CN101266251A - 玻璃微柱亲和层析测定肝癌特异性afp的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种玻璃微柱亲和层析测定肝癌特异性AFP的方法，包括制亲和层析柱装置、取血清0.2ml加洗脱液0.8ml上层析柱，收集25管液体进行A₂₈₀吸光值及AFP浓度测定等步骤。本发明利用AFP异质体对LCA的亲和力建立了检测AFP－L3的方法。该方法的优点是层析柱可反复再生使用，所用仪器简便、重复性满意，同时批量检测样本较多，适合基层单位的临床应用。

Description

玻璃微柱亲和层析测定肝癌特异性AFP的方法

技术领域：

本发明涉及一种测定肝癌特异性AFP的方法。

背景技术：

肝癌(HCC)是世界上最常见恶性肿瘤之一。以东南亚、西太平洋地区及非洲东南部发病率最高。也是我国常见的恶性肿瘤。就死亡率而言，为第三位癌症。肝癌的发病率呈一定的地区分布，沿海高于内地，东南和东北高于西北、华北和西南部。肝癌多见于男性，男女之比为2-5∶1，年龄大多数为40-49岁，越是肝癌高发区，这种性别差别越明显，发病年龄也越轻。由于肝癌在确诊时已多属中、晚期，缺乏有效治疗，几乎所有病例都有肝硬化的基础，因此，预后恶劣。虽然近年来HCC非手术疗法有了很大进展，但手术切除仍然是目前最有效的治疗方法。晚期HCC切除后复发率高，易转移，所以早期诊断、早期治疗显得尤为重要。

AFP(甲胎蛋白)是由590个氨基酸组成的一种单链糖蛋白，分子量为70KD，属于胚胎性蛋白，主要由胚胎时期的肝细胞和卵黄囊产生，胃肠道粘膜上皮也可产生少量，出生后浓度即迅速下降，数月至一年内接近成人水平＜20ng/ml，AFP诊断肝癌的价值很高，但早期诊断肝癌有一定的局限性，鉴于一些非肝癌病人血清AFP也可以升高，所以单独检测AFP来区别肝癌有一定困难。因为在部分良性肝病、生殖系统和胃肠道的一些恶性肿瘤中AFP也可升高，而另一些肝癌患者AFP始终持续低浓度阳性(20-200ng/ml)，针对上述问题，近年来开展的甲胎蛋白亚组分肝癌特异性甲胎蛋白：hepatoma-specificα-fetoprotein(AFP)fraction(AFP-L3)及AFP-mRNA的研究大大提高了AFP临床应用价值。不同来源的AFP其糖链的组成和结构上存在着不均一性，含有岩藻糖苷化糖链的AFP异质体与LCA有较强的亲和力称LCA结合型AFP，与肝癌关系较大。根据其与植物血凝素的亲和性不同，采用电泳法分离出扁豆凝集素(LCA)结合AFP即AFP-L3。AFP-L3百分率可用AFP-L3条带/总AFP条带×100％表示。正常值为10％-15％，＞15％即表示HCC，即使总AFP仅轻微升高，或影像学上没有得到证实，都提示在不久的将来即为HCC。因此，AFP-L3％可用于肝癌早期的辅助诊断。

诸多报道表明AFP异质体可明显提高HCC实验室诊断的特异性、灵敏度及早期诊断阳性率。迄今为止的异质体测定方法对于技术的要求较高、操作繁琐、试剂昂贵、时间长、结果的判断需要特殊设备等，大大限制了AFP异质体测定在临床上的普遍应用。因此，建立一种快速方便、特异、敏感、无需特殊仪器的适合于基层医院和肝癌高危人群普查使用的AFP-L3检测方法就显得非常必要和迫切。

发明内容：

本发明的目的在于提供一种方法简单、易操作的玻璃微柱亲和层析测定肝癌特异性AFP的方法。

本发明的技术解决方案是：

一种玻璃微柱亲和层析测定肝癌特异性AFP的方法，其特征是：依次包括下列步骤：

(1)制亲和层析柱装置，玻璃微柱0.7cm×15cm；

(2)使用洗脱液清洗柱子的每个角落除去气泡，关闭柱子出口并且留下1～2cm的缓冲液在柱子中，将LCA-Sepharose 4B(小扁豆凝集素琼脂糖凝胶4B：lens culinaris agglutinin Sepharose 4B)从4℃冰箱中取出平衡至室温，然后沿柱壁向层析柱中加入，用10倍于柱体积的洗脱液平衡，关闭出口；

(3)取血清0.2ml加洗脱液0.8ml上层析柱，洗脱液洗脱，滴速约8～12/min，每次收集1ml，共收集15管至A₂₈₀＜0.02，随后以解吸液洗脱，方法同前，共收集10管，至A₂₈₀＜0.02，收集完毕用洗脱液清洗并平衡层析柱，用同样的方式分离第二个标本，每个标本共收集25管；

(4)收集25管液体进行A₂₈₀吸光值及AFP浓度测定，以标准品浓度为横坐标，结合率为纵坐标制作标准曲线，根据样品的结合率在标准曲线上查出样本的AFP浓度，解吸液收集的即为AFP-L3，AFP-L3/总AFP即为AFP-L3％；

所述洗脱液：pH7.4 20mmol/L Tris-HCl，含0.5mol/L NaCl，Mg²⁺、Ca²⁺，0.1％TritonX-100；

所述解吸液：含0.3mol/L α-甲基-D-甘露糖苷的洗脱液。

本发明利用AFP异质体对LCA的亲和力建立了检测AFP-L3的方法。以LCA-Sepharose 4B为介质装柱建立微层析装置，将待检样品过柱，此时交联的凝集素会与糖链特异性结合，使得洗脱液洗脱时结合在层析柱上的糖蛋白无法被洗脱，当在洗脱液中加入α-甲基-D-甘露糖苷制成解吸液进行洗脱时，糖蛋白在竞争中从层析柱上被洗脱下来，于是对LCA具有不同结合力的AFP蛋白被收集在不同的离心管中，测定各管AFP含量，即可得到不同组分AFP异质体的百分比及含量。本研究肝癌病例在制作曲线后发现，血清AFP洗脱峰有2个，部分病例有3个峰。而良性肝病患者血清AFP洗脱峰仅有一个。初步判断第一种成分为LCA非结合型AFP，第二种成分为LCA弱结合型AFP，第三种成分为LCA强结合型AFP。该方法的优点是层析柱可反复再生使用，所用仪器简便、重复性满意，同时批量检测样本较多，适合基层单位的临床应用。

下面结合附图和实施例对本发明作进一步说明。

图1是肝癌病人血清AFP洗脱曲线。

图2是良性肝病血清AFP的洗脱曲线。

具体实施方式：

一种玻璃微柱亲和层析测定肝癌特异性AFP的方法，依次包括下列步骤：

(1)制亲和层析柱装置，玻璃微柱0.7cm×15cm；

(2)使用洗脱液清洗柱子的每个角落除去气泡，关闭柱子出口并且留下1～2cm的缓冲液在柱子中，将LCA-Sepharose 4B从4℃冰箱中取出平衡至室温，然后沿柱壁向层析柱中加入，用10倍于柱体积的洗脱液平衡，关闭出口；

(3)取血清0.2ml加洗脱液0.8ml上层析柱，洗脱液洗脱，滴速约8～12/min，每次收集1ml，共收集15管至A₂₀₈<0.02，随后以解吸液洗脱，方法同前，共收集10管，至A₂₈₀<0.02，收集完毕用洗脱液清洗并平衡层析柱，用同样的方式分离第二个标本，每个标本共收集25管；

(4)收集25管液体进行A₂₈₀吸光值及AFP浓度测定，以标准品浓度为横坐标，结合率为纵坐标制作标准曲线，根据样品的结合率在标准曲线上查出样本的AFP浓度，解吸液收集的即为AFP-L3，AFP-L3/总AFP即为AFP-L3％；

所述洗脱液：pH7.4 20mmol/L Tris-HCl，含0.5mol/L NaCl，1mol/L Mg²⁺、1mol/L Ca²⁺，0.1％TritonX-100；

所述解吸液：含0.3m01/L α-甲基-D-甘露糖苷的洗脱液。

Claims (1)

1、一种玻璃微柱亲和层析测定肝癌特异性AFP的方法，其特征是：依次包括下列步骤：

(1)制亲和层析柱装置，玻璃微柱0.7cm×15cm；

(2)使用洗脱液清洗柱子的每个角落除去气泡，关闭柱子出口并且留下1～2cm的缓冲液在柱子中，将LCA-Sepharose 4B从4℃冰箱中取出平衡至室温，然后沿柱壁向层析柱中加入，用10倍于柱体积的洗脱液平衡，关闭出口；

(3)取血清0.2ml加洗脱液0.8ml上层析柱，洗脱液洗脱，滴速约8～12/min，每次收集1ml，共收集15管至A₂₈₀＜0.02，随后以解吸液洗脱，方法同前，共收集10管，至A₂₈₀＜0.02，收集完毕用洗脱液清洗并平衡层析柱，用同样的方式分离第二个标本，每个标本共收集25管；

(4)收集25管液体进行A₂₈₀吸光值及AFP浓度测定，以标准品浓度为横坐标，结合率为纵坐标制作标准曲线，根据样品的结合率在标准曲线上查出样本的AFP浓度，解吸液收集的即为AFP-L3，AFP-L3/总AFP即为AFP-L3％；

所述洗脱液：pH7.4 20mmol/L Tris-HCl，含0.5mol/L NaCl，Mg²⁺、Ca²⁺，0.1％ TritonX-100；

所述解吸液：含0.3mol/L α-甲基-D-甘露糖苷的洗脱液。

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