CN108562751A - 酶膜及其制备方法、糖化血红蛋白的检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种酶膜及其制备方法、糖化血红蛋白的检测方法。所述酶膜包括基底层、以及自基底层一表面向外依次叠设的酶层、抗干扰层。所述糖化血红蛋白的检测方法，将上述酶膜贴附于过氧化氢电极的银片表面；将糖化血红蛋白样品加入含有非离子表面活性剂和蛋白质羧基修饰剂的溶血剂中，获得样品液；以前述过氧化氢电极对样品液进行检测并经采集器采集检测数据，随后进行放大处理，最后由计算机计算出所述样品液中糖化血红蛋白的浓度。该发明的酶膜具有良好的生物相容性，并且能够牢固的将酶层进行附着，确保昂贵的蛋白分解酶与氧化酶可以长期重复使用，将其与过氧化氢电极结合后用于糖化血红蛋白的测试时，具有快速、准确、可重复使用等特点。

Description

酶膜及其制备方法、糖化血红蛋白的检测方法
技术领域
本发明属于糖化血红蛋白的检测技术领域，具体涉及一种酶膜及其制备方法、糖化血红蛋白的检测方法。
背景技术
正常血红蛋白有3种：血红蛋白A(HbA)、血红蛋白F(HbF)、血红蛋白A2(HbA2)，而在成人细胞中主要含有HbA。
使用层析法分离血红蛋白时，可洗脱出3中含糖成分：HbA1a、HbA1b和HbA1c，这些含糖成分统称为糖化血红蛋白(GHb)。其中，糖化血红蛋白(HbA1c)是血液中红细胞内血红蛋白与血糖结合的产物。自20世纪70年代末期，常规实验室常以HbA1c作为检测项目，并且稳定发展至今。通过检测HbA1c，可以作为糖尿病控制是否良好的重要指标。现在国外已经将糖化血红蛋白监测作为糖尿病疗效判定和调整治疗方案的“金指标”。近年来有许多报道表明：HbA1c在冠心病、心肌梗死、脑梗死等疾病的诊治方面亦有很重要的临床价值。
目前HbA1c的检测方法主要有高效液相色谱法、硼酸亲和层析法、免疫法和酶法。其中，高效液相色谱法是采用C18反相HPLC进行初分离，0.1％的三氟乙酸-乙腈为洗脱液进行梯度洗脱，收集并冻干15～18min时间区间内得到的洗脱成分(糖基化和非糖基化β链氮端六肽的混合物)。冻干成分溶解于少量0.01％的三氟乙酸水溶液，并注入CE柱，在电压为25kV、温度为20℃、缓冲液为H3PO4/NaH2PO4(pH＝2.5)的条件下进行精细分离，根据214nm吸收峰测定糖基化以及非糖基化β链氮端六肽的相对含量。该方法具有高度的特异性，能排除包括镰刀型血红蛋白(hemoglobin S，HbS)、血红蛋白C(hemoglobin C，HbC)、胎儿血红蛋白(fetalhemoglobin，HbF)以及氨基甲酰化Hb等的干扰，能反应HbA1c的真实含量。
亲和层析法测定GHb含量的基本原理是采用氨基苯硼酸与固定相基质(如琼脂糖或聚丙烯胺等)交联作为分离介质，利用硼酸基团所携带的羟基与血红蛋白糖化所形成的顺位二元醇可逆结合，将GHb绑定在分离介质上，使其与非糖化血红蛋白分离，绑定的GHb成分通过山梨醇洗脱，其含量通常采用光谱法测定。由于亲和层析中硼酸基团并非针对HbA1c特异性绑定，除HbA1c外，其他位点的糖化产物同样能够与硼酸结合绑定，因此该法的检测对象为GHb。
免疫检测法是基于糖化与非糖化血红蛋白结构差异而设计的检测方法。其基本原理是采用较已知浓度过量的HbA1c抗体与其特异性结合形成可溶性复合物(免疫复合物)，通过测定该复合物的浓度直接表征HbA1c含量或通过测定剩余抗体含量间接表征HbA1c含量。
酶法测定HbA1c的基本原理和实验流程可大致分为三步。a.酶解：HbA1c经酶解反应，其β链糖基化的氮末端水解生成果糖基缬氨酸(fructosyl valine，FV)或果糖基缬氨酸组氨酸复合物(fructosyl valyl histidine，FVH)；b.酶催化：果糖基氨基酸复合物(FV、FVH)经FAOX、FPOX催化氧化产生过氧化氢；c.H2O2的测定：体系中产生的H2O2在过氧化物酶的存在下与显色剂产生显色反应，通过测定吸光度值求出HbA1c的百分浓度。该方法精密度好，与HPLC和免疫法均有良好的相关性。
高效液相色谱法所需仪器设备价格昂贵、需要专业人士进行操作、分析测试过程耗时较长、不利于临床应用，方法存在一定局限性。亲和层析法测定的是GHb，无法将HbA1a、HbA1b和HbA1c这三种物质进行区分，而且测试过程中硼酸与GHb二元醇之间的结合是可逆的，键合不稳定，洗脱流速以及洗脱溶液成分都会影响GHb与硼酸的结合，影响测定结果的准确性和精密度。免疫法中使用的特异性抗体价格高昂，而且缺乏生产糖化血红蛋白抗体的公司，供应量十分有限，并且需要反应-分离步骤，设备也非常复杂。酶法由于酶的特异性反应，抗干扰能力好，与高效液相色谱法、免疫法测定结果具有显著相关性。酶法检测试剂盒中需要三种昂贵的酶制剂，且酶制剂为一次性使用，每次检测均需采用新的酶制剂，会导致检测成本升高。此外，试剂盒中的显色剂易分解，稳定性差，从而影响检测结果的稳定性和准确性。
发明内容
针对目前糖化血红蛋白测试过程繁琐、测试时间长、专一异性差且无法有效进行区分具体的糖化血红蛋白类型等问题，本发明提供一种酶膜及其制备方法，以及借助酶膜检测糖化血红蛋白的方法。
为实现上述发明目的，本发明的技术方案如下：
一种酶膜，包括基底层、以及自所述基底层一表面向外依次叠设的酶层、抗干扰层。
相应地，所述酶膜的制备方法，至少包括以下步骤：
步骤S01.将基底层粘附于O型橡胶圈上；
步骤S02.将酶层的原料组分与双蒸水混合制成铸膜液；
步骤S03.将所述铸膜液涂覆于基底层的与所述O型橡胶圈相背对的表面，并在惰性气氛下干燥，获得叠设有酶层的基底层；
步骤S04.将全氟磺酸树脂溶液涂覆于步骤S03得到的酶层表面，干燥处理，获得酶膜。
以及，一种糖化血红蛋白的检测方法，至少包括以下步骤：
(a).将如上所述的酶膜贴附于过氧化氢电极的银片表面；
(b).将糖化血红蛋白样品加入含有非离子表面活性剂和蛋白质羧基修饰剂的溶血剂中，获得待测糖化血红蛋白样品液；以步骤(a)处理后的过氧化氢电极对所述糖化血红蛋白样品液进行检测并经采集器采集和放大处理，最后由计算机根据采集得到的电信号计算出所述待测糖化血红蛋白样品液中糖化血红蛋白的浓度。
本发明的技术效果为：
相对于现有技术，本发明上述提供的酶膜，其基底层具有良好的生物相容性，并且能够牢固的将酶层进行附着，确保酶膜可以长期重复使用，将其用于糖化血红蛋白的测试时，表现出较长的使用寿命，解决糖化血红蛋白测试成本过高的问题。
本发明上述酶膜的制备方法，工艺简单可行，并且获得的酶膜各个膜层有良好的附着力，保证具有较长的使用寿命。
本发明提供的糖化血红蛋白的检测方法，一方面将向样品中添加非离子表面活性剂和蛋白质羧基修饰剂，可显著的改善溶血速率，并且诱导血红蛋白的β链N端暴露在血红蛋白分子的外侧，从而加快血红蛋白检测的反应速率。蛋白质羧基修饰剂的存在柔化了糖化血红蛋白分子，使得其β链糖基化的氮末端的果糖基缬氨酸更容易被切除，进一步缩短反应时间，加快测试速度；另一方面采用本发明的酶膜，使得糖化血红蛋白分子能够顺利扩散进入酶层但又不会使酶出现催化底物饱和的情况，而酶膜可以长期重复使用，解决目前糖化血红蛋白测试成本过高的问题；此外，由于本发明酶膜的抗干扰层可以排斥血液样品中的还原性物质，使其无法达到过氧化氢电极铂金表面发生氧化反应产生干扰电流，从而使得电极具有较强的抗干扰能力，保证糖化血红蛋白的测试精度和准确性。
附图说明
为更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明酶膜的结构示意图；
图2为本发明过氧化氢电极和酶膜用于检测糖化血红蛋白时的结构示意图；
图3为本发明糖化血红蛋白测试时的放大电路示意图；
其中，1-基底层，也称作扩散限制层；2-酶层；3-抗干扰层；4-过氧化氢电极局部示意图，41-铂金，42-银片；5-O型橡胶圈；V-polarization表示极化电压。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
请参阅图1的示意图，本发明提供一种酶膜，包括基底层1、以及自基底层1一表面向外依次叠设的酶层2、抗干扰层3。
其中，基底层1也可以称作扩散限制层，具体是一种亲水型微孔薄膜。
优选地，基底层1可以为尼龙形成的尼龙层或者醋酸纤维素形成的醋酸纤维素层或者硝酸纤维素形成的硝酸纤维素层。这几种材料形成的基底层1，具有良好的生物相容性、且亲水性好，可以很好的牢固酶层2中的各种酶成分，使得获得的酶膜可以长期反复使用，表现出较长的使用寿命，这极大的减少酶的使用量，有效地解决将酶膜用于糖化血红蛋白测试时，测试成本过高的问题。
优选地，基底层1具有孔径，其孔径为0.6～1.0μm，厚度为30～95μm。在该孔径和厚度范围内，糖化血红蛋白分子能够顺利扩散进入酶层2，但是又不会使得酶出现催化底物饱和的情况。
优选地，酶层2为由分解酶、氧化酶、导电材料、成膜剂、酶稳定剂、防腐剂经过混合涂覆而成的复合膜层。以酶层2的质量为100％计，分解酶的含量为4.5～5.5％；氧化酶的含量为0.8～1.2％；导电材料的含量为0.2～1.6％；成膜剂的含量为90～92％；酶稳定剂的含量为1.2～1.8％；防腐剂的含量为0.2～0.6％。
所述复合膜层一方面可以对糖化血红蛋白进行酶解，同时有利于提高电子传递速率，提高检测响应电流，从而显著提高糖化血红蛋白的检测灵敏度和线性范围。
进一步优选地，所述分解酶为中性蛋白酶、胰蛋白酶、嗜热菌蛋白酶、胃蛋白酶中的至少一种；这几种分解酶可以切除糖化蛋白β链糖基化的氮末端水解生成果糖基缬氨酸。
所述氧化酶为果糖氨基酸氧化酶、果糖基肽氧化酶中的任一种。这几种氧化酶可以特异性地催化果糖基缬氨酸生成过氧化氢，并与过氧化氢电极耦合。
在上述分解酶和氧化酶的作用下，促进更多的过氧化氢生成，实现通过过氧化氢电极测定生成的H2O2含量来计算糖化血红蛋白的含量，从而省去过氧化氢检测所需要的显色剂，解决亲和层析法无法区分HbA1a、HbA1b和HbA1c这三种物质的问题，并且解决现有酶法中显色剂稳定性差而导致测试稳定性能差的问题。此外，通过酶固化技术获得的酶膜，使昂贵的酶制剂能多次重复使用，大大降低测试成本。
优选地，所述导电材料为单壁碳纳米管、多壁碳纳米管、憎水纳米金、亲水纳米金中的至少一种。这些导电材料具有大的比表面积、好的生物相容性，且可加快电子传递速度、增大电流响应，从而显著提高糖化血红蛋白的检测灵敏度和线性范围。
所述成膜剂为聚乙烯酰胺、海藻酸钠、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯醇、聚丙烯酸钠、明胶等中的任一种，主要起到锁定分解酶和氧化酶分子的作用，防止酶在测试过程中随样本流失，提高酶膜的测试稳定性，使酶膜的使用寿命增长。
优选地，所述酶稳定剂为复合酶稳定剂AES、甘油、蔗糖、糊精和精氨酸等中的任一种。向酶层2中添加酶稳定剂，可以确保多种酶的稳定性，从另一方面也可以延长酶膜的使用寿。
优选地，所述防腐剂为叠氮钠、庆大霉素中的任一种。防腐剂的添加可以对酶膜进行有效地抑菌和杀菌，避免细菌滋生腐蚀酶膜而影响酶膜的性能和使用寿命。
优选地，抗干扰层3为全氟磺酸树脂层。全氟磺酸树脂形成的膜层具有电负性，可以排斥血液样品中的抗坏血酸、尿酸、对乙酰氨基酚等还原性物质，使血液样品中的还原性物质无法达到过氧化氢电极铂金表面发生氧化反应产生干扰电流，从而使得电极具有较强的抗干扰能力，保证糖化血红蛋白的测试精度和准确性。
本发明的酶膜，由于比较薄，容易发生褶皱或者卷曲，为了方便储存和使用，一般会将酶膜贴附于O型橡胶圈5上。具体地，酶膜中的基底层1贴附在O型橡胶圈5中，通过O型橡胶圈5的作用，使得酶膜可以保持铺展状态。
相应地，本发明在提供在上述酶膜的前提下，还进一步提供该酶膜的制备方法。
在一实施例中，可以参考图2所示的酶膜，所述酶膜的制备方法至少包括以下步骤：
步骤S01.将基底层1粘附于O型橡胶圈5上；
步骤S02.将酶层2的原料组分与双蒸水混合制成铸膜液；
步骤S03.将所述铸膜液涂覆于基底层1的与所述O型橡胶圈5相背对的表面，并在惰性气氛下干燥，获得叠设有酶层2的基底层1；
步骤S04.将全氟磺酸树脂溶液涂覆于步骤S03得到的酶层2表面，干燥处理，得到抗干扰层3，至此，获得酶膜。
下面对本发明的制备方法做进一步的详细解释。
步骤S01中，具体可以将基底层1材料在质量浓度为30～40％的甲醇溶液中浸泡5～10h，随后用双蒸水冲洗干净并用高纯氮气吹干，使用直径为9mm的打孔器，将处理过的基底层1材料冲压成直径为9mm的膜片，用环氧树脂将基底层1粘贴于O型橡胶圈5上固化，获得基底层1，待用。将其固定于O型橡胶圈5中，一方面方便制作酶膜，另一方面，避免制作出的酶膜发生褶皱，不利于后续贴附在过氧化氢电极的银片上。
步骤S02中，将前文所述的酶层2原料组分与双蒸水混合至均匀，如在实验室制备时，可以采用漩涡振荡器进行震荡至均匀。
步骤S03中，如在实验室中将镀膜液涂覆于基底层1中，可以将铸膜液盛放于BioDot公司GlucoDot滴酶仪上，设置滴样体积为20μL，将铸膜液均匀等量地喷涂到基底层1上，然后用氮气吹干。
步骤S04中，全氟磺酸树脂溶液中，全氟磺酸树脂的质量浓度为1～7.5％。优选为5％。在实验室进行制备时，可以将全氟磺酸树脂溶液安装到GlucoDot滴酶仪上，设置滴样体积为40μL，将全氟磺酸树脂溶液均匀等量地喷涂到酶层2上，然后将酶膜移入2～5℃恒温干燥箱，干燥20～30h，即可获得抗干扰层3。
本发明上述提供的酶膜的制备方法，制备工艺简单可行，并且获得的酶膜膜层牢固性好，保证具有较长的使用寿命。
更进一步地，本发明还提供一种糖化血红蛋白的检测方法，可以参阅图2所示：
(a).将如上所述的酶膜贴附于过氧化氢电极的银片表面；
(b).将糖化血红蛋白样品加入含有非离子表面活性剂和蛋白质羧基修饰剂的溶血剂中，获得待测糖化血红蛋白样品液；以步骤(a)处理后的过氧化氢电极对所述糖化血红蛋白样品液进行检测并经采集器采集和放大处理，最后由计算机根据采集得到的电信号计算出所述待测糖化血红蛋白样品液中糖化血红蛋白的浓度。
具体地，所述非离子表面活性剂为十二烷基葡萄糖苷、十六烷基葡萄糖苷、辛基酚聚氧乙烯醚、烷基醇酰胺中的任一种，这些非离子表面活性剂可以诱导使得血红蛋白的β链N端暴露在血红蛋白分子的外侧，从而加快血红蛋白检测的反应速率。
优选地，所述非离子表面活性剂的浓度为0.9～5.1g/L。
所述蛋白质羧基修饰剂为碳酸胍、亚硝酸钠、亚硝酸钾中的任一种，蛋白质羧基修饰剂的存在柔化了糖化血红蛋白分子，使得其β链糖基化的氮末端的果糖基缬氨酸更容易被切除，进一步缩短反应时间，加快测试速度。
优选地，所述蛋白质羧基修饰剂的浓度为21～53g/L。
在检测中，基底层也可以叫做扩散限制膜，所述扩散限制膜为尼龙膜、醋酸纤维素膜、硝酸纤维素膜中的任一种。这些扩散限制膜可以排斥血液样品中的抗坏血酸、尿酸、对乙酰氨基酚等还原性物质，使其无法达到过氧化氢电极铂金表面发生氧化反应产生干扰电流，从而使得电极具有较强的抗干扰能力，保证糖化血红蛋白的测试精度和准确性。
其具体的测试原理如下：
样品液中的糖化血红蛋白通过基底层1进入酶膜的酶层2，并在在酶层2中依次发生如下(1)至(2)式所示的反应：
(2)式产生的过氧化氢(H2O2)经过酶膜的抗干扰层3进入过氧化氢电极正极铂金41表面，发生如(3)式所示的反应：
反应式(3)中反应放出电子，产生电流，电流大小与糖化血红蛋白浓度成正比，经过如图3所示的放大电路进行放大后，由计算机采集换算成糖化血红蛋白的浓度。
为更有效的说明本发明的技术方案，下面通过具体实施例说明本发明的技术方案。
实施例1
本实施例涉及一种酶膜及其制备方法和采用该酶膜结合过氧化氢电极耦合快速检测糖化血红蛋白的方法，具体如下。
(一).一种酶膜，其结构如图1所示，包括尼龙基底层1、叠设于所述尼龙基底层1一表面的酶层2以及叠设于所述酶层2表面的全氟磺酸树脂层3。
(二)上述酶膜的制备方法，包括以下步骤：
(1).以孔径为0.8μm、厚度为60μm的尼龙膜作为酶的载体，也就是尼龙基底层1；将尼龙膜在35％的甲醇溶液中浸泡6h后，用双蒸水冲洗干净并用高纯氮气吹干；使用直径为9mm的打孔器，将处理过的尼龙膜冲压成直径为9mm的膜片，用环氧树脂将尼龙膜片粘贴于O型橡胶圈上固化待用，固化在O型橡胶圈上主要是方便后续的涂覆过程。
(2).将中性蛋白酶、果糖氨基酸氧化酶、多壁碳纳米管、聚乙烯酰胺、复合酶稳定剂AES、叠氮钠按质量比5：1：0.7：91.3：1.5：0.5的比例进行混合，得到总质量为206mg的混合物，将该混合物溶解到3mL双蒸水在漩涡振荡器上振荡混合均匀，制备出铸膜液。
(3).将步骤(2)的铸膜液安装到BioDot公司GlucoDot滴酶仪上，设置滴样体积为20μL，将铸膜液均匀等量地喷涂到步骤(1)得到的尼龙膜上，然后用氮气吹干。
(4).将浓度为5％的全氟磺酸树脂水溶液安装至GlucoDot滴酶仪，设置滴样体积为40μL，将全氟磺酸树脂水溶液均匀等量地喷涂到步骤(3)得到的酶层上，然后移入2℃恒温干燥箱，干燥20h，即在酶层上制成抗干扰层，整个酶膜制作完毕。
为验证实施例1制作得到的酶膜与过氧化氢电极共同用于测试糖化血红蛋白的性能，首先将其贴附于过氧化氢电极的银片表面；
具体如图2所示。再将图2所示组合得到的过氧化氢电极安装至西尔曼科技生物传感器分析仪上进行糖化血红蛋白的测试。
测试前配制浓度分别为60μM、90μM、135μM、231μM的四份糖化血红蛋白样品，标记为P1、P2、P3、P4，随后进行测试，测试结果如表1所示。
表1
样品 P1 P2 P3 P4
理论浓度(μM) 60 90 135 231
实测浓度(μM) 59.6 91.0 134.1 231.7
由表1可以看出，本发明方法测试糖化血红蛋白，具有准确度高，测试范围宽的特点，完全满足医疗行业对糖化血红蛋白测试的要求。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包括在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种酶膜，其特征在于，包括基底层、以及自所述基底层一表面向外依次叠设的酶层、抗干扰层。
2.如权利要求1所述的酶膜，其特征在于，所述酶层为由分解酶、氧化酶、导电材料、成膜剂、酶稳定剂、防腐剂混合而成的复合膜层。
3.如权利要求2所述的酶膜，其特征在于，以所述酶层质量为100％计，含有分解酶4.5～5.5％；氧化酶0.8～1.2％；导电材料0.2～1.6％；成膜剂90～92％；酶稳定剂1.2～1.8％；防腐剂0.2～0.6％。
4.如权利要求2或3所述的酶膜，其特征在于，所述分解酶为中性蛋白酶、胰蛋白酶、嗜热菌蛋白酶、胃蛋白酶中的至少一种；
和/或所述氧化酶为果糖氨基酸氧化酶、果糖基肽氧化酶中的任一种；
和/或所述导电材料为单壁碳纳米管、多壁碳纳米管、憎水纳米金、亲水纳米金中的至少一种；
和/或所述成膜剂为聚乙烯酰胺、海藻酸钠、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯醇、聚丙烯酸钠、明胶中的任一种；
和/或所述酶稳定剂为复合酶稳定剂AES、甘油、蔗糖、糊精和精氨酸中的任一种；
和/或所述防腐剂为叠氮钠、庆大霉素、苯甲酸钠中的任一种。
5.如权利要求1所述的酶膜，其特征在于，所述基底层为亲水型微孔薄膜；和/或所述基底层的孔径为0.6～1.0μm，厚度为30～95μm。
6.如权利要求1所述的酶膜，其特征在于，所述抗干扰层为全氟磺酸树脂层。
7.一种如权利要求1～6任一项所述的酶膜的制备方法，其特征在于，至少包括以下步骤：
步骤S01.将基底层粘附于O型橡胶圈上；
步骤S02.将酶层的原料组分与双蒸水混合制成铸膜液；
步骤S03.将所述铸膜液涂覆于基底层的与所述O型橡胶圈相背对的表面，并在惰性气氛下干燥，获得叠设有酶层的基底层；
步骤S04.将全氟磺酸树脂溶液涂覆于步骤S03得到的酶层表面，干燥处理，获得酶膜。
8.如权利要求7所述的酶膜的制备方法，其特征在于，所述全氟磺酸树脂溶液的质量浓度为1.0～8％。
9.一种糖化血红蛋白的检测方法，其特征在于，至少包括以下步骤：
(a).将如权利要求1～6任一项所述的酶膜贴附于过氧化氢电极的银片表面；
(b).将糖化血红蛋白样品加入含有非离子表面活性剂和蛋白质羧基修饰剂的溶血剂中，获得待测糖化血红蛋白样品液；以步骤(a)处理后的过氧化氢电极对所述糖化血红蛋白样品液进行检测并经采集器采集和放大处理，最后由计算机根据采集得到的电信号计算出所述待测糖化血红蛋白样品液中糖化血红蛋白的浓度。
10.如权利要求9所述的糖化血红蛋白的检测方法，其特征在于，所述非离子表面活性剂为十二烷基葡萄糖苷、十六烷基葡萄糖苷、辛基酚聚氧乙烯醚、烷基醇酰胺中的任一种，所述非离子表面活性剂的浓度为0.9～5.1g/L；
和/或所述蛋白质羧基修饰剂为碳酸胍、亚硝酸钠、亚硝酸钾中的任一种，所述蛋白质羧基修饰剂的浓度为21～53g/L。
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