。したがって、好適な実施形態では、追加の末端基はまったく存在せず、導電性オリゴマーは、１つの末端基、例えば、アセチレン結合などで末端をなす。あるいは、いくつかの実施形態では、末端基が付加され、時に「Ｑ」と本明細書で表される。末端基は、いくつかの理由で、例えば、ＥＡＭを検出するために導電性オリゴマーの電子利用可能性（electronic availability）に寄与するのに、または他の理由、例えば、非特異的結合を防止するためにＳＡＭの表面を変更するのに使用することができる。例えば、負に帯電した表面を形成するために末端上に負に帯電した基が存在する場合があり、その結果、標的分析物がＤＮＡまたはＲＮＡなどの核酸である場合、核酸は、表面に反発され、または表面上に留まることを防止されて、ハイブリダイゼーションが促進される。好適な末端基としては、−ＮＨ、−ＯＨ、−ＣＯＯＨや、−ＣＨ３などのアルキル基、および（ポリ）エチレングリコールなどの（ポリ）アルキルオキシドがあり、−ＯＣＨ２ＣＨ２ＯＨ、−（ＯＣＨ２ＣＨ２Ｏ）２Ｈ、−（ＯＣＨ２ＣＨ２Ｏ）３Ｈ、および−（ＯＣＨ２ＣＨ２Ｏ）４Ｈが好適である。
一実施形態では、異なるタイプの末端基を有する導電性オリゴマーの混合物を使用することが可能である。したがって、例えば、末端基のいくつかは、検出を促進することができ、いくつかは、非特異的結合を防止することができる。
いくつかの実施形態では、電極は、好ましくは電極表面上で単分子層の形態で不動態化剤をさらに備える。いくつかの分析物については、分析物結合（すなわち、ハイブリダイゼーション）の効率は、結合リガンドが電極から離れているとき増大し得る。さらに、単分子層が存在すると、表面への非特異的結合を減少させることができる（それは、本明細書に概説した末端基の使用によってさらに促進され得る）。不動態化剤層は、結合リガンドおよび／または分析物を電極表面から離して維持することを促進する。さらに、不動態化剤は、電極の表面から離して電荷担体を保持する機能を果たす。したがって、この層は、電極と電子伝達部分との間、または電極と溶媒内の荷電種との間の電気的接触を防止するのに役立つ。このような接触は、直接「短絡」または試料中に存在し得る荷電種を介した間接短絡をもたらし得る。したがって、不動態化剤の単分子層は、存在する「ホール」が最小限であるように、電極表面上で、均一層でしっかりとパックされていることが好ましい。あるいは、不動態化剤は、単分子層の形態でなくてもよいが、導電性オリゴマーのパッキングまたは他の特性に役立つように存在し得る。
したがって、不動態化剤は、電極への溶媒接近性を遮断する物理的バリアとして機能を果たす。したがって、不動態化剤自体は、実際には、（１）導電分子であっても、（２）非導電すなわち、絶縁分子であってもよい。したがって、一実施形態では、不動態化剤は、電極への電荷の移動を遮断し、または減少させる末端基を含む、または含まない、本明細書に記載の導電性オリゴマーである。導電性であり得る他の不動態化剤としては、−−（ＣＦ２）ｎ−−、−−（ＣＨＦ）ｎ−−、および−−（ＣＦＲ）ｎ−−のオリゴマーがある。好適な実施形態では、不動態化剤は、絶縁体部分である。
いくつかの実施形態では、単分子層は、絶縁体を含む。「絶縁体」は、好ましくは線状の、実質的に非導電のオリゴマーである。本明細書で「実質的に非導電」とは、絶縁体を通じた電子移動速度が、導電性オリゴマーを通じた電子移動速度より遅いことを意味する。別の言い方をすれば、絶縁体の電気抵抗は、導電性オリゴマーの電気抵抗より高い。しかし、−−（ＣＨ２）１６分子などの絶縁体であると一般にみなされるオリゴマーでさえ依然として、たとえ遅い速度でも電子を移動させることができることに留意されるべきである。
いくつかの実施形態では、絶縁体は、約１０−７Ω−１ｃｍ−１以下の伝導率、Ｓを有し、約１０−８Ω−１ｃｍ−１が好適である。参照により本明細書に組み込まれている、Ｇａｒｄｎｅｒら、Ｓｅｎｓｏｒｓ ａｎｄ Ａｃｔｕａｔｏｒｓ Ａ ５１（１９９５）５７〜６６頁。
一般に、絶縁体は、シグマ結合を有するアルキルまたはヘテロアルキルオリゴマーまたは部分であるが、任意の特定の絶縁体分子は、芳香族基または１つもしくは複数の共役結合を含有することができる。本明細書で「ヘテロアルキル」とは、少なくとも１つのヘテロ原子、すなわち、窒素、酸素、硫黄、リン、ケイ素、またはホウ素が鎖内に含まれているアルキル基を意味する。あるいは、絶縁体は、電子移動を好ましくは実質的に阻害し、または遅延させる機能を果たす１つまたは複数のヘテロ原子または結合が付加された導電性オリゴマーとかなり同様である場合がある。いくつかの実施形態では、絶縁体は、Ｃ６〜Ｃ１６アルキルを含む。
絶縁体を含む不動態化剤は、電極上の部分または導電性オリゴマーのパッキング、絶縁体の親水性または疎水性、絶縁体の柔軟性、すなわち、回転、ねじり、または縦方向の柔軟性を変更するために、本明細書で定義されるＲ基で置換することができる。例えば、分枝状アルキル基を使用することができる。さらに、絶縁体を含む不動態化剤の末端は、単分子層の露出面に影響を与えるための、時に末端基（「ＴＧ」）と本明細書で呼ばれる追加の基を含有することができる。例えば、帯電基、中性の基、または疎水性基の付加を行って、試料からの非特異的結合を阻害し、または分析物の結合の動態に影響を与えるなどができる。例えば、ある特定の標的分析物の結合を助長もしくは妨害し、または表面に反発し、もしくは表面上に留まるのを防止するための荷電表面を形成するために、末端上に荷電基が存在する場合がある。
不動態化剤の長さは、必要に応じて変化する。一般に、不動態化剤の長さは、上記に概説したように、導電性オリゴマーの長さと同様である。さらに、導電性オリゴマーは、不動態化剤と基本的に同じ長さであり、またはこれらより長い場合があり、結合リガンドが過酸化物によりアクセス可能である状態をもたらす。
単分子層は、絶縁体を含む単一タイプの不動態化剤を含み、または異なるタイプを含むことができる。
適当な絶縁体は、当技術分野で公知であり、これらとして、それだけに限らないが、−−（ＣＨ２）ｎ−−、−−（ＣＲＨ）ｎ−−、および−−（ＣＲ２）ｎ−−、エチレングリコール、または酸素の代わりに他のヘテロ原子、すなわち、窒素または硫黄を使用する誘導体（硫黄誘導体は、電極が金である場合、好適でない）がある。いくつかの実施形態では、絶縁体は、Ｃ６〜Ｃ１６アルキルを含む。
いくつかの実施形態では、電極は、金属表面であり、必ずしもインターコネクト、または電気化学を行う能力を有する必要はない。
電気活性部分
ＳＡＭに加えて、電極は、ＥＡＭを備える。本明細書で「電気活性部分（ＥＡＭ）」または「遷移金属錯体」または「レドックス活性分子」または「電子伝達部分（ＥＴＭ）」とは、１つまたは複数の電子を可逆的または半可逆的に移動させることができる金属含有化合物を意味する。電子ドナーおよびアクセプター能力は、相対的である、すなわち、ある特定の実験条件下で電子を失うことができる分子は、異なる実験条件下で電子を受容することができることが理解されるべきである。
可能な遷移金属錯体の数は非常に多く、電子伝達化合物の当業者は、本発明においていくつかの化合物を利用することができることが理解されるべきである。本明細書で「遷移金属」とは、部分殻または閉殻の電子を有する金属を意味する。本発明で使用するのに適した遷移金属としては、それだけに限らないが、カドミウム（Ｃｄ）、銅（Ｃｕ）、コバルト（Ｃｏ）、パラジウム（Ｐｄ）、亜鉛（Ｚｎ）、鉄（Ｆｅ）、ルテニウム（Ｒｕ）、ロジウム（Ｒｈ）、オスミウム（Ｏｓ）、レニウム（Ｒｅ）、白金（Ｐｔ）、スカンジウム（Ｓｃ）、チタン（Ｔｉ）、バナジウム（Ｖ）、クロム（Ｃｒ）、マンガン（Ｍｎ）、ニッケル（Ｎｉ）、モリブデン（Ｍｏ）、テクネチウム（Ｔｃ）、タングステン（Ｗ）、およびイリジウム（Ｉｒ）がある。すなわち、第一系列の遷移金属、白金金属（Ｒｕ、Ｒｈ、Ｐｄ、Ｏｓ、Ｉｒ、およびＰｔ）が、Ｆｅ、Ｒｅ、Ｗ、Ｍｏ、およびＴｃとともに、本発明において特定の用途を見出す。本発明において用途を見出す金属はまた、ルテニウム、オスミウム、鉄、白金、およびパラジウムを含めた、酸化状態が変化しても配位部位の数を変化させないものであり、オスミウム、ルテニウム、および鉄が特に有用である。一般に、遷移金属は、ＴＭまたはＭと本明細書に（または組み込まれた参考文献に）表されている。
遷移金属および配位する配位子は、金属錯体を形成する。本明細書で「配位子」または「配位する配位子」（本明細書で、または組み込まれた参考文献中で、図面中で「Ｌ」と表されている）とは、１つまたは複数の中心原子またはイオンに配位共有結合によってその電子の１つまたは複数を一般に供与し、または１つまたは複数の中心原子またはイオンと共有結合によってその電子を共有する原子、イオン、分子、または官能基を意味する。
いくつかの実施形態では、小極性配位子が使用される。適当な小極性配位子は一般に、「Ｌ」と本明細書で表され、本明細書でより完全に記載されるように、２つの一般的なカテゴリーに分類される。一実施形態では、小極性配位子は、一般に劣った脱離基として、または良好なシグマドナーとしてのこれらの特性、および金属の素性に起因して、金属イオンに有効に、不可逆的に結合される。これらの配位子は、「置換不活性」と呼ばれる場合がある。あるいは、以下でより完全に記載されるように、小極性配位子は、標的分析物が結合すると、分析物が金属の１つまたは複数の配位原子を提供し、これらの良好な脱離基特性または劣ったシグマドナー特性に起因して、小極性配位子を有効に置き換えることができるように、金属イオンに可逆的に結合することができる。これらの配位子は、「置換的に不安定」と呼ばれる場合がある。配位子は、双極子を形成することが好ましく、その理由は、それが、高溶媒再配置エネルギーに寄与することになるためである。
遷移金属錯体の構造のいくつかを以下に示す：
Figure 2014530367
Ｌは、金属イオンの結合のための配位原子を提供する共配位子である。当業者が理解することになるように、共配位子の数および性質は、金属イオンの配位数に依存することになる。単座、二座、または多座共配位子を、任意の位置で使用することができる。したがって例えば、金属の配位数が６である場合、導電性オリゴマーの末端からのＬ、核酸から寄与されるＬ、およびｒは、合計６になる。したがって、金属の配位数が６である場合、ｒは、０（すべての配位原子が他の２つの配位子によって提供される場合）から、すべての共配位子が単座であるとき、４の範囲となり得る。したがって一般に、ｒは、金属イオンの配位数および他の配位子の選択に応じて０〜８となる。
一実施形態では、金属イオンの配位数は６であり、導電性オリゴマーに付着した配位子および核酸に付着した配位子はともに、少なくとも二座であり、すなわち、ｒは、好ましくは、０、１（すなわち、残りの共配位子が二座である）、または２（２つの単座共配位子が使用される）である。
当技術分野で理解されることになるように、共配位子は、同じであっても異なっていてもよい。適当な配位子は、２つのカテゴリー、すなわち、配位原子として窒素、酸素、硫黄、炭素、またはリン原子（金属イオンに応じて）を使用する配位子（一般に、シグマ（σ）ドナーと文献で呼ばれる）、およびメタロセン配位子などの有機金属配位子（一般に、パイ（π）ドナーと文献で呼ばれ、Ｌｍと本明細書で表す）に分類される。適当な窒素供与配位子は、当技術分野で周知であり、これらとしては、それだけに限らないが、シアノ（Ｃ≡Ｎ）、ＮＨ２；ＮＨＲ；ＮＲＲ’；ピリジン；ピラジン；イソニコチンアミド；イミダゾール；ビピリジン、およびビピリジンの置換誘導体；テルピリジン、および置換誘導体；フェナントロリン、特に１，１０−フェナントロリン（ｐｈｅｎと省略される）、およびフェナントロリンの置換誘導体、例えば、４，７−ジメチルフェナントロリンおよびジピリドール［３，２−ａ：２’，３’−ｃ］フェナジン（ｄｐｐｚと省略される）など；ジピリドフェナジン；１，４，５，８，９，１２−ヘキサアザトリフェニレン（ｈａｔと省略される）；９，１０−フェナントレンキノンジイミン（ｐｈｉと省略される）；１，４，５，８−テトラアザフェナントレン（ｔａｐと省略される）；１，４，８，１１−テトラ−アザシクロテトラデカン（ｃｙｃｌａｍと省略される）、ならびにイソシアニドがある。縮合誘導体を含めた置換誘導体も使用することができる。いくつかの実施形態では、ポルフィリン、およびポルフィリンファミリーの置換誘導体を使用することができる。例えば、Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ Ｃｏｏｒｄｉｎａｔｉｏｎ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、Ｗｉｌｋｉｎｓｏｎら編、Ｐｅｒｇａｍｍｏｎ Ｐｒｅｓｓ、１９８７、１３．２章（７３〜９８頁）、２１．１章（８１３〜８９８頁）、および２１．３章（９１５〜９５７頁）を参照。これらのすべては、参照により本明細書に明白に組み込まれている。
当技術分野で理解されることになるように、ドナー（１）が金属に結合し、ドナー（２）が周囲媒体（溶媒、タンパク質など）との相互作用に利用可能である任意の配位子ドナー（１）−架橋−ドナー（２）を、特にドナー（１）およびドナー（２）が、シアノ（Ｃがドナー（１）であり、Ｎがドナー（２）であり、パイシステムがＣＮ三重結合である）と同様に、パイシステムによってカップリングされている場合、本発明において使用することができる。一例は、ビピリミジンであり、これは、ビピリジンと酷似して見えるが、媒体と相互作用するために、「裏面」にＮドナーを有する。追加の共配位子としては、それだけに限らないが、シアネート、イソシアネート（−Ｎ＝Ｃ＝Ｏ）、チオシアネート、イソニトリル、Ｎ２、Ｏ２、カルボニル、ハロゲン化物、アルコキシド、チオレート、アミド、リン化物、ならびに硫黄含有化合物、例えば、スルフィノ、スルホニル、スルホアミノ、およびスルファモイルなどがある。
いくつかの実施形態では、異なる金属と錯体形成するために、複数のシアノが共配位子として使用される。例えば、７つのシアノがＲｅ（ＩＩＩ）に結合し、８つがＭｏ（ＩＶ）およびＷ（ＩＶ）に結合する。したがって、６つ以下のシアノ、および１つまたは複数のＬを有するＲｅ（ＩＩＩ）、または７つ以下のシアノおよび１つもしくは複数のＬを有するＭｏ（ＩＶ）もしくはＷ（ＩＶ）を、本発明において使用することができる。Ｗ（ＩＶ）系を有するＥＡＭは、より不活性であり、調製するのがより容易であり、より好都合な還元電位であるので、他のものに対して特別な利点を有する。一般に、ＣＮ／Ｌ比がより大きいと、より大きいシフトを与えることになる。
炭素、酸素、硫黄、およびリンを使用する適当なシグマ供与配位子は、当技術分野で公知である。例えば、適当なシグマ炭素ドナーは、参照により本明細書に組み込まれているＣｏｔｔｏｎおよびＷｉｌｋｅｎｓｏｎ、Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、５版、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ、１９８８に見出される。例えば、３８頁を参照。同様に、適当な酸素配位子には、クラウンエーテル、水、および当技術分野で公知の他のものが含まれる。ホスフィンおよび置換ホスフィンも適当である。ＣｏｔｔｏｎおよびＷｉｌｋｅｎｓｏｎの３８頁を参照。
酸素、硫黄、リン、および窒素供与配位子は、ヘテロ原子が配位原子として機能を果たすことが可能になる様式で付着される。
いくつかの実施形態では、有機金属配位子が使用される。レドックス部分として使用するための純粋有機化合物、および複素環置換基または環外置換基としてドナー原子を含むδ結合有機配位子を有する様々な遷移金属配位錯体に加えて、π結合有機配位子を有する多種多様な遷移金属有機金属化合物が利用可能である（参照により本明細書に明白に組み込まれている、Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｉｎｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、５版、Ｃｏｔｔｏｎ＆Ｗｉｌｋｉｎｓｏｎ、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ、１９８８、２６章；Ｏｒｇａｎｏｍｅｔａｌｌｉｃｓ，Ａ Ｃｏｎｃｉｓｅ Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ、Ｅｌｓｃｈｅｎｂｒｏｉｃｈら、２版、１９９２、ＶＣＨ；およびＣｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ Ｏｒｇａｎｏｍｅｔａｌｌｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ＩＩ，Ａ Ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ ｔｈｅ Ｌｉｔｅｒａｔｕｒｅ １９８２−１９９４、Ａｂｅｌら編、７巻、７、８、１０＆１１章、Ｐｅｒｇａｍｏｎ Ｐｒｅｓｓを参照）。このような有機金属配位子には、シクロペンタジエニドイオン［Ｃ５Ｈ５（−１）］などの環式芳香族化合物、およびビス（シクロペンタジエニル）金属化合物（すなわち、メタロセン）のクラスを生じるインデニリド（−１）イオンなどの様々な環置換誘導体および環縮合誘導体が含まれる。例えば、参照により組み込まれている、Ｒｏｂｉｎｓら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１０４：１８８２〜１８９３頁（１９８２）；およびＧａｓｓｍａｎら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１０８：４２２８〜４２２９頁（１９８６）を参照。これらのうちで、フェロセン［（Ｃ５Ｈ５）２Ｆｅ］ならびにその誘導体は、原型的な例であり、これらは、多種多様な化学的（参照により組み込まれているＣｏｎｎｅｌｌｙら、Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．９６：８７７〜９１０頁（１９９６））、ならびに電気化学的（参照により組み込まれているＧｅｉｇｅｒら、Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｏｒｇａｎｏｍｅｔａｌｌｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２３：１〜９３頁；およびＧｅｉｇｅｒら、Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｏｒｇａｎｏｍｅｔａｌｌｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２４：８７頁）電子移動反応または「レドックス」反応において使用されている。第１列、第２列、および第３列遷移金属のメタロセン誘導体は、核酸のリボース環またはヌクレオシド塩基に共有結合的に付着されるレドックス部分としての潜在的な候補である。他の潜在的に適当な有機金属配位子には、ビス（アレーン）金属化合物を生じるベンゼンなどの環式アレーン、ならびに環置換誘導体および環縮合誘導体が含まれ、これらのうちでビス（ベンゼン）クロムが原型的な例である。他の非環式π結合配位子、例えば、アリル（−１）イオンまたはブタジエンなどは、潜在的に適当な有機金属化合物を生じ、すべてのこのような配位子は、π結合配位子およびδ結合配位子と併せて、金属炭素結合が存在する有機金属化合物の一般的なクラスを構成する。架橋有機配位子、および追加の非架橋配位子を有し、かつ金属−金属結合を有する、および有さない化合物の様々な二量体およびオリゴマーの電気化学的試験は、核酸分析における潜在的な候補レドックス部分である。
共配位子の１つまたは複数が有機金属配位子であるとき、配位子は一般に、有機金属配位子の炭素原子の１つを介して付着されるが、結合は、複素環配位子の他の原子を介している場合がある。好適な有機金属配位子には、置換誘導体を含めたメタロセン配位子、およびメタロセノファンが含まれる（Ｃｏｔｔｏｎ ａｎｄ Ｗｉｌｋｅｎｓｏｎ、上記の１１７４頁を参照）。例えば、メチルシクロペンタジエニルなどのメタロセン配位子の誘導体は、ペンタメチルシクロペンタジエニルなどの複数のメチル基が好適であり、メタロセンの安定性を増大させるのに使用することができる。好適な実施形態では、メタロセンの２つのメタロセン配位のうちの１つのみが誘導体化されている。
本明細書に記載するように、配位子の任意の組合せを使用することができる。好適な組合せとしては、ａ）すべての配位子が窒素供与配位子であること、ｂ）すべての配位子が有機金属配位子であること、およびｃ）導電性オリゴマーの末端の配位子がメタロセン配位子であり、核酸によって提供される配位子が窒素供与配位子であり、他の配位子が、必要な場合、窒素供与配位子もしくはメタロセン配位子、または混合物であることが含まれる。
一般的な法則として、非大環状キレーターを含むＥＡＭは、金属イオンに結合されて非大環状キレート化合物を形成し、その理由は、金属が存在すると、複数のプロ配位子が一緒に結合して複数の酸化状態を与えることが可能になるためである。
いくつかの実施形態では、窒素供与プロ配位子が使用される。適当な窒素供与プロ配位子は、当技術分野で周知であり、これらとしては、それだけに限らないが、ＮＨ２；ＮＨＲ；ＮＲＲ’；ピリジン；ピラジン；イソニコチンアミド；イミダゾール；ビピリジンおよびビピリジンの置換誘導体；テルピリジンおよび置換誘導体；フェナントロリン、特に１，１０−フェナントロリン（ｐｈｅｎと省略される）、およびフェナントロリンの置換誘導体、例えば４，７−ジメチルフェナントロリンおよびジピリドール［３，２−ａ：２’，３’−ｃ］フェナジン（ｄｐｐｚと省略される）など；ジピリドフェナジン；１，４，５，８，９，１２−ヘキサアザトリフェニレン（ｈａｔと省略される）；９，１０−フェナントレンキノンジイミン（ｐｈｉと省略される）；１，４，５，８−テトラアザフェナントレン（ｔａｐと省略される）；１，４，８，１１−テトラ−アザシクロテトラデカン（ｃｙｃｌａｍと省略される）、ならびにイソシアニドがある。縮合誘導体を含めた置換誘導体も使用することができる。金属イオンを配位的に飽和させず、別のプロ配位子の付加を必要とする大環状配位子は、本目的に関して非大環状とみなされることに留意されるべきである。当業者が理解することになるように、いくつかの「非大環状」配位子を共有結合的に付着させて配位的に飽和した化合物を形成することが可能であるが、それは、環状骨格を欠いている。
いくつかの実施形態では、単座（例えば、少なくとも１つのシアノ配位子）、二座、三座、および多座配位子の混合物を、ＥＡＭの構築において使用することができる。
本発明で特に有用なのは、メタロセン、特に、少なくとも第１の自壊的部分が付着されたフェロセンであるＥＡＭであるが、いくつかの実施形態では、１つを超える自壊的部分が以下に記載されるように付着される（本明細書に広く記載されているように、自壊的部分を有する他のＥＡＭも使用することができることにも留意されるべきである）。いくつかの実施形態では、１つを超える自壊的部分がフェロセンに付着されているとき、これらはすべて、シクロペンタジエニル環の１つに付着されている。いくつかの実施形態では、自壊的部分は、異なる環に付着されている。いくつかの実施形態では、シクロペンタジエニル環の１つまたは両方を、１つの部位が電極への付着に使用される限り、自壊的部分で飽和させることが可能である。
さらに、ＥＡＭは一般に、電極にＥＡＭを付着させるのに使用される導電性オリゴマーにＥＡＭが付着するための付着部分を有する。一般に、要求されるわけではないが、フェロセンなどのメタロセンの場合では、図１に一般に表されているように、自壊的部分（複数可）は、シクロペンタジエニル環の１つに付着され、付着部分は、他の環に付着されるが、同じ環への付着も行うことができる。当業者が理解することになるように、自壊的部分および少なくとも１つの付着リンカーの任意の組合せを使用することができ、いずれかの環に使用することができる。
自壊的部分（複数可）および付着部分（複数可）に加えて、フェロセンは、少なくとも自壊的基の存在または非存在下でＥ０を変更することを含めた様々な理由で付加され得る追加の置換基を含むことができる。適当な置換基は、「Ｒ」基として、関連し、組み込まれている参考文献でしばしば表され、参照により本明細書に組み込まれている、２００８年１０月１７日に出願された米国特許出願第１２／２５３，８２８号；２００８年１０月１７日に出願された米国特許出願第１２／２５３，８７５号；２０１０年５月７日に出願された米国仮特許出願第６１／３３２，５６５号；２０１０年５月２１日に出願された米国仮特許出願第６１／３４７，１２１号；および２０１０年７月２０日に出願された米国仮特許出願第６１／３６６，０１３号に列挙されている。
いくつかの実施形態では、以下に表すように、ＥＡＭは、過酸化物感受性部分がＥＡＭに直接付着され、過酸化物感受性部分が過酸化物に曝露されるときＥ０の変化をもたらす場合、自壊的部分を含まない。以下に示すように、一実施形態では、過酸化物感受性部分がＥＡＭ（この場合、フェロセン）に直接付着することが可能であり、その結果、フェロセンは、ピナコールボロン酸エステル部分が付着しているとき第１のＥ０、および例えば、過酸化物の存在下で除去されると第２のＥ０を有する。
Figure 2014530367
本発明のＥＡＭは、ＥＡＭが、存在するとき第１のＥ０、および以下に記載するように除去されているとき第２のＥ０を有するようにＥＡＭに共有結合的に付着している少なくとも１つの自壊的部分を含む。
用語「自壊的スペーサー」は、２つの化学部分を共有結合的に連結して通常安定なトリパータイト分子にすることができる二官能性化学部分を指す。自壊的スペーサーは、第１の部分への結合が切断される場合、第２の部分から自発的に分離することができる。本発明では、自壊的スペーサーは、過酸化物感受性部分、例えば、ホウ素部分をＥＡＭに連結する。過酸化物に曝露されると、図１に概略的に表されているように、ホウ素部分が除去され、スペーサーが崩壊する。一般的に言えば、非可逆性の繰り返しの結合転位反応が電子供与性アルコール官能基（すなわち、キノンメチドモチーフ）によって開始される任意のスペーサーを、酸化条件下でアルコールを生成する誘発部分として機能を果たすホウ素基を用いて設計することができる。あるいは、ホウ素部分は、遷移金属のプロキレーターである配位子中の潜在フェノール酸素をマスクすることができる。酸化されると、配位子は、ＳＡＭ中で変換され、ＥＡＭ形成を開始する。例えば、見本のキレート配位子は、鉄に結合するサリチルアルデヒドイソニコチノイルヒドラゾンである。
当業者が理解することになるように、多種多様な自壊的部分を、多種多様なＥＡＭおよび過酸化物感受性部分とともに使用することができる。自壊的リンカーは、米国公開第２の００９００４１７９１号、同第２の０１００１４５０３６号、ならびに米国特許第７，７０５，０４５号、および同第７，２２３，８３７号を含めたいくつかの参考文献に記載されており、これらのすべては、その全体が、特に自壊的スペーサーの開示について参照により明白に組み込まれている。
本発明で特に有用な数個の自壊的リンカーを図６に示す。自壊的スペーサーは、単一単量体ユニット、または同じ単量体（ホモポリマー）もしくは異なる単量体（ヘテロポリマー）のポリマーを含むことができる。あるいは、自壊的スペーサーは、参照により本明細書に組み込まれている以前の出願「Ｅｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ａｓｓａｙ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｅｎｚｙｍｅｓ」、ＵＳ１２／２５３，８２８、ＰＣＴ／ＵＳ２００８／０８０３６３に列挙された化学反応に類似した切断後にＥＡＭの環境を変化させる、ＳＡＭ中のＥＡＭへの隣接基とすることができる。
過酸化物感受性部分
自壊的スペーサーは、本発明の過酸化物感受性部分（ＰＳＭ、時にＰＯＭと本明細書で呼ばれる）およびＥＡＭを接合する。一般に、過酸化物感受性部分は、図１に表したようにホウ素を含有するものである。
例えば、本明細書の図は、フェロセン誘導体の使用を表し、この場合、過酸化物は、ｐ−置換ピナコールホウ酸エステルを含むカルバミン酸ベンジルからアミンへの変換を誘発する。この自己排除基（self-eliminating group）は、過酸化水素の存在下でアミン官能化フルオロフォアを生成するために以前に記載されている（Ｓｅｌｌａ，Ｅ．；Ｓｈａｂａｔ，Ｄ．Ｓｅｌｆ−ｉｍｍｏｌａｔｉｖｅ ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ ｐｒｏｂｅ ｆｏｒ ｔｈｅ ｄｉｒｅｃｔ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｔｒｉａｃｅｔｏｎｅ ｔｒｉｐｅｒｏｘｉｄｅ．、Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍｕｎ．２００８、５７０１〜５７０３頁；およびＬｏ，Ｌ．−Ｃｌ；Ｃｈｕ，Ｃ．−Ｙ．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ｈｉｇｈｌｙ ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ａｎｄ ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ｐｒｏｂｅｓ ｆｏｒ ｈｙｄｒｏｇｅｎ ｐｅｒｏｘｉｄｅ．、Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍｕｎ．２００３、２７２８〜２７２９頁。これらはともに、参照により組み込まれている）。他のこのような基（アリールホウ酸エステルおよびアリールボロン酸）も、ＳｅｌｌａおよびＬｏにおいて記載されている。さらに、フェロセニルアミンは、これらの対応するカルバメート誘導体と比較してより低い電位（約１５０ｍＶ）でレッドクス挙動を呈することが知られている（本明細書に組み込まれている、Ｓａｇｉら、Ａｍｐｅｒｏｍｅｔｒｉｃ Ａｓｓａｙ ｆｏｒ Ａｌｄｏｌａｓｅ Ａｃｔｉｖｉｔｙ；Ａｎｔｉｂｏｄｙ−Ｃａｔａｌｙｚｅｄ Ｆｅｒｒｏｃｅｎｙｌａｍｉｎｅ Ｆｏｒｍａｔｉｏｎ．、Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．２００６、７８、１４５９〜１４６１頁を参照）。
捕捉リガンドおよび可溶性結合リガンド
ＳＡＭおよびＥＡＭに加えて、いくつかの実施形態では、電極は、捕捉結合リガンドを備える。本明細書で「結合リガンド」または「結合種」とは、標的分析物の存在についてプローブするのに使用され、標的分析物に結合する化合物を意味する。一般に、本明細書に記載の実施形態のほとんどについて、標的分析物分子１個当たり少なくとも２種の結合リガンド、すなわち、検出表面に付着される「捕捉」または「アンカー」結合リガンド、および標的分析物に独立して結合し、直接または間接的にＳＯＸなどの少なくとも１種の標識を含む可溶性結合リガンドが存在する。本明細書で「捕捉結合リガンド」とは、標的分析物に結合する電極表面に付着される標的分析物に結合する結合リガンドを意味する。本明細書で「可溶性結合リガンド」とは、溶液中にあり、捕捉結合リガンドと異なる部位で標的分析物に結合する結合リガンドを意味する。
当業者が理解することになるように、結合リガンドの組成は、標的分析物の組成に依存することになる。多種多様な分析物の結合リガンドは、公知であり、または公知の技法を使用して容易に見つけることができる。例えば、分析物がタンパク質であるとき、結合リガンドは、タンパク質（特に、抗体もしくはこれらの断片（ＦＡｂｓなど）を含む）、または小分子を含む。タンパク質および糖化タンパク質の特に有用な結合リガンドの限定されない代表例としては、モノクローナル抗体、モノクローナル抗体の断片、ポリクローナル抗体、ポリクローナル抗体の断片、タンパク質、およびペプチドがある。
一般に、抗体は、捕捉および可溶性結合リガンドの両方として有用である。
一態様では、可溶性結合リガンドは、過酸化物生成系を含む。本明細書の定義では、用語「過酸化物生成系（peroxide generating system）」または「過酸化物生成系（peroxide-generating system）」は、その基質から過酸化物を直接生成する酵素、またはひいては過酸化物を生成する別の酵素の中間体、例えば、補助因子もしくはプレサブストレート（pre-substrate）を生成する中間酵素成分を意味する。一例では、過酸化物生成部分は、過酸化物を生成する酵素とすることができる。グルコースオキシダーゼ、アシルＣｏＡオキシダーゼ、アルコールオキシダーゼ、アルデヒドオキシダーゼなどを含めた多種多様な効能な酵素が公知である。多種多様な適当なオキシダーゼ酵素が当技術分野で公知である（それだけに限らないが、グルコースオキシダーゼ、Ｄ−アミノ酸オキシダーゼ（ＤＡＡＯ）、およびコリンオキシダーゼを含めた、ＥＣ１．１．３．４として分類される任意のグルコースオキシダーゼ酵素を参照）。それだけに限らないが、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ種（例えば、Ａ．ｎｉｇｅｒ）、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｕｍ種、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ種、マウスなどを含めた、細菌、真菌、および動物（哺乳動物を含む）を含めて、多種多様な生物に由来するグルコースオキシダーゼ酵素が周知である。ＥＣ１．３．３．６．として分類されるアシルＣｏＡオキシダーゼも有用である。
あるいは、過酸化物生成系は、中間酵素成分を含むことができる。例えば、可溶性結合リガンドは、ひいては基質と反応することによって過酸化物を生成する、可溶性アポオキシダーゼ（apo-oxidase）酵素のリン酸化前駆体（すなわち、アポ−ＤＡＡＯに結合するＦＡＤに変換されるＦＡＤＰ）からの必要な補助因子の生成を触媒するアルカリホスファターゼ（ＡＰ）などの酵素を含有することができる。このストラテジーは、アポ酵素、リン酸化補助因子、およびオキシダーゼ酵素基質の濃度が、表面に固定された標的に対して高い場合、標的結合イベントのカスケード増幅を可能にする。
一般に、捕捉結合リガンドは、検出の目的のために、検出表面への標的分析物の付着を可能にする。一実施形態では、結合は、特異的であり、結合リガンドは、結合対の一部である。本明細書で「特異的に結合する」とは、配位子が、検査試料の分析物と他の成分または混入物とを区分するのに十分な特異性を伴って分析物に結合することを意味する。結合は、非特異的結合を除去するための洗浄ステップを含めたアッセイの条件下で分析物を結合したままにさせるのに十分であるべきである。いくつかの実施形態では、例えば、ある特定の生体分子の検出において、結合リガンドへの分析物の結合定数は、少なくとも約１０−４〜１０−９Ｍ−１となり、少なくとも約１０−５〜１０−９が好適であり、少なくとも約１０−７〜１０−９Ｍ−１が特に好適である。
多種多様な分析物の結合リガンドは、公知であり、または公知の技法を使用して容易に見つけることができる。例えば、分析物が一本鎖核酸であるとき、結合リガンドは一般に、実質的に相補的な核酸である。あるいは、参照により本明細書に組み込まれている、米国特許第５，２７０，１６３号、同第５，４７５，０９６号、同第５，５６７，５８８号、同第５，５９５，８７７号、同第５，６３７，４５９号、同第５，６８３，８６７号、同第５，７０５，３３７号、および関連特許に概して記載されているように、核酸「アプタマー」を、実質的に任意の標的分析物への結合のために開発することができる。同様に、分析物は、核酸結合タンパク質であり得、捕捉結合リガンドは、一本鎖または二本鎖核酸であり、あるいは、結合リガンドは、分析物が一本鎖または二本鎖核酸であるとき、核酸結合タンパク質であり得る。分析物がタンパク質であるとき、結合リガンドは、上述したタンパク質（特に、抗体もしくはこれらの断片（ＦＡｂなど）を含む）、小分子、またはアプタマーを含む。好適な結合リガンドタンパク質には、抗体およびペプチドが含まれる。当業者が理解することになるように、好ましくは特異的に会合する任意の２種の分子を、分析物または結合リガンドとして使用することができる。適当な分析物／結合リガンド対としては、それだけに限らないが、抗体／抗原、受容体／配位子、タンパク質／核酸、核酸／核酸、酵素／基質および／または阻害剤、炭水化物（糖タンパク質および糖脂質を含む）／レクチン、炭水化物と他の結合パートナー、タンパク質／タンパク質、ならびにタンパク質／小分子がある。これらは、野生型配列であっても、誘導体配列であってもよい。
捕捉結合リガンド（例えば、捕捉抗体）は、電極に共有結合的にカップリングされ（通常、付着リンカーによって）、または例えば、ビオチン／ストレプトアビジン反応（例えば、ＳＡＭの表面上のビオチン、抗体などのストレプトアビジン−コンジュゲート捕捉リガンド、もしくは逆の場合も同様）を使用してしっかりと、しかし共有結合的でなく、核酸反応（例えば、捕捉リガンドは、核酸（「ワトソン」）を有することができ、表面は、相補的核酸（「クリック」）を有することができる）を介して、抗体のＦｃ断片に結合するプロテインＧを使用してなどで結合され得る。
本明細書に記載の発明は、違法の爆発性の過酸化アセトン（ＴＡＴＰ）のセンサーとしても使用することができることにも留意されるべきである。
アンカー基
本発明は、電極表面上にＥＡＭ（電導性オリゴマーを含む電極表面に任意選択により付着した）、ＳＡＭ、および捕捉結合リガンドを含む化合物を提供する。一般に、いくつかの実施形態では、これらの部分は、アンカー基を使用して電極に付着されている。本明細書で「アンカー」または「アンカー基」とは、本発明の化合物を電極に付着させる化学基を意味する。
当業者が理解することになるように、アンカー基の組成は、これが付着している表面の組成に応じて変化することになる。金電極の場合では、ピリジニルアンカー基およびチオール系アンカー基の両方が特定の用途を見出す。
導電性オリゴマーの共有結合は、使用される電極および導電性オリゴマーに応じて様々な方法で達成することができる。一般に、構造１で「Ａ」と以下で表されるいくつかのタイプのリンカーが使用され、ここで、Ｘは導電性オリゴマーであり、ハッチングされた面は電極である：
Figure 2014530367
この実施形態では、Ａは、リンカーまたは原子である。「Ａ」の選択は、電極の特性に部分的に依存することになる。したがって例えば、Ａは、金電極が使用される場合、硫黄部分であり得る。あるいは、金属酸化物電極が使用される場合、Ａは、酸化物の酸素に付着したケイ素（シラン）部分であり得る（例えば、Ｃｈｅｎら、Ｌａｎｇｍｕｉｒ １０：３３３２〜３３３７頁（１９９４）；Ｌｅｎｈａｒｄら、Ｊ．Ｅｌｅｃｔｒｏａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．７８：１９５〜２０１頁（１９７７）を参照。これらの両方は、参照により明白に組み込まれている）。炭素系電極が使用される場合、Ａは、アミノ部分（好ましくは１級アミン；例えば、Ｄｅｉｎｈａｍｍｅｒら、Ｌａｎｇｍｕｉｒ １０：１３０６〜１３１３頁（１９９４）を参照）であり得る。したがって、好適なＡ部分として、それだけに限らないが、シラン部分、硫黄部分（アルキル硫黄部分を含む）、およびアミノ部分が挙げられる。
いくつかの実施形態では、電極は、炭素電極、すなわち、ガラス状炭素電極であり、付着機構は、アミン基の窒素を介するものである。代表的な構造は、その全体においてであるが、特に、中で記載された構造、および異なるアンカー基の記述、および付随する本文について参照により本明細書に組み込まれている、米国特許出願公開第２００８０２４８５９２号の構造１５に表されている。やはり、追加の原子、すなわち、リンカーおよび／または末端基が存在する場合がある。
上記の通り参照により本明細書に組み込まれている米国特許出願公開第２００８０２４８５９２号の構造１６では、酸素原子は、金属酸化物電極の酸化物に由来する。Ｓｉ原子は、他の原子も含有することができ、すなわち、ケイ素部分含有置換基であり得る。他の電極へのＳＡＭの他の付着機構は、当技術分野で公知である。例えば、インジウムスズ酸化物電極への付着についてＮａｐｉｅｒら、Ｌａｎｇｍｕｉｒ、１９９７、およびまたインジウムスズ酸化物電極へのリン酸の化学吸着（Ｈ．Ｈｏｌｄｅｎ Ｔｈｏｒｐｅ、ＣＨＩ ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ、１９９８年５月４〜５日による講演）を参照。
好適な一実施形態では、インジウム−スズ−酸化物（ＩＴＯ）が電極として使用され、アンカー基は、ホスホネート含有種である。
１）．硫黄アンカー基
単一部分として構造１で表されているが、導電性オリゴマーは、１つを超える「Ａ」部分で電極に付着される場合があり、「Ａ」部分は、同じであっても異なっていてもよい。したがって、例えば、電極が金電極である場合、「Ａ」は、硫黄原子または部分であり、構造２、３、および４に以下で一般に表されているものなど、複数の硫黄原子を使用して電極に導電性オリゴマーを付着させることができる。当業者が理解することになるように、他のこのような構造を作製することができる。構造２、３、および４では、Ａ部分は、単に硫黄原子であるが、置換硫黄部分も使用することができる。
したがって、例えば、電極が金電極である場合、「Ａ」は、構造６に以下で一般に表されているものなどの硫黄原子または部分であり、構造２、３、および４に以下で一般に表されているものなど、複数の硫黄原子を使用して電極に導電性オリゴマーを付着させることができる。当業者が理解することになるように、他のこのような構造を作製することができる。構造２、３、および４では、Ａ部分は、単に硫黄原子であるが、置換硫黄部分も使用することができる。
Figure 2014530367
構造４と同様に、電極に付着した３つの硫黄部分を含む単一炭素原子で終端する導電性オリゴマーを有することが可能であり得ることにも留意されるべきである。
別の態様では、本発明は、共役チオールを含むアンカーを提供する。共役チオールアンカーを有するいくつかの例示的な錯体を示す。いくつかの実施形態では、アンカーは、アルキルチオール基を含む。２つの化合物は、それぞれカルベンおよび４−ピリジルアラニンに基づく。
別の態様では、本発明は、金電極などの電極上で分析物を検出するための電気活性部分の構築においてアンカー基として機能を果たす共役多脚チオ含有化合物を提供する。すなわち、スペーサー基（これらは、ＥＡＭ、ＲｅＡＭＣ、または「空の」単分子層形成種に付着され得る）は、２個以上の硫黄原子を使用して付着される。これらの多脚アンカー基は、本明細書に記載するように、線状または環式とすることができる。
いくつかの実施形態では、アンカー基は、金表面に付着する２個の硫黄原子を含有し、線状の「二脚」であるが、いくつかの場合では、他の多脚性（multipodality）（例えば、「三脚」）を有する系も含むことが可能であり得る。このような多脚アンカー基は、安定性の増大を示し、かつ／または立体的に要求の厳しい頭部基を有するチオール含有アンカーからＳＡＭを調製するためのより大きいフットプリントを可能にする。
いくつかの実施形態では、アンカーは、環状ジスルフィド（「二脚」）を含む。しかしいくつかの場合では、他の多脚性（例えば、「三脚」）を有する環系アンカー基を含むことが可能であり得る。環の原子の数は、例えば、５〜１０に変化する場合があり、また、以下に論じるように、多環アンカー基を含む。
いくつかの実施形態では、アンカー基は、以下に示すように、頂点窒素原子および分子内ジスルフィド結合を有する７員環である［１，２，５］−ジチアゼパン単位を含む。
Figure 2014530367
構造（ＩＩＩａ）において、環の炭素原子は、さらに置換され得ることにも留意されるべきである。当業者が理解することになるように、他員環も含められる。さらに、多環環状構造体を使用することができ、これは、他の環状アルカン（環状ヘテロアルカンを含む）または芳香族環構造体で置換された、上記に示した［１，２，５］−ジチアゼパンなどの環状ヘテロアルカンを含むことができる。
いくつかの実施形態では、アンカー基、およびスペーサーの一部は、以下に示す構造を有する。
Figure 2014530367
本明細書で「Ｒ」基は、ＥＡＭの遷移金属成分の末端の配位する配位子を有する共役オリゴフェニルエチニレン単位を含めた、任意の置換基とすることができる。
アンカーは、参照により本明細書に組み込まれているＬｉら、Ｏｒｇ．Ｌｅｔｔ．４：３６３１〜３６３４頁（２００２）に記載されている、二脚中間体（Ｉ）（Ｒ＝Ｉである式ＩＩＩの化合物）から合成される。参照により本明細書に組み込まれている、Ｗｅｉら、Ｊ．Ｏｒｇ，Ｃｈｅｍ．６９：１４６１〜１４６９頁（２００４）も参照。
硫黄原子の数は、本明細書に概説したように変化し得、特定の実施形態では、スペーサー１つ当たり１個、２個、および３個を利用する。
当業者が理解することになるように、本発明の構成物は、以下、および２００８年１０月１７日に出願された米国特許出願第１２／２５３，８２８号；２００８年１０月１７日に出願された米国特許出願第１２／２５３，８７５号；２０１０年５月７日に出願された米国仮特許出願第６１／３３２，５６５号；２０１０年５月２１日に出願された米国仮特許出願第６１／３４７，１２１号；２０１０年７月２０日に出願された米国仮特許出願第６１／３６６，０１３号に概説されたものを含めて、様々方法で作製することができる。いくつかの実施形態では、構成物は、すべてがあらゆる目的でその全体が本明細書に組み込まれている、米国特許第６，０１３，４５９号、同第６，２４８，２２９号、同第７，０１８，５２３号、同第７，２６７，９３９号、米国特許出願第０９／０９６５９３号、および同第６０／９８０，７３３号、および２００８年８月７日に出願された米国仮出願第６１／０８７，１０２号に開示された方法に従って作製される。
用途
本発明のシステムは、本明細書に概説されるように様々な標的分析物の検出に用途を見出す。いくつかの実施形態では、図１１〜１３に概略的に表されているように、「サンドイッチ」タイプアッセイが使用される。他の実施形態では、例えば、ＡＴＰおよびＮＡＤＨなどの特定の代謝産物を検出するために、他のフォーマットが使用される。
いくつかの実施形態では、例えば、「サンドイッチ」タイプフォーマットにおいて、検査試料内に含有される標的分析物が、ＰＳＭ−ＳＩＭ−ＥＡＭ混合物、捕捉結合リガンド、および任意選択によりＳＡＭを含む電極に添加される。この添加の後に任意選択の洗浄ステップおよび可溶性結合リガンドの添加が続くが、当業者が理解することになるように、これらの添加は同時に行うことができ、またはチップに添加する前に、溶液結合リガンドを、標的分析物を含有する試料に添加することができる。表面は、再び任意選択により洗浄され、過酸化物感受性部分、例えば、グルコースの基質が、存在する場合、過酸化物が生成され、ＳＩＭが切断される条件下で添加される。
いくつかの実施形態では、例えば、図１２および図１３に表したように、対象とする代謝産物（例えば、標的分析物または標的代謝産物）を使用する特定のペルオキシダーゼ生成酵素が存在する場合、システムは、異なる配置をとる。例えば、図１２において、電極は、一般にＳＡＭを含み、少なくとも２つの化学種、すなわち、（１）フェロセン系誘導体として図１２に表した自壊的部分を有するＥＡＭ（しかし、本明細書に記載するように、かつ当業者が理解することになるように、他のＥＡＭも使用することができる）、および（２）この場合、ＮＡＤＨオキシダーゼとして表した付着したペルオキシダーゼ生成酵素を含有する。本明細書に概説するように、ペルオキシダーゼ生成酵素は、いくつかの異なる方法で電極表面に付着させることができる。付着機構は、ＰＣＴ／ＵＳ２００８／０８０３７９に概ね概説されているように酵素が単分子層形成種の末端に付着される場合、連結化学反応を使用して、「直接的」とすることができる。あるいは、および図１２に表したように、酵素は、いくつかの「サンドイッチ」タイプ付着を使用して、例えば、ビオチンが付着した単分子層種、ストレプトアビジン、およびビオチン標識酵素を使用して付着させることができる。
いくつかの実施形態では、これらの２つの化学種は、その全体において、かつ具体的には付着構成の概略図について参照により本明細書に組み込まれている７，５９５，１５３の構造７に一般に表されているように、電極表面に単一部分として付着させることができる。
いくつかの実施形態では、対象とする代謝産物または他の標的分析物は、代謝産物または標的分析物が存在する結果として起こる酵素イベントなどのイベントに基づいて検出することができる。例えば、ＡＴＰをいくつかの方法で検出することができる。一実施形態では、ＡＴＰの存在を利用する酵素イベントが何らかの「スイッチ」をもたらし、次いでそれが検出を可能にする。
ＡＴＰは、生体における多くの生物学的プロセスのエネルギー源として機能を果たす多官能性ヌクレオチドである。したがって、ＡＴＰを検出するためのストラテジーは、臨床診断、微生物学、環境分析、および食品の品質管理の分野における研究者にとって中心的な関心の的となっている。これまで、比色的、蛍光定量的、または電気化学的検出法に基づく多数のＡＴＰセンサーが登場している。特に、ＡＴＰ依存酵素反応（すなわち、ホタルルシフェラーゼ、Ｋａｄｉｄａｔｅら、Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．２００６、７８：３３７〜３４２頁、およびＤＮＡリガーゼ、Ｗａｎｇら、Ｂｉｏｓｅｎｓ．Ｂｉｏｅｌｅｃｔｒｏｎ．２０１０、２５：２１０１〜２１０６頁によって触媒されるもの、これらの文献の両方は、その全体が参照により明白に組み込まれている）を使用して出力信号を生成するセンサーは、これらの固有の感度および特異性に起因して魅力的である。一実施形態では、ＡＴＰは、ＳＡＭ修飾金電極においてＥ．Ｃｏｌｉビオチンリガーゼ（ＢｉｒＡ）によって触媒されるＡＴＰ依存ビオチン化反応を活用することによって、電気化学的に検出される。別の実施形態では、ＡＴＰは、ＳＡＭ修飾金電極とのＡＴＰ依存酵素反応を活用することによって電気化学的に検出される。
ビオチンでのタンパク質の翻訳後修飾を触媒する酵素のクラスの中で、ＢｉｒＡは、天然タンパク質基質のものと同様の動態で、１５−アミノ酸アクセプターペプチド（ＡＰ）配列（ＧＬＮＤＩＦＥＡＱＫＩＥＷＨＥ）中のリシンを部位特異的にビオチニル化することが示されている（その全体が本明細書に明白に組み込まれている、Ｂｅｃｋｅｔｔら、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉ．１９９９ ８：９２１〜９２９頁を参照）。この酵素によるビオチン化反応は、２ステップを介して進行する：
１．）ビオチン＋ＡＴＰ→ビオチニル−５’−ＡＭＰ＋ＰＰｉ
２．）ビオチニル−５’−ＡＭＰ＋ＡＰ→ビオチン−ＡＰ＋ＡＭＰ
最初に、ＢｉｒＡは、ビオチンおよびＡＴＰからのビオチニル−５’−ＡＭＰの形成を触媒する。引き続いて、ドッキングしたペプチド／タンパク質基質上の標的リシン残基が、この活性化ビオチン中間体に対する求核攻撃によってビオチン化される（その全体が参照により本明細書に明白に組み込まれているＣｒｏｎａｎ、Ｃｅｌｌ、１９８９、５８：４２７〜４２９頁）。例えば、図１２に表したように、電極は、ビオチンリガーゼ酵素の基質として機能を果たす付着したアクセプターペプチド（ＡＰ）、および自壊的部分を有するＥＡＭで形成される。ＡＴＰを含有する試料がビオチン化酵素およびビオチンの存在下で電極に添加され、その結果、ＡＴＰの存在下で、ビオチンが表面に付加される。次いで、ストレプトアビジン−オキシダーゼ酵素コンジュゲートが添加され、非結合基質が任意選択により洗い流された後、次いでグルコースが添加され、その結果、過酸化物生成酵素が自壊的リンカーを破壊し、フェロセン部分のレドックス電位（Ｅ０）を変化させる。
これらの条件は、一般に生理的条件である。一般に、複数のアッセイ混合物が異なる濃度で並行して実行されて、様々な濃度に対する反応差が得られる。一般に、これらの濃度の１つは、陰性対照、すなわち、ゼロ濃度または検出レベル未満のものとして機能を果たす。さらに、任意の様々な他の試薬をスクリーニングアッセイに含めることができる。これらには、最適な結合を促進し、かつ／または非特異的もしくはバックグラウンド相互作用を低減するのに使用され得る塩のような試薬、中性タンパク質、例えば、アルブミン、界面活性剤などが含まれる。アッセイの効率を他の方法で改善する試薬、例えば、プロテアーゼ阻害剤、ヌクレアーゼ阻害剤、抗微生物剤なども使用することができる。成分の混合物を、要求される結合をもたらす任意の順序で添加することができる。
ペルオキシダーゼが生成すると、錯体のＰＧＭ−ＳＩＭ成分が喪失し、ＥＡＭのＥ０が変化する。いくつかの実施形態では、ＥＡＭのＥ０は、約２０ｍＶ、３０ｍＶ、４０ｍＶ、５０ｍＶ、７５ｍＶ、８０ｍＶ、９０ｍＶ〜１００ｍＶ変化し、２００、３００、または５００ｍＶの変化をもたらすいくつかの実施形態が実現される。いくつかの実施形態では、ＥＡＭのＥ０の変化は減少である。いくつかの実施形態では、ＥＡＭのＥ０の変化は増大である。
溶媒再配置エネルギーの判定は、当業者が理解するように行われる。簡単に言えば、マーカス理論に概説されているように、電子移動速度（ｋＥＴ）がいくつかの異なる原動力（または自由エネルギー、ΔＧ°）で求められ、速度が自由エネルギーと等しくなる点がλである。これは、溶媒再配置エネルギーと等価であるほとんどの場合で扱うことができる。参照により本明細書に組み込まれている、Ｇｒａｙら、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６５：５３７頁（１９９６）を参照。
標的分析物の存在を示す溶媒阻害レドックス活性分子は、電子移動を開始し、溶媒阻害レドックス活性分子と電極との間の電子移動に特徴的な信号を検出することによって検出される。
電子移動は一般に、電子的に開始され、電圧が好適である。電位が、修飾核酸プローブを含有する試料に印加される。印加電位の正確な制御およびバリエーションは、ポテンシオスタット、ならびに３電極システム（１つの参照電極、１つの試料電極、および１つの対電極）または２電極システム（１つの試料電極および１つの対電極）を介してのものとすることができる。これにより、レドックス活性分子の選択に部分的に依存し、使用される導電性オリゴマーに部分的に依存するシステムのピーク電子移動電位に印加電位をマッチングさせることが可能になる。
好ましくは、開始および検出は、アクセス可能な溶媒および溶媒阻害レドックス活性分子の溶媒再配置エネルギー間の相対的差異を最大にするように選ばれる。
検出
レドックス活性分子と電極との間の電子移動は、様々な方法で検出することができ、それだけに限らないが、アンペロメトリー、ボルタンメトリー、電気容量、およびインピーダンスを含めた電子検出が好適である。これらの方法としては、ＡＣまたはＤＣ電流に基づく時間または周波数依存法、パルス法、ロックイン技法、およびフィルタリング（高域通過、低域通過、帯域通過）がある。いくつかの実施形態では、必要なことは、電子移動の検出であり、他の実施形態では、電子移動速度を求めることができる。
いくつかの実施形態では、アンペロメトリー、ボルタンメトリー、電気容量、およびインピーダンスを含めた電子検出が使用される。適当な技法としては、それだけに限らないが、電解重量法；クーロメトリー（定電位クーロメトリーおよび定電流クーロメトリーを含む）；ボルタンメトリー（サイクリックボルタンメトリー、パルスボルタンメトリー（ノーマルパルスボルタンメトリー、矩形波ボルタンメトリー、微分パルスボルタンメトリー、オスターヤング矩形波ボルタンメトリー、および定電量パルス技法）；ストリッピング分析（陽極ストリッピング分析、陰極ストリッピング分析、矩形波ストリッピングボルタンメトリー）；コンダクタンス測定（電解コンダクタンス、直接分析）；時間依存電気化学分析（クロノアンペロメトリー、クロノポテンシオメトリー、サイクリッククロノポテンシオメトリーおよびアンペロメトリー、ＡＣポログラフィー（polography）、クロノ電流測定、およびクロノクーロメトリー）；ＡＣインピーダンス測定；電気容量測定；ＡＣボルタンメトリー、ならびに光電気化学がある。
いくつかの実施形態では、電子移動の監視は、アンペロメトリー検出を介するものである。この方法の検出では、検査試料中で、本発明の構成物を含有する電極と補助（対）電極との間に電位（別個の参照電極と比較して）を印加する。異なる効率の電子移動が、標的分析物の存在または非存在下の試料中で誘導される。
アンペロメトリー的に電子移動を測定するためのデバイスは、高感度電流検出を伴い、電圧電位を制御する手段、通常ポテンシオスタットを含む。この電圧は、レドックス活性分子の電位を参照して最適化される。
いくつかの実施形態では、代替の電子検出モードが利用される。例えば、電位差（またはボルタンメトリー）測定は、非ファラデー（正味の電流がまったく流れない）プロセスを伴い、ｐＨ検出器および他のイオン検出器で伝統的に利用される。同様のセンサーがレドックス活性分子と電極との間の電子移動を監視するのに使用される。さらに、絶縁体の他の特性（抵抗など）および導体の他の特性（伝導率、インピーダンス、および電気容量など）を使用して、レドックス活性分子と電極との間の電子移動を監視することができる。最後に、電流（電子移動など）を生成する任意のシステムは、小磁場も生成し、いくつかの実施形態では、それを監視することができる。
いくつかの実施形態では、標的を添加する前に有機溶媒中でシステムを運転することによって、システムを較正して電極上の溶媒アクセス可能レドックス活性分子の量を求めることができる。これは、センサーまたはシステムの内部対照として機能を果たすのにかなり重要である。これにより、同様の、しかし異なる対照システムを利用するのではなく、検出に使用される同じ分子で、標的を添加する前の予備測定が可能になる。したがって、検出に使用される実際の分子は、任意の実験の前に定量化することができる。水の非存在下、すなわち、アセトニトリルなどの有機溶媒中でシステムを運転すると、水が除外され、任意の溶媒再配置効果が実質的に無効になる。これにより、電極表面上にある分子の実際数を定量化することが可能になる。次いで、試料を添加することができ、出力信号を求めることができ、結合／非結合分子の比を求めることができる。これは、従前の方法に対する有意な利点である。
本発明の構成物中で観察される高速の電子移動の一利点は、時間分解能により、電子電流に基づくモニターの信号対雑音結果が大いに増強され得ることであることが理解されるべきである。本発明の高速の電子移動は、電子移動開始と完了との間の高い信号および定型的遅延の両方をもたらす。電子移動のパルス開始および検出の「ロックイン」増幅器を使用するなどにより特定の遅延信号を増幅することによって、信号対雑音の数桁の改善を実現することができる。
いくつかの実施形態では、電子移動は、直流（ＤＣ）技法を使用して開始および検出される。上述したように、レドックス活性分子のＥ０は、標的分析物が結合した際の溶媒再配置エネルギーの変化の結果としてシフトし得る。したがって、溶媒アクセス可能レドックス活性分子のＥ０で行われる測定および溶媒阻害分子のＥ０で行われる測定により、分析物の検出が可能になる。当業者が理解することになるように、いくつかの適当な方法を、電子移動を検出するのに使用することができる。
いくつかの実施形態では、電子移動は、交流電流（ＡＣ）法を使用して開始される。第１の入力電気信号が、好ましくは、少なくとも試料電極（本発明の錯体を含有する）および対電極を介してシステムに印加されて、電極と第２の電子伝達部分との間で電子移動が開始される。電圧が参照電極及び作用電極に印加される３電極システムも使用することができる。この実施形態では、第１の入力信号は、少なくとも１つのＡＣ成分を含む。ＡＣ成分は、可変振幅および周波数のものであり得る。一般に、本方法で使用するために、ＡＣ振幅は、約１ｍＶ〜約１．１Ｖの範囲であり、約１０ｍＶ〜約８００ｍＶが好適であり、約１０ｍＶ〜約５００ｍＶが特に好適である。ＡＣ周波数は、約０．０１Ｈｚ〜約１０ＭＨｚの範囲であり、約１Ｈｚ〜約１ＭＨｚが好適であり、約１Ｈｚ〜約１００ｋＨｚが特に好適である。
いくつかの実施形態では、第１の入力信号は、ＤＣ成分およびＡＣ成分を含む。すなわち、試料電極と対電極との間のＤＣオフセット電圧が、第２の電子伝達部分の電気化学電位によって掃引される。掃引は、システムの最大応答が見られるＤＣ電圧を識別するのに使用される。これは一般に、レドックス活性分子の電気化学電位またはほぼ電気化学電位である。この電圧が求まると、掃引ＤＣオフセット電圧または１つもしくは複数の均一なＤＣオフセット電圧を使用することができる。約１Ｖ〜約＋１．１ＶのＤＣオフセット電圧が好適であり、約５００ｍＶ〜約＋８００ｍＶが特に好適であり、約３００ｍＶ〜約５００ｍＶがとりわけ好適である。ＤＣオフセット電圧の上で、可変振幅および周波数のＡＣ信号成分が印加される。レドックス活性分子がＡＣ摂動に応答するのに十分低い溶媒再配置エネルギーを有する場合、電極とレドックス活性分子との間の電子移動に起因してＡＣ電流が生成される。
いくつかの実施形態では、ＡＣ振幅は変更される。理論によって束縛されることなく、振幅が増大すると、原動力が増大すると思われる。したがって、振幅がより高いと、過電位がより高くなり、電子移動の速度がより速くなる。したがって、一般に、同じシステムにより、任意の単一周波数で、その周波数でより高い過電位を使用することによって、応答の改善（すなわち、より高い出力信号）が得られる。したがって、振幅を高い周波数で増大させて、システムを通る電子移動の速度を増大させ、より大きい感度をもたらすことができる。さらに、上述したように、電子移動の速度に基づいて溶媒アクセス可能レドックス活性分子と溶媒阻害レドックス活性分子とを区別することが可能になり得、それは次に、周波数または過電位に基づいて２つを区別するのに使用することができる。
いくつかの実施形態では、システムの測定は、少なくとも２つの別々の振幅または過電位で行われ、複数の振幅での測定が好適である。上述したように、振幅変化の結果としての応答変化は、システムの同定、較正、および定量化の基盤を形成することができる。
いくつかの実施形態では、ＡＣ周波数が変更される。異なる周波数で、異なる分子は、異なる様式で応答する。当業者が理解することになるように、周波数を上げると一般に、出力電流が増大する。しかし、周波数が、電子が電極とレドックス活性分子との間を移動することができる速度より大きい場合、周波数がより高いと、出力信号が喪失または減少する。ある時点で、周波数は、溶媒阻害レドックス活性分子さえも通る電子移動の速度より大きくなり、次いで出力信号も低下する。
さらに、ＡＣ技法を使用すると、共有結合的に付着されている核酸以外の実体に起因する任意の単一周波数におけるバックグラウンド信号を有意に低減すること、すなわち、望まれない信号を「ロックアウトする」または「フィルタリングする」ことが可能になる。すなわち、溶液中の電荷担体またはレドックス活性分子の周波数応答は、その拡散係数によって制限される。したがって、高い周波数で、電荷担体は、電極にその電荷を移動させるように十分急速に拡散しない場合があり、かつ／または電荷移動動態は、十分速くない場合がある。このことは、保護層単分子層を利用しない、または部分的もしくは不十分な単分子層を有する、すなわち、溶媒が電極にアクセス可能である実施形態においてとりわけ重要である。上記に概説したように、ＤＣ技法では、電極が溶媒にアクセス可能である「ホール」が存在すると、システムを「短絡する」溶媒電荷担体がもたらされ得る。しかし、本ＡＣ技法を使用して、単分子層が存在しても、存在しなくても、溶液中の１つまたは複数の電荷担体の周波数応答を防止する１つまたは複数の周波数を選ぶことができる。血液などの多くの生体液は、アンペロメトリー検出法を妨害し得るかなりの量のレドックス活性分子を含有するので、このことはとりわけ重要である。
いくつかの実施形態では、システムの測定は、少なくとも２つの別々の周波数で行われ、複数の周波数での測定が好適である。複数の周波数は、スキャンを含む。好適な実施形態では、周波数応答は、少なくとも２、好ましくは少なくとも約５、より好ましくは少なくとも約１０の周波数で求められる。
信号処理
入力信号を送信して電子移動を開始した後、出力信号が受信または検出される。出力信号の存在および規模は、入力信号の過電位／振幅；入力ＡＣ信号の周波数；電子伝達部分同士間の介在媒体の組成、すなわちインピーダンス；ＤＣオフセット；システムの環境；および溶媒に依存することになる。所与の入力信号において、出力信号の存在および規模は、金属イオンの酸化状態の変化を生じさせるのに要求される溶媒再配置エネルギーに一般に依存することになる。したがって、ＡＣ成分およびＤＣオフセットを含む入力信号を送信すると、電子は、電極とレドックス活性分子との間で移動され、溶媒再配置エネルギーが十分低いとき、周波数は範囲内であり、振幅は十分であり、出力信号をもたらす。
いくつかの実施形態では、出力信号は、ＡＣ電流を含む。上記に概説したように、出力電流の規模は、いくつかのパラメータに依存することになる。これらのパラメータを変更することによって、システムをいくつかの方法で最適化することができる。
一般に、本発明において生成されるＡＣ電流は、約１フェムトアンペア〜約１ミリアンペアの範囲であり、約５０フェムトアンペア〜約１００マイクロアンペアの電流が好適であり、約１ピコアンペア〜約１マイクロアンペアが特に好適である。
グリコール化タンパク質（glycolated protein）の分率は、第１のＥ０および第２のＥ０（例えば、Ｅｏ １およびＥｏ ２）におけるＥＡＭの電気化学特性から求めることができる。
一般的な例では、糖化タンパク質の分率を求めることは、以下の通りとすることができる：Ａ１Ｃ％の電気化学的測定値を、サイクリックボルタモグラムからＥｏ １およびＥｏ ２におけるファラデー電流を定量化することによって求める。ボルタモグラムで各ピークが始まる電位から各ピークが終わる電位まで直線ベースラインを外挿する。その電位（電圧）におけるベースライン電流値を引いた最大電流値として、ＥＡＭの還元ピークについてファラデー電流を測定する。その電位においてベースライン電流を加えた最小電流値を測ることによって、ＥＡＭの酸化ピークについてファラデー電流を測定する。ファラデー電流の比（Ｅｏ ２／Ｅｏ １）は、潜在的な電子信号としてボルタモグラムの酸化波または還元波から計算することができる。このプロセスに導入されるＡ１Ｃ％の既知のキャリブレーターは、較正曲線をもたらす特定のピーク比を生成する。次いで未知の試料を検査し、上述したピーク比によって測定されるように生成される生体電子信号を、上述の較正曲線を使用してフィッティングしてＡ１Ｃ％を確認する。
一実施形態では、Ａ１Ｃ％の電気化学的測定値は、サイクリックボルタモグラムからＥｏ １およびＥｏ ２においてファラデー電流を定量化することによって求められる。レドックスピークは、ピークを同定し、ピークを画定する数学関数を求めるウェーブレット変換を使用することによって検出される。この関数の導関数のゼロ交差により、ピークの始まりと終わりが画定される。直線ベースラインは、ピークの始点および終点に基づいて画定される。その電位（電圧）における計算ベースライン電流値を引いた最大電流値として、ＥＡＭの還元ピークについてのファラデー電流が測定される。その電位において計算ベースライン電流を加えた最小電流値を測ることによって、ＥＡＭの酸化ピークについてのファラデー電流が測定される。ファラデー電流の比（Ｅｏ ２／Ｅｏ １）は、Ａ１Ｃ％の測定値としてボルタモグラムの酸化波または還元波から計算することができる。
装置
本発明は、ＡＣ検出法を使用して分析物を検出するための装置をさらに提供する。装置は、少なくとも第１の測定電極または試料電極、および第２の測定電極または対電極を有するテストチャンバーを含む。３電極システムも有用である。第１のおよび第２の測定電極は、検査試料受容領域と接触しており、その結果、液体検査試料の存在下で、２つの電極は、電気的接触していることができる。
さらに別の実施形態では、第１の測定電極は、本明細書に記載されたものなどの、スペーサーを介し、かつ好ましくは導電性オリゴマーを介して共有結合的に付着されたレドックス活性複合体を備える。あるいは、第１の測定電極は、共有結合的に付着されたレドックス活性分子および結合リガンドを備える。
装置は、テストチャンバーに、すなわち測定電極に電気的に接続された電圧源をさらに備える。好ましくは、電圧源は、必要な場合、ＡＣ電圧およびＤＣ電圧を供給することができる。
一実施形態では、装置は、入力信号と出力信号を比較することができるプロセッサをさらに備える。プロセッサは、電極にカップリングされ、出力信号を受信するように構成されており、こうして標的分析物の存在を検出する。
［実施例１］
一般的な方法および材料。別段の注記のない限り、すべての合成操作は、標準的なシュレンク技法を使用して、乾燥アルゴン雰囲気下で実施した。反応媒体については、Ｇｌａｓｓ Ｃｏｎｔｏｕｒｓ（Ｌａｇｕｎａ Ｂｅａｃｈ、ＣＡ）から取得したＤｏｗ−Ｇｒｕｂｂｓ溶媒系１を介して中性アルミナ上で溶媒を乾燥させた。これらの溶媒は、使用前にアルゴンで脱酸素化した。反応は、ＥＭＤプレコートアルミニウム板（シリカゲル６０、Ｆ２５４、ＥＭＤ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．、Ｇｉｂｂｓｔｏｗｎ、ＮＪ）を使用して、ＴＬＣによって監視した。以下の方法、すなわち、ヨウ素蒸気、ＵＶ光への曝露、またはリンモリブデン酸を用いた染色とその後の加熱のうちの１つによってスポットを可視化した。フラッシュクロマトグラフィーは、実験室空気の陽圧下でシリカ（シリカゲル６０、粒径：４０〜６３μｍ；Ｓｏｒｂｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ａｔｌａｎｔａ、ＧＡ）上で実施した。１Ｈ ＮＭＲおよびプロトンデカップルド１３Ｃ ＮＭＲスペクトルは、Ｂｒｕｋｅｒ Ａｖａｎｃｅ ＩＩＩ分光計（１Ｈについて４９９．３７ＭＨｚ、１３Ｃについて１２５．５８ＭＨｚ）で記録し、Ｂｒｕｋｅｒ ＴＯＰＳＰＩＮ ２．１ソフトウェアを用いて処理した。高分解能質量分析（ＨＲＭＳ）は、エレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）法または大気圧光イオン化（ＡＰＰＩ）法を使用して、Ａｇｉｌｅｎｔ ６２１０飛行時間型（ＴＯＦ）ＬＣ／ＭＳ計測器を使用して得た。
クロロホルム−ｄ１は、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｉｓｏｔｏｐｅ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから購入した。化合物２およびｐ−ピナコールボレートベンジルアルコールは、以前に記載されたように合成した（ともに参照により明白に組み込まれている、Ｂｅｒｔｉｎ，Ｐ．Ａ．；Ｍｅａｄｅ，Ｔ．Ｊ． Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．２００９、５０、５４０９〜５４１２頁；Ｓｅｌｌａ，Ｅ．；Ｓｈａｂａｔ、Ｄ．Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍｕｎ．２００８、５７０１〜５７０３頁）。すべての他の試薬は、商業的供給元から購入し、別段の注記のない限り、さらに精製することなく使用した。
化合物３。化合物２（０．５００ｇ、１．２ｍｍｏｌ）およびトリエチルアミン（０．２５ｍＬ、１．８ｍｍｏｌ）のテトラヒドロフラン（１５ｍＬ）溶液に、ジフェニルホスホリルアジド（ＤＰＰＡ）（０．２８５ｍＬ、１．３２ｍｍｏｌ）を添加した。反応物を室温で１．５時間撹拌し、減圧下で濃縮した。粗残留物を、カラムクロマトグラフィー（メタノール：酢酸エチル：ジクロロメタン０．５：１．５：８）によって精製して、赤色／橙色固体として表題化合物を得た（０．４６０ｇ、１．０４ｍｍｏｌ、８７％）。１Ｈ ＮＭＲ、１３Ｃ｛１Ｈ｝ＮＭＲ、およびＨＲＭＳは、表題化合物と一致した。
化合物４。化合物３（０．４６０ｇ、１．０４ｍｍｏｌ）のトルエン（２０ｍＬ）溶液を、Ａｒで活発に脱気し、１００℃に１．５時間加熱し、ｐ−ピナコールボレートベンジルアルコール（０．２６８ｇ、１．１４ｍｍｏｌ）およびジブチルスズ−ジラウレート（ＤＢＴＬ）（０．０１８ｍＬ、０．０３ｍｍｏｌ）を添加し、反応物を１００℃でさらに２時間維持した。反応物を減圧下で濃縮し、粗残留物をカラムクロマトグラフィー（ジエチルエーテル：酢酸エチル：ジクロロメタン、１：２：２）によって精製して、淡橙色固体として表題化合物を得た（０．４８０ｇ、０．７４１ｍｍｏｌ、７１％）。１Ｈ ＮＭＲ、１３Ｃ｛１Ｈ｝ＮＭＲ、およびＨＲＭＳは、表題化合物と一致した。
化合物５。化合物４（０．１３５ｇ、０．２０９ｍｍｏｌ）のジクロロメタン（５ｍＬ）溶液を、氷浴中で冷却した。トリフルオロ酢酸：ジクロロメタン（１：１ ｖ／ｖ、５ｍＬ）を５分にわたって滴下した。１５分後、氷浴を取り除き、反応物を室温に加温した。４５分後、揮発分を真空で除去して、褐色／橙色固体として表題化合物のトリフルオロアセテート塩を得た（定量的）。１Ｈ ＮＭＲ、１３Ｃ｛１Ｈ｝ＮＭＲ、およびＨＲＭＳは、表題化合物と一致した。
化合物１。１１−メルカプトウンデカン酸（０．０４５ｇ、０．２０６ｍｍｏｌ）およびＨＡＴＵ（０．０７８ｇ、０．２０６ｍｍｏｌ）のジクロロメタン：Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（１：１ ｖ／ｖ、５ｍＬ）溶液に、化合物５（０．１０５ｇ、０．１５９ｍｍｏｌ）およびジイソプロピルエチルアミン（０．０８３ｍＬ、０．４７７ｍｍｏｌ）を添加した。反応物を室温で２時間撹拌した。反応混合物を酢酸エチル（１５０ｍＬ）中に希釈し、ブライン（３×５０ｍＬ）で洗浄した。有機相をＮａ２ＳＯ４で乾燥し、濾過し、濃縮して粗残留物にし、これを、カラムクロマトグラフィー（メタノール：酢酸エチル：ジクロロメタン、０．５：１．５：８）によって精製して、黄色固体として表題化合物を得た（０．０３５ｇ、０．０４７ｍｍｏｌ、３０％）。１Ｈ ＮＭＲ、１３Ｃ｛１Ｈ｝ＮＭＲ、およびＨＲＭＳは、表題化合物と一致した。
電気化学。サイクリックボルタンメトリーは、作用電極としてのＳＡＭ修飾金、Ａｇ／ＡｇＣｌワイヤー参照電極、および白金ワイヤー対電極の３電極システム（Ｂｉｏａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して、０．１５Ｍのｎ−Ｂｕ４ＮＣｌＯ４支持電解質（０．５ｍＬ）を含むＴＨＦ中で、ＣＨＩモデル６６０Ａ電気化学アナライザー（ＣＨＩ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ Ｉｎｃ．）を用いて実施した。モデル化合物（緑色）は、過酸化水素で化合物４を処理することによって調製した。結果を図３に示す。
［実施例２］
Ｈ２Ｏ２を直接添加した結果としての２つのユニークな電位Ｅｏ １およびＥｏ ２における定量可能な電気化学的信号の測定
Ｈ２Ｏ２を直接添加した結果としての２つのユニークな電位Ｅｏ １およびＥｏ ２における定量可能な電気化学的信号の測定：Ｃ６希釈剤で希釈したＰＢ２５＿４９に対するＨ２Ｏ２試験；Ｎａ２ＣＯ３緩衝液（ｐＨ１０．１）中での５分および１０分のインキュベーション
Ａ．目的
本試験の目的は、ｐＨ１０．１で洗浄し、ｐＨ８．５でインキュベートしたＥＡＭ１（ＰＢ２５＿４９）の希釈したＳＡＭに対する５分および１０分のＨ２Ｏ２インキュベーション時間の効果を検査することであった。Ｈ２Ｏ２は、ＥＡＭ上のフェロセンを分解して新しい誘導体にするはずであり、これは新しい電位で現れるはずである。
Ｂ．材料
Figure 2014530367
Figure 2014530367
Ｃ．手順
１日目：
チップの洗浄および組立て
１３（アッセイ用に１２＋内部基準検査用に１）のチップを以下の通り洗浄した。チップをインサート付きガラス広口瓶内に置き、０．２％のＴＷＥＥＮ２０溶液中で５分間超音波処理し、ナノ純水およびエタノールですすぎ、次いでアルゴンで乾燥させた。次いでチップをプラズマクリーナーで１０分間浄化し、エタノールですすぎ、アルゴンで乾燥させた。金属床、ガスケット、およびＰＤＭＳスタンプを、ハンドソープで手洗いし、エタノールですすぎ、空気乾燥させた。金属床の中央上に両面テープでチップを、チップ上にＰＤＭＳスタンプを、ＰＤＭＳスタンプ上にガスケットを配置することによってチップを組み立て、バインダークリップですべてを一緒にクランプした。
実験用原料の調製
ＥＡＭ原料は、以下のものをＥＡＭアリコート中に合わせることによって調製した：
Figure 2014530367
ＳＡＭ溶液の調製
ＳＡＭ溶液は、以下のものを別々のガラスバイアル中に合わせることによって調製した：
Figure 2014530367
ＳＡＭのインキュベーション
チップ１〜１２に、上記で調製したＳＡＭ溶液５００μＬを添加し、その後一晩インキュベートした。すべてのチップを、エタノールを含有するプラスチック容器内に置き、パラフィルムで密閉した（エタノール蒸発およびチップの乾燥を回避するため）。この一式をアルミホイルで覆った。
２日目：
内部基準の測定：
１，１’フェロセンジメタノールの１ｍＭの溶液を、１ＭのＬｉＣｌＯ４溶液中で調製した。１，１’フェロセンジメタノール１．３ｍｇを１ＭのＬｉＣｌＯ４ ５ｍＬと合わせた。１，１’フェロセンジメタノールのＭＷ＝２４６．０９。
１ｍＭの１，１’フェロセンジメタノール溶液５００μＬを清潔なチップに添加した。疑似１参照電極および白金対電極をシステムに加え、ＣＶを記録した。
チップ上の適切なＳＡＭ形成を点検するための初期検査：
一晩インキュベートした後、チップをインキュベーション容器から取り出した。ＳＡＭ堆積溶液をバイアル中に収集し、乾燥させて、この先使用するための再生ＥＡＭを得た。一晩インキュベートした後、チップ１〜１２を、以下に示す以下のステップによって洗浄した：
エタノール ８回
ナノ純水 ４回
検査緩衝液、１ＭのＬｉＣｌＯ４ ２回
１ＭのＬｉＣｌＯ４ ５００μＬをチップ１、３、５、６、７、９、１１、および１２に添加し、次いでチップをスイッチボックス内でプラグ接続した。参照電極および対電極をＥＣシステムに加えた。ＣＨＩ６５０Ｃからの白色ワニ口クリップを参照電極（疑似１）に、緑色クリップを作用電極に、赤色クリップを対電極（前もって炎に当て、ＥｔＯＨおよび水ですすいだ白金ワイヤー）に接続した。
ＣＨＩ６５０Ｃシステムを、すべてのチップを検査するのに使用した。各検査について、６つのファイルを使用した：１００００ｍＶ／秒、１００ｍＶ／秒、１００００ｍＶ／秒の長さ、マルチＣＶ（２０サイクル）、およびＡＣＶ（前方および後方）。
この実験ですべてのチップを検査するのにマルチプレクサーを使用した。
初期検査の後、チップ１〜５および７〜１１を以下の通り洗浄した：
ナノ純水 ８回
１００ｍＭのＮａ２ＣＯ３（ｐＨ１０．１） ２回
チップ６および１２は、以下の通り洗浄した：
ナノ純水 ８回
１００ｍＭのＮａＨＣＯ３（ｐＨ８．５） ２回
異なる濃度の過酸化水素の調製：
異なる濃度のＨ２Ｏ２溶液を、使用直前に１００ｍＭのＮａ２ＣＯ３緩衝液（ｐＨ１０．１）中で作製した。Ｈ２Ｏ２の元の原料は、１Ｍであり、これは、５０％のＨ２Ｏ２ ５７μＬをナノ純水９４３μＬと合わせることによって作製した。この原料を４℃の冷蔵庫内で一晩放置して変旋光させた。それから、希釈液を以下に示す通り作製した：
Figure 2014530367
チップへの異なる濃度のＨ２Ｏ２の添加および検査：
作製した過酸化水素溶液を十分にボルテックスした。それぞれの過酸化水素溶液５００μＬを各チップ（１〜１２）に添加し、溶液を完全に混合した。室温で、４分３０秒、２分３０秒、および０分３０秒経過時に、ピペットの先端で合間に溶液を混合しながら５分間、および７分３０秒、５分００秒、および２分３０秒経過時に、ピペットの先端で合間に溶液を混合しながら１０分間、インキュベーションを実施した。それぞれのＨ２Ｏ２インキュベーションの後、チップを以下の通り洗浄した：
ナノ純水 ８回
１００ｍＭのＮａ２ＣＯ３（ｐＨ１０．１）または１００ｍＭのＮａＨＣＯ３（ｐＨ８．５） ２回
各ウェルを、これらのそれぞれの緩衝液５００μＬとともに５分間インキュベートした。チップを緩衝液とともにインキュベートした後、チップを以下の通り洗浄した：
ナノ純水 ８回
１ＭのＬｉＣｌＯ４ ２回
ステップＶＩのｄ、ｅ、およびｆに示したように、すべてのチップを検査するのにスイッチボックスを使用した。検査した後、チップを洗浄し、エタノールおよび水で浄化し、次いで解体した。
実験の概略
Figure 2014530367
［実施例３］
ＰＢ２５＿４９に対するＨ２Ｏ２試験
Ｃ６希釈剤で希釈したＰＢ２５＿４９に対するＨ２Ｏ２試験；１００μＭのグルコースオキシダーゼ（ＧＯｘ）を用いたＮａＨＣＯ３緩衝液（ｐＨ８．５）中での５分および１０分のインキュベーション
Ａ．目的
本試験の目的は、ｐＨ１０．１で洗浄し、ｐＨ８．５でインキュベートしたＰＢ２５＿４９の希釈したＳＡＭに対する５分および１０分のグルコースインキュベーション時間の効果を検査することであった。グルコースオキシダーゼをこれらのチップに１００μＭで添加してＨ２Ｏ２を生成した。Ｈ２Ｏ２は、ＥＡＭ上のフェロセンを分解して新しい誘導体にするはずであり、これは新しい電位で現れるはずである。
Ｂ． 材料
Figure 2014530367
Figure 2014530367
Ｃ．手順
１日目：
チップの洗浄および組立て
１１（アッセイ用に１０＋内部基準検査用に１）のグリーンチップを以下の通り洗浄した。チップをインサート付きガラス広口瓶内に置き、０．２％のＴＷＥＥＮ２０溶液中で５分間超音波処理し、ナノ純水およびエタノールですすぎ、次いでアルゴンで乾燥させた。次いでチップをプラズマクリーナーで１０分間浄化し、エタノールですすぎ、アルゴンで乾燥させた。金属床、ガスケット、およびＰＤＭＳスタンプを、ハンドソープで手洗いし、エタノールですすぎ、空気乾燥させた。金属床の中央上に両面テープでチップを、チップ上にＰＤＭＳスタンプを、ＰＤＭＳスタンプ上にガスケットを配置することによってチップを組み立て、バインダークリップですべてを一緒にクランプした。
実験用原料の調製
ＥＡＭ原料は、以下のものをＥＡＭアリコート中に合わせることによって調製した：
Figure 2014530367
ＳＡＭ溶液の調製
ＳＡＭ溶液は、以下のものを別々のガラスバイアル中に合わせることによって調製した：
Figure 2014530367
ＳＡＭのインキュベーション
チップ１〜１０に、上記で調製したＳＡＭ溶液５００μＬを添加し、その後一晩インキュベートした。すべてのチップを、エタノールを含有するプラスチック容器内に置き、パラフィルムで密閉した（エタノール蒸発およびチップの乾燥を回避するため）。この一式をアルミホイルで覆った。
２日目：
内部基準の測定：
１，１’フェロセンジメタノールの１ｍＭの溶液を、１ＭのＬｉＣｌＯ４溶液中で調製した。１，１’フェロセンジメタノール１．３ｍｇを１ＭのＬｉＣｌＯ４ ５ｍＬと合わせた。１，１’フェロセンジメタノールの分子量＝２４６．０９。１ｍＭの１，１’フェロセンジメタノール溶液５００μＬを清潔なチップに添加した。疑似１参照電極および白金対電極をシステムに加え、ＣＶを記録した。
チップ上の適切なＳＡＭ形成を点検するための初期検査：
一晩インキュベートした後、チップをインキュベーション容器から取り出した。ＳＡＭ堆積溶液をバイアル中に収集し、乾燥させて、この先使用するための再生ＥＡＭを得た。一晩インキュベートした後、チップ１〜１０を、以下に示す以下のステップによって洗浄した：
エタノール ８回
ナノ純水 ４回
検査緩衝液、１ＭのＬｉＣｌＯ４ ２回
１ＭのＬｉＣｌＯ４ ５００μＬをチップ１、３、５、６、８、および１０に添加し、次いでチップをスイッチボックス内でプラグ接続した。
参照電極および対電極をＥＣシステムに加えた。ＣＨＩ６５０Ｃからの白色ワニ口クリップを参照電極（疑似１）に、緑色クリップを作用電極に、赤色クリップを対電極（前もって炎に当て、ＥｔＯＨおよび水ですすいだ白金ワイヤー）に接続した。
ＣＨＩ６５０Ｃシステムを、すべてのチップを検査するのに使用した。各検査について、６つのファイルを使用した：１００００ｍＶ／秒、１００ｍＶ／秒、１００００ｍＶ／秒の長さ、マルチＣＶ（２０サイクル）、およびＡＣＶ（前方および後方）。
この実験ですべてのチップを検査するのにマルチプレクサーを使用した。初期検査の後、チップ１〜１０を以下の通り洗浄した：
ナノ純水 ８回
１００ｍＭのＮａＨＣＯ３ ２回
異なる濃度のグルコースの調製：
ＧＯｘの１００μＭの原料は、使用直前にＧＯｘ １２．８ｍｇをＮａＨＣＯ３緩衝液８００μＬと合わせることによって作製した。
異なる濃度のグルコース溶液を、使用直前に１００ｍＭのＮａ２ＣＯ３緩衝液（ｐＨ８．５）中で作製した。グルコースの元の原料は、１Ｍであり、これは、グルコース０．９９ｇをナノ純水５ｍＬと合わせることによって作製した。この原料を４℃の冷蔵庫内で一晩放置して変旋光させた。それから、希釈液を以下に示す通り作製した：
Figure 2014530367
チップへの異なる濃度のグルコースの添加および検査：
作製したグルコース溶液を十分にボルテックスし、４５０μＬをそれぞれのチップに添加した。１００μＭのグルコースオキシダーゼ５０μＬを各チップ（１〜１０）に添加し、溶液を完全に混合した。室温で、４分３０秒、２分３０秒、および０分３０秒経過時に、ピペットの先端で合間に溶液を混合しながら５分間、および７分３０秒、５分００秒、および２分３０秒経過時に、ピペットの先端で合間に溶液を混合しながら１０分間、インキュベーションを実施した。
それぞれのグルコースインキュベーションの後、チップを以下の通り洗浄した：
ナノ純水 ８回
Ｎａ２ＣＯ３、ｐＨ１０．１ ２回
各ウェルを、Ｎａ２ＣＯ３、（ｐＨ１０．１）緩衝液５００μＬとともに５分間インキュベートした。チップを緩衝液とともにインキュベートした後、チップを以下の通り洗浄した：
ナノ純水 ８回
１ＭのＬｉＣｌＯ４ ２回
ステップＶＩのｄ、ｅ、およびｆに示したように、すべてのチップを検査するのにスイッチボックスを使用した。検査した後、チップを洗浄し、エタノールおよび水で浄化し、次いで解体した。
実験の概略
Figure 2014530367
［実施例４］
トロポニンを含むチップに対するＰＢ２５＿４９の検査
Ａ．目的
本試験の目的は、トロポニン抗体サンドイッチを創製し、グルコースを添加し、二次抗体ＧＯｘ標識化に起因してＨ２Ｏ２が生成された後の、グリーンチップ上のＥＡＭ ＰＢ２５＿４９の電気化学を求めることであった。
Ｂ．材料
Figure 2014530367
Ｃ．手順
１日目：
ＳＡＭ溶液の調製
以下の実験用原料を、ストック材料を対応する溶媒および添加剤と合わせることによって調製した。ＥＡＭ：ＥｔＯＨ ５００μＬを添加し；ビス（１１−ヒドロキシウンデシル）ジスルフィド（ＨＯ−Ｃ１１−Ｓ）２の１ｍｇ／ｍＬの原料を予め作製し、ジウンデシルジスルフィド、（Ｃ１１−Ｓ）２の１ｍｇ／ｍＬの原料を予め作製し；ＨＳ−Ｃ１６−ＣＯＯＨのアリコート０．５ｍｇに５００μＬを添加した、１つの０．５ｍｇのＰＢ２５＿４９のアリコート。
ＳＡＭ溶液は、２０ｍＬのガラスバイアル内で以下のものを合わせることによって調製した：ＰＢ２５＿４９の０．１ｍＭの最終濃度用の１．３４ｍＭのＥＳ（推定原料濃度）４１１μＬ；（ＯＨ−Ｃ１１−Ｓ）２の０．５ｍＭの最終濃度用の２．４６ｍＭのＥＳ １．１１８ｍＬ；（Ｃ１１−Ｓ）２の０．５ｍＭの最終濃度用の２．６７ｍＭの１．０３０ｍＬ：ＨＳ−Ｃ１６−ＣＯＯＨの０．００１ｍＭの最終濃度用の３．４７ｍＭのＥＳ ０．００２ｍＬ；およびエタノール（ＥｔＯＨ）の５．５ｍＬの全体積用の２．９４０ｍＬ。
ＳＡＭの堆積
すべてのチップについて、以下の手順を、ＳＡＭを堆積するのに実施した：チップを、金表面が内側に面して露出した溝付き顕微鏡スライドジャー内に置き、予め作製した０．２％のＴｗｅｅｎ２０を、チップが完全に沈むまでジャーに添加し；チップを、超音波処理した後、ナノ純水で完全にすすぎ、各チップをＥｔＯＨですすぎ、アルゴンガスで乾燥させた。次いでチップを、「低」プラズマ設定で１０分間、プラズマ浄化し、チップをＥｔＯＨで再びすすぎ、アルゴンで乾燥させた。アクセサリーパーツ（基部、ガスケット、タブ）を、ハンドソープでごしごし洗い、脱イオン水およびナノ純水ですすぐことによって浄化し、ＥｔＯＨですすぎ、空気乾燥させた。チップを組み立て、次いでガスケットが良好な密閉を生じさせていることを保証するためにＥｔＯＨで漏れ検査をした。上記で調製した堆積溶液５００μＬを各チップ内のタブに添加し、チップを、密閉され、覆われたガラス容器内で一晩インキュベートした。
２日目：
適切なＳＡＭ形成を検証するための初期検査
一晩インキュベートした後、チップを容器から取り出し、エタノールで２回、ナノ純水で６回、およびＬｉＣｌＯ４で２回洗浄した。検査溶液（上記の表を参照）５００μＬを各タブ内に添加し、電極（上記の表を参照）をＣＨＩシステムに接続した（Ｐｔ対電極を、使用前に、プロパントーチおよびＥｔＯＨによるすすぎで浄化した）。すべてのチップについて、サイクリックボルタンメトリーを、１００００ｍＶ／秒のＣＶ、１００ｍＶ／秒のＣＶで検査する間に求められた範囲内で実施した。
ＥＤＣ、ＮＨＳの活性化
任意のさらなる溶液を添加する前に、チップをナノ純水で４回洗浄した。ＥＤＣ １０００μＬをＮＨＳ １０００μＬに添加し、この混合溶液２００μＬを４つのチップに添加し、３０分間インキュベートした（すべてのインキュベーションは、空のピペット先端容器内で行い、箔で覆って露光量を最小限にした）。インキュベートした後、チップをナノ純水で４回洗浄した。
ストレプトアビジン
ストレプトアビジン溶液２００μＬを添加し、１時間インキュベートし、ＰＢＳで４回およびＬｉＣｌＯ４で１回洗浄した。番号３〜６のチップを３．５．１．のように検査した。注意：検査したチップのみをＬｉＣｌＯ４で洗浄した。検査したすべてのチップを再びＰＢＳで４回洗浄した。これは、以下のすべてのステップに適用する。
Figure 2014530367
エタノールアミンキャッピング
エタノールアミン２００μＬを各チップに添加し、チップを１５分間インキュベートし、ＰＢＳで４回洗浄した。
ＢＳＡブロッキング
０．１％のＢＳＡを添加し、１０分インキュベートし、ＰＢＳで４回およびＬｉＣｌＯ４で１回洗浄し、チップ３〜６を、３．５．１．のように検査した。
ＧＯｘおよび一次抗体の添加
ＧＯｘ−ビオチン原料の濃度は、１ｍｇ／ｍＬであり、ＧＯｘ−ビオチン原料４μＬをＰＢＳ ３９６μＬに添加した。１０μｇ／ｍＬのＧＯｘ−ビオチン２００μＬを番号１〜２のチップに添加し、１時間インキュベートした。ｍＡｂ １９Ｃ７−ビオチンの原料は、１．７ｍｇ／ｍＬであり、ｍＡｂ １９Ｃ７−ビオチン８μＬをＰＢＳ ７９２μＬに添加し、１７μｇ／ｍＬの濃度にした。抗体−ビオチン１００μＬを番号３〜１０のチップに添加した。両溶液を放置して４５分間インキュベートし、番号３〜６のチップを、ＰＢＳで４回およびＬｉＣｌＯ４で１回洗浄し、検査した。
トロポニンおよび二次抗体とのインキュベーション
トロポニンのアリコート（１ｍｇ／ｍＬ）を−２０℃のフリーザーから取り、解凍させ、１μＬをＰＢＳ ９μＬに添加して１００μｇ／ｍＬにした。この原料１μＬを、ＰＢＳ ４８μＬに添加した。ｍＡｂ１６Ａ１１−Ｇｏｘ（１．７ｍｇ／ｍＬ）１μＬもＰＢＳ／トロポニン溶液に添加し、ボルテックスし、３０分間インキュベートした。
Ｇｏｘ−ビオチン検査
番号１および２のチップを、ＰＢＳで４回およびＬｉＣｌＯ４で１回洗浄し、検査し、引き続いてＰＢＳで４回洗浄した。２ｍＭのグルコース溶液は、１Ｍのもの２０μＬをＮａＨＣＯ３（ｐＨ８．５）９９８０μＬに取り入れることによって調製し、この溶液５００μＬをチップに添加し、１０分間インキュベートした。次いで番号１および２のチップを、ＰＢＳで４回およびＬｉＣｌＯ４で１回洗浄し、検査した。次いでチップを、ＰＢＳで４回洗浄し、１００ｍＭのＨ２Ｏ２とともに２分間インキュベートし、次いで洗浄し、検査した。
トロポニンおよび二次抗体の添加
チップ３〜１０をＰＢＳで４回洗浄した。トロポニンおよびｍＡｂ１６Ａ１１−Ｇｏｘのインキュベーション５０μＬを、ＰＢＳ中で最大１．２ｍＬまで希釈し、溶液をボルテックスし、この原料１５０μＬを番号３〜１０のチップに添加し、３０分間インキュベートした。
トロポニンおよび二次抗体の検査
番号３〜１０のチップをＰＢＳで４回洗浄した。番号５〜８のチップを、ＬｉＣｌＯ４で１回洗浄し、検査し、ＰＢＳで４回洗浄した。１００ｍＭのＨ２Ｏ２ ５００μＬを番号６〜７のチップに２分にわたって添加し、インキュベートした後、チップを、ＰＢＳで４回およびＬｉＣｌＯ４で１回洗浄し、検査した。２ｍＭのグルコースを番号９〜１０のチップに２０分にわたって添加し、インキュベートした後、チップを、ＰＢＳで４回およびＬｉＣｌＯ４で１回洗浄し、検査した。
単分子層の調製。金蒸着電極を、０．２％のＴｗｅｅｎ２０溶液中で５分の超音波処理で浄化し、エタノールで洗浄した後、プラズマイオン化を１０分行った。次いで電極をエタノールで洗浄した後、堆積溶液に曝露した。堆積溶液は、化合物１（０．１ｍＭ）、二硫化ジヘキシル（０．５ｍＭの（Ｃ６−Ｓ）２）、およびビス（６−ヒドロキシヘキシル）ジスルフィド（０．５ｍＭの（ＨＯ−Ｃ６−Ｓ）２）、および１６−メルカプトヘキサデカン酸（０．０１ｍＭ、ＭＨＡ）から構成されていた。堆積溶液を、金電極上で約１８時間にわたって一晩インキュベートした。次いで堆積溶液を除去し、電極をエタノールで、その後水で洗浄した。１／１の体積／体積のＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）（０．１Ｍ）および１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）（０．４Ｍ）を使用して３０分間、ＭＨＡを活性化した。この活性化の後、電極を、水で洗浄し、１０ｍＭの酢酸ナトリウム ｐＨ５．７中でストレプトアビジン（０．０５ｍｇ／ｍＬ）とともに１時間インキュベートした。アッセイの残りのステップのために、各ステップ間で電極をＰＢＳで洗浄した。未反応のＭＨＡ部位をキャップするために、エタノールアミン（０．１ｍＭのＮａＨＣＯ３）を１５分にわたって添加した。ＰＢＳ緩衝液中のＢＳＡ（０．１質量％）を１０分にわたって添加して、非特異的結合を低減した。一次抗体（ｍＡｂ−１９ｃ７−ビオチン、ＨｙＴｅｓｔ）を１７μｇ／ｍＬの濃度で添加し、４５分間インキュベートした。この時間の間に、二次抗体（３４μｇ／ｍＬ、ｍＡｂ−１６Ａ１１−ＧＯｘ、Ｈｙｔｅｓｔ）をヒト心臓トロポニンＩ（２μｇ／ｍＬ）とともにインキュベートした。次いで二次抗体−トロポニン複合体を、対象とする濃度で電極に添加し、３０分間インキュベートした。この時点で、完全な「サンドイッチ」が、単分子層でＭＨＡ上に構築される。次いで、グルコース（２ｍＭ）を１０分間インキュベートし、溶液を除去し、電極をＰＢＳで洗浄し、サイクリックボルタモグラムをＬｉＣｌＯ４（１Ｍ）中で記録した。
［実施例５］
ＡＴＰ検出
ＡＴＰは、補基質のグリセロールが反応混合物中に存在する場合、グリセロールキナーゼ（ＧＫ）およびグリセロール−３−リン酸オキシダーゼ（Ｇ３ＰＯ）の活性を使用することによって、ＳＡＭ修飾金電極とともにＡＴＰ依存性酵素反応を活用することによって電気化学的に検出することができる（Ｍｕｒｐｈｙ，Ｌ．Ｊ．ら、Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．１９９４、６６、４３４５〜４３５３頁；およびＬｌａｕｄｅｔ，Ｅ．ら、Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．２００５、７７、３２６７〜３２７３頁を参照）。酵素ステップは、以下のように進行する：
１．）グリセロール＋ＡＴＰ＋ＧＫ→グリセロール−３−リン酸＋ＡＤＰ
２．）グリセロール−３−リン酸＋Ｇ３ＰＯ＋Ｏ２→グリセロンリン酸＋Ｈ２Ｏ２
最初に、ＧＫは、グリセロールおよびＡＴＰからのグリセロール−３−リン酸の形成を触媒する。引き続いて、Ｇ３ＰＯがグリセロール−３−リン酸を酸化して、グリセロンリン酸および過酸化水素を生じる。したがって、生成される過酸化物の量は、グリセロールが過剰にある場合、試料中のＡＴＰの量に直接結びつけられる。この酵素反応シーケンスから生成される過酸化物の電気化学的検出に向けた手法を図１４に示す。
ＡＴＰセンサーは、過酸化物反応性電気活性分子（ＥＡＭ）を含有するＳＡＭ修飾金電極に基づく。単分子層中のＥＡＭの初期の見かけ上の式量電位は、センサーの「オフ」状態を特徴付ける。ＡＴＰ含有試料マトリックスに曝露されると、過酸化水素が生成して、固定されたＥＡＭ中の非可逆性脱離反応が誘発され、電気化学的に検出されるフェロセン基の見かけ上の式量電位の信号「オン」の変化をもたらす。フェロセンＥＡＭの代表的なクラスについてのこの酵素誘発レドックス変化化学的脱離（Ｅ−ＴＲＡＣＥ）反応を、図１５に示す（例えば、米国特許出願第１２／８５３，２０４号を参照）。
上述したアッセイを使用してＡＴＰを検出するための電気化学的データは、サイクリックボルタンメトリー（ＣＶ）を使用して収集した。過酸化物反応性フェロセンプローブの初期の単分子層は、Ｅ０’＝６０ｍＶおよび平均ファラデーピーク電流ｉ＝１．６μＡを有する可逆性レドックス波を示した（１ＭのＬｉＣｌＯ４、対ＡｇＱＲＥ、Ｐｔ対電極、１０Ｖ／秒）。２ｍＭのグリセロール、１．３３Ｕ／ｍＬのＧＫ、およびＧ３ＰＯ（１０ｍＭのＰＢＳ、ｐＨ＝８．５、１ｍＭのＭｇＣｌ２）を含有する緩衝液中の１ｍＭのＡＴＰに電極を１０分間暴露し、その後、２分洗浄すると（ｐＨ＝１０）、ｉ＝０．１μＡを伴った第２の低電位レドックス波（Ｅ０’＝−２２０ｍＶが出現した（図１６）。１ｍＭのＡＴＰについてのこの信号は、ＡＴＰなしでの同じ電極処理について記録されたもの（ｉ＝０．０４μＡ）の２倍であった。陽性対照として、１ｍＭのＨ２Ｏ２を、ＡＴＰを含まない同じ緩衝液中にスパイクした（Ｅ０’＝−２２０ｍＶでｉ＝０．５９μＡ）。陽性対照と比較して、１ｍＭのＡＴＰについての信号がより弱いのは、不十分な反応時間に起因し得る。
［実施例６］
ＨｂＡ１ｃ：一般的な検出法
Ａ１ｃ検出（Ｓ−ＭＡＤ）の単回測定は、酵素誘発レドックス変化化学的脱離（Ｅ−ＴＲＡＣＥ）反応を使用して、電気化学的測定によって、本明細書に記載の方法に従って実施することができる。
図１１に示したように、過酸化物感受性フェロセンＥＡＭ、タンパク質の非特異的結合を低減する希釈剤分子、およびヘモグロビンを非選択的に固定する（すなわち、糖化された、またはされていない）ために抗ヘモグロビン抗体をコンジュゲートするための基を含有する金電極上でＳＡＭを調製する。特に、抗総ヘモグロビン抗体は、確立した架橋方法を使用して共有結合によってＳＡＭ上に固定する、例えば、ビオチン／ストレプトアビジン相互作用を介してコンジュゲートすることができる。ヘム基への分子プローブの結合による、またはタンパク質間相互作用（例えば、ハプトグロビン−ヘモグロビン）を利用する初期捕捉のための異なる方法を使用することも可能であるはずである。
ＳＡＭは、試料マトリックス（溶解した全血）に曝露され、広範に洗浄される。試料中に存在する糖化ヘモグロビンの比率を求めるために、次いで、電極をヘモグロビンの糖化部位に結合するＧＯｘ−コンジュゲート二次抗Ａ１ｃ抗体に曝露し、非糖化ヘモグロビンでなく、固定されたヘモグロビンＡ１ｃのみを有する抗体「サンドイッチ」を創製する（図１７）。表面を、広範に洗浄し、過剰のグルコースを含有する酸素飽和緩衝液で処理する。ＳＡＭ上のＧＯｘは、グルコースおよび酸素のグルコン酸および過酸化水素への反応を触媒し、溶液中で過酸化水素を酵素増幅することができ、過酸化水素は、単分子層表面に拡散し、固定されたＥＡＭ中で化学的脱離反応を誘発する。この非可逆性脱離反応により、フェロセン基の電子環境が変化し、見かけ上の式量電位がシフトし、ヘモグロビンＡ１ｃの濃度依存信号が生成される。
光学的検出スキームからの結果は、上記図１７に見られる電気化学的セットアップに類似して、固定された総ヘモグロビン濃度について、表面結合化学種の比（総ヘモグロビンに対するＡ１ｃ）は、溶液中の化学種の比（総ヘモグロビンに対するＡ１ｃ）を潜在的に代表し得、用量応答が実現され得ることを示唆する。
表面上の捕捉抗体密度をさらに最適化すると、センサーの性能を改善することができる。図１９中のデータは、コーティング溶液における３つの異なる濃度の捕捉抗体に対する様々なパーセンテージのＡ１ｃの応答を示す。Ａ１ｃ試料は、総ヘモグロビンの生理的濃度、１．４８〜１．９８ｍＭで、臨床的に妥当な範囲（４〜１２％）内であった。
図１８および図１９は、Ａ１ｃ特異的酵素レポータータグ付き二次抗体とカップリングした総ヘモグロビン捕捉抗体は、表面上に固定されたＡ１ｃの比率に応じて示差的な信号を提供することができることを示す。
図２０は、固定比のＡ１ｃおよび異なる総ヘモグロビン濃度について得られた動的結果を実証する。異なる希釈液間で無視できる信号の差異が見られ、アッセイが、固定されたＡ１ｃ％を有する異なる総ヘモグロビン濃度で同じ結果をもたらすことができる証拠を提供している。任意のＡ１ｃ％の出力信号は、総ヘモグロビンの臨床的範囲１１〜１８ｇ／ｄＬ（１．６〜２．７ｍＭ）にわたって一定であるという予備データを支持するさらなる証拠が収集されている。アッセイは、総ヘモグロビン濃度の相対的に狭い臨床的範囲にわたるバイアス、またはその範囲の希釈を用いることなく実施することだけを必要とする。
電気活性ＳＡＭとカップリングしたＡ１ｃのこの単回測定検出は、試料中のＡ１ｃと総ヘモグロビンの比率を求めるためのあまり複雑でない手段を提供する。これは、２回の測定を実施する必要がないこと、および光学的測定、複数の抗体対、またはＡ１ｃおよび総ヘモグロビンの２つの別々の測定に基づいてさらに誤差を導入するパーセンテージ計算アルゴリズムを排除することという利点を提供する。アッセイを較正することによって、異なる総ヘモグロビン濃度を有する試料で単回測定からＡ１ｃ％をもたらすことができる。
［実施例７］
Ｈ２Ｏ２が存在する結果としての、２つのユニークな電位Ｅｏ１およびＥｏ２における定量可能な電気化学的信号の測定
溶液または試料中のＡ１ｃのパーセンテージの検出に起因してＨ２Ｏ２が存在する結果としての、２つのユニークな電位Ｅｏ１およびＥｏ２における定量可能な電気化学的信号の測定の実験的記述。
溶液計算は、合計１０のチューブアッセイ、すなわち、３つのキャリブレーター（５％、１％）および２つの臨床試料（５％、１％）に基づく。
原料の調製
４５ｎｇ／μＬの二次抗体溶液（１１０μＬ）は、結合緩衝液１０８．４μＬと混合したビオチン抗Ａ１ｃ １．６３μＬの３．０３ｍｇ／ｍＬの原料（原料３．０３ｇ／ｍＬ）から調製した。９０ｎｇ／μＬのＳＡ−ＡＰ酵素溶液（１１０μＬ）は、結合緩衝液１０３．４μＬと混合したストレプトアビジン−ＡＰ原料６．６μＬ（原料１．５ｍｇ／ｍＬ：Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）から調製した。２μＭのＦＡＤＰ基質溶液（合計１７００μＬ）は、Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ８．５）１６６６μＬ［８３３＊２］と混合した１００μＭのＦＡＤＰ ３４μＬから調製した（１００μＭのＦＡＤＰは、１０ｍＭのＦＡＤＰ １μＬ＋Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ８．５）９９μＬから調製した）。増幅原料（amplification stock）（それぞれ１４０μＬ）も調製した：ｉ）６０μＭのＤＡＡＯは、Ｔｒｉｓ ｐＨ８．５ １１８μＬと混合した原料の２００μＭのＤＡＡＯ ４２μＬから得、ｉｉ）４２０ｍＭのＤ−プロリンは、Ｔｒｉｓ ｐＨ８．５ ８１．２μＬと混合した原料の１ＭのＤ−プロリン５８．８μＬから得た。
磁気ビーズの調製
捕捉抗体を有する磁気ビーズを予め洗浄し、予めブロックする。ビーズ原料をボルテックスして完全に混合する。０．１μｇ／μＬのビーズ溶液（１０５０μＬ）は、１０μｇ／μＬのＭ２８０ビーズ原料１０．５μＬを結合緩衝液１０３９．５μＬ［５１９．５＊２］と混合することによって創製した。０．１μｇ／μＬのビーズ溶液１００μＬを各アリコート中に添加して、１０μｇ／チューブ；１本のチューブ⇔３つのＥ−ＴＲＡＣＥウェルの最終濃度にした。ビーズを添加した後、ビーズを磁気棒に対してペレット化し、上清を取り出した。
標的結合
標的希釈系列を以下の通り調製した：
Figure 2014530367
各キャリブレーター／試料の５％希釈液は、１００％の標的７μＬおよび結合緩衝液１３３μＬを混合して合計１４０μＬにすることによって創製した。各キャリブレーター／試料の１％希釈液は、５％の標的２２μＬおよび結合緩衝液８８μＬを混合して合計１１０μＬにすることによって創製した。標的のそれぞれ１００μＬを、３０秒間隔で、磁気ビーズを含有するこれらの適切なチューブに添加し、手で振り、５分間インキュベートした。
ビーズの洗浄
次いでチューブを、添加した順序で、３０秒間隔で磁石に乗せ、その直後に洗浄緩衝液２００μＬを添加した。上清を除去し、洗浄緩衝液５００μＬを添加した。すべてのチューブが磁石上にある状態になった後、上清を除去し、洗浄緩衝液７００μＬを添加し、その後、チューブを９０°および逆に回転した。
二次抗体の添加
上清をアリコートから除去し、チューブを磁石から取り出し、二次抗体溶液１０μＬを３０秒間隔で各チューブに添加した。試料を手で振り、２分間インキュベートし、ビーズを上述したように洗浄した。
酵素のコンジュゲーション
上清をアリコートから除去し、チューブを磁石から取り出し、ストレプトアビジン−ＡＰ溶液１０μＬを３０秒間隔で各チューブに添加し、手で振り、２分間インキュベートした。ビーズを上述したように洗浄し、洗浄緩衝液８００μＬおよび９００μＬで２回さらに洗浄した。上清約４００μＬを除去し、チューブを磁石から取り出し、手で振ってビーズを再懸濁し、次いでビーズを新しいセットのチューブに移した。上清を除去し、次いでＴＢＳ（ｐＨ８．５）９００μＬを添加した。
基質の添加
上清をアリコートから除去し、チューブを磁石から取り出し、２μＭのＦＡＤＰ １４０μＬを３０秒間隔で各チューブに添加し、９０秒間インキュベートした。ＦＡＤＰインキュベーションの後、ビーズを、３０秒間隔で磁石棒に対してペレット化した。チューブが３０秒間磁石上にあった後、ＦＡＤ＋生成物溶液（１３０μＬ）を取り出して１セットのチューブに入れた。ビーズを上述したように洗浄し、ＴＢＳ ｐＨ８．５ ８００μＬでも洗浄した。次いで、アリコートを磁石から取り出し、ＰＮＰＰ（パラ−ニトロフェニルリン酸）溶液１００μＬを、立て続けに各チューブに添加した。試料を手で振り、シェーカー上で、室温で、３００ｒｐｍでインキュベートした。
ＰＮＰＰを介したＨｂＡ１ｃの光学的測定
４０分間のＰＮＰＰインキュベーションの後、磁気ビーズをペレット化し、９５μＬを取り出し、９６ウェルＥＬＩＳＡプレートに移した。ＥＬＩＳＡプレート吸光度を４０５ｎｍで読み取った。
酵素増幅
酵素増幅混合物を、以下の通り調製した：６０μＭのＤＡＡＯ １３３．９μＬ、４２０ｍＭのＤ−プロリン１３３．９μＬ、および４００ｍＭのＮａ２ＣＯ３ ２２９．７μＬ。ＦＡＤ＋溶液１３０μＬに、ＤＡＡＯ／プロリン／Ｎａ２ＣＯ３混合物４８．３３μＬ（１３μＬ＋１３μＬ＋２２．３μＬ）を、３０秒間隔で添加した（最終濃度は、最終体積に基づいて約３５ｍＭのＤ−プロリン、および約５μＭのＤＡＡＯである）。混合物を軽くボルテックスし、酵素溶液を３０秒にわたって添加した後、チップ上に添加した。
過酸化水素のＥ−ＴＲＡＣＥ検査
６ウェルのチップを、０．１ｍＭのフェロセンＥＡＭおよび０．２５ｍＭのＰＥＧ３−Ｃ１１ＳＨのＳＡＭを用いて１日前に調製した。チップをエタノール（８回）およびナノ純水（４回）で洗浄した。適切なＨ２Ｏ２生成溶液５０μＬを、１０分にわたってこれらのそれぞれのチップに添加し、次いで、チップをエタノール（４回）およびナノ純水（２回）で洗浄した。１ＭのＬｉＣｌＯ４約１５０μＬをチップに添加し、次いでチップをＣＨＩ６５０Ｃシステムにプラグ接続した。参照電極および対電極をＥＣシステムに加えた。
実験的な概略
Figure 2014530367
本明細書に記載の実施例および実施形態は、例示的な目的であるだけであることが理解されるべきである。脈絡によって明確に除外されない限り、本発明の一態様のために開示したすべての実施形態は、任意の適当な組合せで本発明の他の態様のために開示した実施形態と組み合わせることができる。本発明の範囲から逸脱することなく、様々な改変およびバリエーションを本発明に行うことができることが、当業者に明らかとなるであろう。したがって、本発明は、本発明の改変およびバリエーションを、これらが添付の特許請求の範囲およびこれらの均等物の範囲内に入ることを条件として、包含することが意図されている。

Claims (17)

  1. タンパク質および糖化タンパク質を含む検査試料中において、前記タンパク質の前記糖化タンパク質である分率を測定するための単回直接測定法であって、
    （ａ）第１の結合リガンドを前記検査試料と、前記第１の結合リガンドが前記検査試料中の前記糖化タンパク質の分率に正比例して、前記タンパク質および前記糖化タンパク質に選択的および同等に結合する条件下で接触させて、第１の複合体を形成するステップと、
    （ｂ）第１の複合体を含有する前記試料を第２の結合リガンドと、前記第１の複合体および前記第２の結合リガンドが結合する条件下で接触させて、第２の複合体を形成するステップであって、前記第２の結合リガンドは、過酸化物生成系を含み、前記第１の複合体の前記糖化タンパク質に特異的に結合する、ステップと、
    （ｃ）前記第２の複合体を単離するステップと、
    （ｄ）前記第２の複合体を前記過酸化物生成系の基質と、過酸化物が生成される条件下で接触させて、アッセイ混合物を形成するステップと、
    （ｅ）アッセイ混合物を、第１のＥ０を有する共有結合的に付着した電気活性部分（ＥＡＭ）を備える電極を備える第１の固体支持体と接触させるステップであって、前記ＥＡＭは自壊的部分（ＳＩＭ）および過酸化物感受性部分（ＰＳＭ）を含む遷移金属錯体を含み、前記過酸化物は、前記ＰＳＭと反応して、前記ＥＡＭから前記ＳＩＭを放出し、第２のＥ０を有する前記ＥＡＭをもたらすステップと、
    （ｆ）第１のＥ０および第２のＥ０で前記ＥＡＭの電気化学特性を測定するステップと、
    （ｇ）前記電気化学特性から前記糖化タンパク質の分率を判定するステップと
    を含む方法。
  2. タンパク質および糖化タンパク質を含む検査試料中において、前記タンパク質の前記糖化タンパク質である分率を測定するための単回直接測定法であって、
    （ａ）過酸化物生成系を含む第１の結合リガンドを検査試料と、第１の結合リガンドが前記糖化タンパク質に特異的に結合する条件下で接触させて、第１の複合体を形成するステップと、
    （ｂ）第１の複合体を含有する前記試料を第２の結合リガンドと、前記第２の結合リガンドが前記検査試料中の前記糖化タンパク質の分率に正比例して、前記タンパク質、および前記第１の複合体の前記糖化タンパク質に選択的および同等に結合する条件下で接触させて、第２の複合体を形成するステップと、
    （ｃ）前記第２の複合体を単離するステップと、
    （ｄ）前記第２の複合体を前記過酸化物生成系の基質と、過酸化物が生成する条件下で接触させて、アッセイ混合物を形成するステップと、
    （ｅ）アッセイ混合物を、第１のＥ０を有する共有結合的に付着した電気活性部分（ＥＡＭ）を備える電極を備える第１の固体支持体と接触させるステップであって、前記ＥＡＭは自壊的部分（ＳＩＭ）および過酸化物感受性部分（ＰＳＭ）を含む遷移金属錯体を含み、前記過酸化物は、前記ＰＳＭと反応して、前記ＥＡＭから前記ＳＩＭを放出し、第２のＥ０を有する前記ＥＡＭをもたらすステップと、
    （ｆ）第１のＥ０および第２のＥ０で前記ＥＡＭの電気化学特性を測定するステップと、
    （ｇ）前記電気化学特性から前記糖化タンパク質の分率を判定するステップと
    を含む方法。
  3. 前記電極が自己組織化単分子層（ＳＡＭ）をさらに備える、請求項１および２のいずれかに記載の方法。
  4. 前記第１の結合リガンドが第２の固体支持体に付着している、請求項１または３のいずれかに記載の方法。
  5. 前記第２の結合リガンドが第２の固体支持体に付着している、請求項２または３のいずれかに記載の方法。
  6. 前記第２の固体支持体が、微粒子、磁性微粒子、ビーズ、およびマイクロチャネルからなる群から選ばれる、請求項４または５のいずれかに記載の方法。
  7. 前記過酸化物生成系がオキシダーゼ酵素である、請求項１から６のいずれかに記載の方法。
  8. 前記過酸化物生成酵素が、グルコースオキシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、アシルＣｏＡオキシダーゼ、アルコールオキシダーゼ、アルデヒドオキシダーゼ、Ｄ−アミノ酸オキシダーゼ（ＤＡＡＯ）、コリンオキシダーゼ、およびアシルＣｏＡオキシダーゼからなる群から選択される、請求項１から７のいずれかに記載の方法。
  9. 前記過酸化物生成系が、過酸化物生成系の中間酵素成分、例えば、アルカリホスファターゼまたは任意の他のホスファターゼなどである、請求項１から６のいずれかに記載の方法。
  10. 前記第１の結合リガンドおよび前記第２の結合リガンドが独立して、モノクローナル抗体、モノクローナル抗体の断片、ポリクローナル抗体、ポリクローナル抗体の断片、タンパク質、およびペプチドからなる群から選ばれる、請求項１から９のいずれかに記載の方法。
  11. 前記ＥＡＭが遷移金属を含む、請求項１から９のいずれかに記載の方法。
  12. 前記遷移金属が、鉄、ルテニウム、およびオスミウムからなる群から選ばれる、請求項１１に記載の方法。
  13. 前記ＥＡＭが、フェロセンおよび置換フェロセンからなる群から選ばれる、請求項１から１１のいずれかに記載の方法。
  14. 前記タンパク質がヘモグロビンであり、前記糖化タンパク質が糖化ヘモグロビンである、請求項１から１３のいずれかに記載の方法。
  15. 前記タンパク質がヘモグロビンであり、前記糖化タンパク質がヘモグロビンＡ１ｃである、請求項１から１３のいずれかに記載の方法。
  16. 前記糖化タンパク質が、糖化血清タンパク質、フルクトサミン、および糖化アルブミンである、請求項１から１３のいずれかに記載の方法。
  17. （ａ）
    （ｉ）自壊的部分（ＳＩＭ）および過酸化物感受性部分（ＰＳＭ）を含む遷移金属錯体を含む共有結合的に付着した電気活性活性部分（ＥＡＭ）であって、前記ＳＩＭが前記ＥＡＭに共有結合的に付着しているとき第１のＥＯを有し、前記ＳＩＭが存在しないとき第２のＥＯを有する、電気活性活性部分、
    （ｉｉ）任意選択の自己組織化単分子層（ＳＡＭ）
    を備える第１の固体支持体と、
    （ｂ）検査試料中の糖化タンパク質の分率に正比例して、タンパク質および糖化タンパク質に選択的および同等に結合する第１の結合リガンドと、
    （ｃ）前記糖化タンパク質に特異的に結合する第２の結合リガンドであって、過酸化物生成系を含み、第２の固体支持体に任意選択により結合している第２の結合リガンドと、
    （ｄ）前記過酸化物生成系の任意選択の基質と
    を含む構成物。
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