CN102879567B - 用于肝癌诊断的甲胎蛋白异质体分离试剂盒及其组成试剂与应用 - Google Patents
用于肝癌诊断的甲胎蛋白异质体分离试剂盒及其组成试剂与应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN102879567B CN102879567B CN201210375011.9A CN201210375011A CN102879567B CN 102879567 B CN102879567 B CN 102879567B CN 201210375011 A CN201210375011 A CN 201210375011A CN 102879567 B CN102879567 B CN 102879567B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- afp
- kit
- magnetic bead
- tween
- eluent
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
Abstract
本发明涉及一种用于肝癌诊断的甲胎蛋白异质体分离试剂盒及其组成试剂与应用，涉及医用试剂领域。在本发明的优选实施方式中，成功的获得了均一、稳定的保护液，并通过对试剂盒的优化，获得了具有稳定的、高结合力的和特异的凝集素包被磁珠，均一的和稳定的凝集素-磁珠溶液，最佳的反应液和洗脱液。
Description
技术领域
本发明属于医药制剂领域，具体涉及基于磁性微粒分离技术的用于肝癌诊断的甲胎蛋白异质体分离试剂盒及其组成试剂与应用。
背景技术
一般认为，甲胎蛋白（AFP）是HCC（hepatocellular carcinoma，肝细胞癌）相对特异的肿瘤标志物，AFP持续升高是发生HCC的危险因素。目前，有些欧美学者认为AFP的敏感性和特异度不高，2010版美国肝病研究学会(AASLD)指南已不再将AFP作为筛查指标，但是我国的HCC大多与HBV（乙肝病毒）感染相关，与西方国家HCC致病因素不同（多为HCV、酒精和代谢性因素），结合国内随机研究(RCT)结果和实际情况，对HCC的常规监测筛查指标中继续保留AFP。
血清AFP及其异质体是诊断肝癌的重要指标和特异性最强的肿瘤标记物，国内常用于肝癌的普查、早期诊断、术后监测和随访。对于AFP≥400μg/L超过1个月，或≥200μg/L持续2个月，并能排除其他原因引起的AFP升高，包括妊娠、生殖系胚胎源性肿瘤、活动性肝病及继发性肝癌等。但是尚有30%-40%的肝癌病人AFP检测呈阴性，包括ICC、高分化和低分化HCC，或HCC已坏死液化者，AFP均可不增高。因此，仅靠AFP不能诊断所有的肝癌，AFP对肝癌诊断的阳性率一般为60%-70％，有时差异较大。
近年来，国内外临床观察和研究结果均提示，血清AFP在部分ICC和胃肠癌肝转移患者中也可升高，并且ICC也多伴有肝硬化。尽管ICC的发病率远低于HCC，但两者均常见于肝硬化患者，因此，肝占位性病变伴AFP升高并不一定就是HCC，仍需进一步鉴别。
AFP是一个单链糖蛋白，不同的肝病患者产生的血清AFP的糖链结构不同，根据与小扁豆凝集素亲和力不同，AFP可以分成3种类型：AFP-L1由良性病变肝细胞分泌，AFP-L2，来自孕妇，而AFP-L3则为恶性癌细胞产生，即通常所说的甲胎蛋白异质体。AFP-L3是肝癌诊断的高特异指标，被称为新一代肝癌标志物。FDA于2005年批准该指标应用于肝癌预警，并把AFP-L3诊断肝癌的阳性界定值为10%。1999年第四届全国癌症学术会议将AFP-L3列为原发性肝癌临床诊断标准的肝癌标记物之一。被公认为是比单纯的AFP更为特异的原发性肝癌指标。
鉴别肝癌与良性肝病。原发性肝癌患者AFP常升高，但许多良性肝脏疾病也可有AFP升高，单凭AFP结果有时很难区分良、恶性病变。此时AFP异质体检测就具有良好的临床意义，尤其对于AFP在30-400ng/ml之间者具有较好的价值。Yozhiaki对361例肝硬化进行了前瞻性研究，在53例AFP在30ug 几以上的患者中，2年以后21例发展为肝癌，确诊肝癌时39%的患者AFP在400ug/L以下。对比研究开始时肝细胞肝癌(HCC)组与非HCC组AFP测定值，未发现差异有显著性，研究发现病变时AFP异质体的类型有所不同，对HCC诊断LCA阳性率87.12%，假阳性率21.5%，ConA阳性率89.17%，假阳性率17.15%。目前的研究结果把AFP-L3含量大于10%作为肝癌的阳性指标。
肝癌术后的监测。肝癌切除术后，血清AFP含量随之下降，其下降速度取决于体内残留AFP量及半衰期，一般2月内转阴，转阴时AFP异质体随之消失。如果AFP明显下降但不转阴，异质体变化不明显，则提示手术不彻底，可能还存在边缘残留、血管癌检、卫星结节或转移等。如果异质体下降至25%以下，AFP和异质体浓度相对恒定，则可能是患者有肝炎或肝硬化所致。
胚胎异常发育及胎儿先天性疾患。正常妊娘期母体血清中AFP与胚胎中AFP处于平衡状态，一旦胎儿畸形或胎盘屏障发生异常，可导致胎儿血清渗入羊水中或羊水渗入母体血清，造成母体羊水或血清AFP急剧升高。但仅仅测定AFP总量有一定的局限性。实验表明神经管缺损、无脑儿或脊柱裂等。儿童肝母细胞瘤、胆道闭锁、性腺肿瘤、恶性崎胎瘤等可有AFP和/或AFP异质体的阳性。
AFP-L3是唯一由患者肝脏中癌细胞生成的蛋白。在加拿大和美国的一项多中心、前瞻性、双盲、长期临床试验中，对该检测方法进行了研究。结果显示AFP-L3%升高(15%以上)的患者，在接下来的21个月中，发生肝细胞癌的危险增加7倍之多。根据已有的肝细胞癌肿瘤学实践指南，这些患者肝细胞癌发生率极端增高。
目前，AFP-L3检测方法有检测方法有植物凝集素亲和免疫电泳技术、i30检测系统技术及热景生物糖基捕获离心柱前处理技术。其中植物凝集素亲和免疫电泳技术和i30检测系统技术要求高、操作繁琐、试剂昂贵，限制了其临床应用。而糖基捕获离心柱，由于采用非均相反应体系，从而限制了其分离纯化效率和特异性。
免疫磁珠分离反应：免疫磁珠分离技术是将目标分子的亲和配基如抗体、蛋白等共价连接于磁珠表面获得活性磁珠。当活性磁珠与含有目标分子的溶液混合后，由于目标分子与其配基的亲和结合而形成磁珠-配基-目标分子复合物，然后利用磁珠分离器（磁力架或磁棒）与磁珠之间的磁性将磁珠-配基-目标分子复合物分离，经过洗涤液洗涤去除非特异性结合杂质后，最后用洗脱液将目标分子与磁珠分离，进而实现目标分子的分离纯化。由于免疫磁珠分离技术具备了固相化试剂特有的优点以及免疫学反应的高度专一性，并且分离速度快、效率高、可重复性好；同时操作简单，不需要昂贵的仪器设备，已经广泛用于DNA和RNA的分离纯化。如果该技术用于AFP-L3检测方法将是不错的选择，该反应是在均相中进行，所以反应时间短、充分，提高工作效率大幅提升，若与全自动提取仪配套使用，可进一步提高反应通量和工作效率。但是，由于磁颗粒本身的均一性、表面疏水性、张力以及表面包被蛋白等特性，在实际应用过程中会产生聚集沉降，从而影响凝集素包被磁珠对AFP-L3的捕获效率和灵敏度，有待于改进。
发明内容
根据上述领域存在的缺陷和需求，本发明提供一种以甲胎蛋白异质体为目标蛋白的分离试剂盒及其组成试剂。
一种用于肝癌诊断的甲胎蛋白异质体分离试剂盒，包括磁性微粒，其特征在于，所述磁性微粒为植物凝集素与活性磁珠通过1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺法共价偶联而得，所述植物凝集素为小扁豆凝集素，包被活性磁珠所用的小扁豆凝聚素的投料浓度为每毫克磁珠70μg。
所述甲胎蛋白异质体分离试剂盒还包括保护液，所述保护液指：在pH7.510mM PBS、pH8.550mM Tris-HCl或pH5.0100mM柠檬酸缓冲液中按质量体积比溶有以下组份：1～3%BSA、0.5～1%明胶、0～2%蔗糖或0～5％海藻糖、0～5％酪蛋白，0.03%NaN3、0.01～0.05%Tween-20而得的溶液。
所述保护液指：在pH7.510mM PBS、pH8.550mM Tris-HCl或pH5.0100mM柠檬酸缓冲液中按质量体积比溶有以下组份：
1%BSA、1%明胶、2%蔗糖、0.03%NaN3、0.01%Tween-20；
3%BSA、0.5%明胶、2%蔗糖、0.03%NaN3、0.05%Tween-20；
1%BSA、1%明胶、5%海藻糖、0.03%NaN3、0.01%Tween-20；
3%BSA、0.5%明胶、5%海藻糖、0.03%NaN3、0.05%Tween-20；
1%BSA、1%明胶、5%酪蛋白、0.03%NaN3、0.01%Tween-20；或
3%BSA、0.5%明胶、5%酪蛋白、0.03%NaN3、0.05%Tween-20而得的溶液
所述甲胎蛋白异质体分离试剂盒还包括洗脱液，所述洗脱液为：250mM Tris-HCl，1～10M岩藻糖，pH7.4。
所述洗脱液为溶于pH7.4250mM Tris-HCl中所得的10M岩藻糖溶液。
所述甲胎蛋白异质体分离试剂盒还包括反应液，所述反应液为含0.05%（w/v）Tween-20的10mM pH7.4Tris-HCl缓冲液。
一种用于甲胎蛋白异质体分离的磁性微粒，其特征在于，所述磁性微粒为植物凝集素与超顺强磁性颗粒通过1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺法共价偶联而得，所述植物凝集素为小扁豆凝集素，包被活性磁珠所用的小扁豆凝聚素的投料浓度为每毫克磁珠70μg。
一种与所述磁性微粒配合使用的保护液，指在pH7.510mM PBS、pH8.550mM Tris-HCl或pH5.0100mM柠檬酸缓冲液中按质量体积比溶有以下组份：1～3%BSA、0.5～1%明胶、0～2%蔗糖或0～5％海藻糖、0～5％酪蛋白，0.03%NaN3、0.01～0.05%Tween-20而得的溶液。
所述甲胎蛋白异质体分离试剂盒还包括保护液，指在pH7.510mM PBS、pH8.550mMTris-HCl或pH5.0100mM柠檬酸缓冲液中按质量体积比溶有以下组份：
1%BSA、1%明胶、2%蔗糖、0.03%NaN3、0.01%Tween-20；
3%BSA、0.5%明胶、2%蔗糖、0.03%NaN3、0.05%Tween-20；
1%BSA、1%明胶、5%海藻糖、0.03%NaN3、0.01%Tween-20；
3%BSA、0.5%明胶、5%海藻糖、0.03%NaN3、0.05%Tween-20；
1%BSA、1%明胶、5%酪蛋白、0.03%NaN3、0.01%Tween-20；或
3%BSA、0.5%明胶、5%酪蛋白、0.03%NaN3、0.05%Tween-20而得的溶液。
一种与所述磁性微粒配合使用的洗脱液，成分为：250mM Tris-HCl，10M岩藻糖，pH7.4。
上述任一试剂盒在岩藻糖基化蛋白分离纯化中的应用。
AFP-L3是一种糖链上含岩藻糖的糖基化蛋白，由于其糖链含有岩藻糖，因此可以与植物、微生物凝集素亲和结合。试剂盒选用小扁豆凝集素（LCA）与超顺强磁性颗粒用1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺（EDC）法共价偶联，形成稳定的共价化学键，获得活性磁珠。将一定浓度活性磁珠与血清样本混合，包被有凝集素的磁珠会与AFP-L3亲和结合，然后通过洗涤、洗脱步骤将AFP-L3与AFP-L1、AFP-L2分离，最后获得的AFP-L3溶液用AFP定量试剂盒进行检测。
本发明基于免疫磁珠分离技术及AFP-L3与肝癌的特异相关性提供一种改进的甲胎蛋白异质体分离试剂盒：为了提高AFP-L3提取分离效果，实验从包被凝集素种类和浓度选择，调节凝集素与磁珠偶联工艺获得了结合能力及特异性都优良的磁性微粒。
为了提高本发明的试剂盒的性能稳定性，本发明通过对pH值、离子强度、表面活性物质、密度、保护蛋白种类及浓度等因素的选择成功的获得了均一性良好、分散性良好的能够是磁性微粒结合性能持久稳定的保护液。
此外还通过调整成分及pH获得了优选的洗脱液，反应液等试剂盒优化组件，与改进的磁性微粒及保护液配合使用，使试剂盒在应用中每个步骤都发挥最优的效果，综合上提高试剂盒特异及高效的分离纯化效果。
本发明的试剂盒还能用于其他岩藻糖基化蛋白的分离纯化。
附图说明
图1LCA包被磁珠效率；
其中横坐标为LCA加入量（ugLCA/mg MB）,纵坐标为磁珠LCA结合量（ugLCA/mg MB）
图2不同洗脱液洗脱效果；
其中横坐标为样本AFP-L3浓度（ng/ml），纵坐标为洗脱液AFP-L3浓度（ng/ml）
图3不同pH值反应液；
其中横坐标为样本AFP-L3浓度（ng/ml），纵坐标为洗脱液AFP-L3浓度（ng/ml）
图4不同种类凝集素对AFP-L3结合特性。
其中横坐标为样本AFP-L3浓度（ng/ml），纵坐标为洗脱液AFP-L3浓度（ng/ml）
具体实施方式
以下实施例用于进一步详细说明本发明。
所用试剂：
活性磁珠（MB）：Invitrogen，Dynal-Myone
25mM MES：2-(N-吗啉基)乙磺酸（sigma，M3671）缓冲液，称取4.88gMES于900mL超纯水中，完全溶解后调节pH5.0，定容至1L。
EDC（1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺）溶液：sigma，39391
洗脱液：10M岩藻糖洗脱液（Sigma，F2252）
小扁豆凝聚素LCA：1mg/ml，溶于25mM MES缓冲液中，pH5.0（Sigma-L9627）；
反应液：含0.05%（w/v）Tween-20的10mM pH7.4Tris-HCl缓冲液
pH7.510mM PBS：称取0.27g磷酸二氢钾(KH2PO4)（国药，10017608）、1.42g磷酸氢二钠(Na2HPO4)（国药，100203008），8g氯化钠(NaCl)（国药，10019308）、0.2g氯化钾(KCl)（国药，10016308）于900mL超纯水中，完全溶解后调节pH至7.5，然后用容量瓶定容至1L。
10mM Tris-HCl：称取1.576g Tris-HCl（国药，xw020034）于900mL超纯水中，完全溶解后调节到所需的pH值，然后定容至1L。
pH8.550mM Tris-HCl：称取7.88g Tris-HCl（国药，xw020034）于900mL超纯水中，完全溶解后调节pH值到8.5，然后定容至1L。
100mM Tris-HCl：称取15.76g（国药，xw020034）于900mL超纯水中，完全溶解后调节到所需的pH值，然后定容至1L。
250mM Tris-HCl：称取39.4g（国药，xw020034）于900mL超纯水中，完全溶解后用调节到所需的pH值，然后定容至1L。
pH5.0100mM柠檬酸缓冲液：称取1.47g柠檬酸（国药，10007108）、27.35g柠檬酸三钠（国药，10019428）于900mL超纯水中，完全溶解后用浓盐酸调节pH值到5.0，然后定容至1L。
（一）活性磁珠（MB，Dynal-Myone）制备步骤
1、磁珠活化。
取1mg活性MB（Invitrogen，Dynal-Myone），用1mL25mM MES（pH5.0）（sigma，M3671）缓冲液洗涤3次（每次混匀10min）；
1)配制10mg/mL EDC（M=191.7g/mol，C=52mM）溶液（EDC溶解于冷的25mMMES，pH5.0）；（EDC，sigma，39391）
2).将MB用440μL25mM MES（pH5.0）重悬。
3).加入10μL EDC溶液，充分混匀，缓慢振摇，30min，RT；
4).将反应完成的离心管放置在磁力架上4min后，去除上清，并用1mL25mM MES,pH5.0洗涤3次；
2、磁珠包被
1)用300μL25mM MES，pH5.0重悬MB；
2).加入20ul设定浓度的LCA（Sigma-L9627，25mM MES，pH5.0）溶液；
3).用25mM MES,pH5.0使反应体系定容为500μL，充分混匀；
4).缓慢振摇，室温30-120min或4℃2小时；
5).将反应完成的离心管放置在磁力架上4min后，去除上清；
3、磁珠洗涤和保存
1)用500μL25mM MES（pH5.0）洗涤4次；
2).加入100μL0.1-0.5%BSA（amresco，0332），30-60min，RT（室温）。
3).用100μL50mM Tris-HCl（pH6.8，含1%Tween-20）（sigma，44112）洗涤4次；
4).加入1mL保存液（pH8.0,100mM Tris-HCl、1%BSA、0.01%Tween-20、0.03%NaN3（sigma，71289））保存
（二）磁珠包被凝集素量选择
1、磁珠活化
活化方法同上
2、磁珠包被
1)将MB用300μL25mM MES，pH5.0重悬；
2)加入20μL不同浓度的小扁豆凝聚素LCA（sigma，L9267）（0.5mg/ml、1.0mg/ml、1.5mg/ml、2.0mg/ml、2.5mg/ml、3.0mg/ml、3.5mg/ml、4.0mg/ml、4.5mg/ml、5.0mg/ml，25mM MES，pH5.0）溶液；
3)用25mM MES,pH5.0使反应体系为500μL，充分混匀；
4)缓慢振摇，30-120min，RT或2h，4℃；
5)将反应完成的离心管放置在磁力架上4min后，去除上清；
6)用500μL25mM MES（pH5.0）洗涤4次；
7)用BCA蛋白定量试剂盒（Thermo，23225）进行定量检测磁珠包被的蛋白量（小扁豆凝聚素）。
本发明通过在反应体系中加入不同浓度的LCA，选择偶联效率[（偶联量/投料量）×100%]为80%以上的投料量和包被量，最佳投料浓度为70μg LCA/mg MB，最佳包被量为60μg LCA/mg MB，如图1所示。
（三）不同保护液对磁珠稳定性影响
制备好的包被LCA（sigma，L9267）的磁珠用以下不同的稀释液稀释50倍，37℃加速试验6天，记录磁珠的沉降和聚集情况，以下稀释液中的成分为质量／终体积百分比。
在pH7.510mM PBS、pH8.550mM Tris-HCl或pH5.0100mM柠檬酸缓冲液中溶以下成分：
X1：1%BSA（Amaresco，0332）、1%明胶（sigma，6144）、2%蔗糖（sigma，84097）、0.03%NaN3（sigma，71289）、0.01%Tween-20；
X2：3%BSA、0.5%明胶、2%蔗糖、0.03%NaN3、0.05%Tween-20；
X3：1%BSA、1%明胶、5%海藻糖（sigma，T9531）、0.03%NaN3、0.01%Tween-20；
X4：3%BSA、0.5%明胶、5%海藻糖、0.03%NaN3、0.05%Tween-20；
X5：1%BSA、1%明胶、5%酪蛋白（sigma，11615）、0.03%NaN3、0.01%Tween-20；或
X6：3%BSA、0.5%明胶、5%酪蛋白、0.03%NaN3、0.05%Tween-20；
表1不同保护液对磁珠稳定性的影响
注：沉降等级，“-”代表无沉降、“*”代表有沉降但较轻、“**”代表沉降较为严重；聚集程度，“o”代表没有聚集、“#”代表有聚集但较轻、“##”代表聚集较为严重。
通过选择不同pH条件下、保护剂和去污剂浓度以及溶液的密度，使保护液不仅能增加磁珠稳定性，保护凝聚素的活性，而且能降低磁性的聚集和沉降，提高保护液的效果。
本发明通过大量的筛选试验，获得了如表1所示的使磁珠稳定性提高的稀释液，使LCA-MB磁性微粒在有效期内的稳定性大大提升，如表2,磁珠制备180天之后重复上述试验，沉降和聚集的程度都没有发生改变，结果如下，说明本发明提供的保护液对于磁珠及其表面包被的凝聚素具有优良的稳定作用。
表2不同稀释液对磁珠稳定性的影响（180天后）
将（二）所得的最佳包被方式制备的磁珠悬于上述任一保护液中，4℃保存备用于后续试验。
（四）洗脱液
试剂盒采用岩藻糖竞争洗脱方式（即采用一定浓度的岩藻糖溶液进行洗脱，由于岩藻糖与样本中岩藻糖糖基化蛋白竞争结合LCA，所以可将结合的岩藻糖糖基化蛋白释放到洗脱液中）将LCA（sigma，L9267）结合的AFP-L3释放。试验结果表明，10M岩藻糖（Sigma，F2252）洗脱液洗脱效果优于低浓度岩藻糖洗脱液。
1)取200μL步骤（二）制备所得磁珠，在磁性分离架上去除保护液；
2).加入100μL反应液(含0.05%（w/v）Tween-20的10mM pH7.4Tris-HCl缓冲液)，同时加入100μL含有不同浓度AFP-L3的血清，混匀，RT（室温），10min；
3).在磁性分离架上去除上清，加入200μL反应液，混匀；
4).在磁性分离架上去除上清，加入100μL含有不同浓度（1M,2M,5M,10M）岩藻糖洗脱液（250mM Tris-HCl，pH7.4）；
5).然后用Roche AFP定量试剂盒（Roche，Elecsys AFP）测定洗脱液AFP-L3浓度。
结果如图2所示。
（五）反应液
为了增加LCA（sigma，L9267）与AFP-L3结合效率，降低LCA的非特异性结合（尤其AFP其他组分），增加试剂盒的特异性，不同的反应液对试剂盒特性有重要影响，尤其是反应液pH值。试验选择不同pH值（含0.05%（w/v）Tween-20的10mM Tris-HCl缓冲液）作为反应液，结果显示，不同反应液的AFP-L3结合效率[（实际测定浓度/理论浓度）×100%]依此为pH7.4＞pH7.0、pH8.0＞pH6.0、pH8.5，表明中性偏碱的环境有利于LCA与AFP-L3结合。
1)取200μL稀释磁珠，在磁性分离架上去除保护液；
2)加入100μL反应液（含0.05%（w/v）Tween-20的10mM pH7.4Tris-HCl缓冲液），同时加入100μL含有不同浓度AFP-L3的血清，混匀，RT，10min；
3)在磁性分离架上去除上清，加入200μL反应液，混匀；
4)在磁性分离架上去除上清，加入100μL洗脱液（250mM Tris-HCl，pH7.4，含10M岩藻糖）；
5)然后用Roche AFP定量试剂盒（Roche，Elecsys AFP）测定洗脱液AFP-L3浓度。
结果如图3所示。
（六）不同凝集素选择
由于不同的凝集素对糖蛋白糖链的亲和力和特异性不同，因此凝集素种类选择对提高试剂盒的灵敏度和特异性尤为重要。实验对菜豆（Phaseolus vulgaris）凝集素（LPH，Sigma-61764）、小扁豆（Lens culinaris）凝集素（LCA，Sigma-L9267）、荆豆（Ulex europaeus）凝集素（LUE，Sigma-L5505）、刀豆（Canavalia ensiformis）凝集素（ConA，Sigma-61760）进行了对比试验，根据凝集素对不同浓度AFP-L3的结合能力[（实际测定浓度/理论浓度）×100%，选出当样本浓度在0-400ng/ml时，结合能力应85%-115%之间且高于其它类型的凝集素，结果得出AFP-L3的最佳结合型凝集素为LCA小扁豆凝集素。如图4，筛选方法如下：
1)选用不同凝集素包被磁珠，包被步骤同上；
2)取200μL稀释磁珠，在磁性分离架上去除保护液；
3)加入100μL反应液（pH7.4），同时加入100μL含有不同浓度AFP-L3的血清，混匀，RT，10min；
4)在磁性分离架上去除上清，加入200μL反应液，混匀；
5)在磁性分离架上去除上清，加入100μL洗脱液（250mM Tris-HCl，pH7.4，含10M岩藻糖）；
6)然后用Roche AFP定量试剂盒测定洗脱液AFP-L3浓度,根据凝集素对不同浓度AFP-L3的结合能力[（实际测定浓度/理论浓度）×100%，选出当血清样本的AFP-L3浓度在0-400ng/ml时，结合能力在85%-115%之间且高于其它类型的凝集素，结果得出AFP-L3的最佳结合型凝集素为LCA小扁豆凝集素小扁豆凝集是AFP-L3的结合型凝聚素。
（七）试剂盒组成
实验过程需要用磁珠分离架（0.5mL）及0.5mL离心管。
具体操作为：
1)取200μL稀释的磁珠，在磁性分离架上去除保护液；
2)加入100μL反应液，同时加入100μL待测血清（可能含有不同浓度的AFP-L3），混匀，室温10min；
3)在磁性分离架上去除上清，加入200μL反应液，混匀；
4)在磁性分离架上去除上清，加入100μL洗脱液；
5)然后用Roche AFP定量试剂盒测定洗脱液中AFP-L3浓度。
该提取过程可以通过手动实现，也可以采用全自动核酸提取仪实现（如ThermoKingfisher核酸自动提取仪），只需将包被磁珠、反应液、洗脱液提前加入到提取管中，然后按手动提取过程设定好程序即可。
（八）临床样本检测
收集临床样本共572例，其中HCC（原发性肝癌）样本315例，非HCC（慢性肝炎、肝硬化）202例，正常人血清样本55例。
采用（六）的步骤进行检测，结果如表3所示：
表3血清样本分布
实验结果表明，本发明对于原发性肝癌的符合率达89%，在肝硬化中的特异性高达92%，在肝炎中的特异性高达93%。
Claims (4)
1.一种用于肝癌诊断的甲胎蛋白异质体分离试剂盒，包括磁性微粒，其特征在于，所述磁性微粒为植物凝集素与活性磁珠通过1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺法共价偶联而得，所述植物凝集素为小扁豆凝集素，包被活性磁珠所用的小扁豆凝聚素的投料浓度为每毫克磁珠70μg；
所述试剂盒还包括保护液，所述保护液指：在pH7.510mM PBS或pH5.0100mM柠檬酸缓冲液中按质量体积比溶有以下组份：3％BSA、0.5％明胶、5％酪蛋白、0.03％NaN3、0.05％Tween-20而得的溶液。
2.根据权利要求1所述的甲胎蛋白异质体分离试剂盒，还包括洗脱液，所述洗脱液为：250mM pH7.4Tris-HCl，10M岩藻糖。
3.根据权利要求1所述的甲胎蛋白异质体分离试剂盒，还包括反应液，所述反应液为含0.05％(w/v)Tween-20的10mM pH7.4Tris-HCl缓冲液。
4.权利要求1～3任一试剂盒在岩藻糖基化蛋白分离纯化中的应用。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201210375011.9A CN102879567B (zh) | 2012-09-29 | 2012-09-29 | 用于肝癌诊断的甲胎蛋白异质体分离试剂盒及其组成试剂与应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201210375011.9A CN102879567B (zh) | 2012-09-29 | 2012-09-29 | 用于肝癌诊断的甲胎蛋白异质体分离试剂盒及其组成试剂与应用 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN102879567A CN102879567A (zh) | 2013-01-16 |
| CN102879567B true CN102879567B (zh) | 2014-11-05 |
Family
ID=47480966
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201210375011.9A Active CN102879567B (zh) | 2012-09-29 | 2012-09-29 | 用于肝癌诊断的甲胎蛋白异质体分离试剂盒及其组成试剂与应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN102879567B (zh) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP3415918A4 (en) * | 2017-04-20 | 2019-01-16 | Korea Basic Science Institute | METHOD FOR DIAGNOSIS OF LIVER CANCER BY MASS SPECTROMETRY OF GLYCOPEPTIDE FROM ALPHA-FETOPROTEIN |
Families Citing this family (19)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN104714026B (zh) * | 2014-12-31 | 2018-08-21 | 北京热景生物技术股份有限公司 | 一种甲胎蛋白异质体的分离检测组合物、系统及其应用 |
| CN104965088B (zh) * | 2015-05-29 | 2016-05-04 | 广州华弘生物科技有限公司 | 甲胎蛋白异质体afp－l3定量检测试剂盒及其应用 |
| CN105300966A (zh) * | 2015-11-17 | 2016-02-03 | 三诺生物传感股份有限公司 | 一种保存液及其制备方法 |
| CN105891509B (zh) * | 2016-05-03 | 2018-05-11 | 同昕生物技术（北京）有限公司 | 用于定量检测甲胎蛋白异质体的侧向层析系统 |
| CN105785052B (zh) * | 2016-05-11 | 2017-10-10 | 复旦大学附属中山医院 | 基于凝集素磁珠的结合珠蛋白异质体诊断肝癌试剂盒 |
| CN106198998A (zh) * | 2016-06-30 | 2016-12-07 | 深圳市亚辉龙生物科技股份有限公司 | 人甲胎蛋白异质体3化学发光免疫检测试剂盒及其制备方法 |
| CN106226523A (zh) * | 2016-07-04 | 2016-12-14 | 福建广生堂药业股份有限公司 | 一种免疫标志物的检测方法、试剂和检测试剂盒 |
| CN105974132A (zh) * | 2016-07-04 | 2016-09-28 | 福建广生堂药业股份有限公司 | 一种甲胎蛋白异质体的检测方法、检测试剂和检测试剂盒 |
| CN108333343A (zh) * | 2017-01-19 | 2018-07-27 | 深圳市新产业生物医学工程股份有限公司 | 免疫磁性复合物、其制备方法、包括其的抗原捕获剂、试剂盒、系统及应用 |
| CN108196063B (zh) * | 2017-12-26 | 2020-11-24 | 陈复华 | 一种功能磁球主导的免疫荧光试纸条定量检测甲胎蛋白变异体（afp-l3）的试剂盒 |
| CN108226481A (zh) * | 2018-01-08 | 2018-06-29 | 宁波紫园医疗器械有限公司 | 一种用于化学发光免疫检测试剂的磁珠试剂 |
| CN108287237A (zh) * | 2018-01-13 | 2018-07-17 | 中国医学科学院医学生物学研究所 | 一种脊髓灰质炎病毒ⅱ型d抗原预包被检测方法及其检测试剂盒和应用 |
| CN108387726A (zh) * | 2018-01-13 | 2018-08-10 | 中国医学科学院医学生物学研究所 | 脊髓灰质炎病毒ⅰ、ⅱ、ⅲ型d抗原同步快速鉴别、定量检测方法及其检测试剂盒和应用 |
| CN108303533A (zh) * | 2018-01-13 | 2018-07-20 | 中国医学科学院医学生物学研究所 | 一种脊髓灰质炎病毒ⅰ型d抗原预包被检测方法及其检测试剂盒和应用 |
| CN108241058A (zh) * | 2018-01-13 | 2018-07-03 | 中国医学科学院医学生物学研究所 | 一种脊髓灰质炎病毒ⅲ型d抗原预包被检测方法及其检测试剂盒和应用 |
| CN108627653B (zh) * | 2018-06-28 | 2021-01-05 | 热景（廊坊）生物技术有限公司 | 用于甲胎蛋白异质体分离检测的组合物和试剂盒 |
| CN109187983B (zh) * | 2018-08-10 | 2021-10-26 | 杭州市妇产科医院 | 中孕期母血清甲胎蛋白异质体l2和l3筛查胎儿开放性神经管畸形的方法 |
| CN112098654B (zh) * | 2020-09-15 | 2023-07-18 | 武汉生之源生物科技股份有限公司 | 一种胃蛋白酶原i/ii测定试剂盒及其制备方法 |
| CN112710824B (zh) * | 2020-12-15 | 2021-09-28 | 北京美联泰科生物技术有限公司 | 用于超顺磁微粒及其蛋白连接物保存的缓冲液及制备方法 |
Citations (14)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1356552A (zh) * | 2001-11-08 | 2002-07-03 | 郭占军 | 生物化学型蛋白质芯片及其制作方法 |
| WO2003012446A1 (en) * | 2001-07-30 | 2003-02-13 | Quest Diagnostics Investments Incorporated | Methods for detecting down's syndrome |
| CN1430056A (zh) * | 2002-12-20 | 2003-07-16 | 杭州市第一人民医院 | 一种甲胎蛋白异质体的亲和吸附测定方法 |
| CN1773286A (zh) * | 2005-10-09 | 2006-05-17 | 北京微龙阵列生物技术有限公司 | 凝集素竞争法肝癌甲胎蛋白异质体afp－l3定量检测试剂盒 |
| CN1920520A (zh) * | 2006-09-13 | 2007-02-28 | 北京热景生物技术有限公司 | 检测肝癌甲胎蛋白异质体的预装离心柱及含有该离心柱的试剂盒 |
| CN101038275A (zh) * | 2007-04-17 | 2007-09-19 | 北京热景生物技术有限公司 | 一种分离肝癌α1－抗胰蛋白酶异质体、转铁蛋白异质体的凝集素亲和层析离心柱方法 |
| CN101266251A (zh) * | 2008-04-25 | 2008-09-17 | 南通大学附属医院 | 玻璃微柱亲和层析测定肝癌特异性afp的方法 |
| WO2008122241A1 (en) * | 2007-04-04 | 2008-10-16 | Diagcor Bioscience Incorporation Limited | Rapid protein analyses and the device thereof |
| CN101561432A (zh) * | 2009-05-27 | 2009-10-21 | 福建省洪诚生物药业有限公司 | 一种能够维护酶标记物溶液高稳定性的稀释液 |
| CN101622541A (zh) * | 2008-10-24 | 2010-01-06 | 韩国帕克特生物科技有限公司 | 糖化血红蛋白定量检测系统及使用该系统检测糖化血红蛋白含量的方法 |
| CN102147415A (zh) * | 2010-12-30 | 2011-08-10 | 上海市肿瘤研究所 | 一种快速磁分离法主导的肝癌甲胎蛋白变异体检测试剂盒 |
| CN102331494A (zh) * | 2011-06-16 | 2012-01-25 | 广州艺佳生物科技有限公司 | 一种用于微孔板的封闭稳定剂 |
| CN102628863A (zh) * | 2012-04-19 | 2012-08-08 | 上海蓝怡科技有限公司 | 标记了碱性磷酸酶抗原抗体稀释液 |
| CN102695716A (zh) * | 2009-07-14 | 2012-09-26 | 独立行政法人产业技术综合研究所 | 肝病病情指标糖链标记物 |
-
2012
- 2012-09-29 CN CN201210375011.9A patent/CN102879567B/zh active Active
Patent Citations (14)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2003012446A1 (en) * | 2001-07-30 | 2003-02-13 | Quest Diagnostics Investments Incorporated | Methods for detecting down's syndrome |
| CN1356552A (zh) * | 2001-11-08 | 2002-07-03 | 郭占军 | 生物化学型蛋白质芯片及其制作方法 |
| CN1430056A (zh) * | 2002-12-20 | 2003-07-16 | 杭州市第一人民医院 | 一种甲胎蛋白异质体的亲和吸附测定方法 |
| CN1773286A (zh) * | 2005-10-09 | 2006-05-17 | 北京微龙阵列生物技术有限公司 | 凝集素竞争法肝癌甲胎蛋白异质体afp－l3定量检测试剂盒 |
| CN1920520A (zh) * | 2006-09-13 | 2007-02-28 | 北京热景生物技术有限公司 | 检测肝癌甲胎蛋白异质体的预装离心柱及含有该离心柱的试剂盒 |
| WO2008122241A1 (en) * | 2007-04-04 | 2008-10-16 | Diagcor Bioscience Incorporation Limited | Rapid protein analyses and the device thereof |
| CN101038275A (zh) * | 2007-04-17 | 2007-09-19 | 北京热景生物技术有限公司 | 一种分离肝癌α1－抗胰蛋白酶异质体、转铁蛋白异质体的凝集素亲和层析离心柱方法 |
| CN101266251A (zh) * | 2008-04-25 | 2008-09-17 | 南通大学附属医院 | 玻璃微柱亲和层析测定肝癌特异性afp的方法 |
| CN101622541A (zh) * | 2008-10-24 | 2010-01-06 | 韩国帕克特生物科技有限公司 | 糖化血红蛋白定量检测系统及使用该系统检测糖化血红蛋白含量的方法 |
| CN101561432A (zh) * | 2009-05-27 | 2009-10-21 | 福建省洪诚生物药业有限公司 | 一种能够维护酶标记物溶液高稳定性的稀释液 |
| CN102695716A (zh) * | 2009-07-14 | 2012-09-26 | 独立行政法人产业技术综合研究所 | 肝病病情指标糖链标记物 |
| CN102147415A (zh) * | 2010-12-30 | 2011-08-10 | 上海市肿瘤研究所 | 一种快速磁分离法主导的肝癌甲胎蛋白变异体检测试剂盒 |
| CN102331494A (zh) * | 2011-06-16 | 2012-01-25 | 广州艺佳生物科技有限公司 | 一种用于微孔板的封闭稳定剂 |
| CN102628863A (zh) * | 2012-04-19 | 2012-08-08 | 上海蓝怡科技有限公司 | 标记了碱性磷酸酶抗原抗体稀释液 |
Non-Patent Citations (4)
| Title |
|---|
| Jian Liao等.Serum profiling based on fucosylated glycoproteins for differentiating between chronic hepatitis B and hepatocellular carcinoma.《Biochemical and Biophysical Research Communications》.2012,第420卷(第2期), * |
| Serum profiling based on fucosylated glycoproteins for differentiating between chronic hepatitis B and hepatocellular carcinoma;Jian Liao等;《Biochemical and Biophysical Research Communications》;20120430;第420卷(第2期);第308-314页 * |
| 廖剑.糖蛋白质组学分析肝癌相关血清糖蛋白岩藻糖基化异常.《中国博士学位论文全文数据库医药卫生科技辑》.2010, * |
| 糖蛋白质组学分析肝癌相关血清糖蛋白岩藻糖基化异常;廖剑;《中国博士学位论文全文数据库医药卫生科技辑》;20101231;第E072-80页 * |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP3415918A4 (en) * | 2017-04-20 | 2019-01-16 | Korea Basic Science Institute | METHOD FOR DIAGNOSIS OF LIVER CANCER BY MASS SPECTROMETRY OF GLYCOPEPTIDE FROM ALPHA-FETOPROTEIN |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN102879567A (zh) | 2013-01-16 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN102879567B (zh) | 用于肝癌诊断的甲胎蛋白异质体分离试剂盒及其组成试剂与应用 | |
| CN104714026B (zh) | 一种甲胎蛋白异质体的分离检测组合物、系统及其应用 | |
| CN100588942C (zh) | 检测肝癌甲胎蛋白异质体的预装离心柱及含有该离心柱的试剂盒 | |
| CN102967649B (zh) | 电感耦合等离子体质谱在氯高铁血红素药物检测中的应用 | |
| CN102147415A (zh) | 一种快速磁分离法主导的肝癌甲胎蛋白变异体检测试剂盒 | |
| CN103344772B (zh) | Miltenberger血型抗体检测新方法 | |
| CN108362881B (zh) | 一种吡唑酮类解热镇痛药物的胶体金快速检测试装置及其制备方法和用途 | |
| CN204422547U (zh) | 一种甲胎蛋白异质体的分离检测试剂盒及装置 | |
| CN104749380B (zh) | hCE1及其抗体在制备用于诊断主体中肝癌的组合物中的应用 | |
| EP2006685A1 (en) | Immune agglutination reaction reagent kit and method of assaying antigen | |
| CN105647932A (zh) | 甲胎蛋白核酸适体afp1及其制备方法 | |
| CN106366197A (zh) | 一种HER2、EGFR、EpCAM、MUC1多重抗体免疫磁珠及其制备方法 | |
| CN113433318A (zh) | 一种检测甲胎蛋白异质体afp-l3含量的试剂盒及其检测方法和应用 | |
| CN108761090A (zh) | 用于检测c反应蛋白的试剂的制备方法 | |
| CN106366195B (zh) | 一种pd-l1抗体免疫磁珠及其制备方法 | |
| CN105891509B (zh) | 用于定量检测甲胎蛋白异质体的侧向层析系统 | |
| CN108918885B (zh) | 一种特异性结合鱼类小清蛋白的核酸适配体、试剂盒及检测方法 | |
| CN201196651Y (zh) | 双肿瘤标志物金标检测试纸 | |
| CN105424941B (zh) | Akr1b10蛋白和用于肝硬化诊断的试剂盒 | |
| KR101974230B1 (ko) | Pivka-ii 측정 시약에서의 비특이 반응의 억제 방법 | |
| CN202141725U (zh) | 一种定性/定量检测乙型肝炎病毒表面抗原的磁珠免疫层析试剂盒 | |
| CN107533050A (zh) | 凝血酶‑抗凝血酶复合体的测定试剂及测定方法 | |
| CN108396059A (zh) | 一种检测乙肝病毒的试剂盒及乙肝病毒的检测方法 | |
| CN101819210A (zh) | 产前筛查β-人绒毛膜促性腺激素测定试剂盒(时间分辨荧光免疫法)及其制备方法 | |
| US20230258629A1 (en) | Extracellular vesicle purification material and purification method |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant |