CN106461670A - 糖化蛋白质试验 - Google Patents

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Abstract

描述了用于进行血红蛋白A1c、糖化白蛋白和其他糖化蛋白质的试验的方法、装置和试剂。该方法包括确定糖化蛋白质与未糖化蛋白质之间的比率。在一些应用中，试验采用LOCI用于信号生成。本发明涉及用于检测糖化蛋白质，尤其包括糖化血红蛋白的试验和相应装置及试剂。通常理解所述检测用于控制糖尿病患者的血糖水平和监测前期糖尿病个体的状态。

Description

糖化蛋白质试验
相关申请的交叉参考
本申请要求2014年3月20日提交的美国临时专利申请号61/968,297的优先权，该文通过引用纳入本文。
发明领域
本发明涉及糖化蛋白质试验。
发明背景
提供以下说明仅仅辅助阅读者理解，并且并不承认本文公开或参考的任意信息构成本发明的现有技术。
对糖尿病患者中血糖浓度的控制已经显示降低疾病的长期微血管和神经并发症的频率和严重程度。已经发现糖化血红蛋白形成的速率与血液中的葡萄糖浓度直接相关。结果，在对葡萄糖水平的监控中，利用对糖化血红蛋白的检测来确定血糖浓度在延长的时间段内已被控制的程度。
一般而言，血红细胞的平均寿命是约90-120天。因此，血红蛋白的糖化百分比的确定与这段时间期间，并且尤其是在之前的2-3个月中的平均葡萄糖浓度相关。因此，糖化血红蛋白的百分比是这段时间中血糖控制的指标。
血红蛋白变体，如HbS、HbC、HbD、HbE，可能具有较短的平均寿命和不同的糖化率并且可能对％HbA1C与平均葡萄糖浓度的相关性有影响，因此影响HbA1C结果的临床价值。
知晓常见变体是否存在，尤其在筛选环境中，是评价血糖控制时的重要因素。
已经发现葡萄糖粘附于血液中的非血红蛋白蛋白质，例如，丰富蛋白质，白蛋白。由于白蛋白的循环半衰期为约20天，糖化白蛋白的浓度(或比率)是对之前2-3周中的平均葡萄糖浓度的度量。
一些用于确定糖化蛋白质的浓度或百分比的方法已经使用与糖化蛋白质的糖的1，2顺二醇结合的二羟基硼基化合物来使它们与非糖化蛋白质分离。这类方法包括美国专利号4,269,605、5,284,777、5,110,745、4,861,728、PCT申请WO 96/03657、和PCT申请WO9840750中所述的那些方法，其通过引用全文纳入本文。
发明内容
本发明涉及用于检测糖化蛋白质，尤其是包括糖化血红蛋白的试验和相应装置以及试剂。如一般理解，这种检测可用于控制糖尿病患者的血糖水平，并且用于监控前期糖尿病(pre-diabetic)个体。本文描述了提供适用于多种环境，包括医疗点环境中的快速、高精度试验的试验。
本发明描述了用于对血红蛋白A1C(即，糖化血红蛋白)进行精确和准确定量的试验模式。另外，在一些实施方式中，这种多重试验将检测在测试的样品中是否存在常见变体。在一些实施方式中，试验通过分别测量血红蛋白A1C和总血红蛋白并取得这两个结果的比率提供了血红蛋白A1C百分比的定量结果。可定量、半定量或定性检测常见血红蛋白变体HbS、HbC、HbD和HbE。如本文所述，血红蛋白变体结果可合并或分开表达，从而提供了各种变体的存在或量。这种检测可用于筛选糖尿病患者并用于监测糖尿病个体的状态。本文描述了提供适用于多种环境，包括医疗点环境中的快速、高精度试验的试验。
本发明的第一方面涉及一种确定样品中糖化蛋白质的分数的方法。该方法包括使(i)标记的特异性结合成员，其对总蛋白质或对应于总蛋白质(即，糖化或未糖化形式的特定蛋白质的总量，例如，糖化或未糖化血红蛋白的总量)的肽有特异性或对未糖化蛋白质或肽有特异性，和(ii)标记的特异性结合成员，其对糖化蛋白质(例如，血红蛋白A1c)或肽有特异性，与以下物质接触：
a.含有易于糖化的所述蛋白质或蛋白质的肽的样品；和
b.所述蛋白质或肽或者所述蛋白质或肽的未糖化形式，其中任一者是竞争蛋白质，并且不来自所述样品，并且在一些实施方式中是生物素化的；和/或
c.所述蛋白质或肽的糖化形式，其任一者是竞争蛋白质，并且不来自所述样品，并且在一些实施方式中是生物素化的。
该方法然后包括用至少指示糖化蛋白质(例如，A1c)水平的第一信号，和至少指示未糖化蛋白质或总蛋白质水平(例如，血红蛋白(糖化和未糖化)和任选的血红蛋白变体的总量)的第二信号检测多种信号；并且确定糖化蛋白质与未糖化蛋白质之间，或糖化蛋白质与总蛋白质之间的比率，作为所述样品中糖化的所述蛋白质的分数的指标。在该试验中，在竞争性结合条件下进行接触，并且第一信号和第二信号是可区分的，例如，在空间上不同，或以可区分形式不同的信号(例如，不同的发射光波长和/或不同时间发射性质)。
在一个方面中，该方法包括提供：
1.对以下物质有特异性的第一标记的结合成员：
a.未糖化蛋白质(例如，血红蛋白)或
b.其(a.的)肽片段，该肽片段特异性指示所述未糖化蛋白质；
c.或总(糖化或未糖化)蛋白质(例如，糖化和未糖化血红蛋白)；
d.或其(c.的)肽片段，该肽片段指示总(糖化和未糖化)蛋白。
2.对蛋白质或肽片段(例如，糖化血红蛋白(HbA1c)或其包含糖化氨基酸的肽)有特异性的第二标记特异性结合成员。
第一和第二结合成员接触包含感兴趣蛋白质的混合物(例如，获自患者血液样品的血红蛋白)。在血红蛋白样品中，人一般具有一些量的糖化血红蛋白和一些量的未糖化血红蛋白。如本文他处所示，可用内肽酶预处理(感兴趣)蛋白质以生成所述蛋白质的肽片段。在这种情况中，第一和第二结合成员接触包含所述肽片段的混合物。
然后可检测(i)糖化和(ii)总蛋白质和未糖化的相对量。在比较试验中，结合成员与蛋白质或肽的所得混合物由(1)与蛋白质或肽结合的结合成员和(2)未结合的过量结合成员组成。然后检测过量结合成员的量。未结合成员的量与混合物中靶蛋白质或肽的量呈反比。在一些实施方式中，对总血红蛋白有特异性的标记的特异性结合成员特异性结合至选白下组的肽：8KSAVTALWGKVNV20、11VTALW15、45FGDLSTP51、76AHLDNLKGTFAT87、49STPDAVMGNPKVKAHGKKVLGA70、和122FTPPVQ127。
试验模式可根据需要改变。在一些实施方式中，结合成员(例如，抗体)连接至固体支持物，其可包括但不限于可任选被检测的珠或颗粒。在一些实施方式中，向结合成员和来自样品的蛋白质及其肽的混合物中施加侧流以将混合物迁移到用于未结合的结合成员的捕获区。例如，侧流路径中的第一捕获区可包含被第一结合成员识别的肽，从而固定未结合的第一结合成员。流路径中的第二捕获区可包含被第二结合成员识别的肽以固定第二结合成员。第一和第二捕获区可在流路径中的相同或不同位置上。
在其他实施方式中，混合物还可包含对蛋白质(例如，血红蛋白变体)有特异性的其他结合成员。例如，混合物还可包含对HbS有特异性的第三结合成员和对HbC有特异性的第四结合成员。这些结合成员也可连接至固体支持物并且是任选标记的。此外，可使用相应结合成员特异性结合的肽来将第三和第四结合成员固定在侧流中。这将允许使用者进一步确定样品是否来自携带变体蛋白质的供体。
在一些实施方式中，该方法包括裂解细胞以释放蛋白质(例如，含有血红蛋白的血红细胞)和/或至少部分使蛋白质(例如，血红蛋白或白蛋白)变性和/或使用内肽酶(例如，胃蛋白酶或内肽酶GluC(金黄色葡萄球菌(S.aureus))消化释放蛋白质的N-端肽或所述蛋白质的相关多肽。
在具体实施方式中，所述蛋白质是人血红蛋白，例如血红蛋白A1c。在一些实施方式中，肽是人血红蛋白β链的N-端肽，例如，长度为5-14、5-11、5-8、5-7、5、6、7或8个氨基酸残基。在一些实施方式中，蛋白质是人血清白蛋白；肽是人血清白蛋白的N-端肽，例如，长度为4-17、4-16、4-15、4-14、4-10、4-8、6-17、6-16、6-15、6-14、6-10、6-8个氨基酸残基的肽。在一些实施方式中，肽包括人血清白蛋白Lue585、Lys525、Lys199、Lys439或Lys281；使用多种肽，其包括分别包括白蛋白N-端氨基酸、Leu585、Lys525、Lys199、Lys439、和Lys281肽中的至少2、3、4或5个的肽，包括各种可能的组合。在一些实施方式中，使用内肽酶，例如，胃蛋白酶或内肽酶GluC来切割肽(例如，从样品中的血红蛋白或白蛋白切下)；肽是多种肽，例如，2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多种不同肽。
连接至特异性结合成员的标记物可以是，例如，本质上发荧光、时间分辨荧光(TRF)、化学发光、比色/吸收或电子/氧化还原的标记物。如上所述，可在侧流装置上设置分离检测区，其中该装置包括具有针对血红蛋白A1C或相应肽序列的固定位点和针对未糖化血红蛋白或相应肽的固定位点的检测区，并且其中在分开的区中检测信号。可包括其他检测区用于变体检测。这可以是针对全部四种变体的一个区或针对各特定变体的分开的区。在一些实施方式中，各特异性结合成员连接至相同标记物的不同拷贝(例如，TRF)并且通过在侧流装置的不同捕获区中捕获不同结合成员来分开检测。在一些实施方式中，从标记物检测到的信号是磷光。
对于一些实施方式，试验试剂组也包括缓冲溶液；该试验试剂组也包括内肽酶，例如，胰蛋白酶、胃蛋白酶、内肽酶GluC、木瓜蛋白酶，或脯氨酰内肽酶。
在某些实施方式中，第一和第二结合成员信号是荧光信号或时间分辨荧光(TRF)信号。在一些实施方式中，检测在侧流试验装置上进行，其中该装置包括具有用于对糖化蛋白质或肽有特异性的结合成员的固定位点和用于对总蛋白质或肽(或未糖化蛋白质或肽)有特异性的结合成员的固定位点的检测区，并且其中分开检测对应于结合成员特异性糖化蛋白质或肽的信号和对应于对总蛋白质或肽(或未糖化蛋白质或肽)的信号。在一些实施方式中，试验装置如说明的那样并且用于对糖化蛋白质或肽有特异性的结合成员的固定位点和用于对未糖化蛋白质或肽有特异性的结合成员的固定位点在物理上是分离的。在一些实施方式中，试验装置如上述说明并且用于糖化蛋白质或肽的固定位点和用于总蛋白质或肽(或未糖化蛋白质或肽)的固定位点是相同的，并且第一和第二信号是不同的，并由此分开检测。
在具体实施方式中，第一和第二信号来自发光氧通道试验(LOCI)标记物，其包括供体和受体标记物。
在使用LOCI的一些实施方式中，用供体LOCI标记物固定或连接总蛋白质或肽(或蛋白质或肽的未糖化形式)和肽的糖化形式，并且对总蛋白质或肽(或未糖化蛋白质或肽)有特异性的特异性结合成员和对糖化蛋白质或肽有特异性的特异性结合成员用受体LOCI标记物连接，例如，其中供体LOCI标记物是或包括珠(其可经被覆)，其包括多个供体LOCI标记物分子，并且多种蛋白质或肽固定在珠表面上(例如，与珠的共价连接或者特异性结合如生物素/链霉亲和素结合)。
在使用LOCI的其他实施方式中，用受体LOCI标记物固定总蛋白质或对应于总蛋白质的肽(或肽的未糖化形式)和肽的糖化形式，并且对总蛋白质或肽(或未糖化蛋白质或肽)有特异性的特异性结合成员，和对糖化蛋白质或肽有特异性的特异性结合成员用供体LOCI标记物连接。
在使用LOCI的具体实施方式中，该试验以均相试验进行或者使用细颗粒(或交换免疫试验)试验的均匀悬浮液来进行该试验。
在某些实施方式中，对于在试验系统的有效范围内的样品水平的计算的糖化蛋白质或肽(例如，HbA1c)的变异系数低于3.0、2.7、2.5、2.3、2.1、2.0、1.9、1.8、1.7、1.6、1.5、1.4、1.3、或1.2％，基于最少20次重复测量。
一个相关的方面涉及用于LOCI试验的试剂组，包括在糖化位点糖化的具体蛋白质的糖化形式或由其衍生的糖化肽；标记的特异性结合试剂，其包括对具体蛋白质的糖化形式有特异性或对由其衍生的与第一供体和受体LOCI标记物对连接的糖化肽有特异性的特异性结合试剂；标记的特异性结合试剂，其包括对具体蛋白质的未糖化形式有特异性或对由其衍生的与第二供体和受体LOCI标记物对连接的未糖化肽有特异性的特异性结合试剂；和第一供体和受体LOCI标记物对的第二成员，其连接或可连接具体蛋白质的糖化形式或由其衍生的糖化肽；和第二供体和受体LOCI标记物对的第二成员，其连接或可连接具体蛋白质的未糖化形式或由其衍生的未糖化肽。第一和第二供体和受体LOCI标记物对可以是相同或不同的。
在一些实施方式中，LOCI供体标记物连接或可连接未糖化蛋白质或肽和所述蛋白质或肽的糖化形式，例如，其中LOCI供体标记物包括具有多种固定的蛋白质或肽的珠，或多种用于蛋白质或肽的特异性结合的结合位点。
在某些实施方式中，试剂组或其组分在试验装置中；试剂组的组分与含有具体蛋白质的样品结合，其可在体内糖化或者是包含糖化位点的由其衍生的肽。
对于一些实施方式，试验试剂组也包括缓冲溶液；该试验试剂组也包括内肽酶，例如，胰蛋白酶、胃蛋白酶、内肽酶GLuC、木瓜蛋白酶或脯氨酰内肽酶。
在一些实施方式中，具体蛋白质是人免疫球蛋白；试验试剂组包括Hb A1c肽；该试剂组包括人免疫球蛋白β链的N-端肽，例如，长度为5-14、5-11、5-8、5-7、5、6、7、或8个氨基酸残基；具体蛋白质是人血清白蛋白；试剂组中的肽是人血清白蛋白的N-端肽，例如，长度为4-17、4-16、4-15、4-14、4-10、4-8、6-17、6-16、6-15、6-14、6-10、6-8个氨基酸残基的肽；试剂组中的肽包括人血清白蛋白Lue585、Lys525、Lys199、Lys439、或Lys281；试剂组包括多种肽；试剂组包括多种肽，其分别包括白蛋白N-端氨基酸、Leu585、Lys525、Lys199、Lys439、和Lys281肽中的至少2、3、4或5个，包括各种可能的组合；试剂盒包括第一方面说明或如本发明的他处所说明的一种或多种试剂。
在一些方面中，提供了侧流装置(例如，如本文所述)。在一些实施方式中，侧流装置包括流体连通的以下顺序：取样区域；内肽酶区域(包含本文所述的内肽酶的区域)；任选地，中和区域(例如，包含用于中和来自酸性内肽酶区域的溶液的试剂，如果需要，或任选包含结合或灭活内肽酶的试剂的区域)；一个或多个试剂混合区域；一个或多个侧流条；和吸收垫。在一些实施方式中，至少一个试剂混合区域包含；(i)标记的特异性结合成员，其对总蛋白质或对应于总蛋白质的肽或未糖化蛋白质或肽有特异性，(ii)标记的特异性结合成员，其对糖化蛋白质或肽有特异性，和(iii)所述蛋白质或肽的非样品衍生的糖化形式。在一些实施方式中，所述蛋白质是人免疫球蛋白。在一些实施方式中，所述糖化蛋白质是HbA1C。在一些实施方式中，对总蛋白质有特异性的标记的特异性结合成员特异性结合至选自下组的肽：8KSAVTALWGKVNV20、11VTALW15、45FGDLSTP51、76AHLDNLKGTFAT87、49STPDAVMGNPKVKAHGKKVLGA70、和122FTPPVQ127。在一些实施方式中，所述蛋白质或肽的非样品衍生的糖化形式是生物素化的并且一个或多个侧流条中的至少一个包含含有链霉亲和素的固定区。在一些实施方式中，一个或多个侧流条中的至少一个包含以下的分开的固定区：包含总蛋白质或对应于总蛋白质的肽的固定区；包含糖化蛋白质或糖化肽的固定区。在一些实施方式中，相同或不同侧流条包含：包括一种或多种蛋白质同种型的固定区。在一些实施方式中，蛋白质同种型包含HbC、HbD Punjab、HbE或HbS中的至少一种。在一些实施方式中，一个横向条包含以下的分开的固定区：包含总蛋白质或对应于总蛋白质的肽的固定区；包含糖化蛋白质或糖化肽的固定区；和包含含有一种或多种蛋白质同种型的固定区的第二侧流条。在一些实施方式中，糖化蛋白质是人蛋白质；侧流条包含非人靶标；并且试剂混合区域包含对照标记的结合成员，其特异性结合非人靶标。在一些实施方式中，标记物是荧光或时间分辨荧光(TRF)标记物。在一些实施方式中，结合成员的标记物是相同标记物。
其他实施方式将对于说明书和权利要求而言是显而易见的。
附图说明
图1是比率式A1c试验设置的示意图。TRF-官能化的抗-Hb、抗-A1c和参照(对照标记的结合成员)珠的混合物与胃蛋白酶-消化的血液样品和生物素化的合成A1c肽混合。反应混合物通过毛细管作用移动到用链霉亲和素(用于A1c检测)、合成Hb肽(用于Hb检测)和参照抗体条纹化的硝酸纤维膜中。释放的Hb和A1c肽竞争合适的区导致信号随着肽浓度的增加而降低。参照区提供信号来中和流动不规则，膜缺陷，和试剂浓度变化。根据标准曲线，可通过将任意分析区(Hb，A1c)信号除以参照区信号或通过将分析区信号互除来获得分析信号。
图2是血红蛋白变体检测试验设置的示意图，在这种特定构造中被检测到的4种变体在本文中称为“SCDE”。TRF-官能化的抗-HbS、抗-HbC、抗-HbD和抗-HbE珠的混合物与胃蛋白酶消化的血样混合。反应混合物通过毛细管作用移动到用合成SCDE肽偶联物条纹化的硝酸纤维素膜中。如果SCDE肽之一存在于样品中，将会在合适区中发生竞争，导致减少的结合。通过信号水平的特定降低来确定各同种型的存在/缺失。
图3是用于检测A1C水平和患者是否携带血红蛋白变体的检测试验构造的示意图。稀释缓冲液储器提供了与血样混合的稀释液。混合物在通道中(例如，通过真空或毛细管作用)移动到含有内肽酶的腔室中(显示为“胃蛋白酶”，其中血液蛋白质呈现为肽)。所得的肽混合物移动到中和区域(中和内肽酶活性，例如，改变溶液pH以灭活酸活化的内肽酶，如胃蛋白酶)并且然后在液相中与结合成员(TRF-官能化的抗-Hb、抗-A1c和参照(对照标记的结合成员)珠)和竞争物A1c(例如，生物素化的合成A1c肽)混合。混合物可任选地被分入(或不分入)不同侧流条，其中之一检测血红蛋白和A1c和参照水平，并且其中之一检测可能存在的血红蛋白变体蛋白质。末端的垫吸收来自反应的液体，由此抽吸液体穿过条。
图4提供了对证明血红蛋白和A1c的比率式测量的优势的数据的选择。不同的图显示了各种中和使试验内差异减小的优势。
发明详述
本发明涉及检测具体糖化蛋白质水平的试验方法。这类方法可用于，例如，监测个体中的血糖平均水平(通常是人，但是方法也可适于其他动物，尤其是其他哺乳动物)。虽然可使用多种方法来确定在特定时间点的葡萄糖水平，但还能够随时间监测平均水平。已经发现某些蛋白质，尤其是血红蛋白和血清白蛋白的糖化水平与对应于体内具体蛋白质的平均寿命的之前时间段上的平均葡萄糖水平强相关。由于血红蛋白在血液中大约90-120天的寿命，糖化血红蛋白可用作在之前2-3个月的平均葡萄糖水平的指标，更大的权重在之前的一个月，而白蛋白可用作之前1-3周葡萄糖水平的指标。由于血红蛋白变体可能在血液中有不同寿命，其可有助于进行试验解释来说明测试的患者是否携带一种或多种血红蛋白变体形式。关于血红蛋白同种型的量的定量或半定量信息可说明患者对于具体变体是杂合或纯合的，并且临床医师可在评价试验结果时考虑。
因此，可使用本发明的方法，例如，对糖化血红蛋白的水平进行定量，但也可用于对糖化非血红蛋白，例如白蛋白的水平进行定量。在大多数情况中，本发明的试验设置成针对具体感兴趣的蛋白质，提供糖化蛋白质对未糖化蛋白质的相对量。
以下说明集中在糖化血红蛋白的确定，但是应认识到该方法通过用对其他所需蛋白质有特异性的结合分子替换对血红蛋白有特异性的结合分子，以及其他相应材料并凭经验选择的过程调节可应用于监测其他糖化蛋白质。在试验中，虽然可使用全长蛋白质或多肽，在许多情况中，可使用短肽，通常长度为约4-20个氨基酸残基。这种肽可使用具有合适切割位点特异性的内肽酶从全长多肽上切下。
在一些方面中，提供用血红蛋白变体检测来对糖化血红蛋白百分比(％HbA1C)进行确定。在试验中，虽然可使用全长蛋白质或多肽，在一些情况中，可使用短肽，通常长度为约4-20个氨基酸残基。这种肽可使用具有合适切割位点特异性的内肽酶从全长多肽上切下。肽(多肽片段)的检测可改善试验的精度和准度。
A.血红蛋白试验构造
本文所述的试验模式适用于各种标记物和设计的检测，包括但不限于：荧光、时间分辨荧光(TRF)化学发光、比色/吸收或电化学。为了实现多重结果(对一次测试的多重结果)，可使用侧流构造来进行这种试验构造，采用分开的未糖化Hb(或总Hb)和糖化Hb(HbA1C)结合/检测区。
已经开发了两种糖化血红蛋白试验的不同构造，并且适用于其他糖化蛋白质试验。第一种采用发光标记物，如荧光、磷光、或时间分辨荧光(TRF)标记物。这种试验构造可以，例如，使用侧流构造实施，通常用分开的Hb和糖化Hb(HbA1C)结合/检测区，虽然可使用多重化。可通过检测磷光来检测TRF信号。在一些实施方式中，检测TRF信号使得荧光或自荧光最小化。可通过在一个波长上(例如，在紫外区)的间歇光激发并随后测量另一波长上的延迟发光信号(通常在可见区)来实现对磷光的度量。在这种方式中，具有较长延迟时间(一般在毫秒至秒区域中的任意处)的磷光可与荧光区分，荧光具有较短延迟时间(例如，一般小于1毫秒)。检测TRF信号的实施例描述于，例如，PCT/GB2012/051645。例如，PCT/GB2012/051645描述了用于测量样品的发光性质的设备，该设备包含：在控制信号的控制下，用于发射辐射以激发所述样品的激发光源；用于生成调节所述发射辐射强度的所述控制信号的信号源，所述控制信号具有第一频率的第一组分和第二频率的第二组分，所述第一频率的周期小于所述发光性质的预期特征时间常数或与其有相同数量级，所述第二频率的周期大于所述发光性质的预期特征时间常数；用于从所述样品接收由于所述激发发出的辐射并用于生成代表所述接收的辐射强度的检测信号的光检测器；和用于解调所述检测信号从而产生代表所述样品的所述发光性质的信号的解调器。
也可使用其它构造。其次使用近标记物方法，通常发光氧通道试验(LOCI)，其可使用例如分割的样品排列或使用多重化来进行。各种这些构造在下文中详细描述。
1.样品处理
为了确定糖化血红蛋白的水平，在大多数情况中，使用(人)血样。血样或悬浮细胞与血红细胞裂解试剂(例如，合适的裂解去污剂或去污剂组合)接触以从血红细胞中释放血红蛋白。在许多情况中，在加入试验装置之前，样品与血红细胞裂解剂接触，例如，作为样品预处理。然而，在试验装置中可替代性包含裂解剂。多种这类血红细胞裂解剂是已知的并且可用于，例如，各种含去污剂的组合物。合适的血红细胞裂解剂包括，例如，曲通X-100和Igepal CA-630，并且其他裂解剂是本领域技术人员已知的并且可使用。
除了裂解血红细胞以外，样品处理可包括处理以使天然血红蛋白变性，例如，以解离血红蛋白四聚体，并且可进一步使β链变性。例如，在低pH(例如，约pH 4或1-3)下处理血红蛋白以更好地使β-链N-端肽暴露于切割以释放N-端肽。在胃蛋白酶切割的情况中，这种酸性条件(或甚至更酸性的条件)也适于胃蛋白酶活性。
另外，处理可包括稀释样品以提供合适的降低浓度的Hb用于检测。选择稀释以与待使用的试验的灵敏度和动态范围相容。
对于其他蛋白质，样品处理将取决于感兴趣蛋白质。虽然血红蛋白是血红细胞的内部组分，其他糖化蛋白质在血液中是胞外的(例如，人血清白蛋白)、包埋或附连至细胞壁、或在其他类型细胞中是细胞内的。例如，对于胞外蛋白质，通常需要从样品中去除细胞组分，如通过过量或其他细胞去除方法。类似地，对于包埋或附连至细胞膜的细胞膜蛋白质，通常例如使用合适的去污剂来从膜释放蛋白质。
对于血红蛋白，可使多组分蛋白质变性和/或使蛋白质二级和/或三级结构至少部分变性来使得结合或切割位点更可及。可易于确定各具体蛋白质的这种变性需要，并且可选择合适的变性剂和/或条件。
2.血红蛋白肽切割
如上所述，可使用完整蛋白质或多肽，或者用蛋白质衍生的短肽来进行本发明的试验。虽然可使用完整血红蛋白进行试验(通常经变性以解离亚基)，在本发明的方法中通常采用对糖化肽片段而非完整蛋白质的检测。
血红蛋白主要在N-端β-链缬氨酸残基上糖化(通常仅在天然四聚体结构中的2个β-链之一上)。因此，样品处理也可包括切割血红蛋白以提供包含N-端缬氨酸的肽片段。这可使用合适的肽酶，例如，内肽酶，例如，胃蛋白酶或内肽酶GluC消化来实现。根据选择的肽每和消化条件，在一些实施方式中，所得的N-端β链肽的长度将为约5-11个残基。
当使用肽用于切割时，一般溶液是酸性的，例如，约pH 1.1-4.5(通常约1.2-2.0)并且允许切割进行凭经验确定的合适时间。对于胃蛋白酶，合适的消化时间将为37℃下约0.1至60分钟，并且在某些实施方式中为0.3至3.0分钟。然后可通过将pH升至约pH 8.0来变性来使胃蛋白酶失活。
内肽酶可接触液体或固体形式的样品。例如，内肽酶可配制成冻干或干组合物，其在与液体样品接触时易溶。在内肽酶消化之后，所得的溶液可与缓冲液接触以升高溶液的pH，例如，至约pH 6-8，例如，7.2-7.8，例如7.4。
3.血红蛋白同种型检测
已经发现本发明的方法能够通过提供以完整蛋白质(或完整亚基)对多种血红蛋白同种型测量和多重检测或检测特征性同种型肽(包含相应突变残基的可区分肽)带来显著优势。在一些实施方式中，特征性同种型肽包括相应突变残基：HbC(E6K)、HbS(E6V)、HbE(E26K)、和HbD Punjab(E121Q)。按照本领域的标准引用血红蛋白的这些同种型。在没有进一步多态性鉴定的情况下，本文中引用HbD应表示HbD Punjab(HbD Los Angeles)。
最常见的血红蛋白是HbA(普通成年Hb)，变体同种型HbC、HbD、HbE、和HbS在人群中以各种频率出现。这些列出的变体同种型均包括β链中的突变。可在本发明的糖化血红蛋白试验中使用针对相应同种型有良好特异性(或更优选具有对特征性同种型肽有良好特异性)的抗体形成复合物(例如，用于捕获和标记以形成用于TRF检测的可检测复合物)来检测感兴趣同种型。可在单个多重化区或不同区中检测不同的同种型。在例如美国专利号8,603,828 B2中描述了抗体特异性和血红蛋白变体。可选择检测总血红蛋白的单克隆抗体，其结合至HbA和血红蛋白变体共有的表位。可选择特异性检测未糖化血红蛋白的单克隆抗体，其结合具有未糖化的潜在糖化位点的血红蛋白肽。用于产生能够精确检测总血红蛋白的示例性肽包括，例如，8KSAVTALWGKVNV20、11VTALW15、45FGDLSTP51、76AHLDNLKGTFAT87、49STPDAVMGNPKVKAHGKKVLGA70、122FTPPVQ127。
上述同种型检测提供了不受HbF(α2γ2)干扰的检测，因为相应的β链(β链肽)在HbF中不存在并且适当的同种型特异性将不会结合HbF蛋白质或肽。
还已经发现用于释放A1c肽的胃蛋白酶消化也释放HbC、HbD Punjab、HbE、和HbS的合适特征性同种型肽。结果，可在单次胃蛋白酶消化反应中进行适于HbA1c、HbC、HbD、HbD、和HbS中的任意或全部的单次消化。这可在试验装置中进行，后续的同种型检测基于与特征性同种型肽的特异性结合。
A1c的消化也从其他同种型中释放相应的N-端肽。结果，A1c/未糖化肽比率确定将包括比率确定中的其他Hb同种型。
一旦确认具体肽酶释放合适的肽，也可使用其他内肽酶。当使用这种其他肽酶时，通常将需要在同时终止消化反应。这种终止可通过使用相应抑制剂或适于感兴趣内肽酶的其他方法来完成。在一些情况中，可能需要通常分开采用两种或更多种不同的内肽酶。
4.侧流HbA1c试验
如上所述，可使用侧流构造用未消化的Hb或用一种或多种来自β链的肽进行试验。可进行该方法作为包括确定总Hb和糖化Hb的竞争性试验，从而提供HbA1C对总Hb的比率(其可表示成百分比)，虽然也可能构成非竞争性试验。因此，该试验包括至少2次检测：1)确定总Hb(或替代性的未糖化Hb)；和2)确定糖化Hb。因此，在一些情况中，试验确定未糖化Hb和糖化Hb的水平，并且然后总Hb确定为未糖化Hb和糖化Hb之和。当用相同类型的试验生成未糖化Hb和糖化Hb值时，这可具体用于改善精度，使得在一次测量中出现的不精确被“删除”或减少其他测量中的类似错误，例如，在使用如下的比率时。
然后可将％HbA1C计算为：
％HbA1C＝[HbA1C]/([HbA1C+未糖化Hb]x 100
＝[HbA1C]/[总Hb]x 100
这本文的说明聚焦于使用竞争肽的竞争性试验。在一些实施方式中，对于总Hb确定，从样品Hb切下的肽(样品)和未糖化N-端肽竞争物(不来自样品的外源肽，通常合成)竞争结合未糖化Hb肽的标记的特异性结合试剂，例如，抗-Hb肽抗体。在一些实施方式中，肽包含或由Hb的氨基酸49-70组成，但在任意情况中是包含被未糖化Hb的结合试剂识别的表位的全部或部分的肽。结合试剂可被标记、连接至珠或颗粒，或两者同时。在一些实施方式中，结合试剂被固定或者可在检测区中捕获(例如，使用生物素-链霉亲和素结合或通过结合成员与固定肽的特异性结合)。两种肽(一种来自样品且一种是竞争肽)竞争结合特异性结合试剂并且检测了样品肽或竞争肽与特异性结合试剂的结合量。图1说明了这一方面。
例如，在一些实施方式中，内肽酶处理并中和的样品与对代表总蛋白质的肽有特异性的标记的特异性结合成员接触，并且所得的混合物随后接触竞争结合特异性结合成员的固定的肽。与固定的肽的结合与样品中靶肽的量呈反比。检测到的信号与样品中总Hb水平负相关。
类似地，在相同的反应中，对于HbA1C确定，从样品HbA1C切下的N-端肽(样品)和糖化N-端肽(不来自样品，通常合成)竞争结合针对HbA1C N-端肽的标记的特异性结合试剂(例如，抗体)。在检测区中可固定或可捕获结合试剂(例如，使用生物素-链霉亲和素结合)。两种肽竞争结合至特异性结合试剂。检测到的信号与样品中未糖化Hb水平负相关。
例如，在一些实施方式中，内肽酶处理并中和的样品与对代表糖化Hb(例如，A1c)的肽有特异性的标记的特异性结合成员接触，并且所得的混合物随后接触竞争结合特异性结合成员的A1c肽。A1c肽可初始或在另一个实施方式中固定，A1c肽可经生物素化。在后一种情况中，样品中的A1c与竞争A1c肽竞争结合至结合成员并且随后在包含固定的链霉亲和素的区中捕获竞争生物素化A1c肽，从而捕获生物素化的竞争物A1c和结合至生物素化的竞争物A1c的任何特异性结合成员。与固定的肽的结合与样品中靶肽的量呈反比。检测到的信号与样品中A1c水平负相关。
未糖化Hb和HbA1c的检测区在试验中不同，其中两次检测使用相同的标记物，但是检测区可在试验中相同，其中使用不同的标记物，其提供可区分的信号。
在Hb变体待检测的方面中，样品可与对变体有特异性的标记的结合成员(例如，各待检测变体的不同特异性结合成员)接触并且然后接触各待检测变体的竞争肽。如上述试验所述，在一些实施方式中，可固定各变体的竞争肽，并且标记的特异性结合成员与竞争肽的结合与样品中变体的量呈反比。可在相同的侧流条中捕获对变体有特异性的标记的结合成员，因为其中检测到总和糖化蛋白质，或者可在分开的侧流条中检测。例如，参见图2和3。
在一些实施方式中，混合出现在液相中(例如，在微流体通道中，而不在侧流条或垫中)并且从液相直接递送到侧流条。这一方面避免了在“干相”中(即在垫或膜中)发生混合的标准侧流试验中可能出现的一些问题，其中垫和膜之间的连接可能干扰颗粒移动，导致一些额外程度的不准确。
在一些实施方式中，也可进行控制结合反应并且可用于中和来自上述结合反应的信号。例如，在一些实施方式中，结合成员混合物还可包含对照标记的结合成员，其特异性结合不太可能在样品中存在的靶标。例如，对照标记的结合成员(例如，抗体)可具有对来自不同物种的蛋白质的结合特异性(例如，山羊IgG)。对照标记的结合成员可经过含有其余溶液的侧流，并且然后在包含特异性结合对照标记的结合成员的蛋白质(例如，抗-山羊IgG)的区中被捕获。结合的量应该保持相当一致，但将根据试验中除特异性结合亲和性以外的变量而变化。然后，从对照生成的信号可用于中和其他靶信号，从而减少试验中的变异。
5.LOCI HbA1c试验
已经发现可使用发光氧通道试验(LOCI)有效设计HbA1c试验。有效构造是竞争性试验模式。在许多情况中，特异性结合试剂首先接触切割肽，然后接触合成肽，但是顺序可颠倒或者接触可以同时发生。
因此，在竞争性LOCI试验中，组分可包括用LOCI供体或受体标记物连接的合成或纯化的Hb肽(例如，已结合至标记物或者可结合至标记物，如通过使用链霉亲和素/生物素对)和相似的合成或纯化的A1c肽。还存在抗-Hb肽和抗-HbA1c肽抗体(或其他特异性结合试剂)，各自连接LOCI供体或受体标记物对的另一个。
在一些构造中，样品在样品处理后分开，从而分别在分开的空间或位置上确定Hb肽和HbA1c肽的水平，例如，在分开的溶液体积中。例如，样品可沉积在分开的孔中，或者可流入分开的流动通道中。
作为分割样品的替代，试验可多重化，例如，通过使用在可区分的不同波长下和/或在可区分不同时间下发光的LOCI受体标记物。多种这类受体已知并可使用。
在一些实施方式中，使用A1c肽的基础试验包括使用未糖化N-端肽和糖化N-端肽。未糖化N-端肽和糖化N-端肽可在分开的竞争性结合反应中使用，或者可用于与多重化结合的单次结合反应。将描述糖化肽的反应；未糖化肽的反应是基本相同的，除了其涉及对未糖化肽有特异性的抗体。在一些实施方式中，肽与生物素连接，但可替代性地直接与LOCI供体头部连接。结合混合物也包括与LOCI受体标记物连接的抗-HbA1C肽。(注，其他反应将包括抗-HbN-端肽)。这些试剂和含有切割的糖化N-端肽(HbA1C肽)样品混合在一起，并且允许发生切割的N-端肽和可连接或已连接LOCI供体标记物的肽的竞争性结合。结果抗体-受体标记物偶联物将以对应于其在结合反应混合物中相应数量的相对比例结合至切割的肽和可连接或已连接至供体标记物的肽。
当LOCI供体标记物与适于该标记物的波长的光接触时，供体标记物生成单线态氧。由于单线态氧在水性介质中寿命非常短，其将仅在如果供体和受体标记物之间的距离短时激发从受体标记物发出光，即，如果与供体标记物连接的肽已结合至其抗体-受体标记物偶联物。对于与来自样品的肽结合的抗体-受体标记物偶联物，没有发生光发射，因为没有紧密连接的LOCI供体标记物(即，单线态氧生成器)。
结果，当用适于从LOCI供体标记物生成单线态氧的波长的光照射完全的竞争性结合混合物时，发射的光信号的强度将与结合反应混合物中切割的肽的浓度负相关。因此，切割的N-端肽的浓度越高，所得的信号将越小，并且相反，切割的N-端肽的浓度越低，所得的信号将越大。对应于糖化肽的信号和对应于未糖化肽的信号与相应的相关肽浓度相关。然后糖化肽的分数可如下计算为糖化肽与总肽的比率：
糖化分数＝[gHb]/([gHb+Hb]＝[gHb]/([总Hb]
在一些情况中，使用LOCI的试验提供了高精度，给出了具有小于3.0、2.7、2.5、2.3、2.1、2.0、1.9、1.8、1.7、1.6、或1.5％的CV的计算的HbA1c百分比的结果，基于最少20个重复。
6.HbA1c试验实施例
已使用侧流模式的TRF标记物并使用竞争性LOCI来进行试验。
胃蛋白酶消化和试验准备
肽酶消化的条件可显著变化。胃蛋白酶条件的示例可发现于Thomas等，Reg.Toxicol Pharmacol 39(2004)87-98。就潜在差异而言，将测试不同条件下释放Hb N-端肽，包括以下条件：
1.Hb(A1c和未糖化Hb)稀释至5mg/mL(3x)。
2.在84mM HCl，35mM NaCl，pH 1.3(模拟胃液-SGF)中制备1mg/ml胃蛋白酶。
3. 100μL的SGF分成12管并加热至37℃。
4.向6管中加入5μL的总Hb(5mg/mL)，最后一管没有胃蛋白酶。
5.向另外6管中加入5μL的A1c(5mg/mL)，最后一管没有胃蛋白酶。
6.在5、10、20、30和60分钟时取出Hb和A1c管，用35μL的0.2M NaHCO3pH11猝灭，并且然后在85℃下加热10分钟。
TRF试验实施例
对于测试试验，用SGF进行小规模消化。在这一消化方案中，2μl的消化样品([Hb]＝180μg/ml)被加至37℃下的149μl SGF(含胃蛋白酶)，pH 1.3中。消化允许进行1分钟，然后通过加入50μl 0.2M NaHCO3pH11猝灭(也含有5mg/ml的果糖基缬氨酸)，给出最终[Hb]＝1.8μg/ml。
对于实际试验，16μl的消化物与2μl的TRF-抗肽抗体(5μg/ml)和2μl生物素化的肽(20μg/ml)混合。
混合物施加到含有链霉亲和素条的试验条。抗体同时竞争性结合来自消化物的肽和生物素化的肽，但是仅生物素化的肽-Ab复合物将在链霉亲和素条处固定(试验条的捕获区)。可进行试验来给出定量的糖化肽结果，或者可用糖化和未糖化肽同时进行来给出比率(例如，百分比)结果。当同时测试糖化和未糖化肽时，它们可分开进行(例如，使用单一样品或2个不同条)或用多重化一起进行(例如，用在可区分的不同波长下发射的标记物和/或用可区分的不同时间特征或通过在试验条的不同位置处捕获)。
比率式测量和标准化结果导致降低的试验差异
设计了比率式试验，其中保留一条泳道用于A1c竞争性试验，而另一个包含抗山羊抗体，与抗-A1c Ab修饰混合的山羊抗体修饰的TRF颗粒将与其结合以形成参照线。用于该试验中的条含有两条线：链霉亲和素和抗山羊抗体。通过将抗-A1c-TRF珠与生物素化的A1c肽混合并抑制与链霉亲和素线上的消化的A1c校准物的结合来进行A1c试验。抗山羊Ab在第二线上条纹化并用作恒定参照。抗-A1c-TRF和山羊-TRF珠混合并且它们的相对浓度经调节以给出与零抑制时大约相等的信号。
图4提供了来自上述试验的数据。当独立检测总Hb和Ref信号时，差异分别为17％和19％CV(图4，A和B)。将Hb信号除以参照信号使CV降至7％(图4，C和D)。当独立测量A1c和Ref信号时，差异分别为20％和17％CV。将Hb信号除以参照信号使CV降至8％(图4，E和F)。当独立测量A1c和Hb信号时，差异分别为20％和19％CV。将Hb信号除以参照信号将CV降至6％。
Hb变体(同种型)检测
在37℃下在模拟胃液(SGF)中用胃蛋白酶消化已知含有Hb同种型的患者样品。经消化的样品用试验稀释液稀释至总共500倍。向含有4种SCED珠类型的冻干的团块中加入18μl的上述样品。反应混合物在用HbS、HbC、HbD、和HbE肽条纹化的免疫层析膜上跑动(图2)。然后在TRF读数仪上直接读取条。表1显示了相对于平均信号HbAA非同种型阴性对照在条的各区上剩余的信号百分比，证明可通过试验检测不同的同种型。
表1
LOCI试验实施例
进行试验为使用Hb A1c肽的LOCI试验，获得高度精确结果。在下文中，“受体”是指LOCI受体标记物，并且“供体”是指LOCI供体标记物。LOCI试验实施例使用与TRF实施例相同的消化。为了进行试验，将14μl的消化物与2μl的200μg/ml的受体-抗肽抗体复合物溶液、2μl的2μg/ml的生物素化肽溶液、和2μl的链霉亲和素-供体偶联物混合。混合物在黑暗中保持1小时，然后读取信号。对于TRF实施例，可运行糖化肽和未糖化肽的试验，从而信号在分开的位置上，或者信号可经多重化。
7.替代性试验构造
除了所述的一般试验构造以外，可以其他方式构造本发明试验中的一些。
在一些方面中，再次用HbA1C说明构造，虽然构造也可应用于其他糖化蛋白质，可使用针对感兴趣肽，例如，来自患者样品的HbA1C肽，和合成竞争性A1c肽的第一抗体来进行侧流或LOCI模式中的试验。对于侧流，合成A1c肽固定或者游离但可固定在试验条的第一位置上(例如，使用链霉亲和素-生物素对，例如，其中合成A1c肽连接至生物素并且可通过结合至链霉亲和素固定在位置上)。结果，合成A1c肽结合第一抗体并且固定或可固定在第一位置上。因此，对于合成A1c肽和来自患者样品的切割的A1c肽之间的竞争性结合，不与来自患者样品的切割的肽结合的抗-肽抗体标记的偶联物将结合固定或可固定的合成A1c肽。用合成肽固定的标记物提供了与样品中A1c肽的浓度负相关的信号。与来自患者样品的切割的肽结合的抗体-标记物偶联物将不会在第一位置上结合，因为其不含结合部分(如生物素)。
在一些实施方式中，也提供了针对HbA1C有特异性的第二抗体。在该实施方式中，第二抗体，与结合的来自患者样品的切割的肽将在第二位置上结合。如果第二抗体的浓度经滴定，使得基本所有的第二抗体与来自患者样品的切割的肽结合，则第二位置上的信号将与样品中切割的肽的浓度相关，其因此与原始样品中HbA1C的浓度相关。在这种模式中，第二位置的作用是对第一位置上的信号和竞争性结合的检查。
另一种替代性方案包括使用抗糖化肽抗体和针对全蛋白的抗体或针对与全蛋白相关的肽的抗体。还包括消化蛋白质以释放具体糖化肽，例如，N-端肽。如果使用针对全蛋白的抗体，在一些实施方式中，消化仅是部分的，而保留被抗-蛋白质抗体识别的关键表位结构。如果使用额外消化，针对与总蛋白质相关的第二肽的抗体是合适的。对于侧流模式，向条施加含有切割的糖化肽和部分消化的蛋白质(或其他与总蛋白质相关的肽)的消化溶液，其在第一位置上有固定的合成肽(或链霉亲和素或其他结合成员用于固定合成肽)。来自患者样品的切割的糖化肽竞争结合可固定(例如，使用链霉亲和素/生物素对)或固定的合成肽。结果，在第一位置上的结合产生与样品中切割的肽的浓度负相关的信号。第二位置含有针对抗体-蛋白质(或抗体-第二肽)偶联物的固定试剂。
也可针对包括糖化肽和总蛋白质或与总蛋白质相关的肽的双重确定设计使用LOCI的试验(用于具体蛋白质)。在这类试验中，组分包括与合成糖化肽连接或可与之连接的LOCI标记物对之一和与针对肽的抗体连接的LOCI标记物对的另一个。切割的肽与合成肽竞争结合标记的抗体。如前所述，信号与切割的(样品)肽浓度负相关。对糖化肽的检测与对蛋白质或与总蛋白质相关的肽的检测成对。可在分开的体积上或在用多重化提供可区分信号的单体积中进行相应检测。
B.白蛋白试验构造
经过体内非酶促糖化的另一种蛋白质是人血清白蛋白，其血清半衰期为约20天。已经提出了确定白蛋白的糖化水平作为可用于糖尿病管理的度量。
虽然针对血红蛋白A1c试验描述的不同构造可用于糖化白蛋白，LOCI方法有益于该应用。如前所述，该方法使用LOCI，并且可例如使用分割的样品排列或使用多重化来进行。已经报告了白蛋白在自然上主要在4个位点上糖化，主要是N-端。
可构造试验来采用天然糖化位点中的一个或多个，并且可采用完整白蛋白或具有天然糖化位点的肽片段，例如，糖化可及的赖氨酸残基。在一些情况中，选择的糖化位点将包括N-端和/或Lys525、Lys199、Lys439和Lys281中的一个或多个。如上所述，可选择并使用一种或多种肽，其包括这些糖化位点和/或其他中的一个或多个。其他糖化位点包括，例如，可及的精氨酸残基和其他可及的赖氨酸残基。可确定在一个或多个残基处糖化的白蛋白的分数代替确定糖化绝对水平。使用糖化分数有助于消除一些差异来源，包括许多患者间和样品处理差异。
各种糖化位点可以不同比率糖化并因此可糖化至不同程度，该程度取决于平均血糖浓度。因此，可组合使用多个糖化位点以确定糖化模式和/或糖化程度。与单糖化位点分析相似，可确定各位点的糖化率。即，确定各位点上糖化残基与未糖化残基的比率。在低血糖水平上，只有更易感的一个或多个残基将被糖化，例如，5-端残基。在较高血糖水平下，越来越大比例的更易感残基将被糖化，并且中等易感残基将开始被糖化。在更高的血糖水平下，最易感残基将被糖化至更大的程度，越来越大分数的中等易感残基将被糖化，并且弱易感残基将开始被糖化。因此，可使用一组经过糖化的残基各自的糖化模式和/或程度来提供对平均血糖水平的验证和/或附加信息。这可用于，例如，监测不同医药或生活方式介入策略对患者的功效和/或风险。
C.试验准确度控制
样品处理可包括稀释样品以提供合适的降低浓度的分析物用于检测。在一些实施方式中，选择稀释以与待使用的试验的灵敏度和动态范围相容。采用提供至少4、4.5或5个数量级的动态信号范围，或甚至更大范围的试验是有帮助的。
更一般地，通过在宽的动态范围检测系统中使用合适的样品稀释、标记物加载、和用合适标记物构建检测区，相关(例如，临床相关)分析物浓度范围可在可检测信号动态范围上扩展，产生增强的临床准确性。可获得这种优势，因为在大范围上，由于试验和检测系统的不精确是相对恒定的。因此，在这样做的时候，需要避免信号-浓度曲线上系统噪音变得明显更高的区。可在许多试验应用中使用这种方法，例如，在浓度范围的相关数量级明显小于检测系统的动态范围的情况下。因此，例如，如果相关浓度范围在1或2个数量级上延伸，同时系统的信号动态范围是5个数量级，则对应于1或2个数量级的信号可在5个数量级的信号范围上延伸。
可通过调节多个不同参数中的任一个来调节信号-浓度曲线斜率。在许多情况中，调节信号-浓度的斜率和位置，使得对应于感兴趣的最高浓度的信号将在检测系统的动态范围的顶部处或其附近(对于竞争型试验，这将通常是相反的)。通过这种方式，系统的全动态范围可被利用或至少移动对应于感兴趣分析物浓度范围的细胞范围远离低信号区域。这样的结果是降低了固有系统噪音的相对影响。
可以多种方式调节高信号点。这些包括，例如，样品稀释度和/或样品尺寸，其调节样品中分析物的量并因此将标记样品的量用于检测(假定试验系统不被分析物过载)。
或者或量外，可调节每种分析物的信号，例如，通过选择可检测标记物(即，区分每种标记物部分的信号强度)、信号放大、调节捕获位点数量、和/或调节每种分析物的信号生成部分的数量。
定义
“总蛋白质”是指样品中具体蛋白质(例如，血红蛋白)的总量，如论该蛋白质被糖化与否。“对应于总蛋白质的肽”是指感兴趣蛋白质(例如，血红蛋白)的肽部分，其在检测时表示样品中蛋白质的量。这种肽将一般是不包含用于蛋白质的糖化的潜在位点的蛋白质的部分。
本文所用术语“试验装置”(也称为“试验筒”或简称“筒”)是指用于进行试验的装置，其在装置上和/或装置中包括用于施加样品、反应和信号读取的位置。在许多但非全部试验装置中，将有固定分析物的定位区，例如，在大多数侧流试验装置中。
以生物或生物化学试验常用的方式使用术语“标记物”，并且其指以一定方式直接或间接可检测的复合物或分子的部分，该方式提供对标记物是否存在或存在的标记物的量的检测。示例包括荧光团、化学发光部分、光吸收部分、共振光散射颗粒、酶等，以及特异性结合部分，如生物素，其可用于连接用于检测的另一个部分。本文所用术语“可检测标记物”等于术语“标记物”。指示标记物是“直接可检测”表示该标记物直接参与信号生成(例如，荧光团或具有特征性光吸收、反射或散射性质的部分，或放射性部分)。相反，对于待生成的可检测信号而言，“间接可检测”标记物需要存在至少一种其他物质。间接可检测标记物的示例包括与底物反应产生有色、荧光或化学发光物质的酶，和与特异性结合对的另一个特异性结合的特异性结合部分，从而使信号生成物质或部分与间接标记物相关。
术语“全包被标记物”是指一种结构，通常是颗粒，其含有或包含可检测部分并且是下文定义的层状标记物或具有至少一个蛋白质涂层，其基本完全连接至下面的表面(即，“全连接涂层标记物”)，例如，连接至颗粒表面。在大多数情况中，蛋白质将通过胺完全连接，例如，使得可及的胺被基本消除。在大多数情况中，这种全包被标记物具有基本完全覆盖包被颗粒或没有固相颗粒核心的层状结构的内部的一个或多个涂层。
术语“层状标记物”是指一种结构，同时是颗粒，其含有或包含可检测部分并且具有至少2层的一种或多种聚合材料。在许多情况中，层之间有共价连接。在许多情况中，层将是亲水性的。层状标记物将具有核心颗粒，例如，聚苯乙烯颗粒，或可在没有核心的情况下形成。可检测部分，例如，可被层覆盖，和/或可在层内或层间分布。对于具有核心颗粒和被层覆盖的可检测部分的层状标记物，可检测部分可包埋在核心颗粒中和/或核心颗粒的表面上。
术语“分段标记物”是指一种结构，通常是颗粒，其是用共价连接的蛋白质涂覆的蛋白质。蛋白质以基本消除蛋白质中至少一种类型的官能团的方式连接。
然后，例如，通过消除二硫键在蛋白质中产生其他官能团。这种结构，例如，颗粒，含有或包含可检测部分。蛋白质涂层具有一个或多个通过-SH基团连接的其他部分，其通过二硫键还原或通过从这种还原的二硫键衍生的官能团产生。这种其他部分可以是多种类型，例如，特异性结合对的成员(例如，抗原-抗体对的抗原，或链霉亲和素对的生物素)、可检测部分、或其他涂层物质，其可以是相同或不同的蛋白质或不同类型，例如，多糖或合成聚合物。
本文所用术语“侧流试验”和“条试验”等价指代试验模式，通常是免疫试验，其中测试样品通过毛细管作用从样品施加区沿着固相基材(通常是膜，如硝酸纤维素，其可粘附至试验中使用的液体不可渗透的背衬材料)流动到流体接收器中。样品通常遇到检测试剂(通常在样品施加区下游的试剂垫中干燥；通常是有色试剂)，其与样品混合并且通过遇到一个或多个已经用合适的特异性结合部分(一般是抗体或抗原)预处理的线或区的固相基材。
根据样品中存在的分析物，检测试剂可在测试线或区处结合。在通过检测线或区之后，流体进入流体接收器中(通常是吸收性材料)。
术语“分析物”在本文中以体外生物试验的通常方式使用，是指物质，例如离子、分子或复合物，其在试验中被检测和/或定量或至少旨在被检测和/或定量。
本文所用术语“分析物-特异性结合试剂”和“分析物-结合剂”是指特异性结合所需分析物的复合物或分子，并且还可包括具有其他功能的部分，如标记分子或复合物。在一些但不是所有实施方式中，分析物-结合剂在结合分析物后经过可检测结构变化(例如，变构结构变化)。
术语“抗体”在本文中以最宽泛的含义使用并且旨在包括完整单克隆抗体和多克隆抗体，及其衍生物、变体、片段和/或其他修饰，至少它们显示出所需的结合活性。抗体包括免疫球蛋白分子和免疫球蛋白(Ig)分子的免疫活性部分，即包含特异性结合抗原(与其免疫反应)的抗原结合位点的分子。这些包括但不限于多克隆、单克隆、嵌合、单链、Fc、Fab、Fab′、和Fab2片段，以及Fab表达文库。抗体分子涉及IgG、IgM、IgA、IgE和IgD的任何种类，它们之间的差异在于分子中重链的特性。这些也包括亚类，如IgG1、IgG2等。轻链可以是κ链或λ链。本文引用抗体包括引用所有种类、亚类和类型。
抗体可来自多种来源，例如，人、山羊、小鼠、兔、大鼠、绵羊、驼科和鲨鱼等。还包括嵌合抗体，例如，对超过一种来源，例如，小鼠或人序列有特异性的单克隆抗体或其修饰形式。还包括驼科抗体或纳米抗体。抗体也包括多特异性，例如双特异性(例如，多价或多聚)抗体及其功能性片段。将理解在本文中每次引用“抗体”或任意类似术语包括完整抗体，及其任意修饰形式。
与本发明联用的术语“糖化”和“糖化的”或类似术语是指非酶促糖基化。
引用“样品中糖化蛋白质的分数”和类似术语表示，对于具体鉴定的蛋白质，糖化蛋白质水平与总蛋白质水平的比率，或者糖化蛋白质与未糖化蛋白质的比率。可以多种方式表示这种比率，例如，表示成常规分数、小数或百分比。在许多情况中，使用蛋白质的肽片段来进行对糖化蛋白质、未糖化蛋白质、和/或总蛋白质水平的确定。
与本发明的试验相关的术语“总蛋白质”是指具体蛋白质的水平，无论蛋白质被糖化与否，并不指样品中或来自取样的生物体中所有蛋白质的合并水平。
指示蛋白质或肽“对糖化易感”表示该蛋白质或肽含有至少一个可在高血糖条件下在体内被糖化的位点或参加，优选地血糖在临床显著的范围内。这类糖化位点的非限制性示例是血红蛋白β链的N-端氨基酸。在许多情况中，暴露的赖氨酸残基的胺基侧链可在体内被糖化。
在本发明的内容中，引用从样品蛋白质切下的肽(其可被称为“样品肽”)和用于与样品肽竞争结合的肽(其可被称为“竞争肽”)。对于具体的样品肽，竞争肽不需要相同(例如，其可以有不同长度)，但是相反，其在试验关键特性，例如抗体结合方面性质基本相同。例如，从样品蛋白质切下的N-端肽可比相应的竞争肽长或短，和/或竞争肽可经生物素化而样品肽未经生物素化，但是两者基本等价地结合相应抗体。
对于具有不同同种型的蛋白质或多肽，“特征性同种型肽”是包含对应于具有特定同种型特征性的突变残基的多肽序列的序列以及对应于在突变残基的一侧或两侧上的多肽的其他氨基酸残基的肽。例如，对于HbS，特征性HbS同种型肽将包括E6V残基和在缬氨酸残基的一侧或两侧上相邻的Hb氨基酸序列。该术语应用于从全长多肽和合成肽消化的肽。
本文中引用蛋白质或肽的“未糖化形式”和蛋白质或肽的“糖化形式”。“糖化形式”表示糖化的具体蛋白质或肽，而“未糖化形式”是指未糖化的，或至少在相关试验中待检测的位点上未糖化的相同蛋白质或肽。
在本发明的内容中，术语“竞争性结合条件”是指其中特异性结合对的成员接触溶液或悬浮液，和其中特异性结合对的两种可区分成员存在使得它们互相有效竞争结合特异性结合对的关联成员的试验条件。例如，在Hb A1c肽竞争试验中，条件使得来自样品的N-端肽与固定或可固定的N-端肽有效竞争结合相应标记的抗体。
说明书中引用的全部专利和其他参考文献表明本发明所属领域技术人员的水平，并且通过引用全文纳入本文，包括任意表和图，就如同各参考文献单独通过引用全文纳入本文。
本领域技术人员应易于理解本发明将充分调整以获得所述的结果和优势，如同本文固有的那些那样。本文优选实施方式目前所代表的本文所述的方法、变异和组合物是示例性的，并不旨在显示本发明的范围。本领域技术人员将想到其中的变化和其他用途，这将包括在由权利要求的范围所限定的本发明的精神内。
对本领域的普通技术人员而言，显而易见的是，可以对本发明进行各种取代和修改而不会偏离本发明的范围和精神。例如，对使用的具体标记物可进行改变。因此，这种其他实施方式将在本发明和以下权利要求的范围内。
在本文中适当描述的本发明可以在本文中未具体揭示的任何元素、限制存在下实施。因此，例如，在本文的各种情况下，术语“包含”、“基本由……组成”和“由……组成”可相互替换。本文中已经使用的术语和表达用作说明而非限制性的术语，这些术语和表达的使用并不排除所显示和所描述的特征或其部分的任何等同特征或其部分，应认识到各种修饰都有可能落入本发明要求的范围之内。因此，应理解尽管本发明通过优选的实施方式和任选的特征进行了具体地公开，但是本领域技术人员能够想到本文所揭示的内容的改变和变化，这些改变和变化应认为落在本发明权利要求书所限定的范围内。
另外，当按照马库什群(Markush group)或其他替代群描述本发明的特征或方面的时候，本领域技术人员将会认识到，本发明还可由此按照所述马库什群或其他群中的任意单独组成部分或子群描述本发明。
同样，除非有相反水平，在实施方式中提供各种数值或数值范围端点的情况下，通过取任意两个与范围端点不同的值，或通过取2个与其他范围的端点不同的范围端点来描述其他实施方式。这种范围也在本发明的范围内。另外，包括超过一的值的数值范围的说明包括对该范围内各整数值的具体说明。
因此，其他实施方式将在本发明和以下权利要求的范围内。

Claims (67)

1.一种用于确定样品中糖化蛋白质分数的方法，所述方法包括：
使(i)标记的特异性结合成员，其对总蛋白质或对应于总蛋白质的肽或者对未糖化蛋白质或肽有特异性，和(ii)标记的特异性结合成员，其对糖化蛋白质或肽有特异性与以下物质接触
a)含有易于糖化的所述蛋白质或所述蛋白质的肽的样品；和
b)所述蛋白质或肽的非样品衍生的糖化形式；或
c)所述蛋白质或肽的非样品衍生的未糖化形式；
检测多种信号，其中，至少第一信号指示糖化蛋白质水平，并且至少第二信号指示总蛋白质或未糖化蛋白质的水平；并且
确定糖化蛋白质与未糖化蛋白质之间，或糖化蛋白质与总蛋白质之间的比率，作为所述样品中糖化的所述蛋白质的分数的指标，
其中所述接触在竞争性结合条件下进行，并且其中所述第一信号和所述第二信号是可区分的。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述蛋白质是人血红蛋白。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述糖化肽是HbA1C N-端肽。
4.如权利要求1-3中任一项所述的方法，其特征在于，所述蛋白质或肽的非样品衍生的糖化形式是生物素化的HbA1c，并且所述检测在侧流装置上进行，并且所述生物素化的HbA1c在包含链霉亲和素的固定位点处被捕获。
5.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述肽是长度为5-14个氨基酸残基的N-端肽。
6.如权利要求3所述的方法，其特征在于，由胃蛋白酶或内肽酶GluC切割所述肽。
7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述蛋白质是人血清白蛋白。
8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述肽是长度为4-16个氨基酸残基的N-端肽。
9.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述肽包括Lys525、Lys199、Lys439和Lys281中的至少一个。
10.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述肽是多种肽。
11.如权利要求10所述的方法，其特征在于，所述多种肽包含：包括Leu585、Lys525、Lys199、Lys439或Lys281中的至少2个的肽。
12.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述肽是内部肽。
13.如权利要求12所述的方法，其特征在于，所述肽的长度为5-20个氨基酸。
14.如权利要求1所述的方法，其特征在于，由胰蛋白酶、内肽酶GluC、胃蛋白酶或脯氨酰内肽酶切割所述肽。
15.如权利要求1-14中任一项所述的方法，其特征在于，所述第一和第二信号是荧光信号或TRF信号。
16.如权利要求1-15中任一项所述的方法，其特征在于，所述检测在侧流试验装置上进行，其中所述装置包括：检测区，所述检测区包含用于糖化蛋白质或肽的固定位点和用于所述总蛋白质或对应于总蛋白质的肽的固定位点，其中分开检测对应于糖化蛋白质或肽的信号和对应于总蛋白质或对应于总蛋白质的肽的信号。
17.如权利要求16所述的方法，其特征在于，所述用于糖化蛋白质或肽的固定位点和所述用于总蛋白质或对应于总蛋白质的肽的固定位点在物理上是分开的。
18.如权利要求16所述的方法，其特征在于，所述用于糖化蛋白质或肽的固定位点和所述用于总蛋白质或对应于总蛋白质的肽的固定位点是相同的，并且所述第一和第二信号是多重化的。
19.如权利要求16-18中任一项所述的方法，其特征在于，所述样品与对照标记的结合成员接触，所述对照标记的结合成员特异性结合不处于所述样品中的靶标，并且所述对照标记的结合成员固定在固定位点处，所述固定位点包含不处于样品中的靶标的固定形式，并且使用结合定位于所述固定位点的对照标记的结合成员的量来对糖化蛋白质或总蛋白质或两者水平的信号进行标准化。
20.如权利要求19所述的方法，其特征在于，所述不处于样品中的靶标是来自非人物种的蛋白质。
21.如权利要求19或20所述的方法，其特征在于，所述特异性结合不处于样品中的靶标的对照标记的结合成员是标记的抗体。
22.如权利要求1-21中任一项所述的方法，其特征在于，所述检测在侧流试验装置上进行，其中所述装置包括：检测区，所述检测区包含用于糖化蛋白质或肽的固定位点和用于未糖化蛋白质或肽的固定位点，其中分开检测对应于糖化蛋白质或肽的信号和对应于未糖化蛋白质或肽的信号。
23.如权利要求22所述的方法，其特征在于，所述用于糖化蛋白质或肽的固定位点和所述用于未糖化蛋白质或肽的固定位点在物理上是分开的。
24.如权利要求22所述的方法，其特征在于，所述用于糖化蛋白质或肽的固定位点和所述用于未糖化蛋白质或肽的固定位点是相同的，并且所述第一和第二信号是多重化的。
25.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述第一和第二信号来自包括供体和受体标记物的发光氧通道试验(LOCI)标记物。
26.如权利要求25所述的方法，其特征在于，用供体LOCI标记物固定所述肽的所述未糖化形式和所述肽的所述糖化形式，并且，对未糖化蛋白质或肽有特异性或者对总蛋白质或对应于总蛋白质的肽有特异性的所述特异性结合成员，和，对糖化蛋白质或肽有特异性的所述特异性结合成员，用受体LOCI标记物连接。
27.如权利要求26所述的方法，其特征在于，所述供体LOCI标记物包括：珠，所述珠包含多种供体LOCI标记物分子，并且多种所述蛋白质或肽固定或被固定在所述珠的表面上。
28.如权利要求27所述的方法，其特征在于，所述珠被包被。
29.如权利要求25所述的方法，其特征在于，用受体LOCI标记物固定所述肽的所述未糖化形式和所述肽的所述糖化形式，并且对未糖化蛋白质或肽有特异性或者对总蛋白质或对应于总蛋白质的肽有特异性的所述特异性结合成员，和，对糖化蛋白质或肽有特异性的所述特异性结合成员，用供体LOCI标记物连接。
30.如权利要求25所述的方法，其特征在于，所述试验以均相试验的形式进行。
31.如权利要求25所述的方法，其特征在于，所述试验采用在液体反应混合物中均匀悬浮的微颗粒。
32.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述试验提供至少4个数量级的动态范围并且通过调节信号-浓度曲线的斜率来提供增强的临床准确性。
33.如权利要求32所述的方法，其特征在于，所述临床变异系数(CV)小于5％。
34.如权利要求32所述的方法，其特征在于，所述临床CV小于3％。
35.如权利要求32所述的方法，其特征在于，所述临床CV小于2％。
36.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述试验具有至少4个数量级的信号动态范围。
37.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述试验具有至少5个数量级的信号动态范围。
38.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述蛋白质或其肽的多种同种型可区分检测。
39.如权利要求31所述的方法，其特征在于，在单个区中检测所述多种同种型。
40.如权利要求38所述的方法，其特征在于，在分开的区中检测所述同种型。
41.如权利要求38所述的方法，其特征在于，所述蛋白质是血红蛋白β链并且所述同种型包括HbA、HbC、HbD Punjab、HbE和HbS中的至少2种。
42.如权利要求38所述的方法，其特征在于，所述蛋白质是血红蛋白β链并且所述同种型包括HbC、HbD Punjab、HbE和HbS。
43.如权利要求38所述的方法，其特征在于，所述蛋白质是血红蛋白β链并且所述同种型包括HbE和HbS。
44.如权利要求1-43中任一项所述的方法，其特征在于，所述样品与对照标记的结合成员接触，所述对照标记的结合成员特异性结合不处于样品中的靶标，并且之后检测所述对照标记的结合成员，其中使用所述对照标记的结合成员的检测的量来对糖化蛋白质或总蛋白质或两者水平的信号进行标准化。
45.如权利要求44所述的方法，其特征在于，所述不处于样品中的靶标是来自非人物种的蛋白质。
46.如权利要求44或45所述的方法，其特征在于，特异性结合不处于样品中靶标的所述对照标记的结合成员是标记的抗体。
47.用于LOCI试验的试剂组，其包含
在糖化位点上糖化的具体蛋白质的糖化形式或由其衍生的糖化肽；
标记的特异性结合试剂，其包含对所述具体蛋白质的糖化形式有特异性或对由其衍生的糖化肽有特异性的特异性结合试剂，其用第一供体和受体LOCI标记物对的第一成员连接；
标记的特异性结合试剂，其包含对所述具体蛋白质的未糖化形式有特异性或对由其衍生的未糖化肽有特异性的特异性结合试剂，其用第二供体和受体LOCI标记物对的第一成员连接；和
连接或可连接所述具体蛋白质的糖化形式或由其衍生的糖化肽的所述第一供体和受体LOCI标记物对的第二成员；和
连接或可连接所述具体蛋白质的未糖化形式或由其衍生的未糖化肽的所述第二供体和受体LOCI标记物对的第二成员，
其中所述第一和第二供体和受体LOCI标记物对可以是相同或不同的。
48.如权利要求37所述的试验试剂组，其特征在于，所述LOCI供体标记物连接或可连接所述未糖化蛋白质或肽，且连接或可连接所述蛋白质或肽的糖化形式。
49.如权利要求37所述的试验试剂组，其特征在于，所述LOCI供体标记物包含：珠，所述珠包含多种固定的蛋白质或肽，或用于蛋白质或肽的特异性结合的多个位点。
50.如权利要求37所述的试验试剂组，其特征在于，所述试剂组在试验装置中。
51.如权利要求37所述的试验试剂组，其特征在于，所述试剂组的组分与含有可在体内被糖化的所述具体蛋白质或由其衍生的包含糖化位点的肽的样品混合。
52.如权利要求37所述的试验试剂组，其还包含有效量的糖-氨基酸偶联物。
53.如权利要求37所述的试验试剂组，还包含缓冲溶液。
54.如权利要求37所述的试验试剂组，其特征在于，所述具体蛋白质是人血红蛋白。
55.如权利要求37所述的试验试剂组，其特征在于，所述具体蛋白质是人白蛋白。
56.包括按照以下顺序流体连通的侧流装置：
取样区域，其中样品与液体介质混合；
内肽酶区域，其中稀释的样品与内肽酶混合并反应；
中和区域，其中所述反应混合物与中断内肽酶活性的试剂混合；
一个或多个试剂混合区域，其中反应混合物的全部或部分与结合至微颗粒表面的抗体或其他配体混合并反应；
一个或多个侧流条，其中所述微颗粒结合至离散反应区域；和
吸收垫。
57.如权利要求56所述的侧流装置，其特征在于，至少一个试剂混合区域包含：
(i)对总蛋白质或对应于总蛋白质的肽或者未糖化蛋白质或肽有特异性的标记的特异性结合成员，
(ii)对糖化蛋白质或肽有特异性的标记的特异性结合成员，和
(iii)所述蛋白质或肽的非样品衍生的糖化形式。
58.如权利要求56或57所述的侧流装置，其特征在于，所述蛋白质是人血红蛋白。
59.如权利要求56或57所述的侧流装置，其特征在于，所述糖化蛋白质是HbA1C。
60.如权利要求56-59中任一项所述的侧流装置，其特征在于，所述蛋白质或肽的非样品衍生的糖化形式是生物素化的，并且一个或多个侧流条中的至少一个包含含有链霉亲和素的固定区。
61.如权利要求56-60中任一项所述的侧流装置，其特征在于，所述一个或多个侧流条中的至少一个包括以下分开的固定区：
包含总蛋白质或对应于总蛋白质的肽的固定区；
包含糖化蛋白质或糖化肽的固定区。
62.如权利要求61所述的侧流装置，其特征在于，所述相同或不同侧流条包含含有一种或多种蛋白质同种型的固定区。
63.如权利要求62所述的侧流装置，其特征在于，所述蛋白质同种型包括HbC、HbDPunjab、HbE或HbS中的至少一种。
64.如权利要求56-63中任一项所述的侧流装置，其特征在于：
一个横向条包含以下分开的固定区：
包含总蛋白质或对应于总蛋白质的肽的固定区；
包含糖化蛋白质或糖化肽的固定区；并且
第二侧流条包含含有一种或多种蛋白质同种型的固定区。
65.如权利要求56-64中任一项所述的侧流装置，其特征在于，所述糖化蛋白质是人蛋白质；
侧流条包含非人靶标；并且
试剂混合区域包含特异性结合所述非人靶标的对照标记的结合成员。
66.如权利要求56-65中任一项所述的侧流装置，其特征在于，所述标记物是荧光的或时间分辨荧光(TRF)标记物。
67.如权利要求56-66中任一项所述的侧流装置，其特征在于，所述结合成员的标记物是相同标记物。
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