CN109884149A - 糖化血红蛋白电化学发光酶传感器制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及糖化血红蛋白电化学发光酶传感器制备方法。本发明的技术方案是制备纳米复合物；将纳米复合物滴涂在电极表面；将酶复合物固定在电极上；将电极放到发光池，得到糖化血红蛋白电化学发光酶传感器；所述纳米复合物的制备工艺：基于静电纺丝制备出TiNTs@C复合物，然后将金或铂金纳米粒子负载在TiNTs@C复合物上，获得Au/TiNTs@C或AuPt/TiNTs@C纳米复合物。本发明克服了HPLC法易受大部分血红蛋白变异体的干扰、干扰洗脱过程、检测时间长、试剂和设备昂贵、检测费用高等缺陷。本发明可有效避免血红蛋白变异体和血尿素引起的干扰，具有良好的灵敏度、准确性和稳定性，检测速度快，成本低廉、操作简单，适用于开发便携式。
Description
技术领域
本发明涉及生物化学技术领域，特别涉及糖化血红蛋白电化学发光酶传感器制备方法。
背景技术
糖化血红蛋白(glycated hemoglobin，HbA1c)是人体血液中红细胞内的血红蛋白β链-N末端缬氨酸的氨基与血液中的葡萄糖缓慢、持续且不可逆的非酶促反应的产物，可反映人体内既往2-3个月平均血糖水平，成为糖尿病患者长期随访的金标准，也是指导临床调整治疗方案的重要依据。
目前，已有将HbA1c作为诊断2型糖尿病指标，但HbA1c目前尚未作为诊断指标列入我国2型糖尿病防治指南，其中一个重要原因是对血红蛋白变异体测定结果的干扰无法提供干扰的验证实验和对测定结果给予临床合理解释。
在本发明作出之前，在临床实验室HbA1c的主要检测方法为高效液相色谱法(HPLC)。但是，HPLC法的缺点为洗脱过程中易受大部分血红蛋白变异体的干扰、血尿素升高的患者也干扰洗脱过程、检测过程需要多次洗脱致检测时间长、试剂和设备昂贵、检测费用高、且需要专业人员能够准确识别异常色谱图。这些缺点可造成HbA1c检测结果不准，会导致临床医生漏诊或者误诊，影响糖尿病患者及时诊治、出现慢性并发症，甚至用药过度造成患者出现低血糖；检测费用高及试剂、设备昂贵会给患者和医院造成经费负担，甚至导致部分患者无法及时就诊，影响患者控制血糖；检测时间长会浪费患者及医务人员宝贵的时间。
因此，发展一种可避免血红蛋白变异体和血尿素干扰、快速、准确、低成本和操作简单的糖化血红蛋白检测方法至关重要。
发明内容
本发明的目的就在于克服上述缺陷，研制检测糖化血红蛋白电化学发光酶传感器制备方法。
本发明的技术方案是：
一种糖化血红蛋白电化学发光酶传感器制备方法，其主要技术特征在于步骤如下：
(1)制备纳米复合物；
(2)将纳米复合物滴涂在电极表面；
(3)将酶复合物固定在电极上；
(4)将电极放到发光池，得到糖化血红蛋白电化学发光酶传感器；
所述纳米复合物的制备工艺：
基于静电纺丝制备出TiNTs@C复合物，然后将金或铂金纳米粒子负载在TiNTs@C复合物上，获得Au/TiNTs@C或AuPt/TiNTs@C纳米复合物。
所述步骤(2)中，将Au/TiNTs@C或AuPt/TiNTs@C纳米复合物滴涂在ITO电极表面，形成Au/TiNTs@C/ITO或AuPt/TiNTs@C/ITO电极。
所述步骤(3)中，将戊二醛、牛血清蛋白和果糖基氨基酸氧化酶三种溶液混合均匀后形成酶复合物溶液，取此酶复合物溶液滴涂在Au/TiNTs@C/ITO或AuPt/TiNTs@C/ITO电极上，交联反应后得到FAO/Au/TiNTs@C/ITO或FAO/AuPt/TiNTs@C/ITO电极。
本发明的优点和效果在于：
1.该方法不仅可有效避免血红蛋白变异体和血尿素引起的干扰，而且具有良好的灵敏度、准确性和稳定性，检测速度快。
2.电化学发光酶传感器法成本低廉、操作简单，患者在专业人员的指导下即可在家自行检测HbA1c，适用于开发便携式HbA1c检测仪器，具有很好的社会效益和应用前景。
具体实施方式
本发明的技术思路是：
为了克服HPLC法仪器洗脱过程中易受大部分血红蛋白变异体和血尿素的干扰、检测时间长、试剂和设备昂贵、检测费用高且需要专业人员能够准确识别异常色谱图的缺陷，本发明欲从电化学发光酶传感器入手，采用静电纺丝技术、半导体纳米材料、金属纳米材料、酶固定、电极修饰和传感器等手段，最后期望得到一种可避免血红蛋白变异体和血尿素干扰、快速、准确、低成本和操作简单的糖化血红蛋白电化学发光酶传感器。
下面具体说明本发明。
步骤一：制备纳米复合物
先准备前驱体待纺溶液，然后设置静电纺丝参数，一次性注射器吸取前驱体待纺溶液后连接高压电源的正极，液体通过喷射口，在金属接收器表面形成一层膜。静电纺丝技术制备的纳米纤维具有高效快捷和成本低廉等特点，因此可以降低制作成本。将膜放在冲入稀有气体的管式炉中高温退火，冷却至室温，得到粉末，即二氧化钛管包裹碳棒的结构，该结构克服了二氧化钛的透光性，因此能够在电化学发光方面得到应用。再制备粉末分散液，将贵金属纳米粒子加入改分散液中，制得纳米复合物。该纳米复合物具有大比表面积、良好的导电性和较好的生物相容性。较大的比表面积，使得传感器表面的生物分子固定量呈指数倍增长；而良好的导电性能和较好的生物相容性够加快催化氧化还原反应和增强鲁米诺的电化学发光强度，从而提高了反应速度和灵敏度。
步骤二：将纳米复合物滴涂在电极表面
先制备块状的ITO电极，洗净后用气体吹干备用。取纳米复合物滴涂在ITO电极表面，红外灯下烘干2h，于保干器中保存。电极体积较小，降低纳米复合物用量，均可降低检测成本。
步骤三：将酶复合物固定在电极上
采用中性或偏酸性缓冲溶液配制酶混合溶液，立刻取混合溶液滴涂在电极表面。由于电极表面包含果糖基氨基酸氧化酶，可确保对糖化血红蛋白上的果糖缬氨酸特异性识别，因此，可避免血红蛋白变异体和血尿素的干扰，提高检测的准确性。酶固定化后，有利于运输、贮存、自动化生产，降低成本。
步骤四：将电极放到发光池，得到糖化血红蛋白电化学发光酶传感器
将电极放到发光池，发光池为含有鲁米诺的盒，就得到糖化血红蛋白电化学发光酶传感器。鲁米诺具有无毒、廉价等优点，可降低检测成本。由于电化学发光的能量是由电化学反应过程提供，从而具有鲁米诺可重复使用、重现性较好的优点。鲁米诺重复使用可减少其他试剂的使用，因此，可降低成本和使设备简单化、微型化；较好的重现性可提高检测结果的稳定性。此外，果糖基氨基酸氧化酶与果糖缬氨酸反应产生过氧化氢，而过氧化氢可增强鲁米诺的电化学发光强度，也可提高检测的灵敏度。糖化血红蛋白电化学发光酶传感器是基于糖化与非糖化血红蛋白结构的不同而HPLC法是基于糖化与非糖化血红蛋白所带电荷不同，因此，检测原理不同。同时，糖化血红蛋白电化学发光酶传感器没有色谱图，无需专业人员识别色谱图，体积较小，因此，可使操作简单化和设备微型化，患者在专业人员指导下即可在家自行检测。
实施例1：
步骤一：制备纳米复合物
先准备前驱体待纺溶液，将0.4g聚乙烯吡咯烷酮(PVP)在4g无水乙醇、2g乙酸、3g钛酸丁酯的混合溶液中溶解，磁力搅拌2h。然后设置静电纺丝参数：纺丝间距为20cm，纺丝电压为16kV，一次性双喷头注射器连接16kV电源的正极。双喷头注射器里层吸取4ml PVP溶液，外层吸取5ml混合液，液体通过喷射口，最终在铝箔接收器形成一层肉眼可见的膜。将膜刮下后放在冲入氩气的管式炉中500℃退火2h，然后自然冷却至室温，得到肉眼可见的粉末，即二氧化钛管包裹碳棒(TiNTs@C)的结构。接着水解氨丙基三甲氧基硅烷，在粉末的表面覆盖聚合物膜。取0.1g粉末分散于30mL乙醇中，混匀，加入250μL氨丙基三甲氧基硅烷和氨水。反应12h，离心，用乙醇和纯水洗涤4次，分散在20mL的纯水，再将金纳米粒子加入该分散液中，离心，并用纯水洗涤3次，制得Au/TiNTs@C纳米复合物。
步骤二：将纳米复合物滴涂在电极表面
将ITO电极用玻璃刀裁成大小为1.0cm×1.2cm的块状，放入干净烧杯中，用蒸馏水冲洗后依次使用NaOH和无水乙醇的混合液(体积比1∶1)、丙酮、纯水，分别清洗30min，最后用氮气吹干备用。取0.1g纳米复合物滴涂在ITO电极表面，红外灯下烘干2h，形成Au/TiNTs@C/ITO电极，后于保干器中保存。
步骤三：将酶复合物固定在电极上
采用pH为7.0的PBS溶液配制的戊二醛、牛血清蛋白和果糖基氨基酸氧化酶溶液，三种溶液按体积比1∶1∶1混合均匀后形成酶复合物溶液，立刻取6μL滴涂在Au/TiNTs@C/ITO电极表面。交联反应后形成FAO/Au/TiNTs@C/ITO电极，放4℃冰箱晾干保存。
步骤四：将电极放到发光池，得到糖化血红蛋白电化学发光酶传感器将FAO/Au/TiNTs@C/ITO电极放到发光池，发光池为含有鲁米诺的盒，得到糖化血红蛋白电化学发光酶传感器。
实施例2：
步骤一中将铂金纳米粒子加入到分散液得到AuPt/TiNTs@C纳米复合物。
步骤三中采用pH为7.5的PBS溶液，戊二醛、牛血清蛋白和果糖基氨基酸氧化酶溶液三种溶液按体积比1∶1∶2混合均匀，得到FAO/AuPt/TiNTs@C/ITO电极。
余同实施例1。
Claims (3)
1.一种糖化血红蛋白电化学发光酶传感器制备方法，其特征在于步骤如下：
(1)制备纳米复合物；
(2)将纳米复合物滴涂在电极表面；
(3)将酶复合物固定在电极上；
(4)将电极放到发光池，得到糖化血红蛋白电化学发光酶传感器；
所述纳米复合物的制备工艺：
基于静电纺丝制备出TiNTs@C复合物，然后将金或铂金纳米粒子负载在TiNTs@C复合物上，获得Au/TiNTs@C或AuPt/TiNTs@C纳米复合物。
2.根据权利1所述的一种糖化血红蛋白的电化学发光酶传感器制备方法，其特征在于步骤(2)中，将Au/TiNTs@C或AuPt/TiNTs@C纳米复合物滴涂在ITO电极表面，形成Au/TiNTs@C/ITO或AuPt/TiNTs@C/ITO电极。
3.根据权利1或2所述的一种糖化血红蛋白的电化学发光酶传感器制备方法，其特征在于步骤(3)中，将戊二醛、牛血清蛋白和果糖基氨基酸氧化酶三种溶液混合均匀后形成酶复合物溶液，取此酶复合物溶液滴涂在Au/TiNTs@C/ITO或AuPt/TiNTs@C/ITO电极上，交联反应后得到FAO/Au/TiNTs@C/ITO或FAO/AuPt/TiNTs@C/ITO电极。
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