JP5352742B2 - 酵素による酸化還元変化化学的脱離(e−trace)免疫学的検定法 - Google Patents
酵素による酸化還元変化化学的脱離(e−trace)免疫学的検定法 Download PDFInfo
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Description
本出願は、2009年8月7日に出願された米国仮特許出願第61/232,339号の利益および優先権を主張するものであり、その開示内容全体は参照により本明細書に援用する。
本発明は、遷移金属錯体のE0の変化を用いて酵素を検出するための新規な組成物および方法に関する。
電子移動反応は、光合成または酸素呼吸に及ぶ様々な生物学的変換における重要な工程である。化学系および生物系の両方における電子移動反応の研究により、少数のパラメータに関する電子移動速度を説明する大きな知識体系および強力な理論的基礎が発展した。
kET=(4π3/h2λkBT)1/2(HAB)2exp[(−ΔG0+λ)2/λkBT]
に従い、駆動力(−ΔG0)、核再構成パラメータ(λ)、および遷移状態(HAB)における反応体と生成物との間の電子結合強度に応じて決まることが予測される。
本発明は、酸化還元活性分子のE0に対応する溶媒の再構成エネルギーを用いて標的検体を検出するための組成物および方法を提供する。
概説
本発明は、標的検体の結合の際に電気化学電位の変化が見られるように標的検体を検出する電子的方法に関する。この機構は、米国特許第7,595,153号、7,759,073号および7,713,711号、ならびに2008年10月17日に出願された米国特許出願第12/253,828号;2008年10月17日に出願された米国特許出願第12/253,875号;2010年5月7日に出願された米国仮特許出願第61/332,565号;2010年5月21日に出願された米国仮特許出願第61/347,121号;および2010年7月20日に出願された米国仮特許出願第61/366,013号に一般に記載されており、これらは全て、全体が参照により明示的に援用される。
本明細書における「標的検体」または「検体」あるいは文法上の相当語句は、検出対象となる任意の分子、化合物または粒子を意味する。以下により詳細に記載されるように、標的検体は、結合リガンド(捕捉結合リガンドおよび可溶性結合リガンドの両方)に結合する。当業者によって理解されるように、本発明の方法を用いて多数の検体を検出することができ、基本的に、後述される結合リガンドが作製され得るあらゆる標的検体を本発明の方法を用いて検出することができる。
試料
標的検体は、一般に試料中に存在する。当業者によって理解されるように、試料溶液は、以下に限定はされないが、体液(以下に限定はされないが、実質的にあらゆる生物の血液、尿、血清、リンパ液、唾液、肛門および膣分泌物、汗および精液を含み、哺乳類の試料が好ましく、ヒトの試料が特に好ましい);環境試料(以下に限定はされないが、空気、農産物、水および土壌試料を含む);植物材料;化学兵器用剤試料;研究試料、精製試料、原試料などを含む物を多種類含んでいてもよく;当業者によって理解されるように、実質的にあらゆる実験操作を試料に対して行ってもよい。ある実施形態は、貯蔵された(例えば冷凍および/または保存された)組織または新鮮な組織に由来する標的試料を用いる。パラフィン包埋試料が多くの実施形態において特に用いられる。これらの試料は、診断および予後診断などの、試料に関連するさらなるデータの存在により非常に有用であり得るためである。本明細書に記載の固定組織およびパラフィン包埋組織試料は、貯蔵可能または保存可能な組織試料を指す。ほとんどの患者由来の病理学的試料は、組織学的分析およびその後の保管を可能にするために、通常、固定およびパラフィン包埋される。
標的検体は、電極を含む固体支持体を用いて検出される。本明細書における「基質」または「固体支持体」あるいは他の文法上の相当語句は、捕捉リガンドの結合または会合に適した、分離した個々の部位を含むように修飾され得る任意の材料を意味する。好適な基質には、金などの金属表面、以下に規定されるような電極、ガラスおよび改質または機能化ガラス、ガラス繊維、テフロン(teflon)(登録商標)、セラミック、雲母、プラスチック(アクリル、ポリスチレンおよびスチレンと他の材料とのコポリマー、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリブチレン、ポリイミド、ポリカーボネート、ポリウレタン、テフロン(Teflon)(登録商標)、ならびにそれらの誘導体などを含む)、GETEK(ポリプロピレンオキシドとガラス繊維とのブレンド)など、多糖類、ナイロンまたはニトロセルロース、樹脂、ケイ素もしくは変性ケイ素を含むシリカまたはシリカ系材料、炭素、金属、無機ガラスおよび様々な他のポリマーが含まれ、プリント回路基板(PCB)材料が特に好ましい。
本発明の固体支持体は電極を含む。本明細書における「電極」とは、電子デバイスに接続されたとき、電流または電荷を検知し、それを信号に変換することができる組成物を意味する。好ましい電極は、当該技術分野において公知であり、以下に限定はされないが、金;白金;パラジウム;ケイ素;アルミニウム;酸化白金、酸化チタン、酸化スズ、酸化インジウムスズ、酸化パラジウム、酸化ケイ素、酸化アルミニウム、酸化モリブデン(Mo2O6)、酸化タングステン(WO3)および酸化ルテニウムを含む金属酸化物電極を含む特定の金属およびそれらの酸化物;ならびに炭素(ガラス状炭素電極、黒鉛およびカーボンペーストを含む)を含む。好ましい電極には、金、ケイ素、炭素および金属酸化物電極が含まれ、金が特に好ましい。
電極は、自己組織化単分子層(「SAM」)を含む。本明細書における「単分子層」または「自己組織化単分子層」または「SAM」とは、互いにほぼ平行に、かつ表面に対してほぼ垂直に配向される、表面に自然に化学吸着される分子の比較的整列された集合体を意味する。分子の各々は、表面に結合する官能基、および単分子層中の隣接する分子と相互作用して比較的整列された配列を形成する部分を含む。「混合された」単分子層は、少なくとも2種の異なる分子が単分子層を構成する、異種成分からなる単分子層を含む。本明細書において概説されるように、単分子層の使用により、表面への生体分子の非特異的結合の量が減少し、核酸の場合、電極からのオリゴヌクレオチドの距離の結果としてオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションの効率が高まる。したがって、単分子層は、標的酵素を電極表面に近づけないようにする。さらに、単分子層は、電荷担体を電極の表面に近づけない働きをする。したがって、この層は、電極とReAMとの間、または電極と溶媒中の荷電種との間の電気的接触を防ぐのに役立つ。このような接触は、直接の「短絡」または試料中に存在し得る荷電種を介した間接的な短絡を生じ得る。したがって、単分子層は、最小限の「孔」が存在するように、電極表面上の均一層に密に詰まっているのが好ましい。ここで、単分子層は、溶媒が電極に接近するのを防ぐための物理的障壁として働く。
電極は、SAMに加えてEAMを含む。本明細書における「電気活性部分(EAM)」または「遷移金属錯体」または「酸化還元活性分子」または「電子移動部分(ETM)」とは、可逆的または半可逆的に1つ以上の電子を移動することができる金属含有化合物を意味する。電子供与体および電子受容体の容量は相対的なものであり;すなわち、特定の実験条件下で電子を失い得る分子は、異なる実験条件下で電子を受容し得ることを理解されたい。
後述されるように、本発明のEAMは、自壊的部分が存在する場合、EAMが第1のE0を有し、自壊的部分が除去された場合、第2のE0を有するように、EAMに共有結合された少なくとも1つの自壊的部分を含む。
自壊的スペーサーは、本発明の過酸化物感受性部分(PSM、本明細書においてPOMと呼ばれることもある)とEAMとを結合する。一般に、過酸化物感受性部分は、図1に示されるように、ホウ素を含有するものである。
SAMおよびEAMに加えて、電極は捕捉結合リガンドを含む。本明細書における「結合リガンド」または「結合種」とは、標的検体の存在を調べるのに用いられ、標的検体に結合する化合物を意味する。一般に、本明細書に記載の実施形態のほとんどでは、標的検体の1分子あたり用いられる少なくとも2つの結合リガンド;すなわち、検出表面に結合される「捕捉」または「アンカー」結合リガンド、および標的検体に独立して結合し、直接または間接的にSOXなどの少なくとも1つの標識を含む可溶性結合リガンドがある。本明細書における「捕捉結合リガンド」とは、標的検体を結合する電極表面に結合される標的検体を結合する結合リガンドを意味する。本明細書における「可溶性結合リガンド」とは、捕捉結合リガンドと異なる部位において標的検体を結合する溶液中の結合リガンドを意味する。
本発明は、電極表面上にEAM(導電性オリゴマーを用いて電極表面に任意選択により結合される)、SAM、および捕捉結合リガンドを含む化合物を提供する。一般に、ある実施形態において、これらの部分は、アンカー基を用いて電極に結合される。本明細書における「アンカー」または「アンカー基」とは、本発明の化合物を電極に結合する化学基を意味する。
単一部分として構造1に示されるが、導電性オリゴマーは、2つ以上の「A」部分で電極に結合されてもよく;「A」部分は同じであってもまたは異なっていてもよい。したがって、例えば、電極が金電極であり、「A」が硫黄原子または部分である場合、以下の構造2、3および4に一般に示されるように、複数の硫黄原子が、導電性オリゴマーを電極に結合するのに用いられてもよい。当業者によって理解されるように、他のこのような構造を構成することができる。構造2、3および4において、A部分は単なる硫黄原子であるが、置換硫黄部分も用いられてもよい。
本発明のシステムは、本明細書において概説されるように、様々な標的検体の検出に使用される。ある実施形態において、試験試料中に含まれる標的検体は、PSM−SIM−EAM混合物、捕捉結合リガンド、および任意選択によりSAMを有する電極に添加される。この添加後、任意選択による洗浄工程および可溶性結合リガンドの添加が続くが、当業者によって理解されるように、これらの添加は、同時に行うことができ、または溶液結合リガンドは、チップに加える前に標的検体を含有する試料に添加することができる。表面はここでも任意選択により洗浄され、過酸化物感受性部分用の基質、例えばグルコースが、存在する場合、過酸化物が生成され、SIMが開裂される条件下で加えられる。これらの条件は、一般に生理学的条件である。一般に、様々な濃度に対する反応の差を得るために、複数の検定の混合が異なる濃度で並行して行われる。通常、これらの濃度の1つが、陰性対照として、すなわち、0の濃度または検出のレベル未満の濃度で使用される。さらに、任意の種類の他の試薬が、スクリーニング検定に含まれ得る。これらには、塩、中性タンパク質、例えばアルブミン、最適な結合を促進し、および/または非特異的なまたはバックグラウンド相互作用を低減するのに用いられ得る洗浄剤などのような試薬が含まれる。また、プロテアーゼ阻害剤、ヌクレアーゼ阻害剤、抗菌剤などの、検定の効率を他の方法で高める試薬が用いられ得る。成分の混合物は、必要な結合を提供する任意の順序で加えられ得る。
酸化還元活性分子と電極との間の電子移動は、以下に限定はされないが、好ましくは、電流測定、ボルタンメトリー、静電容量およびインピーダンスを含む電子検出を用いた様々な方法で検出することができる。これらの方法は、ACまたはDC電流に基づいた時間または周波数に依存する方法、パルス法、ロックイン技術(lock in technique)、および(高域、低域、帯域)フィルタリングを含む。ある実施形態において、必要なのは電子移動検出のみであり;他の実施形態において、電子移動の速度が測定され得る。
電子移動を開始するために入力信号を送信した後、出力信号が受信または検出される。出力信号の存在および大きさは、入力信号の過電圧/振幅;入力AC信号の周波数;介在媒体の組成、すなわち、電子移動部分間のインピーダンス;DCオフセット;システムの環境;および溶媒に応じて決まる。所与の入力信号では、出力信号の存在および大きさは、一般に、金属イオンの酸化状態を変化させるのに必要な溶媒の再構成エネルギーに応じて決まる。したがって、AC成分およびDCオフセットを含む入力信号の送信の際、溶媒の再構成エネルギーが十分低く、周波数が範囲内にあり、振幅が十分である場合、電子が電極と酸化還元活性分子との間で移動され、出力信号が得られる。
本発明は、AC検出方法を用いて検体を検出するための装置をさらに提供する。本装置は、少なくとも第1の測定電極すなわち試料電極、および第2の測定電極すなわち対電極を有する試験チャンバを含む。3つの電極系も有用である。第1および第2の測定電極は、液体試験試料が存在すると、2つの電極が電気接触し得るように、試験試料受け入れ領域と接触している。
一般的な方法および材料
特に断りのない限り、標準的なSchlenk技術を用いて乾燥アルゴン雰囲気下で全ての合成操作を行った。反応媒体のために、Glass Contours(Laguna Beach、CA)から入手されるDow-Grubbs溶媒系1を介して中性アルミナ上で溶媒を乾燥させた。これらの溶媒を、使用する前にアルゴンで脱酸素化した。EMDが予め被覆されたアルミニウム板(シリカゲル60、F254、EMD Chemicals,Inc.、Gibbstown、NJ)を用いたTLCによって反応をモニタリングした。以下の方法、すなわち、ヨウ素蒸気、紫外線への暴露、またはリンモリブデン酸による染色とその後の加熱のうちの1つによって複数の領域を視覚化した。実験室空気の陽圧下でフラッシュクロマトグラフィーをシリカ上で行った(シリカゲル60粒径:40〜63μm;Sorbent Technologies、Atlanta、GA)。1H NMRおよびプロトンデカップリング(proton-decoupled)13C NMRスペクトルを、Bruker Avance III分光計(1Hについて499.37MHz、13Cについて125.58MHz)において記録し、Bruker TOPSPIN 2.1ソフトウェアを用いて処理した。エレクトロスプレーイオン化(ESI)または大気圧光イオン化(APPI)方法を用いて、Agilent 6210飛行時間(TOF)LC/MS機器を用いて、高分解能質量分析(HRMS)を得た。
化合物2(0.500g、1.2mmol)およびトリエチルアミン(0.25mL、1.8mmol)をTHF(15mL)に溶解させた溶液に、DPPA(0.285mL、1.32mmol)を加えた。反応物を室温で1.5時間攪拌し、減圧下で濃縮した。粗残渣をカラムクロマトグラフィー(MeOH:EtOAc:DCM、0.5:1.5:8)によって精製して、赤色/オレンジ色の固体(0.460g、1.04mmol、87%)として表題化合物を得た。1H NMR、13C{1H}NMR、およびHRMSは、表題化合物と一致していた。
化合物3(0.460g、1.04mmol)をトルエン(20mL)に溶解させた溶液をArで激しく脱気し、1.5時間にわたって100℃まで加熱した。p−ピナコールボレートベンジルアルコール(0.268g、1.14mmol)およびDBTL(0.018mL、0.03mmol)を加え、反応物をさらに2時間100℃に保った。反応物を減圧下で濃縮し、粗残渣をカラムクロマトグラフィー(Et2O:EtOAc:DCM、1:2:2)によって精製して、薄いオレンジ色の固体(0.480g、0.741mmol、71%)として表題化合物を得た。1H NMR、13C{1H}NMR、およびHRMSは、表題化合物と一致していた。
化合物4(0.135g、0.209mmol)をDCM(5mL)に溶解させた溶液を氷浴中で冷却した。TFA:DCM(1:1v/v、5mL)を5分間かけて滴下添加した。15分後、氷浴を取り除き、反応物を室温まで温めた。45分後、揮発性物質を真空除去して、褐色/オレンジ色の固体(定量)として表題化合物のTFA塩を得た。1H NMR、13C{1H}NMR、およびHRMSは、表題化合物と一致していた。
11−メルカプトウンデカン酸(0.045g、0.206mmol)およびHATU(0.078g、0.206mmol)をDCM:DMF(1:1v/v、5mL)に溶解させた溶液に、化合物5(0.105g、0.159mmol)およびDIPEA(0.083mL、0.477mmol)を加えた。反応物を室温で2時間攪拌した。反応混合物をEtOAc(150mL)中に希釈し、塩水(3×50mL)で洗浄した。有機相をNa2SO4上で乾燥させ、ろ過し、濃縮して粗残渣にし、この粗残渣をカラムクロマトグラフィー(MeOH:EtOAc:DCM、0.5:1.5:8)によって精製して、黄色の固体(0.035g、0.047mmol、30%)として表題化合物を得た。1H NMR、13C{1H}NMR、およびHRMSは、表題化合物と一致していた。
作用電極としてのSAM変性金、Ag/AgCl線基準電極、および白金線対電極(Bioanalytical Systems)の3つの電極系を用いて、0.15Mのn−Bu4NClO4支持電解質(0.5mL)を含むTHF中でCHIモデル660A電気化学分析器(CHI Instruments Inc.)を用いてサイクリックボルタンメトリーを行った。化合物4を過酸化水素で処理することによってモデル化合物(未加工)を調製した。結果は図3に示される。
C6希釈剤で希釈されたPB25_49におけるH2O2の研究;Na2CO3緩衝液(pH10.1)中での5分間および10分間のインキュベーション
A.目的
この研究の目的は、pH10.1で洗浄され、pH8.5でインキュベートされたEAM1の希釈されたSAM(PB25_49)における5分間および10分間のH2O2のインキュベーション時間の効果を試験することであった。H2O2は、EAM上のフェロセンを新たな電位で現れ得る新たな誘導体に分解するであろう。
1日目:
チップの洗浄および組み立て
13個(検定のために12個および内部基準試験のために1個)の未加工のチップを以下のとおりに洗浄した:
インサート付きのガラスジャーにチップを入れた。
0.2%のTWEEN溶液中で5分間超音波処理した。
超純水およびエタノールですすいでから、アルゴンで乾燥させた。
プラズマ洗浄装置で10分間洗浄した。
エタノールですすぎ、アルゴンで乾燥させた。
金属基材、ガスケット、およびPDMSスタンプを以下のとおりに洗浄した:
ハンドソープで手洗いした。
エタノールですすぎ、空気乾燥させた。
金属基材の中央の両面テープ上にチップを、チップの上にPDMSスタンプを、PDMSスタンプの上にガスケットを設置することによってチップを組み立て、バインダークリップで全て一緒に留めた。
EAMアリコート中に以下のものを組み合わせることによってEAMストックを調製した:
別個のガラスバイアル中に以下のものを組み合わせることによってSAM溶液を調製した:
チップ1〜12に、500μLの上で調製したSAM溶液を加えた後、一晩インキュベートした。
内部基準測定:
1,1’−フェロセンジメタノールの1mMの溶液を、1MのLiClO4溶液中で調製した。1.3mgの1,1’−フェロセンジメタノールを、5mLの1MのLiClO4と組み合わせた。MW1,1’−フェロセンジメタノール=246.09である。
一晩インキュベートした後、チップをインキュベーション容器から取り出した。SAM析出溶液をバイアル中に収集し、乾燥させて、将来の使用のためにリサイクルされたEAMを得た。
エタノールで8回
超純水で4回
試験緩衝液、1MのLiClO4で2回。
500uLの1MのLiClO4を、チップ1、3、5、6、7、9、11、および12に加え、次にチップを配電箱につないだ。
超純水で8回
100mMのNa2CO3(pH10.1)で2回
チップ6および12を以下のとおりに洗浄した:
超純水で8回
100mMのNaHCO3(pH8.5)で2回。
使用の直前に、100mMのNa2CO3緩衝液(pH10.1)に溶解させた様々な濃度のH2O2溶液を作製した。H2O2の元のストックは1Mであり、57uLの50%のH2O2を943uLの超純水と組み合わせることによって作製した。このストックを4℃の冷蔵庫に一晩入れたままにして、変旋光を生じさせた。それから、以下に示されるように希釈物を作製した:
作製した過酸化水素溶液をよくボルテックスした。
超純水で8回
100mMのNa2CO3(pH10.1)または100mMのNaHCO3(pH8.5)で2回。
各ウェルを500uLのそれぞれの緩衝液で5分間インキュベートした。チップを緩衝液でインキュベートした後、チップを以下のとおりに洗浄した:
超純水で8回
1MのLiClO4で2回。
目的
この研究の目的は、pH10.1で洗浄され、pH8.5でインキュベートされたPB25_49の希釈されたSAMにおける5分間および10分間のグルコースのインキュベーション時間の効果を試験することであった。グルコースオキシダーゼを100uMでこれらのチップに加えて、EAMにおいて、フェロセンを新たな電位で現れ得る新たな誘導体に分解するであろうH2O2を生成した。
1日目:06/16/10
チップの洗浄および組み立て
11個(検定のために10個および内部基準試験のために1個)の未加工チップを以下のとおりに洗浄した:
インサート付きのガラスジャーにチップを入れた。
0.2%のTWEEN溶液中で5分間超音波処理した。
超純水およびエタノールですすいでから、アルゴンで乾燥させた。
プラズマ洗浄装置で10分間洗浄した。
エタノールですすぎ、アルゴンで乾燥させた。
金属基材、ガスケット、およびPDMSスタンプを以下のとおりに洗浄した:
ハンドソープで手洗いした。
エタノールですすぎ、空気乾燥させた。
金属基材の中央の両面テープ上にチップを、チップの上にPDMSスタンプを、PDMSスタンプの上にガスケットを設置することによってチップを組み立て、バインダークリップで全て一緒に留めた。
EAMアリコート中に以下のものを組み合わせることによってEAMストックを調製した:
別個のガラスバイアル中に以下のものを組み合わせることによってSAM溶液を調製した:
チップ1〜10に、500μLの上で調製したSAM溶液を加えた後、一晩インキュベートした。
内部基準(reference)測定:
1,1’−フェロセンジメタノールの1mMの溶液を、1MのLiClO4溶液中で調製した。1.3mgの1,1’−フェロセンジメタノールを、5mlの1MのLiClO4と組み合わせた。MW1,1’−フェロセンジメタノール=246.09である。
一晩インキュベートした後、チップをインキュベーション容器から取り出した。SAM析出溶液をバイアル中に収集し、乾燥させて、将来の使用のためにリサイクルされたEAMを得た。
エタノールで8回
超純水で4回
試験緩衝液、1MのLiClO4で2回。
500uLの1MのLiClO4を、チップ1、3、5、6、8、および10に加え、次にチップを配電箱につないだ。
超純水で8回
100mMのNaHCO3で2回。
使用の直前に、12.8mgのGOxを800uLのNaHCO3緩衝液と組み合わせることによって、GOxの100uMのストックを作製した。
作製したグルコース溶液をよくボルテックスし、450uLをそれぞれのチップに加えた。
超純水で8回
Na2CO3(pH10.1)で2回。
超純水で8回
1MのLiClO4で2回。
工程VI d、eおよびfに示される全てのチップを試験するのに配電箱を用いた。試験の後、チップを洗浄し、エタノールおよび水で清浄にしてから分解した。
研究:トロポニンを用いた未加工チップにおけるPB25_49の試験
A.目的
この研究の目的は、トロポニン抗体サンドイッチの作製、および二次抗体Gox標識によるH2O2生成をもたらすグルコースの添加の後の未加工チップにおけるEAM PB25_49の電気化学を測定することであった。
1日目:
SAM溶液の調製
ストック材料を対応する溶媒および添加剤と組み合わせることによって、以下の実験ストックを調製した。
EAM:1回分が0.5mgのPB25_49アリコート
500uLのEtOHを加えた。
(HO−C11−S)2:1mg/mLのストックを予め作製した。
(C11−S)2:1mg/mLのストックを予め作製した。
HS−C16−COOH:500uL〜0.5mgのアリコートを加えた。
20mLのガラスバイアル中で以下のものを組み合わせることによって、SAM溶液を調製した:
PB25_49:最終濃度が0.1mMとなるような411uLの1.34mMのES(推定されるストック濃度)
(OH−C11−S)2:最終濃度が0.5mMとなるような1.118mLの2.46mMのES
(C11−S)2:最終濃度が0.5mMとなるような1.030mLの2.67mM
HS−C16−COOH:最終濃度が0.001mMとなるような0.002mLの3.47mMのES
EtOH:全体積が5.5mLとなるような2.940mL。
全てのチップについて、SAMを析出させるために以下の手順を行った。内側に面して露出された金表面を有する穴付きの顕微鏡スライドジャーにチップを入れた。チップが完全に沈められるまで、予め作製された0.2%のTween 20をジャーに加えた。超音波処理の後、チップを超純水で十分にすすいだ。各チップをEtOHですすぎ、アルゴンガスで乾燥させた。チップを「低」プラズマ設定で10分間プラズマ洗浄した。プラズマ洗浄の後、チップを再度EtOHですすぎ、アルゴンで乾燥させた。補助部分(基板、ガスケット、タブ)をハンドソープでこすることによって手洗いし、脱イオン水および超純水ですすぎ、EtOHですすぎ、空気乾燥させた。チップを組み立て、次にEtOHで漏れを試験して、ガスケットが十分な密封を確実に形成するようにした。上のように調製した500uLの析出溶液を、各チップのタブに加えた。密封した、覆われたガラス容器でチップを一晩インキュベートした。
適切なSAMの形成を確認するための初期試験
一晩インキュベートした後、チップを容器から取り出した。
チップを以下のとおりに洗浄した:
エタノールで2回
超純水で6回
LiClO4で2回。
500uLの試験溶液(上の表を参照のこと)を各タブに加えた。
電極(上の表を参照のこと)をCHI系(使用する前に、Pt対電極をプロパントーチで洗浄し、EtOHですすいだ)に接続した。
全てのチップについて:
10000mV/秒のCV、100mV/秒のCVでの試験の際に決定された範囲の間でサイクリックボルタンメトリーを行った。
さらなる溶液を加える前に、チップを超純水で4回洗浄した。
1000ulのEDCを1000uLのNHSに加えた。
200uLのこの混合溶液を4つのチップに加えた。
30分間インキュベートした。注記:全てのインキュベーションを空のピペットチップ容器中で行い、光への暴露を最小限に抑えるために箔で覆った。インキュベーションの後、超純水で4回洗浄した。
200uLのストレプトアビジン溶液を加えた。
1時間インキュベートした。
PBSで4回、LiClO4で1回洗浄した。
チップ3〜6を、3.5.1として試験した。
注記:試験したチップのみをLiClO4で洗浄した。試験した全てのチップをPBSで4回再度洗浄した。これは以下の全ての工程に当てはまる。
200uLのエタノールアミンを各チップに加えた。
15分間インキュベートした。
PBSで4回洗浄した。
BSAブロッキング
0.1%のBSAを加えた。
10分間インキュベートした。
PBSで4回、LiClO4で1回洗浄した。
チップ3〜6を3.5.1として試験した。
Gox−ビオチンストックの濃度は1mg/mLであるため、4uLのGox−ビオチンストックを396uLのPBSに加えた。
200uLの10ug/mLのGox−ビオチンをチップ#1および2に加えた。
1時間インキュベートした。
mAb 19C7−ビオチンのストックは1.7mg/mLであるため、17ug/mLの濃度になるように8uLを792uLのPBSに加えた。
100uLの抗体−ビオチンを#3〜10に加えた。
両方の溶液を45分間インキュベートさせておいた。
チップ3〜6をPBSで4回、LiClO4で1回洗浄し、試験した。
トロポニンアリコート(1mg/mL)を−20Cの冷凍庫から取り、解凍した。1uLを9uLのPBSに加え、100ug/mLを得た。注記:この希釈は、尿素/トリス緩衝液中で行った。1uLの100ug/mLを48uLのPBSに加えた。
mAb16A11−Goxを冷蔵庫から取り出した(1.7mg/mL)。
1uLのmAb16A11−GoxをPBS/トロポニン溶液に加え、ボルテックスした。この溶液を30分間インキュベートした。
チップ#1、#2をPBSで4回、LiClO4で1回洗浄し、試験した。
試験の後、それらをPBSで4回洗浄した。
20uLの1M〜9980uLのNaHCO3(pH8.5)を取り込むことによって、2mMのグルコース溶液を調製した。
500uLの2mMのグルコースを両方のチップに加え、10分間インキュベートした。
次に、#1、2をPBSで4回、LiClO4で1回洗浄し、試験した。
チップをPBSで4回洗浄した。
チップを100mMのH2O2で2分間インキュベートし、次に洗浄し、試験した。
チップ3〜10をPBSで4回洗浄した。
トロポニンおよびmAb16A11−Goxの50uLのインキュベート物を、PBS中で1.2mLになるまで希釈した。
溶液をボルテックスした。
150uLのこの溶液をチップ3〜10に加え、30分間インキュベートした。
チップ3〜10をPBSで4回洗浄した。
チップ5〜8をLiClO4で1回洗浄し、試験した。
チップ5〜8をPBSで4回洗浄した。
500uLの100mMのH2O2を、#6〜7に2分間加えた。インキュベーションの後、それらをPBSで4回、LiClO4で1回洗浄し、試験した。
2mMのグルコースをチップ9、10に加え、20分間インキュベートした。インキュベーションの後、それらをPBSで4回、LiClO4で1回洗浄し、試験した。
金蒸着電極を、0.2%のTween 20溶液中での5分間の超音波処理によって清浄にし、エタノールで洗浄してから、10分間のプラズマイオン化を行った。次に、電極をエタノールで洗浄してから、析出溶液に曝した。析出溶液は、化合物1(0.1mM)、ジヒドロキシジスルフィド(0.5mM(C6−S)2)およびジヒドロキシ−ジヘキシル−ジスルフィド(0.5mM(HO−C6−S)2)および16−メルカプトヘキサデカン酸(0.01mM)から構成されていた。析出溶液を金電極上で一晩、約18時間インキュベートした。次に、析出溶液を除去し、電極をエタノールで洗浄した後、水で洗浄した。1/1体積/体積のNHS(0.1M)およびEDC(0.4M)を用いてMHAを30分間活性化した。この活性化の後、電極を水で洗浄し、10mMの酢酸ナトリウム(pH5.7)に溶解させたストレプトアビジン(0.05mg/mL)を用いて1時間インキュベートした。検定の残りの工程のために各工程間で電極をPBSで洗浄した。未反応のMHA部位をキャッピングするためにエタノールアミン(0.1mMのNaHCO3)を15分間加えた。非特異的結合を低減するためにPBS緩衝液に溶解させたBSA(0.1重量%)を10分間加えた。一次抗体(mAb−19c7−ビオチン、HyTest)を17ug/mLの濃度で加え、45分間インキュベートした。この時間の間、二次抗体(34ug/mL、mAb−16A11−GOx、Hytest)をヒト心筋トロポニンI(2ug/mL)でインキュベートした。次に、二次抗体−トロポニン錯体を該当する濃度で電極に加え、30分間インキュベートした。この時点で、完全な「サンドイッチ」を単分子層のMHA上に作り上げる。次に、グルコース(2mM)を10分間インキュベートし、溶液を除去し、電極をPBSで洗浄し、LiClO4(1M)中でのサイクリックボルタモグラムを記録した。
Claims (9)
- 試験試料中の標的検体を検出するための方法であって:
(a)(i)自己組織化単分子層(SAM)と;
(ii)自壊的部分と過酸化物感受性部分(PSM)とを含む遷移金属錯体を含む共有結合された電気活性部分(EAM)であって、第1の標準電極電位(E0 )を有するEAMと、
(iii)前記検体を結合する捕捉結合リガンドと
を含む電極を含む固体支持体を提供する工程と;
(b)前記標的検体が前記捕捉結合リガンドを結合して第1の錯体を形成する条件下で、前記標的検体と前記固体支持体とを接触させる工程と;
(c)前記標的検体を結合する可溶性捕捉リガンドと前記第1の錯体を接触させる工程であって、前記可溶性捕捉リガンドが、第2の錯体を形成するための過酸化物生成部分を含む工程と;
(d)前記EAMが第2のE0を有するように、過酸化物が生成され、前記自壊的部分が除去される条件下で、過酸化物基質を前記第2の錯体に加える工程と;
(e)前記標的の存在の指標としての前記第2のE0を検出する工程と
を含む方法。 - 前記工程(b)の前に、洗浄工程が行われる、請求項1に記載の方法。
- 前記工程(c)の前に、洗浄工程が行われる、請求項1または2に記載の方法。
- 前記工程(b)および(c)が同時に行われる、請求項1に記載の方法。
- 前記過酸化物生成部分がグルコースオキシダーゼ酵素である、請求項1〜4のいずれか一項に記載の方法。
- 前記固体支持体が電極の配列を含む、請求項1に記載の方法。
- 前記遷移金属が、鉄、ルテニウムおよびオスミウムからなる群から選択される、請求項1〜6のいずれか一項に記載の方法。
- 前記EAMがフェロセンである、請求項1〜7のいずれか一項に記載の方法。
- (a)(i)自己組織化単分子層(SAM)と;
(ii)自壊的部分と過酸化物感受性部分(PSM)とを含む遷移金属錯体を含む共有結合された電気活性部分(EAM)であって、前記自壊的部分が前記EAMに共有結合される場合、第1の標準電極電位(E0 )を有し、前記自壊的部分が存在しない場合、第2のE0を有する、EAMと;
(iii)前記検体を結合する捕捉結合リガンドと
を含む電極と;
(b)前記標的検体を結合する可溶性捕捉リガンドであって、過酸化物生成部分を含む可溶性捕捉リガンドと
を含む固体支持体を含む組成物。
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