CN107656074A - 一种使用双色荧光免疫层析技术检测糖化血红蛋白的试剂盒 - Google Patents

一种使用双色荧光免疫层析技术检测糖化血红蛋白的试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种使用双色荧光免疫层析技术检测糖化血红蛋白的试剂盒。在NC膜下边缘于样品垫上方1～2mm处包被有Alexa Fluor647标记的糖化血红蛋白单克隆抗体1D7及Alexa Fluor488标记的血红蛋白单克隆抗体IHB01，检测区包被血红蛋白单克隆抗体9E10，质控区包被有兔抗鼠IgG抗体RM08；其中荧Alexa Fluor647和Alexa Fluor488为两种不同波长荧光物质；通过检测Alexa Fluor647和Alexa Fluor488的荧光强度，分别记为I(647)和I(488)，通过仪器计算公式计算出糖化血红蛋白百分比。可一次性读取检测结果，提高准确度，简化操作。

Description

一种使用双色荧光免疫层析技术检测糖化血红蛋白的试剂盒
技术领域
本发明属于临床体外诊断技术领域，涉及一种使用双色荧光免疫层析技术检测糖化血红蛋白的试剂盒。
背景技术
随着人类社会的快速发展，生活水平的不断提高，饮食结构发生变化，全球糖尿病发病率呈不断上升趋势，再加其病因及发病机制还未完全确认，从而糖尿病成为人类健康的重要卫生问题。糖化血红蛋白(HbAlc)，作为反映长期血糖水平的金标准，也是监测糖尿病治疗的重要指标。
HbAlc是血液中葡萄糖与红细胞内血红蛋白结合形成的产物，其合成量与红细胞所处环境中糖的浓度成正相关，且其反应不可逆。红细胞的平均寿命为120天左右，所以利用检测糖化血红蛋白可观测到120天前的血糖浓度，不会受到抽血时间，是否空腹，是否使用胰岛素等因素干扰，不受偶尔一次血糖的降低或升高的影响。因此，对HbAlc进行测定，可以较全面的了解某一段时间的血糖控制水平。
一般临床上使用糖化血红蛋白占总血红蛋白的百分比作为衡量糖化血红蛋白含量是否正常的指标。糖化血红蛋白的控制情况：>9％血糖控制差，可能引发糖尿病性肾病、动脉硬化、白内障等并发症，并有可能出现酮症酸中毒等急性合并症。8％-9％，控制不理想，需加强血糖控制，多运动及注意饮食结构，并在医生指导下进行治疗；7％-8％，血糖控制一般；6％-7％，血糖控制比较理想；4％-6％，血糖控制正常；由于糖化血红蛋白比例的浓度范围窄，且正常水平再4％-6％，所以对检测方法的准确度及精密度要求较高。
目前常用的检测糖化血红高蛋白的方法有高效液相色谱、离子交换层析、酶法、免疫法等。其中高效液相色谱和离子交换层析因仪器昂贵，需专业人员完成，实际应用不便捷。同样的，酶法也需要使用多种酶配合进行反应，并经过大型生化分析仪仪器进行检测才能得到最终结果。免疫层析法是一种低成本，高便捷，操作简单的糖化血红蛋白检测方案。然而，免疫层析试纸条的固相载体表面显色与免疫均相反应(生化、化学发光等)相比准确性的劣势显著。因此，本发明提供低成本，高便捷，操作简单的糖化血红蛋白检测方案。的同时，也能达到与色谱，交换层析等相当的准确度。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术的上述缺陷，提供一种使用双色荧光免疫层析技术检测糖化血红蛋白的方法。
本发明的另一目的是提供一种使用双色荧光免疫层析技术检测糖化血红蛋白的试剂盒。
本发明的目的可通过以下技术方案实现：
一种使用双色荧光免疫层析技术检测糖化血红蛋白的方法，在NC膜下缘于样品垫上方1～2mm处包被有荧光物质A标记的糖化血红蛋白HbA1c单克隆抗体及荧光物质B标记的血红蛋白Hb单克隆抗体1，检测区包被血红蛋白Hb单克隆抗体2，质控区包被兔抗鼠IgG抗体；其中荧光物质A与荧光物质B为两种互不干扰的荧光物质，所述的糖化血红蛋白HbA1c单克隆抗体只与样品中的糖化血红蛋白抗原特异性结合，所述的血红蛋白Hb单克隆抗体1只与样品中的血红蛋白抗原特异性结合，而不与样品中的糖化血红蛋白抗原结合，所述的血红蛋白Hb单克隆抗体2既能够与样品中的血红蛋白抗原结合，也能够和样品中的糖化血红蛋白结合；反应原理为样本中的糖化血红蛋白抗原特异性地和荧光物质A标记的糖化血红蛋白HbA1c单克隆抗体及检测区包被的血红蛋白Hb单克隆抗体2结合，形成糖化血红蛋白HbA1c单克隆抗体-糖化血红蛋白抗原-血红蛋白Hb单克隆抗体2的三明治结构；样本中血红蛋白Hb抗原跟荧光物质B标记的血红蛋白Hb单克隆抗体1及检测区包被的血红蛋白Hb单克隆抗体2特异结合，形成血红蛋白单克隆抗体1-血红蛋白Hb抗原-血红蛋白Hb单克隆抗体2的三明治结构；分别检测荧光物质A,荧光物质B荧光强度，经计算即可获得样本中糖化血红蛋白HbA1c和血红蛋白Hb的浓度。
其中，所述的糖化血红蛋白HbA1c单克隆抗体为糖化血红蛋白HbA1c单克隆抗体1D7，由保藏编号为CCTCC NO:C2017168的杂交瘤细胞株1D7分泌；所述的血红蛋白Hb单克隆抗体1为商品化的抗体，优选Fitzgerald公司生产的血红蛋白Hb单克隆抗体；所述的血红蛋白Hb单克隆抗体2为血红蛋白Hb单克隆抗体9E10，由保藏编号为CCTCC NO:C2017167的杂交瘤细胞9E10分泌。这两株保藏的细胞分别分泌血红蛋白和糖化血红蛋白单抗为申请人筛选得到，其中杂交瘤细胞X分泌的糖化血红蛋白单克隆抗体抗体1D7仅与糖基化的血红蛋白发生抗原-抗体特异反应；而杂交瘤细胞Y分泌的血红蛋白单克隆抗体9E10既能跟糖化血红蛋白反映，也能跟非糖化的血红蛋白反应。
所述的干式免疫层析试纸条包括加样孔、观察窗、底板、样品垫、层析膜(NC膜)和吸水纸，所述样品垫、层析膜和吸水垫以水平方向顺序相接方式依次固定在底板上。
所述的荧光物质A和B优选自Alexa Fluor647、488、350、405、430、488、514、532、546、555、568、594、610、633、635、647、660、680、700、750和790中任意两种互不干扰的荧光物质，进一步优选自Alexa Fluor647和488。
本发明所述的方法优选全血经稀释后作为待检样本，稀释方法优选为：取7～12ul全血添加到200～1000ul的溶血剂中，摇匀3-5次得待检样本。溶血剂配方为：溶血成分CTAB0.5～1％,PBS缓冲液20Mm,表面活性剂1～1.5％。
一种使用双色荧光免疫层析技术检测糖化血红蛋白的试剂盒，包括干式免疫层析试纸条；在NC膜下缘于样品垫上方1～2mm处包被有荧光物质A标记的糖化血红蛋白HbA1c单克隆抗体1D7及荧光物质B标记的血红蛋白Hb单克隆抗体1，检测区包被血红蛋白Hb单克隆抗体9E10，质控区包被兔抗鼠IgG抗体；其中荧光物质A和荧光物质B为两种不同波长荧光物质；所述的糖化血红蛋白HbA1c单克隆抗体为糖化血红蛋白HbA1c单克隆抗体1D7，由保藏编号为CCTCC NO:C2017168的杂交瘤细胞株1D7分泌；所述的血红蛋白Hb单克隆抗体1为商品化的抗体，优选Fitzgerald公司生产的血红蛋白Hb单克隆抗体；所述的血红蛋白Hb单克隆抗体2为血红蛋白Hb单克隆抗体9E10，由保藏编号为CCTCC NO:C2017167的杂交瘤细胞9E10分泌。
所述的干湿免疫层析试纸条优选包括加样孔、观察窗、底板、样品垫、层析膜和吸水纸，所述样品垫、层析膜和吸水垫以水平方向顺序相接方式依次固定在底板上。
所述的荧光物质A和B优选自Alexa Fluor647、488、350、405、430、488、514、532、546、555、568、594、610、633、635、647、660、680、700、750和790中任意两种互不干扰的荧光物质，进一步优选选自Alexa Fluor647和488。
所述的试剂盒，还优选包括用于稀释血液的配套溶血剂。
所述的配套溶血剂配方优选为：溶血成分CTAB 0.5～1％,PBS缓冲液20Mm,表面活性剂1～1.5％。
本发明试剂盒在使用时优选配套相应处理双色荧光测量程序的测量仪器，所述测量仪器有以下功能：
1)绘制并烧写测量曲线：绘制糖化血红蛋白浓度c(HbA1c)与Alexa Fluor647的荧光强度I(647)的标准曲线1，记为c(HbA1c)＝a1*I(647)+b1，其中a1，b1为常数项。绘制血红蛋白浓度c(Hb)与Alexa Fluor488的荧光强度I(488)的标准曲线2，记为c(Hb)＝a2*I(488)+b2,其中a2，b2为常数项，烧写成记忆芯片并预先用检测仪器中读取。
2)读取、计算糖化血红蛋白百分比：当检测某一样本时，仪器读取Alexa Fluor647和Alexa Fluor488荧光强度分别记为I1(647)和I1(488)。通过计算公式HbA1c(％)＝(a1*I1(647)+b1)/(a2*I1(488)+b2)*100％可得到糖化血红蛋白的百分含量，其中a1，b1，a2，b2为常数项。
所述的荧光物质荧光物质Alexa Fluor647、488为系列染料，优选荧光组合为Alexa Fluor647和488。
在NC膜下边缘于样品垫上方1～2mm处包被有Alexa Fluor647标记的HbA1c单克隆抗体1D7及Alexa Fluor488标记的Hb单克隆抗体IHB01，检测区包被Hb单克隆抗体9E10，质控区包被有兔抗鼠IgG抗体RM08；其中Alexa Fluor647和Alexa Fluor488为两种不同波长荧光物质。
有益效果：
本发明方法及试纸条是基于双色荧光干式免疫层析技术，优势之一是利用双色荧光技术将同一份样本中的HbA1c浓度和Hb浓度的检测过程集成于同一套检测系统中，避免多次检测造成的系统误差的增加，提高准确度的同时，也增加了操作简便性。
本发明的试盒优势之二是通过相同位置包被Alexa Fluor647标记的单克隆抗体1D7和Alexa Fluor488标记单克隆抗体IHB01，可将Alexa Fluor488标记的单克隆抗体IHB01作为内置参数校准加工工艺带来的偏差，提高检测试剂盒的精密度。
本发明研发的通过双色荧光检测糖化血红蛋白百分含量的试剂，目前国内市场上尚未有类似产品，具有创新性。客户在使用本产品时，开机检测仪器并插入记忆芯片，插入检测条，滴入血液样本，读取结果，操作方便。本发明制备方法简单,便于非专业人士操作,适于大、中、小各类医疗机构及家庭使用。
生物材料保藏信息
杂交瘤细胞株1D7，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国武汉武汉大学，保藏日期为2017年8月31日，保藏编号为CCTCC NO:C2017168。
杂交瘤细胞株9E10，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国武汉武汉大学，保藏日期为2017年8月31日，保藏编号为CCTCC NO:C2017167。
附图说明
图1本发明试纸条的整体示意图
1为加样孔，2为观察窗，3为试剂壳，4为底衬，5为样品垫，6为NC膜，7为用荧光A和荧光B的标记抗体，8为检测线，9为质控线，10为吸水纸。
具体实施方式
以下实施例中1D7抗体为糖化血红蛋白HbA1c单克隆抗体1D7的简称，
实施例1：Alexa Fluor647和Alexa Fluor488标记的抗体制备
1.1 Alexa Fluor647标记糖化血红蛋白单克隆抗体1D7制备：取1mg的AlexaFluor647干粉用DMF溶液溶解到10mg/ml，备用。再取5mg的1D7抗体以1:2(1mg抗体加入2ul，10mg/ml的Alexa Fluor647溶液)比例在22-28℃反应30min，后用2000Da的透析袋透析24h，透析液为20mM的PBS，8h换液一次。透析完取出透析袋内的溶液即可得1D7-Alexa Fluor647荧光溶液。
1.2 Alexa Fluor488标记的血红蛋白单克隆抗体IHB01制备：取1mg的AlexaFluor488干粉用DMF溶液溶解到10mg/ml，备用。再取5mg的IHB01抗体以1:2(1mg抗体加入2ul，10mg/ml的Alexa Fluor488溶液)比例在22-28℃反应30min，后用2000Da的透析袋透析24h，透析液为20mM的PBS，8h换液一次。透析完取出透析袋内的溶液即可得IHB01-AlexaFluor488荧光溶液。
实施例2：双色荧光糖化血红蛋白检测试剂条的制备
如图1所示，双色荧光糖化血红蛋白检测试剂条，包括底板4，在底板上顺次贴上样品垫5、NC膜6和吸水垫10；其中样品垫5、NC膜6和吸水垫10各部件连接处重叠1～2mm，保证检测样本顺利从样本区通过样品垫到达检测区，在NC膜下缘于样品垫上方1～2mm处包被有Alexa Fluor647标记的糖化血红蛋白HbA1c单克隆抗体1D7及Alexa Fluor488标记的血红蛋白Hb单克隆抗体IHB01(Fitzgerald公司生产)，检测区包被血红蛋白Hb单克隆抗体9E10，质控区包被兔抗鼠IgG抗体RM08。各部件的制备方法如下所述：
2.1样品垫5的制备：用10mM，pH7.2～7.4的PBS缓冲液100mL溶解0.5g的BSA蛋白，然后加入0.025g的表面活性剂Tween20，调节pH至7.0-7.4；样品垫可选用玻璃纤维或聚酯材料，30cm长样品垫置于上述缓冲液、表面活性剂和蛋白的混合溶液2.5ml中浸泡1h，取出后25℃干燥8h制备样品垫5；
2.2 NC膜6的处理
A.捕获线的制备：将血红蛋白单克隆抗体9E10用20mmol/L，pH7.2的PB缓冲液稀释到2.0mg/mL的浓度，0.8μL/cm在硝酸纤维素膜上划线涂布得捕获线，干燥箱内25℃鼓风干燥12h；
B.1D7-647和IHB01-488荧光溶液喷膜处理：将Alexa Fluor488和647分别标记的IHB01，1D7按1:2比例用喷膜仪按0.5～0.6ul/cm的划量划于NC膜下缘上方1～2mm处。干燥箱内25℃鼓风干燥3h；
2.4吸水纸10的制备：吸水纸裁剪成30*2.7cm每条；
2.5组装：塑料底板4，样品垫5层和吸水纸10为本领域通用的部件，将上述NC膜、吸水纸10、样品垫5层，依次贴在塑料底板1上，将贴好的中间物用斩切机切成4.0mm即可得双色荧光糖化血红蛋白检测试剂条。
实施例3：双色糖化血红蛋白检测试剂条准确度评估
配制5.8％和7.0％的糖化血红蛋白裂解溶液，采用本发明体系试剂条进行测定浓度，分别重复测定10次，分别计算测定均值和标准偏差、CV值如表2和表3。结果表明，双色荧光糖化血红蛋白检测试剂条的精密度分别为2.3％和1.9％，较对照组免疫层析试剂条精密度有明显的优势，且能满足临床对糖化血红蛋白指标的检测要求。其中对照组免疫层析试剂条的检测原理为单色荧光方法检测糖化血红蛋白比例，具体方法为在NC膜下缘于样品垫上方1～2mm处包被有Alexa Fluor647标记的糖化血红蛋白HbA1c单克隆抗体1D7，检测区包被血红蛋白Hb单克隆抗体9E10，质控区包被兔抗鼠IgG抗体；当滴加糖化血红蛋白裂解溶液时，由糖化血红蛋白HbA1c单克隆抗体1D7-糖化血红蛋白抗原-血红蛋白Hb单克隆抗体9E10的三明治结构，根据不同浓度糖化血红蛋白拟合的回归曲线计算出样本中糖化血红蛋白的浓度，同时对照组的血红蛋白浓度为固定浓度，进而计算出待测样本的糖化血红蛋白比例。
表2糖化血红蛋白5.8％的精密度数据
表3糖化血红蛋白7.0％的精密度数据
序号 实验组7.0％ 对照组7.0％
1 7 7.2
2 6.9 7.1
3 6.8 7
4 7.2 7.4
5 7.1 7
6 7 6.7
7 6.8 6.7
8 6.9 6.8
9 6.9 6.7
10 7.1 6.9
平均值 6.97 6.95
标准偏差 0.133 0.233
CV 1.9％ 3.4％

Claims (10)

1.一种使用双色荧光免疫层析技术检测糖化血红蛋白的方法，其特征在于在NC膜下缘于样品垫上方1～2mm处包被有荧光物质A标记的糖化血红蛋白HbA1c单克隆抗体及荧光物质B标记的血红蛋白Hb单克隆抗体1，检测区包被血红蛋白Hb单克隆抗体2，质控区包被兔抗鼠IgG抗体；其中荧光物质A与荧光物质B为两种互不干扰的荧光物质，所述的糖化血红蛋白HbA1c单克隆抗体只与样品中的糖化血红蛋白抗原特异性结合，所述的血红蛋白Hb单克隆抗体1只与样品中的血红蛋白抗原特异性结合，而不与样品中的糖化血红蛋白抗原结合，所述的血红蛋白Hb单克隆抗体2既能够与样品中的血红蛋白抗原结合，也能够和样品中的糖化血红蛋白抗原结合；反应原理为样本中的糖化血红蛋白抗原特异性地和荧光物质A标记的糖化血红蛋白HbA1c单克隆抗体及检测区包被的血红蛋白Hb单克隆抗体2结合，形成糖化血红蛋白HbA1c单克隆抗体-糖化血红蛋白抗原-血红蛋白Hb单克隆抗体2的三明治结构；样本中血红蛋白Hb抗原跟荧光物质B标记的血红蛋白Hb单克隆抗体1及检测区包被的血红蛋白Hb单克隆抗体2特异结合，形成血红蛋白单克隆抗体1-血红蛋白Hb抗原-血红蛋白Hb单克隆抗体2的三明治结构；分别检测荧光物质A,荧光物质B荧光强度，经计算即可获得样本中糖化血红蛋白HbA1c和血红蛋白Hb的浓度。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述的糖化血红蛋白HbA1c单克隆抗体为糖化血红蛋白HbA1c单克隆抗体1D7，由保藏编号为CCTCC NO:C2017168的杂交瘤细胞株1D7分泌；所述的血红蛋白Hb单克隆抗体1为商品化的抗体，优选Fitzgerald公司生产的血红蛋白Hb单克隆抗体；所述的血红蛋白Hb单克隆抗体2为血红蛋白Hb单克隆抗体9E10，由保藏编号为CCTCC NO:C2017167的杂交瘤细胞9E10分泌。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述的荧光物质A和B选自AlexaFluor647、488、350、405、430、488、514、532、546、555、568、594、610、633、635、647、660、680、700、750和790中任意两种互不干扰的荧光物质，优选选自Alexa Fluor647和488。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于全血经稀释后作为待检样本，稀释方法优选为：取7～12ul全血添加到200～1000ul的溶血剂中，摇匀3-5次得待检样本。
5.一种使用双色荧光免疫层析技术检测糖化血红蛋白的试剂盒，其特征在于包括干式免疫层析试纸条；在NC膜下缘于样品垫上方1～2mm处包被有荧光物质A标记的糖化血红蛋白HbA1c单克隆抗体1D7及荧光物质B标记的血红蛋白Hb单克隆抗体1，检测区包被血红蛋白Hb单克隆抗体9E10，质控区包被兔抗鼠IgG抗体；其中荧光物质A和荧光物质B为两种不同波长荧光物质；所述的糖化血红蛋白HbA1c单克隆抗体为糖化血红蛋白HbA1c单克隆抗体1D7，由保藏编号为CCTCC NO:C2017168的杂交瘤细胞株1D7分泌；所述的血红蛋白Hb单克隆抗体1为商品化的抗体，优选Fitzgerald公司生产的血红蛋白Hb单克隆抗体；所述的血红蛋白Hb单克隆抗体2为血红蛋白Hb单克隆抗体9E10，由保藏编号为CCTCCNO:C2017167的杂交瘤细胞9E10分泌。
6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于所述的干湿免疫层析试纸条包括加样孔、观察窗、底板、样品垫、层析膜和吸水纸，所述样品垫、层析膜和吸水垫以水平方向顺序相接方式依次固定在底板上。
7.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于所述的荧光物质A和B选自AlexaFluor647、488、350、405、430、488、514、532、546、555、568、594、610、633、635、647、660、680、700、750和790中任意两种互不干扰的荧光物质，优选选自Alexa Fluor647和488。
8.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于还包括用于稀释血液的配套溶血剂。
9.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于所述的配套溶血剂配方为：溶血成分CTAB0.5～1％,PBS缓冲液20Mm,表面活性剂1～1.5％。
10.根据权利要求5本发明试剂盒，其特征在于在使用时配套相应处理双色荧光测量程序的测量仪器，所述测量仪器有以下功能：
1)绘制并烧写测量曲线：绘制糖化血红蛋白浓度c(HbA1c)与Alexa Fluor647的荧光强度I(647)的标准曲线1，记为c(HbA1c)＝a1*I(647)+b1，其中a1，b1为常数项。绘制血红蛋白浓度c(Hb)与Alexa Fluor488的荧光强度I(488)的标准曲线2，记为c(Hb)＝a2*I(488)+b2,其中a2，b2为常数项，烧写成记忆芯片并预先用检测仪器中读取；
2)读取、计算糖化血红蛋白百分比：当检测某一样本时，仪器读取Alexa Fluor647和Alexa Fluor488荧光强度分别记为I1(647)和I1(488)；通过计算公式HbA1c(％)＝(a1*I1(647)+b1)/(a2*I1(488)+b2)*100％可得到糖化血红蛋白的百分含量，其中a1，b1，a2，b2为常数项。
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