CN114167060B - 一种肝癌生物标志物及检测肝癌的试剂盒 - Google Patents

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Abstract

本发明公开一种肝癌生物标志物及检测肝癌的试剂盒，属于生物标志物及试剂盒技术领域。本发明首次发现Neu5Gc修饰的IgG在肝癌患者血清中异常高表达，将其作为诊断肝癌的生物标志物，本发明还提供一种检验肝癌的试剂盒，包含有包被试剂、洗涤液、捕获试剂、检测试剂、显色试剂及终止试剂，捕获试剂为生物素偶联的七鳃鳗免疫蛋白，可特异性识别血清中IgG糖蛋白Neu5Gc修饰位点，检测试剂为偶联辣根过氧化物酶(HRP)的链霉亲和素，通过生物素‑链酶亲和素反应系统可将Neu5Gc修饰的IgG进行准确定量。本发明的试剂盒能够高效、特异性诊断肝癌，并且对患者治疗手段的有效性具有监测效能，对于患者预后监测有指示意义。

Description

一种肝癌生物标志物及检测肝癌的试剂盒
技术领域
本发明属于生物标志物及试剂盒技术领域，具体涉及一种肝癌生物标志物及检测肝癌的试剂盒。
背景技术
肝癌是一种具有高死亡率的癌症，原发性肝癌或其他肿瘤肝转移都会造成严重的肝损伤。成年人中大多数原发性肝癌属于两种类型之一：肝细胞癌和胆管瘤/胆管癌，是世界上最常见的8种癌症之一，肝细胞癌是我国常见恶性肿瘤之一，居我国恶性肿瘤死亡第二位。肝癌在男性中的发生率至少比女性高2到3倍，早期症状不明显且不典型,肿瘤开始生长与首次出现征兆之间的时间长，是高死亡率的主要原因，肝癌出现症状时多属中晚期，切除后复发率、转移率高。因此肝癌的早期诊断对延长患者的生存时间和降低肝癌病死率具有重要意义。
腹部超声一直是肝癌监测的基本手段，便宜、方便、安全、对身体的直接伤害最小，但其发现往往于中晚期，对于检测早期肝癌灵敏度较低，仅为47％(95％CI，33-61％)。其有效性会受到操作人员专业知识以及肥胖和肝病严重程度等患者层面因素的影响，导致患者之间的敏感性差异很大。在临床实践中进一步检查手段常采用计算机断层扫描(CT)或磁共振成像(MRI)，基于MRI的监测对早期肝癌检测的敏感性显著高于超声，但其潜在身体伤害(辐射和造影剂暴露)和经济成本限制CT或MRI的广泛应用。此外影像研究不能区分肝脏肿瘤和肝中组织(结节)的其它异常团块，进一步明确诊断肝癌需要进行肝组织样品活组织检查，此操作对患者有创伤，而一些肿瘤有大量血管易出血，这些限制亟需简单的、非侵入性的诊断方式对肝癌实行检测。基于此，人们对可提高早期肝癌检测灵敏度的血清生物标志物越来越感兴趣。迄今为止研究得较好的生物标志物是甲胎蛋白(AFP)，由于单独使用时对肝癌的敏感性较差，临床上将其与超声联合使用，其敏感性可提高至63％(95％CI，48％-75％)，研究者还通过开发AFP不同算法以提高其早期肝癌检测的准确性，但收效甚微，因此寻找肝癌新的诊断标志物对于早期诊断及关口前移至关重要。
免疫球蛋白G(IgG)，是一种高丰度血清糖蛋白，介导多种血液免疫反应。有研究表明上皮性卵巢癌(EOC)与血清IgG的糖基化变化以及IgG的亚类特异性改变相关。另有研究显示，血清IgG糖基化在多种癌症的模式有相似的变化以及IgG半乳糖化谱的改变可作为癌症筛查的泛癌生物标志物。唾液酸是细胞膜糖蛋白修饰的重要组成部分，但迄今为止并没有以血清中唾液酸(Neu5Gc)修饰的IgG作为肝癌诊断标记物的相关研究报道。
发明内容
鉴于此，本发明的目的是提供了一种肝癌生物标志物及检测肝癌的试剂盒。
本发明目的是通过以下方式实现：
本发明提供一种肝癌生物标志物，所述肝癌生物标志物为Neu5Gc修饰的IgG糖蛋白。
本发明另一方面提供一种检测肝癌的试剂盒，以上述的生物标志物为抗原，主要包含有捕获试剂和检测试剂，所述的捕获试剂为生物素偶联的七鳃鳗免疫蛋白(LIP-Biotin)，可特异性识别血清中IgG糖蛋白Neu5Gc修饰位点，检测试剂为偶联辣根过氧化物酶的链霉亲和素，通过生物素-链酶亲和素反应系统可将Neu5Gc修饰的IgG进行准确定量。
进一步地，所述的试剂盒内还包含有包被试剂、洗涤液。
进一步地，包被试剂为IgG多克隆抗体，洗涤液为TBST缓冲液，其组分为：Tris10mM、NaCl 150mM、Tween-20 0.05％(V/V)、HCl调PH至7.6。
进一步地，所述的试剂盒内还包含有显色试剂及终止试剂。
进一步地，显色试剂为TMB显色液，终止试剂为硫酸溶液。
进一步地，所述生物素偶联的七鳃鳗免疫蛋白按照如下方法制备：将七鳃鳗免疫蛋白LIP水溶液置于反应器皿中，加入生物素，室温条件下，充分混匀得到混合液，将混合液经脱盐柱纯化，得到生物素偶联的七鳃鳗免疫蛋白。
进一步地，所述的七鳃鳗免疫蛋白LIP水溶液的浓度为0.3-1mg/mL。
进一步地，所述的七鳃鳗免疫蛋白LIP与生物素的用量比为1mg：0.25mg。
本发明相对于现有技术具有的有益效果如下：
本发明首次发现Neu5Gc修饰的IgG糖蛋白在肝癌患者血清中异常高表达，因此将Neu5Gc修饰的IgG糖蛋白作为诊断肝癌的生物标志物，并设计包含有包被试剂、洗涤液、捕获试剂、检测试剂、显色试剂及终止试剂的检验肝癌的试剂盒，本发明的试剂盒不会造成假阳性，能够高效、特异性诊断肝癌，并且对患者治疗手段的有效性具有监测效能，对于患者预后监测有指示意义。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例，下面将对实施例涉及的附图进行简单地介绍。
图1为经过SDS-PAGE电泳分析LIP-Biotin识别后的复合物在25-35kDa处和60-75kDa处有明显目的条带。
图2为LIP-Biotin识别后的复合物的质谱鉴定结果。
图3为本发明建立的LIP-Biotin/avidin亲和系统，通过ELISA法检测血清中Neu5Gc的含量。
图4为将Neu5Gc与临床血清其他检测指标的特异性和灵敏度进行比较。
图5为检测Neu5Gc的含量监测肝癌治疗效果及预后。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明进行详细的说明，但本发明的实施方式不限于此，显而易见地，下面描述中的实施例仅是本发明的部分实施例，对于本领域技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，获得其他的类似的实施例均落入本发明的保护范围。
实施例1
本发明涉及的IgG多克隆抗体由实验室制备，鼠IgG多抗的分离纯化步骤如下：
(1)取小鼠血清于PBS中按照1:10的比例稀释，于0.22μm滤膜过滤，与Protein G琼脂糖凝胶柱于4℃旋转混合孵育6h；
(2)用大约30mL的20％的乙醇水溶液洗涤纯化设备；
(3)使用Binding Buffer(0.1M NaCl，20mM NaHPO4，pH＝7.0-7.4)平衡纯化设备，待纯化设备示数稳定后，调整示数为“0”；
(4)上样：将步骤(1)得到的样品以1mL/min的速度上样(进样速度调为12-18)，待柱子中的血清预混液上样结束后(待纯化设备示数急速上升即可接收流出液，即为“流穿”)，使用Binding Buffer平衡纯化设备；
(5)平衡：使用Binding Buffer以2mL/min(进样速度调开始为16-18)的速度加入柱子中，示数急速下降至平稳后，即可进行洗脱(平衡可以时间长一些，可以将非特异性结合的蛋白洗脱下来)；
(6)洗脱：使用Elution Buffer(0.1M柠檬酸，pH＝2.5-3.0)洗脱液对目的蛋白进行洗脱，约500μL/管。
(7)洗脱过程中待仪器示数基本稳定即可停止收样，收集的样品处于酸性液体环境中，添加少量的Tris-Hcl中和pH值至7.0左右即可，得到IgG多抗溶液。
(8)将获得的IgG多抗进行电泳检测并于1×PBS中透析。
(9)透析后收集IgG多抗进行浓度测定，可置于-80℃保存，供长期使用。
实施例2
本实施例中使用的的七鳃鳗免疫蛋白LIP的制备参考专利号201310501366.2，名称为“七鳃鳗李蛋白、制备方法及在制备预防和治疗肿瘤疾病药物中的应用”的中国发明专利。七鳃鳗免疫蛋白LIP的获得可以从七鳃鳗李氏小体的培养液中分离，或者通过异源表达系统获得，例如大肠杆菌原核表达系统，优选pColdⅠ表达载体，高效获得重组蛋白rLiprotein。
从七鳃鳗李氏小体的培养液中分离七鳃鳗免疫蛋白LIP的制备按如下步骤进行：
a.取新鲜的七鳃鳗李氏小体，放入胰蛋白酶中4℃过夜消化；
b.收集消化后的细胞，PBS清洗两次；
c.转入无血清的1640培养液中培养72小时；
d.收集七鳃鳗李氏小体细胞的培养液，加入终浓度为2mmol/L的苯甲基磺酰氟；
e.以0.1M KCl/buffer A(20mM KPB，5％Glycerol，pH 7.0)为透析液，在4℃条件下对所收集的细胞培养液透析2hr～O/N，共透析3次；
f.透析后的样品通过0.45μm滤膜过滤；
g.将过滤后样品上样至柱体积为10ml的Macro-Prep Ceramic HydroxyapatiteType I 80μm羟基磷灰石吸附层析柱中，线性梯度洗脱0～250mM KPB pH7.0/0.1M KCl/buffer A，流速为1.0ml/min，分管收集2.5ml/管，共80管；
h.合并第8～23管洗脱液，置于1L buffer B(20mM Tris-HCl，5％Glycerol，pH8.0)中4℃下透析，2hr～O/N更换一次透析液，共透析3次；
i.透析后的样品通过0.45μm滤膜过滤；
j.取20ml Q Sepharose Fast Flow(购自GE Healthcare)填料灌装层析柱，用于对上一步样品进行离子交换层析，将过滤后样品全部上样，线性梯度洗脱0～0.3M KCL/buffer B，流速1.0ml/min，分管收集2.5ml/管，80管；
k.收集29-35管，使用PBS透析2hr～O/N，共透析3次，得到产物即为纯化的七鳃鳗免疫蛋白LIP。
将制备的七鳃鳗免疫蛋白LIP和Biotin偶联，获得生物素偶联的七鳃鳗免疫蛋白(LIP-Biotin)，所述生物素偶联的七鳃鳗免疫蛋白(LIP-Biotin)按照如下方法制备：将浓度为0.5mg/mL的七鳃鳗免疫蛋白LIP水溶液置于试管后加入生物素，室温条件下，充分混匀得到混合液，所述七鳃鳗免疫蛋白LIP与生物素的用量比为1mg：0.25mg；将混合液经脱盐柱纯化，得到生物素偶联的七鳃鳗免疫蛋白LIP。
实施例3
本发明提供一种检验肝癌的试剂盒，包含有包被试剂、洗涤液、捕获试剂、检测试剂、显色试剂及终止试剂，包被试剂为IgG多克隆抗体，洗涤液为TBST，其组分为：Tris10mM、NaCl 150mM、Tween-20 0.05％(V/V)、HCl调PH至7.6，捕获试剂为生物素偶联的七鳃鳗免疫蛋白(LIP-Biotin)，可特异性识别血清中IgG糖蛋白Neu5Gc修饰位点，检测试剂为偶联辣根过氧化物酶(HRP)的链霉亲和素，显色试剂为TMB显色液，终止试剂为硫酸溶液，通过生物素-链酶亲和素反应系统可将Neu5Gc修饰的IgG进行准确定量。
首先建立检测Neu5Gc含量的标准曲线，具体方法如下：
(1)Neu5Gc纯品于含多聚赖氨酸的PBS缓冲液中进行梯度稀释；
(2)稀释后的Neu5Gc按照每孔100μL的体积加入到96孔板中，4℃过夜孵育；
(3)弃掉步骤(2)中液体，加入生物素偶联的七鳃鳗免疫蛋白(LIP-Biotin)，4℃孵育6-8h；
(4)使用TBST缓冲液清洗3次，加入偶联辣根过氧化物酶的链霉亲和素，37℃孵育1-2h；
(5)加入TMB室温显色15min后加入2mol/L硫酸溶液终止反应；
(6)检测450nm波长下OD值，进行标准曲线绘制。
本发明的检验肝癌的试剂盒的具体使用过程如下：
(1)包被IgG多抗，将鼠IgG多克隆抗体按照0.1μg/mL浓度包被到聚苯乙烯96孔板中，4℃孵育8h；聚苯乙烯孔板中有较强的阴离子吸附功能，包被液的pH值为9.6，使蛋白质为碱性，因此可以牢固吸附在孔板中；
(2)孵育血清：弃掉包被液，每孔添加新的包被液并加入0.4μL待检测血清孵育8h；
(3)封闭：每孔中加入100μL无糖封闭液(vector公司，LOT:ZH0128)，4℃封闭6h；
(4)弃掉封闭液并清洗孔板；
(4)LIP-Biotin孵育：将生物素偶联的七鳃鳗免疫蛋白按照一定比例稀释后每孔加入100μL，4℃孵育6h；
(5)加入偶联辣根过氧化物酶的链霉亲和素：弃掉LIP-Biotin后并清洗孔板，于每孔加入100μL偶联辣根过氧化物酶的链霉亲和素，37℃孵育1-2h；
(6)TMB显色：每孔加入100μL TMB显色液，室温孵育15min；
(7)终止反应：每孔加入2mol/L硫酸溶液50μL，于450nm波长下检测OD值。
(8)通过Neu5Gc标准品绘制的标准曲线，计算出样品中的Neu5Gc含量。
将LIP-Biotin识别后的复合物经过SDS-PAGE电泳分析，结果如图1所示，可以看到LIP-Biotin识别后的复合物在25-35kDa处和60-75kDa处有明显目的条带，经过质谱鉴定结果为免疫球蛋白分子。
实施例4
采用本发明的检验肝癌的试剂盒对1680例正常人、160例非肿瘤肝病(肝硬化72例，慢性乙型肝炎44例，慢性丙型肝炎44例)和84例肝癌患者的血液样品进行了检测，结果如图3所示，可以看出正常人血液样本LIP特异性识别修饰IgG糖蛋白的Neu5Gc含量在10.63±0.31ng/ul；160例非肿瘤肝病样本中LIP特异性识别修饰IgG糖蛋白的Neu5Gc含量相对于正常人没有显著性差异，范围在13.71±1.20ng/ul。结果表明：筛查肝癌，当肝脏存在炎症及实质器官损伤等问题时，LIP特异性识别修饰IgG糖蛋白的Neu5Gc与正常人识别含量没有显著性差异，不会造成假阳性；84例肝癌患者血液样本LIP特异性识别修饰IgG糖蛋白的Neu5Gc含量范围在50.25±9.38ng/ml。由此可见，本发明的试剂盒能够高效、特异性诊断肝癌。
实施例5
将本发明的试剂盒检测方法与ALT、LDL-CHO、甲胎蛋白(AFP)和E_med等指标的检测灵敏度和特异性进行对比，结果如图4所示，临床不同反映肝脏病变指标ROC分析显示，其他指标的鉴别诊断效能明显低于本发明的LIP特异性识别修饰IgG糖蛋白的Neu5Gc含量，可以看出本发明的试剂盒检测方法具有更高的灵敏度和特异性，诊断效能良好。
实施例6
本发明还对肝癌手术患者及术后化疗周期加以分析，以术后化疗3周期为界限，经治疗后患者血液中Neu5Gc含量明显下降(如图5所示)，证明该指标对于患者治疗手段有效性具有监测效能，对于患者预后监测有指示意义。通过对比检测样本中LIP可特异性识别血液中修饰IgG糖蛋白的Neu5Gc含量范围，从而达到筛查检测样本是否为肝癌的目的，准确率高达90％以上。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

Claims (8)

1.检测血清样品中Neu5Gc修饰的IgG糖蛋白含量的试剂在制备肝癌检测试剂盒中的应用，其特征在于，所述的检测血清样品中Neu5Gc修饰的IgG糖蛋白含量的试剂包括包被试剂、捕获试剂和检测试剂，所述的包被试剂为抗IgG的多克隆抗体，所述的捕获试剂为生物素偶联的七鳃鳗免疫蛋白，所述的检测试剂为偶联辣根过氧化物酶的链霉亲和素。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的试剂盒内还包含洗涤液。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，洗涤液为TBST缓冲液，其组分为：Tris10mM、NaCl 150mM、Tween-20 0.05％(V/V)、HCl调PH至7.6。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述的试剂盒内还包含有显色试剂及终止试剂。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，显色试剂为TMB显色液，终止试剂为硫酸溶液。
6.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的生物素偶联的七鳃鳗免疫蛋白按照如下方法制备：将七鳃鳗免疫蛋白LIP水溶液置于反应器皿中，加入生物素，室温条件下，充分混匀得到混合液，将混合液经脱盐柱纯化，得到生物素偶联的七鳃鳗免疫蛋白。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述的七鳃鳗免疫蛋白LIP水溶液的浓度为0.3-1mg/mL。
8.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述的七鳃鳗免疫蛋白LIP与生物素的用量比为1mg：0.25mg。
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