CN101622541A - 糖化血红蛋白定量检测系统及使用该系统检测糖化血红蛋白含量的方法 - Google Patents

糖化血红蛋白定量检测系统及使用该系统检测糖化血红蛋白含量的方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种能同时检测血液中血红蛋白和糖化血红蛋白的装置，包括侧流分析检测试纸条，激光诱导表面荧光检测器，LED检测器，以及一种利用上述装置通过免疫学方法同时定量测定血液种血红蛋白和糖化血红蛋白的方法。

Description

糖化血红蛋白定量检测系统及使用该系统检测糖化血红蛋白含量的方法
技术领域
本发明涉及一种高灵敏度定量检测血液中的糖化血红蛋白的侧流(lateral flow)定量分析检测系统，以及使用该系统进行检测的方法，特别是能同时定量检测糖化血红蛋白和总血红蛋白的集成式定量分析检测方法和系统。
背景技术
糖尿病是一种不正常的碳水化合物代谢疾病，其中葡萄糖不能进入人体细胞也不能被人体利用，因而高浓度停留在血液中，进而引起许多并发症。糖尿病分为三种类型：糖尿病的主要类型是1型糖尿病，叫做胰岛素依赖型糖尿病，当胰腺β细胞受到自动免疫反应的伤害，从而停止产生或分泌胰岛素，就会产生1型糖尿病；2型糖尿病叫做非胰岛素依赖型糖尿病，该类型糖尿病的特征是外周胰岛素抵抗并破坏胰岛素分泌；3型糖尿病是妊娠性糖尿病，典型的发生在怀孕期。在发达国家，已知2型糖尿病是是最普遍的糖尿病，占糖尿病人的90-95％，而1型和妊娠性糖尿病没有那么普遍。
糖尿病可以通过检测尿中或血液中的葡萄糖水平来诊断，但是尿糖对诊断来说并不可靠。由于血糖水平可以被多种因素影响，如饮食和锻炼，因此血糖检验也不准确。由于这些原因，糖化血红蛋白检验是主要用作诊断或监控糖尿病的血液检验。
在1986年，美国糖尿病协会推荐每年进行两次糖化血红蛋白检验来监控所有类型的糖尿病，而且糖化血红蛋白认为是血糖控制的一个稳定指标，自从1993年DCCT(糖尿病控制与并发症试验)显示糖化血红蛋白水平和糖尿病并发症有直接关系以来，被广泛用于处理糖尿病。
基于DCCT和UKPDS(英国糖尿病前瞻性研究)的结果，现行美国糖尿病协会(ADA)指导推荐目标糖化血红蛋白应低于7％。如果糖化血红蛋白的含量高于8％，ADA建议糖尿病治疗要重新检测，且根据需要修改。在2001年，美国临床内分泌学家协会建议目标糖化血红蛋白是6.5％或更低，基于UKPDS的数据如果糖化血红蛋白为6.5％或更高，糖尿病患者的视网膜脱落会增加。在1999年，国际糖尿病联合会(IDF)也推荐目标值为6.5％。
根据DCCT对1441名患者6.5年的临床研究，通过成功对血糖的严密控制，微脉管并发症的风险显著减少。因此，患者和内科医生都认为严密控制血糖水平是必须的。
人类成熟的血红蛋白一般包括三种类型：97％HbA，2.5％HbA2和0.5％HbF。其中，HbA含有四个多肽链：两个α链，每个含有141个氨基酸，以及两个β链，每个含有146个氨基酸。HbA色谱分析显示有96％的较多血红蛋白和5～6％的较少血红蛋白，命名为HbA1或糖化血红蛋白。糖化形式的血红蛋白是通过在β链N端的缬氨酸加上葡萄糖形成的，HbA1为80％，剩下的部分为HbA1a和HbA1b。
糖化是在蛋白质的氨基酸残基上通过非酶作用加入糖分子的，这是一个非常慢且不能逆转的反应。糖化血红蛋白是通过不断在血红蛋白上添加血糖形成的，且糖化血红蛋白和血红蛋白的比例由红细胞暴露于葡萄糖的时间决定。特别是，在糖化作用中，葡萄糖加在HbA的缬氨酸上形成HbA1c前体，然后通过阿玛多尔重排形成稳定的酮氨型。此时，血糖水平的升高增加了血红蛋白暴露在周围葡萄糖中的时间，从而产生高比例的糖化血红蛋白。因此，糖化血红蛋白的比例反映了血糖水平。同时，由于红细胞的寿命是60天到120天，糖化血红蛋白检验能帮助监控血糖水平的长期控制。
人们开发了血液中糖化血红蛋白检测的不同方法。目前可用的方法包括离子交换色谱、亲和色谱、电泳、复合比色法或类似方法。这些方法都难于实施，且需要熟练的技术人员和仪器。同时，考虑到一次性临床分析系统的发展趋势，在异地应用的，如家里，或即时检验(POCT，point-of-care testing)，非常有用的定量检测系统被提了出来，如视觉，光学和电化学检测方法。
近来，识别糖化血红蛋白N-端残基的单克隆和多克隆抗体被开发出来(U.S.Pat.No.4,647,654)，因此推进了利用抗体对糖化血红蛋白进行定量免疫分析系统的研究。由于在免疫分析系统中采用了识别糖化血红蛋白的抗体，其在特异性和灵敏性方面具有优势。当用免疫分析检验法检测糖化血红蛋白水平时，必须制备具有高灵敏度识别糖化血红蛋白特异的糖化区域的抗体。由于血液中的糖化血红蛋白被糖化的区域不是暴露在外部，为了能被抗体识别，糖化血红蛋白必须首先被修饰。因此，血红蛋白必须变成高铁血红蛋白以用于总血红蛋白的分光检测。高铁血红蛋白具有吸收特定波长的光的性质，因此其通过分光法测定其吸收可以定量检测总血红蛋白含量。同时，修饰的糖化血红蛋白通过免疫学方法确定其在血液中的糖化血红蛋白的含量。
免疫检验装置根据其原理可以分成通流(flow through)型和侧流(lateral flow)型。在通流型中，抗体与多孔基质表面共价偶联，且样品中的分析物与固定化抗体结合。然后，再加入二级捕获抗体，随后再用发色酶底物进行视觉检测。有两种类型的侧流免疫分析检验装置。一种类型是一体式装置(all-in one)，另一种类型是当流动样品通过固定在多孔基质上的标记固定化抗体时，与标记抗体结合的装置。
侧流型的结构包括：样品垫(sample pad)，可以用于上样；释放垫(releasing pad)，包被有检测抗体；显影膜或试纸条(developing membrane or strip)，样品中的成份在其中移动，并被独自分开，再进行抗原-抗体反应；以及吸收垫，可以连续吸收流体以使样品能持续流过该装置。侧流分析检验可以广泛且便利地应用于不同领域，如怀孕诊断，癌症诊断和微生物检测。但是由于不能用裸眼进行定量检测，因此不能检测分析物的准确含量，其应用受到限制。
利用HbA1c的抗体的免疫分析检测一般应用测定反应体系的浊度变化来进行。由于HbA1c特异性抗原表位只出现在糖化血红蛋白β链N端，因此抗原-抗体复合物不会聚集。因此，具有多个抗原表位的多聚半抗原会与抗体反应，形成不可溶的免疫复合物。可以通过比浊来测量。浊度信号与样品中的糖化血红蛋白浓度成反比。但是，这种方法有个缺点：需要单独的分析实验室和自动分析设备，因为它包含几个处理步骤。
韩国专利公开号为2004-0018893公开了一种糖化血红蛋白检验试剂盒，它包含缓冲液，缓冲液中含有糖化血红蛋白抗体，含有血红蛋白抗体的试纸条，以及洗脱溶液。不幸的是，不能检测糖化血红蛋白的准确含量，这是由于试剂盒是一个半定量分析检验系统，其中将染料加入糖化血红蛋白抗体中，并且HbA1c存在所引起的颜色变化是通过裸眼观测或者使用比色板进行视觉比较。
目前，可以定量检测分析物的放射免疫检测法(RIA)或酶联免疫吸附测定(ELISA)法，涉及几个复杂步骤，包括，用酶处理和洗涤。因此，对能够进行更快速，更便利，更灵敏定量检测的普通检测方法有很大的需求。
发明内容
技术问题
如上所述，用抗体对糖化血红蛋白的量进行定量测定的便利的检测装置的灵敏性较低且为进行定量免疫检测包含几个复杂的步骤，包括，用酶处理和洗涤。因此，本发明人通过努力研究提供了一种集成式定量分析检测系统，它能够同时对糖化血红蛋白和总血红蛋白进行定量测定，以及能进行定量的更快速，便利，灵敏的方法，从而实现了本发明。
技术方案
考虑到免疫分析检验的优势和对定量分析的需要，本发明人提供了一种检测糖化血红蛋白水平的即时检验装置，可以简单的对血液中的糖化血红蛋白水平进行定量，从而实现糖尿病的早期诊断。相应的，本发明的一个目的是提供一种防止或减小糖尿病患者并发症风险的方法，为患者或内科医生严格控制葡萄糖水平提供便利。
本发明的另一个目的是，提供一种集成式定量分析检测系统，它能同时对糖化血红蛋白和总血红蛋白进行定量测定，该集成式定量分析检测系统包括，能定量测定糖化血红蛋白的侧流分析检验试纸条，定量测定抗原分析物的激光诱导表面荧光检测器，以及定量测定染料分析物的LED检测装置。
本发明的另一个目的是，提供一种使用免疫反应的特异性和选择性，定量检测样品中抗原分析物的方法，其中，当含有抗原分析物的样品和预定量的检测物沿侧流分析检验试纸条移动的时候，样品中的检测物和基质上固定化的捕捉物发生竞争性抗原-抗体反应，检测标记的检测物产生的信号，单独检验侧流分析检测试纸条上的染料分析物的量，计算抗原分析物与染料分析物的比例。
有益效果
如上所述，一种集成式定量分析检验系统，包括侧流分析检测试纸条，激光诱导表面荧光检测器，和LED检测器，提供了一种利用抗原-抗体反应有效定量检测糖化血红蛋白的方法，因此对于需要严格控制葡萄糖水平的患者是非常有用的。
附图说明
图1.本发明的定量检测血液中血红蛋白水平的集成式定量分析检验系统的透视图；
图2.本发明的侧流定量分析检测试纸条的透视图；
图3A.用激光诱导表面荧光检测器检测糖化血红蛋白的光路系统的透视图，和
图3B.用LED检测总血红蛋白含量的光路系统的透视图；
图4.使用LED检测器测定的血红蛋白标准曲线；
图5.糖化血红蛋白标准曲线；和
图6.已知的大型仪器与本发明的定量分析检测系统间的性能比较的结果。
附图标记说明
100：侧流定量分析检测试纸条
101：背板
102：样品垫
103：偶合释放垫
104：色谱介质
105：吸收垫
106：抗原分析物检测区
107：染料分析物检测区
108：窗口
109：样品架
110：试纸条盒
200：激光诱导表面荧光检测器
201：激光
202：激光束形状控制透镜
203：收集透镜
204：萤光滤光片
205：聚焦透镜
206：空间滤波器
207：光学检测器
300：LED检测器
301：LED光源
302：光圈
303：光检测器
最佳实施方式
根据第一方面，本发明提供了一个侧流定量分析检测试纸条，包括背板，样品垫，色谱介质，以及吸收垫，其中所述背板支撑试纸条上的所有部件，且所述样品垫和吸收垫不重叠的分别黏附在背板的两端。朝向黏附吸收垫方向的样品垫的一端与色谱介质的一端重叠，样品首先加在其上。色谱介质的另一端与吸收垫重叠，捕捉物固定在与样品垫有一定距离的色谱介质上。在样品垫和色谱介质之间，试纸条最好还包括一个偶合释放垫，其上吸附有荧光标记的检测物。更优选的是，试纸条还包括一个试纸条容纳器，可以覆盖除了点样点、表面荧光检测区和LED检测区以外的整个试纸条，以防止试纸条被污染。
此处术语“流体样品”或“样品”指的是被分析的化合物或组分，其中含有分析物或检测物和分析物，且本发明所用的流体样品或样品指的是能在色谱介质上迁移的液相材料或液体样的流体材料。
此处术语“分析物”指的是样品中含有的用于分析的化合物，且包括抗原分析物和染料分析物。此外，术语“染料分析物”和“抗原分析物”在此分别指的是一种蛋白和糖化蛋白，特别是血红蛋白和糖化血红蛋白。抗原分析物参与抗原-抗体反应，且本发明中染料分析物和抗原分析物都通过LED产生信号。
此处术语“检测物”指的是上述抗原分析物的抗体，优选糖化血红蛋白的抗体，更优选标记有荧光材料的糖化血红蛋白抗体。
此处术语“捕捉物”指的是与样品中抗原分析物一样的化合物或材料，或含有与抗原分析物的检测物识别区一样结构的材料，糖化的蛋白，优选人糖化血红蛋白。捕捉物固定化在试纸条上，特异的，选择性的捕获样品中沿试纸条移动的游离检测物。
此处术语“表面荧光”指的是由荧光标记的检测-分析物的偶联体或荧光标记的检测物发出的荧光，它们被固定在色谱侧流分析检测试纸条的抗原-分析物检测区。
此处术语“吸收”指的是浓缩材料被吸附在构成试纸条的色谱介质或垫上。它可以随色谱的流动相一起迁移，也可以通过适当处理固定化。
此处术语“固定化”或“固定的”指的是样品或试剂被固定在色谱介质或试纸条上，尤其指的是样品或试剂不溶于色谱流动相或溶剂的状态，且不随流动相迁移，固定在一定位置。
根据另一方面，本发明提供了一种集成式侧流定量分析检测试纸条，它能同时定量检测样品中的抗原分析物和染料分析物的含量，包括上述第一方面所述的侧流分析检测试纸条，激光诱导表面荧光检测器，该检测器可以通过测定侧流分析检测试纸条上的荧光物质的荧光测定抗原分析物的量，以及LED(发光二极管)检测器，该检测器可以测定侧流分析检测试纸条上的染料分析物的含量。
特别是在表面荧光检测器中，通过控制激光束形状的透镜和激发滤色镜后光被照亮，反射光通过聚焦透镜形成平行光。平行光通过荧光滤光片去除散射光，然后纯荧光进入聚光镜。通过聚光镜纯荧光聚焦在空间滤波器的中心。在空间滤波器中，除了纯荧光之外的其它光被除去。光再进入光学检测器。通过与光学检测器连接的模数转换器(ADC)转变成数字信号，再传给中央处理器(CPU)，根据耦联物的荧光强度与参考荧光强度的比值测定分析物含量。
在LED检测器中，根据LED光源吸收或散发的光量随染料分析物含量变化的原理，测定染料分析物的含量。特别是，分析物被LED光源照亮，被分析物散射的光被定位在光轴前的空间滤波器过滤掉。为了测定样品中染料分析物的含量，染料分析物的散射光送到光学检测器。光学检测器检测的光信号通过数模转换器(ADC)传给CPU。
根据另一方面，本发明提供了一种利用本发明的集成式侧流定量分析检测系统检测血液糖化血红蛋白水平的方法。
特别是，预期含有抗原分析物和染料分析物的样品加到侧流分析检测试纸条的样品垫后，流体样品沿色谱介质移动，加样前或移动过程中，通过在样品中添加一定量的检测物，从而通过初级免疫反应形成检测物与抗原的偶联物。当样品沿色谱介质展开的过程中，捕捉物与检测物与抗原分析物的偶联物和/或游离检测物间形成竞争性的二级免疫反应，从而形成偶联物。其中该捕捉物固定在色谱介质上，与样品垫有一定的距离。竞争反应之后，分别检测，与在色谱介质上固定的捕捉物结合的检测物的量和色谱介质上染料分析物的量。计算抗原分析物与样品中分析物的比例，来定量检测抗原分析物的量。
优选，荧光材料标记一定量的检测物，在向试纸条上加样前，将检测物与液体样品混合。如果侧流分析检测试纸条包括偶合释放垫，也可以先将检测物吸附到偶合释放垫上。当样品沿色谱介质迁移时，通过偶合释放垫，此时检测物溶解在液体样品中，或与其混合。然后，检测物与样品中的抗原分析物结合形成荧光标记的检测物-抗原偶合物。没有抗原或抗原分析物缺乏的情况下，检测物以游离形式沿色谱介质迁移。
在色谱介质上距加样点一定距离(下文指的是抗原分析物-检测区)的位置固定捕捉物。当样品到达捕捉物固定化的区域时，捕捉物与游离的检测物和/或检测物-抗原分析物偶合物结合，形成检测物-捕捉物偶合物。最后，可以检测荧光标记检测物的激光诱导表面荧光检测器收集抗原分析物检测区的信号，以测定抗原分析物的含量，即与检测物偶合的糖化血红蛋白的量。
同时，色谱介质上血红蛋白和糖化血红蛋白的量用能够检测染料分析物的LED检测。计算抗原分析物与染料分析物的比例来定量测定样品中抗原分析物的含量。
下文中，结合附图将详细介绍集成式侧流定量分析检测系统，该系统包括侧流分析检测试纸条，激光诱导表面荧光检测器和LED检测器，和一种使用该系统同时定量检测血液中总血红蛋白和糖化血红蛋白含量的方法。
图1.根据本发明优选实施例的侧流分析检测试纸条的透视图；其中，该试纸条包括背板101，样品垫102，偶合释放垫103，色谱介质104和吸收垫105。构成该侧流分析检测试纸条的每个组件详述如下。
背板
背板101支撑试纸条上的所有组件，实际上为了省事，层析基质104本身可以是背板。典型的背板可以由宽度和长度与位于其上的垫相等的水不溶、非孔且硬质材料构成，样品沿着其展开，但是尺寸可以比垫宽或窄。在制作背板的时候，可以采用不同的天然或合成有机或无机材料，只要由这些材料所制备的背板不妨碍吸收材料的毛细作用，不与分析物进行非特异性结合，不妨碍分析物与检测物的反应即可。本发明可用的聚合物的例子包括，聚乙烯，聚脂，聚丙烯，聚4-甲基丁烯，聚苯乙烯，聚甲基丙烯酸酯，聚对苯二甲酸乙二酯，尼龙，聚乙烯基丁酸酯，玻璃，陶瓷，金属和其类似物，但不限于此。
在背板上，通过黏合剂粘上一系列的垫。选择合适的黏合剂可以提高试纸条的性能和延长试纸条的货架期。根据本发明，压感黏合剂(PSA)适于本发明的侧流分析检测试纸条。特别是当黏合剂渗入垫的孔中时，侧流分析检测试纸条的不同垫黏合在背板上了。这种结合，黏合剂在正常条件下的流动能力称为“冷流动”。因为，在垫上涂PSA时没有用任何热量，一定水平的冷流动对于垫与背板的结合是必不可少的。如果冷流动太低，在试纸条的储存过程中，黏合剂迁移到被它粘结的垫中，从而封闭了孔，形成疏水污染点或导致垫再次潮湿问题。这种问题与黏合剂的冷流有关，可以通过使用直接成型膜来解决。例如，在直接成型膜中，支撑塑料片可以阻止黏合剂进入膜的孔中，从而防止黏合剂在储存过程中的纵向移动。
样品垫
样品垫102位于试纸条的一端，样品垫的一端与色谱介质104重叠，或者当有偶合释放垫103时，与一部分偶合释放垫103重叠。
样品垫主要用于接收含有分析物的流体样品。除了这个功能，样品垫还可以过滤样品中的不溶性颗粒。从这种观点看，本发明的样品垫优选具有过滤功能的纤维素滤纸或玻璃滤纸组成。通常，采用S&S生产的纤维素膜(903级)。
更好的是，样品垫事先处理以防止样品中的分析物非特性吸附在其上，使得样品组分易于在色谱介质中迁移，维持反应的灵敏性且防止不期望的荧光标记检测物与样品组分间发生的非特异性吸附。样品垫的预处理通常可以用非活性蛋白或表面活性剂处理。例如，非活性蛋白的预处理可以通过将垫材料浸在0.1％-10％脱脂奶粉的0.1M Tris溶液(pH6-9)且含有0.1-10％的BSA(牛血清白蛋白)和/或0.1-10％的酪蛋白溶液。用表面活性剂预处理可以通过将垫浸在Triton X-100或吐温-20中，但是这些预处理步骤要参考分析物和样品的种类来决定。]
偶合释放垫
侧流分析检测试纸条可以有选择的包括一个偶合释放垫103。因此，偶合释放垫黏在背板101上，以使偶合释放垫的一端与样品垫102重叠，而另一端与色谱介质104重叠。
能够与样品中的分析物反应形成偶合物的荧光标记检测物黏附在偶合释放垫上，但不是固定在上面。它通过与样品中的分析物反应形成偶合物，与样品一起在色谱介质中迁移。
将试剂黏附在偶合释放垫上的方法包括所有已知的方法。其具体实施例包括渗透，干燥，或冷冻干燥过程，但不限于此。
偶合释放垫材料优选具有快速过滤能力且具有很好黏附颗粒的能力。作为这种材料，可以采用合成材料如聚酯和玻璃纤维滤纸。通常可以采用玻璃中的主要成分玻璃纤维和聚酯，在本发明的实施例中使用的是S&S生产的玻璃纤维。由于这些都是生物惰性物质，且比天然材料更脆的纤维材料，当加液体试剂或样品的时候，它们不变形，不胀大。更优选的是，偶合释放垫用表面活性剂这样的试剂进行预处理，以防止在释放垫上分析物与荧光标记检测物的非特异性结合，且偶合物可以平稳的释放迁移。
偶合释放垫可以用稳定剂和保护剂处理，以提高其性能和稳定性。稳定剂包括蔗糖和海藻糖这样的糖类。保护剂包括如BSA(牛血清白蛋白)，明胶，酪蛋白和脱脂牛奶这样的蛋白，但不限于此。
色谱介质
色谱介质104的两端分别与样品垫102和吸收垫105重叠。当有偶合释放垫的时候，偶合释放垫103和吸收垫105彼此不重叠。
色谱介质可以黏在背板101上，也可以色谱介质本身就是背板。
色谱介质的材料可以是任何让流体样品和分析物通过毛细作用快速移动到固定在其上的捕捉物的地方，最好具有相同的性质。尤其是，色谱介质具有至少0.1μM孔径的多孔材料，优选1.0μM孔径，液体可以通过毛细作用快速移动。这种材料通常是亲水的或疏水的，例如，包括无机粉末(如纤维，如滤纸和色谱纸)，合成或改性聚酯(硝化纤维素，醋酸纤维素，聚氯乙烯，聚丙烯酰胺，交联葡聚糖，琼脂，聚丙烯酸酯)，可以只用这些材料也可以将其与其它材料合用。也可以用陶瓷。
色谱介质是多功能的，或与捕捉物共价结合修饰成多功能的。
具有上述性质的色谱介质的实例包括：S&S生产的AE98，AE99和AE100；Millipore生产的HF090，HF120，HF135，HF180和HF240；Sartorius生产的CN90，CN140和CN200，优选的色谱介质是Sartorius生产的CN90。由于CN90膜具有最小的流速变化(±3秒)，因此重现性好。每平方厘米结合配体的容量是10-30μg，这是足够的，因此荧光物质的放大是非常好的。
在色谱介质上，在特定区域(抗原分析物检测区)加上抗体或HbA1c抗体作为捕捉物，以检测糖化血红蛋白的水平，因此用激光诱导表面荧光检测器检测该区域的荧光信号，从而定量糖化血红蛋白水平。
吸收垫
吸收垫105位于侧流分析检测试纸条距样品垫端最远的位置，且与色谱介质末端重叠。
吸收垫是物理吸收通过毛细作用在色谱介质上层析移动的样品的装置，且可以去除不反应的物质。吸收带位于侧流分析检测试纸条的末端，可以象泵一样控制和促进样品和试剂的移动，并作为容纳它们的容器。样品和试剂移动的速度由吸收垫的大小和质量决定。通常所用的吸收垫是由吸水材料如纤维素滤纸，非织布，衣料和醋酸纤维素构成的。
图2为本发明的集成式层析定量检测系统。本发明的集成式层析定量检测系统包括上述侧流分析检测试纸条100，激光诱导表面荧光检测器200，LED检测器300和一个传动装置。而且，图3-A和3-B为用于本发明的集成式定量检测系统的激光诱导表面荧光检测器200和LED检测器300。下文，将详述构成本发明的集成式定量检测系统的激光诱导表面荧光检测器和LED检测器。
激光诱导表面荧光检测器
激光诱导表面荧光检测器(图3-A)包括激光器201，激光束形状控制透镜202，激发滤色片，收集透镜203，荧光滤光片204，和聚焦透镜205，空间滤波器206，光学检测器207，数模转换器(ADC)和CPU。激光诱导表面荧光检测器可以与公开号为10-0639776的韩国专利中所用的一样，即本发明所用的激光诱导表面荧光检测器。激光诱导表面荧光检测器通过如下方式工作。激光光源发出的光形成一个光点或线形光，通过激发滤色片，照在样品的预定位置。黏附在目标材料上的荧光物质发出荧光。荧光通过收集透镜，荧光滤光片，和聚焦透镜，荧光聚焦在空间滤波器的中央。平行光进入光学检测器。模数转换器(ADC)和中央处理器转变成数字信号，再打印出来。
抗原分析物的定量检测采用激光诱导表面荧光检测器，最好是血液中的糖化血红蛋白水平。从激光光源发出的光照在与抗原分析物特异结合的荧光标记检测物上。光学系统收集发出的荧光，在光学检测器中进行定量测定。当加入流体样品免疫反应终止后，传动装置驱动试纸条以一定速度沿光源方向移动。在扫描过程中，检测器检测激光诱导的荧光。更好的是，当试纸条移动的时候，抗原分析物检测区产生的信号可以收集几次，然后定量测定。
LED检测器
在本发明中，采用LED检测器(图3-B)以光学检测分析物中总血红蛋白的含量。与免疫反应中的荧光物质不同，血红蛋白和糖化血红蛋白本质上都是红色的，因此用绿光LED作为光源。也就是说，所需的光源为具有高斯光谱(458nm-612nm)的绿色LED，光学系统采用硅二极管用于检测流体样品加样区或色谱介质上染料分析物检测区107发出的光。采用与荧光检测系统相似的扫描系统，在短时间内检测从光源反射来的所有光。
结合说明书附图，用本发明侧流分析检测系统，定量检测样品中抗原分析物的方法将在下文中详细描述。
图1为本发明侧流分析检测试纸条的结构图。根据本发明的抗原分析物的定量测定，以流体样品加到本发明的试纸条上作为开始。最好通过样品架109，在样品垫102上加流体样品。当样品加到样品垫后，样品通过毛细作用移动，其移动速度由吸收垫的质量和大小决定。此时，加样前或迁移过程中，将检测物加入到样品上，发生初级免疫反应形成偶合物。这可以通过两种方法实现。一种方法如下，从样品中收集流体样品后，定量测定前将一定量标记的检测物直接加到流体样品中，流体样品中的抗原分析物和检测物发生初级免疫反应，所形成的流体样品加到试纸条上。另一个可选择的方法是，将流体样品加到含有偶合释放垫的试纸条上，上述偶合释放垫是通过事先在偶合释放垫上吸附荧光标记检测物来制作。在这一点上，虽然检测物吸附在偶合释放垫上，它可以溶解在加在偶合释放垫的溶液或流体样品中和/或与之混合，从而与抗原分析物产生初级免疫反应。上述方法任意一个都可以采用，但是由于前一个方法中可以方便的添加不同的检测物便于分析，且可以很容易检测总血红蛋白水平，所以优选前者。
检测物是一种不与流体样品中其它染料分析物结合的抗体，但可以与抗原分析物糖化血红蛋白特异性结合。它可以通过本申请前公开的不同方法制备。优选，鼠单克隆抗体，但不限于此。同时，不管上述方法中是否将检测物加到样品中，优选使用标记有产生信号的荧光材料的检测物。
初级免疫反应形成荧光标记的检测物与抗原的偶合物，它沿色谱介质104迁移，没有与抗体分析物结合的游离检测物也沿试纸条移动，到达抗原分析物检测区106。
抗原分析物检测区位于距加样点(即样品垫)一定距离的位置，一定量的捕捉物固定化在其上。捕捉物可以是糖化血红蛋白或能够识别检测物的化合物，并被固定化在抗原分析物检测区。因此，捕捉物不随液体样品一起迁移，尽管液体样品沿试纸条展开。当含有检测物-抗原分析物偶合物和/或游离检测物的样品到达捕捉物固定化的区域的时候，会在检测物、检测物-抗原分析物偶合物和捕捉物中间发生二级竞争性免疫反应，激光诱导表面荧光检测器收集捕捉物固定区(抗原分析物检测区)荧光标记的检测物-捕捉物偶合物产生的信号。
样品持续沿试纸条移动，穿过染料分析物检测区107。染料分析物检测区不是特别定义的，但是试纸条上只要没有固定捕捉物的任何位置都可以是染料分析物检测区。优选染料分析物检测区是暴露在样品垫或试纸条盒110形成的窗口108的任何位置。在染料分析物检测区，总血红蛋白水平通过响应血红蛋白红色的LED检测。然后吸收垫150容纳通过抗原分析物检测区和染料分析物检测区的样品。
为了定量测定抗原分析物，需要建立血红蛋白和糖化血红蛋白的标准曲线，其中采用的是全血，可以通过现有技术的任何方法测定其浓度。制备的全血样本加到本发明的试纸条上，然后用激光诱导表面荧光检测器检测荧光，来建立标准曲线。
实施例
下文中，通过实施例来详细说明本发明。但是应当理解这些实施例只是为了说明的目的，不能解释为限制本发明。
实施例1：蛋白荧光材料偶合物的制备
如下所述，作为信号源的荧光材料连接到目的抗原分析物，糖化血红蛋白(HbA1c)的鼠单克隆抗体上。结合有荧光材料的蛋白纯化到至少95％的纯度。为了最佳结合，所用蛋白的浓度为至少1mg/ml。纯化的蛋白用不含氨或铵离子的的缓冲溶液(0.1M碳酸氢纳，pH8.5)在4度的冰箱中透析12-24小时，以便于与荧光材料进行反应。透析后的蛋白在-20度冰箱中保存备用。在缓冲溶液中透析后的蛋白直接且缓慢加入粉末Alexa647荧光材料(Molecular Probes，美国)，4度冰箱内搅拌1-2小时。
实施例2：蛋白荧光材料偶合物的纯化
用填充有Sephadex G-25的柱除去不与蛋白荧光材料偶合物反应的过量荧光材料。纯化缓冲液为0.1M碳酸钠(pH8.5)。纯化的蛋白/荧光材料偶合物在冰箱或-20度的冷冻室内保存备用。
实施例3：在硝酸纤维素膜上固定捕捉物
用Biodot分配器将捕捉物，HbA1c以细线状固定在硝酸纤维素膜上，同时改变其浓度和用量。具有固定化蛋白的膜储存在干燥器中，保持温度为25度且湿度为35-50％2小时。然后，为了稳定蛋白，且防止试剂间的非特异性反应，用稳定的溶液(1％BSA，0.05％吐温-20，1％蔗糖，0.1％PVA)处理膜，平衡5分钟。作为稳定溶液的组分，BSA可以用明胶代替，吐温-20可以用Triton X-100代替，蔗糖可以用海藻糖代替，PVA(聚乙烯醇)可以用PEG或PVP(聚乙烯吡咯烷酮)代替。除去过多的溶液后，膜在40度干燥30分钟。干膜保存在合适的容器中，保持温度为25度，相对湿度为35-50％，备用。
实施例4：样品垫的预处理
为了便于溶液中组分通过硝酸纤维素膜移动，保持高反应灵敏性，防止蛋白/荧光材料偶合物与样品间的非特异性反应引起的实验误差，要对样品垫进行预处理。
通过重复向样品垫(2.5X 30cm)加1ml预处理液(20mM Tris-C1，0.1％TritonX-100，0.05％NaN3，pH 8.5)然后平衡10分钟，将样品垫充分湿润。当以全血作为样品的时候，另一个预处理液(PBS，10mM磷酸，150mM NaCl，1％BSA，0.05％Tween 20，0.05％NaN3，pH 7.4)用于防止红色的血细胞溶血。除去过多的溶液后，样品垫50-60℃真空干燥1小时，防止垫受热变形。为了减少蛋白/荧光材料偶合物的变性，可以采用冻干法。制备的样品垫保存在与前述膜相同条件下的，合适容器中。
实施例5：制备糖化血红蛋白荧光免疫色谱检验试纸条
硝酸纤维素膜(NC膜)，样品垫，吸收垫和背板在一次性盒中组装，制造460mm大小的试纸条。用Biodot分配器将捕捉物，人糖化血红蛋白(2mg/ml)以0.88μl/cm的量分配在硝酸纤维素膜上，使其成0.8mm宽的线，在相对湿度为35-50％环境中固定2小时。然后，用稳定溶液(1％BSA，0.05％Tween 20，0.1％PVA)处理膜，以稳定蛋白并防止试剂之间的非特异性反应，然后平衡5分钟(作为稳定溶液的组分，BSA可以用明胶代替，吐温-20可以用Triton X-100代替，蔗糖可以用海藻糖代替，PVA可以用PEG或PVP代替)。除去多余溶液后，处理后的膜在40度下干燥30分钟。实验中用到的膜与样品垫，吸收垫等组装在一起，用切割工具切成4mm宽，从而得到4X60mm的最终试纸条。
用Biodot(Irvine，美国加州)分配器以1μL/cm的量将链霉亲和素(3g/L)分配在硝酸纤维素膜的内标对照线上，使其成1mm宽的线。制作的试纸条放在一次性盒子(16X90mm)里，将其设计成与激光荧光扫描仪的支架相适应，在干燥器中包装后，室温储存备用。
实施例6：检测物缓冲溶液的制备
代替在目前侧流色谱技术中应用的偶合释放垫上固定化检测物的方法，将检测物以液体状态储存在试管中。收集的血液不超过5μl，不会造成在展开膜上的迁移。因此需要额外的缓冲液。所用的缓冲液是添加了1％BSA的PBS。
实施例7：红色血细胞溶血溶液的制备
50g铁氰化钾溶解在1L 10mM Kpi溶液中，加入100mg洋地黄皂甙使红色血细胞溶血，以制备pH7.4的溶液。制备的溶液用0.45μm膜过滤除菌，低温避光保存，备用。
实施例8：用LED检测系统制作血红蛋白标准曲线
通过已知的生化检验方法测定全血的浓度后，将其作为参比材料用于血红蛋白测量。制备的溶液加到试纸条上检测糖化血红蛋白，血红蛋白的值用为同时检测糖化血红蛋白和血红蛋白制作的装置进行检测，然后制作标准曲线。结果显示，用硅二极管检测的血红蛋白浓度与现有生化检验测定的血红蛋白浓度完全一致。基于浓度的结果如图4所示。用试纸条检测的浓度与已知的方法检测的浓度之间有很高的相关性(R2值为0.98或更高)。代表重复性的CV％值低于3％，说明有很高的可靠性。
实施例9：用免疫层析法制作糖化血红蛋白标准曲线
BSA-生物素偶合物(0.1g/L)和抗HbA1c抗体(4μg/ml)用于制备糖化血红蛋白检测溶液，将0.25，0.5，1，2mg/ml浓度的糖化血红蛋白按1∶1的比例分别与检测溶液混合。将75μl的每一种混合液加到试剂盒的样品架上。加有混合液的盒子在室温下反应12分针，用荧光检测器检测荧光强度。用准备好的程序将测试线和对照线记载的结果转化成面积值(测试线：AT，对照线：AC)，根据面积值的比例(AT/AC)计算抗原的浓度，结果如图5所示。如图5所示，面积值正比于糖化血红蛋白的浓度。在基于浓度的方法中用标准曲线计算HbA1c的浓度。结果，HbA1c浓度有很强的相关性(R值为0.99)，并有5％的较低CV％值。
实施例10：用已知HbA1c检测仪器检测样本的比较实验
用HPL Bio-Rad Variant II测定糖化血红蛋白值，然后用本发明的糖化血红蛋白检测系统检测样本。比较测得的值。比较结果如图6所示。本发明所用的免疫检测和HPLC法基本不相同，但是具有较强的相关性(R值为0.96)。
工业实用性
包括侧流分析检测试纸条，激光诱导表面荧光检测器，LED检测器的集成式层析定量检测系统提供了一种用抗原-抗体反应，有效定量测定糖化血红蛋白的方法，从而对需要严格控制葡萄糖水平的患者是非常有用的。

Claims (16)

1.一种侧流分析检测试纸条，包括背板，样品垫，色谱介质和吸收垫，其特征为，所述背板支撑所述试纸条上的所有部件，且所述样品垫和所述吸收垫分别无重叠的黏附于所述背板的两端，所述样品垫朝向黏附吸收垫方向的一端与所述色谱介质的一端重叠，首先将样品加于所述样品垫上，所述色谱介质的另一端与所述吸收垫重叠，所述色谱介质上距离所述样品垫一定距离处固定有一种捕捉物，所述捕捉物与所述样品中的一种分析物实质相同，且通过竞争性免疫反应与样品中的分析物通过抗原-抗体反应结合，并且所述捕捉物为糖化血红蛋白。
2.根据权利要求1所述的侧流分析检测试纸条，其特征为，还包括偶合释放垫，所述偶合释放垫的一端与所述样品垫重叠，并且另一端与所述色谱介质重叠，并且在所述偶合释放垫上吸附了一种检测物，所述检测物通过抗原-抗体反应能选择性地结合一种分析物。
3.根据权利要求2所述的侧流分析检测试纸条，其特征为，所述检测物为抗糖化血红蛋白抗体。
4.根据权利要求3所述的侧流分析检测试纸条，其特征为，所述检测物为表面荧光标记的抗糖化血红蛋白抗体。
5.一种集成式定量分析检验系统，所述系统能同时定量检测通过抗原-抗体反应检测的抗原分析物和通过染料检测的染料分析物，所述系统包括权利要求1和2中任意一项权利要求所述的侧流分析检测试纸条，用于检测来自于所述试纸条上固定捕捉物区域的荧光信号的激光诱导表面荧光检测器，以及用于检测染料分析物的LED检测器。
6.根据权利要求5所述的集成式定量分析检验系统，其特征为，所述LED检测器采用458-612nm的光源。
7.根据权利要求5所述的集成式定量分析检验系统，其特征为，所述检测物是抗糖化血红蛋白抗体。
8.根据权利要求5所述的集成式定量分析检验系统，其特征为，所述抗原分析物是糖化血红蛋白，并且所述染料分析物是糖化的或非糖化的血红蛋白。
9.一种同时定量检测样品中抗原分析物和染料分析物的方法，其中预期含有抗原分析物和染料分析物的样品加到侧流分析检测试纸条的样品垫上，流体样品沿色谱介质移动，由于加样前在所述样品中添加了一定量的检测物，因此通过免疫反应形成检测物-抗原分析物的偶合物，当所述样品沿所述色谱介质展开时，固定在所述色谱介质上的捕捉物与检测物-抗原分析物的偶合物和/或游离检测物之间发生竞争性免疫反应，并形成偶合物，然后，用激光诱导表面荧光检测器测定与捕捉物结合的检测物的量，其中所述的捕捉物固定在所述色谱介质上，并单独的，用LED检测器检测所述色谱介质上染料分析物的量；
其中，所述侧流分析检测试纸条包括背板，样品垫，色谱介质和吸收垫，其中所述背板支撑所述试纸条上的所有部件，所述样品垫和所述吸收垫分别无重叠的黏附于所述背板的两端，所述样品垫朝向黏附吸收垫方向的一端与所述色谱介质的一端重叠，首先将样品加于所述样品垫上，所述色谱介质的另一端与所述吸收垫重叠，所述色谱介质上距离所述样品垫一定距离处固定有一种捕捉物，所述捕捉物与所述样品中的一种分析物实质相同，且通过竞争性免疫反应与样品中的分析物通过抗原-抗体反应结合。
10.一种同时定量检测样品中抗原分析物和染料分析物的方法，其中预期含有抗原分析物和染料分析物的样品加到侧流分析检测试纸条的样品垫上，所述样品穿过所述的偶合释放垫而形成检测物-抗原分析物的偶合物，当所述样品沿所述色谱介质展开时，固定在所述色谱介质上的捕捉物与检测物-抗原分析物的偶合物和/或游离检测物之间发生竞争性免疫反应，并形成偶合物，然后用激光诱导的表面荧光检测器测定与捕捉物结合的检测物的量，其中所述的捕捉物固定在所述色谱介质上，并单独的，用LED检测器检测所述色谱介质上染料分析物的量；
其中，所述侧流分析检测试纸条包括背板，样品垫，色谱介质，吸收垫和偶合释放垫，其中所述背板支撑所述试纸条上的所有部件，所述样品垫和所述吸收垫分别无重叠的黏附于所述背板的两端，所述样品垫朝向黏附吸收垫方向的一端与所述色谱介质的一端重叠，首先将样品加于所述样品垫上，所述色谱介质的另一端与所述吸收垫重叠，所述色谱介质上距离所述样品垫一定距离处固定有一种捕捉物，所述捕捉物与所述样品中的一种分析物实质相同，且通过竞争性免疫反应与样品中的分析物通过抗原-抗体反应结合，所述偶合释放垫的一端与所述样品垫重叠，并且另一端与所述色谱介质重叠，并且其上吸附有通过抗原-抗体反应能选择性地结合一种分析物的检测物。
11.根据权利要求9或10所述的方法，其特征为，所述检测物标记有荧光材料。
12.根据权利要求9或10所述的方法，其特征为，还包括通过计算抗原分析物浓度与被检测到的染料分析物浓度的比例来定量检测样品中抗原分析物的步骤。
13.根据权利要求9或10所述的方法，其特征为，所述抗原分析物为糖化血红蛋白，且所述染料分析物是糖化的或非糖化的血红蛋白。
14.根据权利要求13所述的方法，其特征为，所述检测物为抗糖化血红蛋白抗体。
15.根据权利要求13所述的方法，其特征为，所述捕捉物为糖化血红蛋白。
16.根据权利要求14所述的方法，其特征为，所述捕捉物为糖化血红蛋白。
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