CN108169494B - 一种检测脂联素的胶体金试纸条及其定量检测方法 - Google Patents

一种检测脂联素的胶体金试纸条及其定量检测方法 Download PDF

Info

Publication number
CN108169494B
CN108169494B CN201810141218.7A CN201810141218A CN108169494B CN 108169494 B CN108169494 B CN 108169494B CN 201810141218 A CN201810141218 A CN 201810141218A CN 108169494 B CN108169494 B CN 108169494B
Authority
CN
China
Prior art keywords
colloidal gold
adiponectin
test strip
antibody
solution
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201810141218.7A
Other languages
English (en)
Other versions
CN108169494A (zh
Inventor
夏宣喜
赖华
孔浩杰
刘志文
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Guangdong Uniten Biotechnology Co ltd
Original Assignee
Guangdong Uniten Biotechnology Co ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Guangdong Uniten Biotechnology Co ltd filed Critical Guangdong Uniten Biotechnology Co ltd
Priority to CN201810141218.7A priority Critical patent/CN108169494B/zh
Publication of CN108169494A publication Critical patent/CN108169494A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN108169494B publication Critical patent/CN108169494B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6854—Immunoglobulins
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/92—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving lipids, e.g. cholesterol, lipoproteins, or their receptors

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)

Abstract

本发明公开一种检测脂联素的胶体金试纸条及其定量检测方法，其中，所述检测脂联素的胶体金试纸条包括PVC衬板、硝酸纤维素膜、耦合物结合垫片、样本垫片及吸水垫片，所述PVC衬板上粘贴有硝酸纤维素膜，所述硝酸纤维素膜的一端粘贴有耦合物结合垫片，另一端粘贴有吸水垫片，所述耦合物结合垫片上粘贴有样本垫片；所述硝酸纤维素膜上设置有测试带和控制带，所述测试带内包被有鼠抗脂联素抗体，所述控制带内包被有兔抗鼠抗体；所述耦合物结合垫片包被有胶体金标记脂联素抗体。本发明的检测脂联素的胶体金试纸条具有方便快捷，操作简单，耗时较短，便于临床推广应用等优点。

Description

一种检测脂联素的胶体金试纸条及其定量检测方法
技术领域
本发明涉及医学检验领域，特别涉及一种检测脂联素的胶体金试纸条及其定量检测方法。
背景技术
脂肪组织（adipose tissue）主要由大量聚集成团的脂肪细胞构成，脂联素(Adiponectin)是脂肪细胞分泌的一种内源性生物活性多肽或蛋白质。正常人血清中脂联素的浓度范围在3～30μg/mL，占血浆蛋白总量的0.01％，不随饮食或昼夜节律而改变，女性血清中的脂联素含量大于男性。随着对脂联素研究的不断深入，已发现，脂联素在肥胖症患者和II型糖尿病患者血清中的浓度明显低于非肥胖者，其浓度的降低导致了胰岛素抵抗和高胰岛素血症，而脂联素有防止动脉粥样硬化斑块形成的作用，因此，脂联素与肥胖症患者II型糖尿病及冠心病的发生发展密切相关，即脂联素的明显降低预示着II型糖尿病及冠心病的发生明显增加。测定血中脂联素水平，对这些疾病的诊断和预后有重要意义。
而现有技术中一般采用酶联免疫分析试剂盒来检测脂联素浓度，虽然酶联免疫法检测的准确度较高，但是该方法检测过程繁琐，耗时较长，且样本需要批量检测，不适用于及时检测。
发明内容
本发明的主要目的是提出一种检测脂联素的胶体金试纸条及其定量检测方法，具有方便快捷、操作简单、耗时较短的特点。
为实现上述目的，本发明提出的检测脂联素的胶体金试纸条，包括PVC衬板、硝酸纤维素膜、耦合物结合垫片、样本垫片及吸水垫片，所述PVC衬板上粘贴有硝酸纤维素膜，所述硝酸纤维素膜的一端粘贴有耦合物结合垫片，另一端粘贴有吸水垫片，所述耦合物结合垫片上粘贴有样本垫片；所述硝酸纤维素膜上设置有测试带和控制带，所述测试带内包被有鼠抗脂联素抗体，所述控制带内包被有兔抗鼠抗体；所述耦合物结合垫片包被有胶体金标记脂联素抗体。
优选地，所述检测脂联素的胶体金试纸条还包括壳体，所述壳体上设置有加样窗口和检测窗口，所述加样窗口位于所述样本垫片处，所述检测窗口位于所述测试带和所述控制带处。
优选地，所述硝酸纤维素膜按如下步骤制备：
分别将测试带抗体原液和控制带抗体原液在4℃下以6000～13000r/min速度离心60min，吸取两种上清液；
将两种上清液分别装入透析袋，用双蒸水透析去除盐分后，超滤浓缩后装瓶冷冻，得到测试带抗体和控制带抗体；
用pH值为6.5～6.7的磷酸盐缓冲液或Tris缓冲液分别稀释两种抗体，得到0.8mg/ml测试带包被液和0.8mg/ml控制带包被液；
将所述测试带包被液和所述控制带包被液分别喷涂在硝酸纤维素膜对应的测试带和控制带位置，喷涂量为1μL/cm；
再将包被好硝酸纤维素膜置于37℃温度下烘干。
优选地，所述样本稀释液包括磷酸盐缓冲液和/或Tris缓冲液。所述磷酸盐缓冲液按重量计包括：Na2HPO40.263-0.376份，KH2PO41.000-1.109份，NaCl6份，KCl0.2份，蒸馏水1000份；
所述Tris缓冲液按重量计包括：三羟甲基氨基甲烷4.6-5.5份，KH2PO42.0-3.0份，NaCl8份，KCl0.4份，牛血清白蛋白9份，蒸馏水1200份。
优选地，所述胶体金标记脂联素抗体按如下步骤制备：
将质量分数为1%氯金酸与双蒸水按体积比1∶79配成A液；将质量分数为1％柠檬酸三钠、质量分数为1％鞣酸、25mM K2CO3与双蒸水按体积比4∶0.035～0.080∶0.035～0.080∶15.84～15.93配成B液；再将所述A液和所述B液在水浴内同时加热到59～61℃，搅拌A液，快速加入B液，继续搅拌1分钟，在10～13分钟内加热至沸腾，得到胶体金液；
利用0.25M K2CO3调整所述胶体金液的pH值为6.8～7.1；
将人血清白蛋白标记抗体原液在4℃下6000～13000r/min离心60分钟，吸取上清液；将所述上清液装入透析袋，用双蒸水透析去除盐分后，装瓶冷冻，得到脂联素抗体；
将0.27～0.30mg脂联素抗体缓慢加入100ml胶体金液中进行标记，搅拌15分钟后，依次加入10％迭氮钠500μl和1％牛血清白蛋白100μl，搅匀后在2.5～4.0℃，6000r/min条件下离心30分钟，去除上清液，沉淀物即为胶体金标记脂联素抗体。
优选地，所述柠檬酸三钠、鞣酸、K2CO3与双蒸水的体积比为4:0.08: 0.08: 15.84，所述胶体金液中胶体金颗粒的直径范围为10nm~11nm。
优选地，所述样本垫片为经过pH值为6.5～6.7的封闭液封闭处理的玻璃纤维垫片，所述封闭液为含有2.0%吐温-20、0.5%牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲液。
优选地，所述检测脂联素的胶体金试纸条还包括定标卡，所述定标卡为人脂联素梯度质量浓度溶液所检测颜色相对应的检测信号值。
检测信号值。
优选地，所述梯度质量浓度分别为0.5 mg/L、1 mg/L、2 mg/L、4 mg/L、10 mg/L、20mg/L、40 mg/L。
本发明还提出一种检测脂联素的胶体金试纸条的定量检测方法，其特征在于，包括如下步骤：
采集血样2～3ml，室温放置15min-120min，以3000r/min速度离心30min，吸取上清液至样本稀释液中混匀，即得待测样本；
利用移液器准确吸取80μL待测样本，滴加在检测脂联素的胶体金试纸条的样本垫片上；
待测样本层析完全后，检测胶体金试纸条的测试带信号值和控制带信号值，通过仪器结合定标卡信息计算待测样本的脂联素浓度，定量判定其质量浓度。
本发明提供了一种检测脂联素的胶体金试纸条及其定量检测方法，其中，所述检测脂联素的胶体金试纸条包括PVC衬板、硝酸纤维素膜、耦合物结合垫片、样本垫片及吸水垫片，所述PVC衬板上粘贴有硝酸纤维素膜，所述硝酸纤维素膜的一端粘贴有耦合物结合垫片，另一端粘贴有吸水垫片，所述耦合物结合垫片上粘贴有样本垫片；所述硝酸纤维素膜上设置有测试带和控制带，所述测试带内包被有鼠抗脂联素抗体，所述控制带内包被有兔抗鼠抗体；所述耦合物结合垫片包被有胶体金标记脂联素抗体。与现有技术相比，本发明的检测脂联素的胶体金试纸条具有方便快捷，操作简单，耗时较短，便于临床推广应用等优点。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图示出的结构获得其他的附图。
图1为本发明检测脂联素的胶体金试纸条一实施例的结构示意图；
图2为本发明检测脂联素的胶体金试纸条又一实施例的结构示意图；
图3为本发明检测脂联素的胶体金试纸条另一实施例的结构示意图；
图4为图3中第一纤维膜层与第二纤维膜层的结构示意图。
附图标号说明：
本发明目的的实现、功能特点及优点将结合实施例，参照附图做进一步说明。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明提出了一种检测脂联素的胶体金试纸条。
参照图1，本发明提出的检测脂联素的胶体金试纸条包括PVC衬板10、硝酸纤维素膜20、耦合物结合垫片30、样本垫片40及吸水垫片50，所述PVC衬板10上粘贴有硝酸纤维素膜20，所述硝酸纤维素膜20的一端粘贴有耦合物结合垫片30，另一端粘贴有吸水垫片50，所述耦合物结合垫片30上粘贴有样本垫片40。所述硝酸纤维素膜20上设置有测试带60和控制带70，所述测试带60内包被有鼠抗脂联素抗体，所述控制带70内包被有兔抗鼠抗体。所述耦合物结合垫片30包被有胶体金标记脂联素抗体。
其中，胶体金试纸条检测原理是让待测样本通过耦合物结合垫片30，与耦合物垫片上包被的胶体金标记脂联素抗体特异性结合，结合物在硝酸纤维素膜20上层析到达包被有鼠抗脂联素抗体区域后，脂联素-胶体金标记脂联素抗体复合物被脂联素抗体捕获，待测样本中脂联素浓度越高，测试带60光密度值越高；游离的胶体金标记脂联素抗体继续层析至控制带70区域，并与控制带70抗体结合，通过仪器检测测试带60和控制带70的信号值，即可定量待测样本中脂联素的浓度。
具体地，所述测试带60位于所述硝酸纤维素的左侧，所述控制带70位于所述硝纤维素的右侧，所述测试带60与所述控制带70之间的距离为3mm~7mm。优选地，所述测试带60与所述控制带70之间的距离为5mm。
所述硝酸纤维素膜20的厚度为0.3cm~0.5cm，所述硝酸纤维素膜20的宽度为0.2mm~0.4mm。优选地，所述硝酸纤维素膜20的厚度为0.4cm，所述硝酸纤维素膜20的宽度为0.3mm。另外，所述硝酸纤维素膜20的孔径为0.2um~5um。所述吸水垫片50为吸水纸垫、吸水纤维垫、吸水棉垫、吸水性树脂或复合吸水材料。
参照图2，在一实施例中，所述硝酸纤维素膜20的厚度自靠近所述耦合物结合垫片30的一侧至靠近所述吸水垫片50的一侧逐渐减小。
参照图3，所述硝酸纤维素膜20还可包括第一纤维膜层20a和第二纤维膜层20b，所述第二纤维膜层20b粘贴于所述PVC衬板10上，所述第一纤维膜层20a粘贴于所述第二纤维膜层20b上，所述测试带60和所述控制带70均设置于所述第一纤维膜层20a上。
进一步地，为了提高所述硝酸纤维素膜20的层析能力，参照图4，所述第一纤维膜层20a包括间隔设置的第一层析部21和第二层析部20b，所述第一层析部21、所述第二层析部22与所述第二纤维膜层20b共同围设形成引流槽23，所述引流槽23的槽宽朝向靠近所述吸水垫片50的方向呈渐缩设置。
在上述各实施例中，所述硝酸纤维素膜20按如下步骤制备：
分别将测试带60抗体原液和控制带70抗体原液在4℃下以6000～13000r/min速度离心60min，吸取两种上清液；将两种上清液分别装入透析袋，用双蒸水透析去除盐分后，超滤浓缩后装瓶冷冻，得到测试带60抗体和控制带70抗体；用pH值为6.5～6.7的磷酸盐缓冲液或Tris缓冲液分别稀释两种抗体，得到0.8mg/ml测试带60包被液和0.8mg/ml控制带70包被液；将所述测试带60包被液和所述控制带70包被液分别喷涂在硝酸纤维素膜20对应的测试带60和控制带70位置，喷涂量为1μL/cm；再将包被好硝酸纤维素膜20置于37℃温度下烘干。
具体地，所述磷酸盐缓冲液按重量计包括：Na2HPO40.263-0.376份，KH2PO41.000-1.109份，NaCl6份，KCl0.2份，蒸馏水1000份；所述Tris缓冲液按重量计包括：三羟甲基氨基甲烷4.6-5.5份，KH2PO42.0-3.0份，NaCl8份，KCl0.4份，牛血清白蛋白9份，蒸馏水1200份。
在上述各个实施例中，所述胶体金标记脂联素抗体按如下步骤制备：
将质量分数为1%氯金酸与双蒸水按体积比1∶79配成A液；将质量分数为1％柠檬酸三钠、质量分数为1％鞣酸、25mM K2CO3与双蒸水按体积比4∶0.035～0.080∶0.035～0.080∶15.84～15.93配成B液；再将所述A液和所述B液在水浴内同时加热到59～61℃，搅拌A液，快速加入B液，继续搅拌1分钟，在10～13分钟内加热至沸腾，得到胶体金液；利用0.25M K2CO3调整所述胶体金液的pH值为6.8～7.1；将人血清白蛋白标记抗体原液在4℃下6000～13000r/min离心60分钟，吸取上清液；将所述上清液装入透析袋，用双蒸水透析去除盐分后，装瓶冷冻，得到脂联素抗体；将0.27～0.30mg脂联素抗体缓慢加入100ml胶体金液中进行标记，搅拌15分钟后，依次加入10％迭氮钠500μl和1％牛血清白蛋白100μl，搅匀后在2.5～4.0℃，6000r/min条件下离心30分钟，去除上清液，沉淀物即为胶体金标记脂联素抗体。
具体地，所述样本垫片40为经过pH值为6.5～6.7的封闭液封闭处理的玻璃纤维垫片，所述封闭液为含有2.0%吐温-20、0.5%牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲液。
优选地，所述柠檬酸三钠、鞣酸、K2CO3与双蒸水的体积比为4:0.08: 0.08: 15.84，所述胶体金液中胶体金颗粒的直径范围为10nm~11nm。
在本实施例中，所述检测脂联素的胶体金试纸条还包括定标卡，所述定标卡为人脂联素梯度质量浓度溶液所检测颜色相对应的检测信号值。优选地，所述梯度质量浓度分别为0.5 mg/L、1 mg/L、2 mg/L、4 mg/L、10 mg/L、20 mg/L、40 mg/L。
在一较佳实施例中，所述检测脂联素的胶体金试纸条还包括壳体，所述壳体上设置有加样窗口和检测窗口，所述加样窗口位于所述样本垫片40处，所述检测窗口位于所述测试带60和所述控制带70处。
本发明检测脂联素的胶体金试纸条操作简单，检测耗时2min，且其测试误差为5%，相对偏差为10%，检测的最低浓度低至10ug/mL，线性范围为0.5~40ug/mL。因此，与现有技术相比，本发明提供的检测脂联素的胶体金试纸条方便快捷，准确度高，精密度好，灵敏度高，此外，该检测脂联素的胶体金试纸条有利于进行临床推广应用，特别适合在基层医院、诊所以及体检中心等单位使用。
本发明还提出一种检测脂联素的胶体金试纸条的定量检测方法，其中，该检测脂联素的胶体金试纸条采用上述全部实施例中制备的胶体金试纸条。所述检测脂联素的胶体金试纸条的定量检测方法包括如下步骤：
采集血样2～3ml，室温放置15min-120min，以3000r/min速度离心30min，吸取上清液至样本稀释液中混匀，即得待测样本；利用移液器准确吸取80μL待测样本，滴加在检测脂联素的胶体金试纸条的样本垫片40上；待测样本层析完全后，检测胶体金试纸条的测试带60信号值和控制带70信号值，通过仪器结合定标卡信息计算待测样本的脂联素浓度，定量判定其质量浓度。需要说明的是，所述血样可以为血清、血浆或者全血。所述样本稀释液为含0.2% Tween-20的0.01mol/L磷酸盐缓冲液(PBS)溶液，样本稀释液的pH值为6.5～6.7。
为了进一步对本发明进行解释，下面将结合具体实施例对本发明的技术方案进行详细说明，本发明的保护范围不受以下实施例的限制。
实施例1
一种检测脂联素的胶体金试纸条，包括PVC衬板10、硝酸纤维素膜20、耦合物结合垫片30、样本垫片40及吸水垫片50，所述PVC衬板10上粘贴有硝酸纤维素膜20，所述硝酸纤维素膜20的一端粘贴有耦合物结合垫片30，另一端粘贴有吸水垫片50，所述耦合物结合垫片30上粘贴有样本垫片40；所述硝酸纤维素膜20上设置有测试带60和控制带70，所述测试带60内包被有鼠抗脂联素抗体，所述控制带70内包被有兔抗鼠抗体；所述耦合物结合垫片30包被有胶体金标记脂联素抗体。
其中，所述硝酸纤维素膜20按如下步骤制备：
（1）抗体的纯化。分别将测试带60抗体原液和控制带70抗体原液在4℃下以6000r/min速度离心60min，吸取两种上清液；将两种上清液分别装入透析袋，用双蒸水透析去除盐分后，超滤浓缩后装瓶冷冻，得到测试带60抗体和控制带70抗体。
（2）用pH值为6.5的磷酸盐缓冲液分别稀释两种抗体，得到0.8mg/ml测试带60包被液和0.8mg/ml控制带70包被液。所述磷酸盐缓冲液按重量计包括：Na2HPO40.263份，KH2PO41.000份，NaCl6份，KCl0.2份，蒸馏水1000份。其中，质量分数为2%的吐温-20 水溶液为将2ml的吐温-20加入到998ml蒸馏水中配置而成。
（3）将所述测试带60包被液和所述控制带70包被液分别喷涂在硝酸纤维素膜20对应的测试带60和控制带70位置，喷涂量为1μL/cm；再将包被好硝酸纤维素膜20置于37℃温度下烘烤4h，即可得到包被好的硝酸纤维素膜20。
所述胶体金标记脂联素抗体按如下步骤制备：
（1）将质量分数为1%氯金酸与双蒸水按体积比1∶79配成A液；将质量分数为1％柠檬酸三钠、质量分数为1％鞣酸、25mM K2CO3与双蒸水按体积比4∶0.080∶0.080∶15.84配成B液；再将所述A液和所述B液在水浴内同时加热到59～61℃，搅拌A液，快速加入B液，继续搅拌1分钟，在10～11分钟内加热至沸腾，得到胶体金液。其中，该胶体金液的颜色由黑→蓝→紫→红色时即成，胶体金颗粒直径为10nm~11nm。
（2）利用0.25M K2CO3调整所述胶体金液的pH值为6.8。
（3）将人血清白蛋白标记抗体原液在4℃下6000r/min离心60分钟，吸取上清液；将所述上清液装入透析袋，用双蒸水透析去除盐分后，装瓶冷冻，得到脂联素抗体；
（4）将0.27mg脂联素抗体缓慢加入100ml胶体金液中进行标记，搅拌15分钟后，依次加入10％迭氮钠500μl和1％牛血清白蛋白100μl，搅匀后在2.5～4.0℃，6000r/min条件下离心30分钟，去除上清液，沉淀物即为胶体金标记脂联素抗体。
所述耦合物结合垫片30的包被：将胶体金标记脂联素抗体用PBS溶液稀释16倍后，再将稀释后的胶体金标记脂联素抗体均匀的喷涂到玻璃纤维膜上，喷涂量为25μL/cm，于37℃温度下烘烤干燥4小时，制得包被有胶体金标记脂联素抗体的耦合物结合垫片30。
一种检测脂联素的胶体金试纸条的定量检测方法，包括如下步骤：
（1）采集血样2～3ml，室温放置15min-120min，以3000r/min速度离心30min，吸取上清液至样本稀释液中混匀，即得待测样本；（2）利用移液器准确吸取80μL待测样本，滴加在检测脂联素的胶体金试纸条的样本垫片40上；（3）待测样本层析完全后，检测胶体金试纸条的测试带60信号值和控制带70信号值，通过仪器结合定标卡信息计算待测样本的脂联素浓度，即可定量判定其质量浓度。本实施例的检测脂联素的胶体金试纸条，检测耗时2min，且其测试误差为5%，相对偏差为10%。
实施例2
一种检测脂联素的胶体金试纸条，包括PVC衬板10、硝酸纤维素膜20、耦合物结合垫片30、样本垫片40及吸水垫片50，所述PVC衬板10上粘贴有硝酸纤维素膜20，所述硝酸纤维素膜20的一端粘贴有耦合物结合垫片30，另一端粘贴有吸水垫片50，所述耦合物结合垫片30上粘贴有样本垫片40；所述硝酸纤维素膜20上设置有测试带60和控制带70，所述测试带60内包被有鼠抗脂联素抗体，所述控制带70内包被有兔抗鼠抗体；所述耦合物结合垫片30包被有胶体金标记脂联素抗体。
其中，所述硝酸纤维素膜20按如下步骤制备：
（1）抗体的纯化。分别将测试带60抗体原液和控制带70抗体原液在4℃下以10000r/min速度离心60min，吸取两种上清液；将两种上清液分别装入透析袋，用双蒸水透析去除盐分后，超滤浓缩后装瓶冷冻，得到测试带60抗体和控制带70抗体。
（2）用pH值为6.6的磷酸盐缓冲液分别稀释两种抗体，得到0.8mg/ml测试带60包被液和0.8mg/ml控制带70包被液。所述磷酸盐缓冲液按重量计包括：Na2HPO40.376份，KH2PO41.109份，NaCl6份，KCl0.2份，蒸馏水1000份。其中，质量分数为2%的吐温-20 水溶液为将2ml的吐温-20加入到998ml蒸馏水中配置而成。
（3）将所述测试带60包被液和所述控制带70包被液分别喷涂在硝酸纤维素膜20对应的测试带60和控制带70位置，喷涂量为1μL/cm；再将包被好硝酸纤维素膜20置于37℃温度下烘烤4h，即可得到包被好的硝酸纤维素膜20。
所述胶体金标记脂联素抗体按如下步骤制备：
（1）将质量分数为1%氯金酸与双蒸水按体积比1∶79配成A液；将质量分数为1％柠檬酸三钠、质量分数为1％鞣酸、25mM K2CO3与双蒸水按体积比4∶0.055∶0.055∶15.88配成B液；再将所述A液和所述B液在水浴内同时加热到59～61℃，搅拌A液，快速加入B液，继续搅拌1分钟，在10～11分钟内加热至沸腾，得到胶体金液。其中，该胶体金液的颜色由黑→蓝→紫→红色时即成，胶体金颗粒直径为10nm~11nm。
（2）利用0.25M K2CO3调整所述胶体金液的pH值为6.9。
（3）将人血清白蛋白标记抗体原液在4℃下6000r/min离心60分钟，吸取上清液；将所述上清液装入透析袋，用双蒸水透析去除盐分后，装瓶冷冻，得到脂联素抗体；
（4）将0.28mg脂联素抗体缓慢加入100ml胶体金液中进行标记，搅拌15分钟后，依次加入10％迭氮钠500μl和1％牛血清白蛋白100μl，搅匀后在2.5～4.0℃，6000r/min条件下离心30分钟，去除上清液，沉淀物即为胶体金标记脂联素抗体。
所述耦合物结合垫片30的包被：将胶体金标记脂联素抗体用PBS溶液稀释16倍后，再将稀释后的胶体金标记脂联素抗体均匀的喷涂到玻璃纤维膜上，喷涂量为25μL/cm，于37℃温度下烘烤干燥4小时，制得包被有胶体金标记脂联素抗体的耦合物结合垫片30。
一种检测脂联素的胶体金试纸条的定量检测方法，包括如下步骤：
（1）采集血样2～3ml，室温放置15min-120min，以3000r/min速度离心30min，吸取上清液至样本稀释液中混匀，即得待测样本；（2）利用移液器准确吸取80μL待测样本，滴加在检测脂联素的胶体金试纸条的样本垫片40上；（3）待测样本层析完全后，检测胶体金试纸条的测试带60信号值和控制带70信号值，通过仪器结合定标卡信息计算待测样本的脂联素浓度，即可定量判定其质量浓度。本实施例的检测脂联素的胶体金试纸条，检测耗时2min，且其测试误差为5%，相对偏差为10%。
实施例3
一种检测脂联素的胶体金试纸条，包括PVC衬板10、硝酸纤维素膜20、耦合物结合垫片30、样本垫片40及吸水垫片50，所述PVC衬板10上粘贴有硝酸纤维素膜20，所述硝酸纤维素膜20的一端粘贴有耦合物结合垫片30，另一端粘贴有吸水垫片50，所述耦合物结合垫片30上粘贴有样本垫片40；所述硝酸纤维素膜20上设置有测试带60和控制带70，所述测试带60内包被有鼠抗脂联素抗体，所述控制带70内包被有兔抗鼠抗体；所述耦合物结合垫片30包被有胶体金标记脂联素抗体。
其中，所述硝酸纤维素膜20按如下步骤制备：
（1）抗体的纯化。分别将测试带60抗体原液和控制带70抗体原液在4℃下以13000r/min速度离心60min，吸取两种上清液；将两种上清液分别装入透析袋，用双蒸水透析去除盐分后，超滤浓缩后装瓶冷冻，得到测试带60抗体和控制带70抗体。
（2）用pH值为6.5的Tris缓冲液分别稀释两种抗体，得到0.8mg/ml测试带60包被液和0.8mg/ml控制带70包被液。所述Tris缓冲液按重量计包括：三羟甲基氨基甲烷4.6份，KH2PO42.0份，NaCl8份，KCl0.4份，牛血清白蛋白9份，蒸馏水1200份。
（3）将所述测试带60包被液和所述控制带70包被液分别喷涂在硝酸纤维素膜20对应的测试带60和控制带70位置，喷涂量为1μL/cm；再将包被好硝酸纤维素膜20置于37℃温度下烘烤4h，即可得到包被好的硝酸纤维素膜20。
所述胶体金标记脂联素抗体按如下步骤制备：
（1）将质量分数为1%氯金酸与双蒸水按体积比1∶79配成A液；将质量分数为1％柠檬酸三钠、质量分数为1％鞣酸、25mM K2CO3与双蒸水按体积比4∶0.035∶0.035∶15.93配成B液；再将所述A液和所述B液在水浴内同时加热到59～61℃，搅拌A液，快速加入B液，继续搅拌1分钟，在10～11分钟内加热至沸腾，得到胶体金液。其中，该胶体金液的颜色由黑→蓝→紫→红色时即成，胶体金颗粒直径为10nm~11nm。
（2）利用0.25M K2CO3调整所述胶体金液的pH值为7.1。
（3）将人血清白蛋白标记抗体原液在4℃下6000r/min离心60分钟，吸取上清液；将所述上清液装入透析袋，用双蒸水透析去除盐分后，装瓶冷冻，得到脂联素抗体；
（4）将0.30mg脂联素抗体缓慢加入100ml胶体金液中进行标记，搅拌15分钟后，依次加入10％迭氮钠500μl和1％牛血清白蛋白100μl，搅匀后在2.5～4.0℃，6000r/min条件下离心30分钟，去除上清液，沉淀物即为胶体金标记脂联素抗体。
所述耦合物结合垫片30的包被：将胶体金标记脂联素抗体用PBS溶液稀释16倍后，再将稀释后的胶体金标记脂联素抗体均匀的喷涂到玻璃纤维膜上，喷涂量为25μL/cm，于37℃温度下烘烤干燥4小时，制得包被有胶体金标记脂联素抗体的耦合物结合垫片30。
一种检测脂联素的胶体金试纸条的定量检测方法，包括如下步骤：
（1）采集血样2～3ml，室温放置15min-120min，以3000r/min速度离心30min，吸取上清液至样本稀释液中混匀，即得待测样本；（2）利用移液器准确吸取80μL待测样本，滴加在检测脂联素的胶体金试纸条的样本垫片40上；（3）待测样本层析完全后，检测胶体金试纸条的测试带60信号值和控制带70信号值，通过仪器结合定标卡信息计算待测样本的脂联素浓度，即可定量判定其质量浓度。本实施例的检测脂联素的胶体金试纸条，检测耗时2min，且其测试误差为5%，相对偏差为10%。
实施例4
一种检测脂联素的胶体金试纸条，包括PVC衬板10、硝酸纤维素膜20、耦合物结合垫片30、样本垫片40及吸水垫片50，所述PVC衬板10上粘贴有硝酸纤维素膜20，所述硝酸纤维素膜20的一端粘贴有耦合物结合垫片30，另一端粘贴有吸水垫片50，所述耦合物结合垫片30上粘贴有样本垫片40；所述硝酸纤维素膜20上设置有测试带60和控制带70，所述测试带60内包被有鼠抗脂联素抗体，所述控制带70内包被有兔抗鼠抗体；所述耦合物结合垫片30包被有胶体金标记脂联素抗体。
其中，所述硝酸纤维素膜20按如下步骤制备：
（1）抗体的纯化。分别将测试带60抗体原液和控制带70抗体原液在4℃下以13000r/min速度离心60min，吸取两种上清液；将两种上清液分别装入透析袋，用双蒸水透析去除盐分后，超滤浓缩后装瓶冷冻，得到测试带60抗体和控制带70抗体。
（2）用pH值为6.5的Tris缓冲液分别稀释两种抗体，得到0.8mg/ml测试带60包被液和0.8mg/ml控制带70包被液。所述Tris缓冲液按重量计包括：三羟甲基氨基甲烷5.5份，KH2PO43.0份，NaCl8份，KCl0.4份，牛血清白蛋白9份，蒸馏水1200份。
（3）将所述测试带60包被液和所述控制带70包被液分别喷涂在硝酸纤维素膜20对应的测试带60和控制带70位置，喷涂量为1μL/cm；再将包被好硝酸纤维素膜20置于37℃温度下烘烤4h，即可得到包被好的硝酸纤维素膜20。
所述胶体金标记脂联素抗体按如下步骤制备：
（1）将质量分数为1%氯金酸与双蒸水按体积比1∶79配成A液；将质量分数为1％柠檬酸三钠、质量分数为1％鞣酸、25mM K2CO3与双蒸水按体积比4∶0.035∶0.035∶15.93配成B液；再将所述A液和所述B液在水浴内同时加热到59～61℃，搅拌A液，快速加入B液，继续搅拌1分钟，在10～11分钟内加热至沸腾，得到胶体金液。其中，该胶体金液的颜色由黑→蓝→紫→红色时即成，胶体金颗粒直径为10nm~11nm。
（2）利用0.25M K2CO3调整所述胶体金液的pH值为7.1。
（3）将人血清白蛋白标记抗体原液在4℃下6000r/min离心60分钟，吸取上清液；将所述上清液装入透析袋，用双蒸水透析去除盐分后，装瓶冷冻，得到脂联素抗体；
（4）将0.30mg脂联素抗体缓慢加入100ml胶体金液中进行标记，搅拌15分钟后，依次加入10％迭氮钠500μl和1％牛血清白蛋白100μl，搅匀后在2.5～4.0℃，6000r/min条件下离心30分钟，去除上清液，沉淀物即为胶体金标记脂联素抗体。
所述耦合物结合垫片30的包被：将胶体金标记脂联素抗体用PBS溶液稀释16倍后，再将稀释后的胶体金标记脂联素抗体均匀的喷涂到玻璃纤维膜上，喷涂量为25μL/cm，于37℃温度下烘烤干燥4小时，制得包被有胶体金标记脂联素抗体的耦合物结合垫片30。
一种检测脂联素的胶体金试纸条的定量检测方法，包括如下步骤：
采集血样2～3ml，室温放置15min-120min，以3000r/min速度离心30min，吸取上清液至样本稀释液中混匀，即得待测样本；（2）利用移液器准确吸取80μL待测样本，滴加在检测脂联素的胶体金试纸条的样本垫片40上；（3）待测样本层析完全后，检测胶体金试纸条的测试带60信号值和控制带70信号值，通过仪器结合定标卡信息计算待测样本的脂联素浓度，即可定量判定其质量浓度。本实施例的检测脂联素的胶体金试纸条，检测耗时2min，且其测试误差为5%，相对偏差为10%。
以上所述仅为本发明的优选实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是在本发明的发明构思下，利用本发明说明书及附图内容所作的等效变换，或直接/间接运用在其他相关的技术领域均包括在本发明的专利保护范围内。

Claims (7)

1.一种检测脂联素的胶体金试纸条，包括PVC衬板、硝酸纤维素膜、耦合物结合垫片、样本垫片及吸水垫片，其特征在于，所述PVC衬板上粘贴有硝酸纤维素膜，所述硝酸纤维素膜的一端粘贴有耦合物结合垫片，另一端粘贴有吸水垫片，所述耦合物结合垫片上粘贴有样本垫片；
所述硝酸纤维素膜上设置有测试带和控制带，所述测试带上喷涂有0.8 mg/ml测试带包被液，所述测试带包被液内含有鼠抗脂联素抗体，所述控制带上喷涂有0.8 mg/ml控制带包被液，所述控制带包被液内含有兔抗鼠抗体，所述测试带包被液和所述控制带包被液的喷涂量为1μL/cm；所述耦合物结合垫片包被有胶体金标记脂联素抗体，其中，所述胶体金标记脂联素抗体中的胶体金颗粒的直径范围为10nm~11nm，所述胶体金标记脂联素抗体中的脂联素抗体的浓度为0.27~0.3mg/100ml胶体金溶液；
所述硝酸纤维素膜还包括第一纤维膜层和第二纤维膜层，所述第二纤维膜层粘贴于所述PVC衬板上，所述第一纤维膜层粘贴于所述第二纤维膜层上，所述测试带和所述控制带均设置于所述第一纤维膜层上；所述第一纤维膜层包括间隔设置的第一层析部和第二层析部，所述第一层析部、所述第二层析部与所述第二纤维膜层共同围设形成引流槽，所述引流槽的槽宽朝向靠近所述吸水垫片的方向呈渐缩设置；
所述硝酸纤维素膜的厚度自靠近所述耦合物结合垫片的一侧至靠近所述吸水垫片的一侧逐渐减小；所述检测脂联素的胶体金试纸条还包括定标卡，所述定标卡为人脂联素梯度质量浓度溶液所检测颜色相对应的检测信号值，所述梯度质量浓度分别为0.5 mg/L、1mg/L、2 mg/L、4 mg/L、10 mg/L、20 mg/L、40 mg/L。
2.如权利要求1所述的检测脂联素的胶体金试纸条，其特征在于，所述检测脂联素的胶体金试纸条还包括壳体，所述壳体上设置有加样窗口和检测窗口，所述加样窗口位于所述样本垫片处，所述检测窗口位于所述测试带和所述控制带处。
3.如权利要求1所述的检测脂联素的胶体金试纸条，其特征在于，所述硝酸纤维素膜按如下步骤制备：
分别将测试带抗体原液和控制带抗体原液在4℃下以6000～13000r/min速度离心60min，吸取两种上清液；
将两种上清液分别装入透析袋，用双蒸水透析去除盐分后，超滤浓缩后装瓶冷冻，得到测试带抗体和控制带抗体；
用pH值为6.5～6.7的磷酸盐缓冲液或Tris缓冲液分别稀释两种抗体，得到测试带包被液和控制带包被液；
将所述测试带包被液和所述控制带包被液分别喷涂在硝酸纤维素膜对应的测试带和控制带位置；
再将包被好的硝酸纤维素膜置于37℃温度下烘干。
4.如权利要求3所述的检测脂联素的胶体金试纸条，其特征在于，所述磷酸盐缓冲液按重量计包括：Na2HPO40.263-0.376份，KH2PO41.000-1.109份，NaCl6份，KCl0.2份，蒸馏水1000份；
所述Tris缓冲液按重量计包括：三羟甲基氨基甲烷4.6-5.5份，KH2PO42.0-3.0份，NaCl8份，KCl0.4份，牛血清白蛋白9份，蒸馏水1200份。
5.如权利要求1所述的检测脂联素的胶体金试纸条，其特征在于，所述胶体金标记脂联素抗体按如下步骤制备：
将质量分数为1%的氯金酸与双蒸水按体积比1∶79配成A液；将质量分数为1％的柠檬酸三钠、质量分数为1％的鞣酸、25mM K2CO3与双蒸水按体积比4:0.08: 0.08: 15.84配成B液；再将所述A液和所述B液在水浴内同时加热到59～61℃，搅拌A液，快速加入B液，继续搅拌1分钟，在10～13分钟内加热至沸腾，得到胶体金液；
利用0.25M K2CO3调整所述胶体金液的pH值为6.8～7.1；
将人血清白蛋白标记抗体原液在4℃下6000～13000r/min离心60分钟，吸取上清液；将所述上清液装入透析袋，用双蒸水透析去除盐分后，装瓶冷冻，得到脂联素抗体；
将0.27～0.30mg脂联素抗体缓慢加入100ml胶体金液中进行标记，搅拌15分钟后，依次加入10％迭氮钠500μl和1％牛血清白蛋白100μl，搅匀后在2.5～4.0℃，6000r/min条件下离心30分钟，去除上清液，沉淀物即为胶体金标记脂联素抗体。
6.如权利要求5所述的检测脂联素的胶体金试纸条，其特征在于，所述胶体金液中胶体金颗粒的直径范围为10nm~11nm。
7.如权利要求1所述的检测脂联素的胶体金试纸条，其特征在于，所述样本垫片为经过pH值为6.5～6.7的封闭液封闭处理的玻璃纤维垫片，所述封闭液为含有2.0%吐温-20、0.5%牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲液。
CN201810141218.7A 2018-02-09 2018-02-09 一种检测脂联素的胶体金试纸条及其定量检测方法 Active CN108169494B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201810141218.7A CN108169494B (zh) 2018-02-09 2018-02-09 一种检测脂联素的胶体金试纸条及其定量检测方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201810141218.7A CN108169494B (zh) 2018-02-09 2018-02-09 一种检测脂联素的胶体金试纸条及其定量检测方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN108169494A CN108169494A (zh) 2018-06-15
CN108169494B true CN108169494B (zh) 2024-01-23

Family

ID=62514238

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201810141218.7A Active CN108169494B (zh) 2018-02-09 2018-02-09 一种检测脂联素的胶体金试纸条及其定量检测方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN108169494B (zh)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114002437A (zh) * 2021-11-01 2022-02-01 西安文理学院 一种人血清白蛋白多克隆抗体胶体金层试纸条及其制备方法和应用

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2015072181A (ja) * 2013-10-02 2015-04-16 積水メディカル株式会社 赤血球含有サンプル中の対象物を検出するためのイムノクロマトグラフィー用テストストリップ、および該テストストリップを使用するイムノクロマトグラフィー
JP6168580B1 (ja) * 2016-02-24 2017-07-26 積水メディカル株式会社 イムノクロマトグラフィーを利用した癌胎児性フィブロネクチンの検出方法
CN207992243U (zh) * 2018-02-09 2018-10-19 广东优尼德生物科技有限公司 一种检测脂联素的胶体金试纸条

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103069277B (zh) * 2010-03-31 2016-03-30 积水医疗株式会社 利用免疫色谱法的测定法、免疫色谱测试条和用于免疫色谱法的测定试剂盒
EP2693213B1 (en) * 2011-03-31 2017-07-26 Sekisui Medical Co., Ltd. Detection method using immunochromatography capable of determining sample without addition of specimen as operation-failure sample, and test strip for use in same
EP3351937B1 (en) * 2012-03-30 2019-09-11 Sekisui Medical Co., Ltd. Immunochromatographic test strip for detecting object in red blood cell-containing sample

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2015072181A (ja) * 2013-10-02 2015-04-16 積水メディカル株式会社 赤血球含有サンプル中の対象物を検出するためのイムノクロマトグラフィー用テストストリップ、および該テストストリップを使用するイムノクロマトグラフィー
JP6168580B1 (ja) * 2016-02-24 2017-07-26 積水メディカル株式会社 イムノクロマトグラフィーを利用した癌胎児性フィブロネクチンの検出方法
CN207992243U (zh) * 2018-02-09 2018-10-19 广东优尼德生物科技有限公司 一种检测脂联素的胶体金试纸条

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
刘丽.《胶体金免疫层析技术》.河南科学技术出版社,2017,(第1版),71-77. *
刘丽.《胶体金免疫层析技术》.河南科学技术出版社,2017,4. *
孙兆林 等.《肾脏标志物临床与检验》.人民军医出版社,2014,126. *
王文勇等.《免疫细胞（组织）化学和分子病理学技术》.第四军医大学出版社,2010,(第1版),135. *

Also Published As

Publication number Publication date
CN108169494A (zh) 2018-06-15

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN102759631B (zh) 一种定量检测降钙素原pct的胶乳增强免疫比浊试剂盒
CN202794178U (zh) 降钙素原快速定量免疫层析检测试剂盒
CN202794189U (zh) C反应蛋白快速全程定量免疫层析检测试剂盒
Chamorro-Garcia et al. Detection of parathyroid hormone-like hormone in cancer cell cultures by gold nanoparticle-based lateral flow immunoassays
CN106814190A (zh) Pct与crp联检试纸条及其制备方法
CN102135535B (zh) 一种直接进行半定量分析的免疫胶体金属检测技术及其制备方法和用途
CN113311173B (zh) 一种用于提高检测精确性的检测血液样本中ST2和Galectin-3抗体的联检试纸条、制备方法和试剂盒
CN106771207A (zh) 一种胰腺癌干式荧光量子点联检诊断试剂盒
CN107656074A (zh) 一种使用双色荧光免疫层析技术检测糖化血红蛋白的试剂盒
CN109307765A (zh) 胃蛋白酶原ⅱ检测试剂盒
CN106596937A (zh) 一种同步检测胰腺癌标记物的量子点试剂盒
CN105866410A (zh) 一种联合检测nse、cea的免疫层析检测试纸条及其制备方法和应用方法
CN109307766A (zh) 胃蛋白酶原ⅰ检测试剂盒
CN102226811B (zh) 一种检测尿液中心脏型脂肪酸结合蛋白诊断试纸的制备方法
CN108169494B (zh) 一种检测脂联素的胶体金试纸条及其定量检测方法
CN115060888A (zh) 一种新型冠状病毒核衣壳蛋白抗原检测试纸的制备方法
Aleyassine et al. Natural fluorescence in serum of patients with chronic renal failure not to be confused with creatine kinase-BB isoenzyme.
CN105759050B (zh) 一种定量检测肌钙蛋白i含量免疫荧光试剂盒及制备方法
CN108181465B (zh) 检测25-羟基维生素d的荧光层析试剂盒及其定量检测方法
CN207992243U (zh) 一种检测脂联素的胶体金试纸条
CN106443012B (zh) 一种试纸条及其制备方法与在尿微量白蛋白和β2微球蛋白联合检测中的应用
CN108303550A (zh) 一种检测脂联素的斑点金渗滤试剂盒及其定量检测方法
CN105158484A (zh) 一种快速检测全血中甲胎蛋白的试纸条及其制备方法
JPH02193071A (ja) ハプトグロビン―ヘモグロビン複合体測定用試薬キット及びそれを用いるハプトグロビン―ヘモグロビン複合体の測定法
EP1256802B1 (en) Method for examination of feces occult blood

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant