CN112379096B - 一种外泌体膜蛋白作为结肠癌诊断标志物的应用以及结肠癌早期诊断试剂盒 - Google Patents

Abstract

本申请公开了一种外泌体膜蛋白作为结肠癌诊断标志物的应用以及结肠癌早期诊断试剂盒，属于生物医学技术领域。本申请通过实验确定了外泌体的CD33和CD147蛋白可以作为结肠癌诊断标志物，对其进行检测可以实现对结肠癌的早期精确诊断。本申请针对外泌体CD33和CD147蛋白还提出了一种结肠癌早期诊断试剂盒，包括免疫磁珠、兔抗人CD33抗体、鼠抗人CD147抗体、羊抗兔荧光二抗、羊抗鼠荧光二抗和缓冲液。本申请试剂盒结合流式细胞术可以对待测样本血清外泌体的CD33和CD147蛋白进行定量检测，并通过与阈值进行简单比较，便可判定待测样本结肠癌的阴阳性，检测结果准确、可靠。

Description

一种外泌体膜蛋白作为结肠癌诊断标志物的应用以及结肠癌 早期诊断试剂盒

技术领域

本申请涉及生物医学技术领域，特别涉及一种外泌体膜蛋白作为结肠癌诊断标志物的应用以及结肠癌早期诊断试剂盒。

背景技术

结肠癌是常见的发生于结肠部位的消化道恶性肿瘤，在全世界范围内，结直肠癌是第三大常见的癌症。据估算，2018年全球新增180万肠癌患者，占所有癌症的10%；86万人因肠癌死亡，位居癌症死亡谱第二位。在我国，结直肠癌的发病率和病死率在过去10年中都呈持续上升趋势，逐渐与欧美国家“看齐”。据估算，我国肠癌每年新增发病人数约38万，位列所有癌症种类第三位；死亡人数约19万，位居癌症死亡谱第五位。

绝大多数肠癌是由腺瘤发展而来，早期肠癌基本上没有症状。从良性息肉发展为肠癌通常需要5～15年。当发现结直肠息肉和腺瘤时，及时通过手术将息肉或腺瘤切除，就能杜绝其演变为肠癌。肠癌预后与临床分期密切相关。目前，早期肠癌可以通过外科手术治愈，5年生存率高达90%；中期肠癌需要接受以手术、放疗和化疗相结合的多学科治疗，也可以获得理想疗效；而晚期肠癌的5年生存率只有10%~20%。

由于结肠癌早期症状不明显，常被漏诊。目前，结肠癌诊断主要依靠影像学检查，包括肠镜、腹部CT，结肠镜及通过结肠镜下活组织病理学检查是肠癌筛查、诊断的金标准，然而肠镜不适用于普通人群的筛查。而已有的血清学检测指标CEA并不能完全代表结肠癌的病情，对于结肠癌早期诊断的灵敏度及特异性均难达到要求。因此，适用于临床结肠癌早期诊断的检测方法亟待开发。

发明内容

针对现有的结肠癌早期诊断方法准确度不高，容易漏诊的问题，本申请提供一种外泌体膜蛋白作为结肠癌诊断标志物的应用以及结肠癌早期诊断试剂盒。

第一方面，本申请提供一种外泌体膜蛋白的检测试剂在制备用于结肠癌诊断的产品中的应用，通过以下技术方案得以实现。

一种外泌体膜蛋白的检测试剂在制备用于结肠癌诊断的产品中的应用，所述外泌体膜蛋白为CD33蛋白和CD147蛋白。

通过采用上述技术方案，本申请通过对正常细胞系和结肠癌细胞系的外泌体蛋白进行蛋白组学分析，发现CD33及CD147两种膜蛋白存在于结肠癌细胞系外泌体中，而在正常细胞系中未能鉴定到。由此，初步确定CD33及CD147可以作为结肠癌的潜在判断指标。为了验证以上结论的准确性，本申请又通过Western Blot方法检测结肠癌、肠道息肉、肠炎和健康献血者血清外泌体中CD33及CD147的表达情况，发现CD33及CD147只在结肠癌患者血清外泌体中高表达，从而进一步确定CD33及CD147可以作为结肠癌诊断标志物。

本申请将在结肠癌患者血清外泌体中特异性表达的CD33及CD147两种膜蛋白作为结肠癌诊断标志物，与现有的血清学检测指标CEA相比，提高了结肠癌早期诊断的特异性，检测结果能够完全反映结肠癌的病情；与肠癌筛查、诊断的金标准影像学检查方法相比，提高了结肠癌早期诊断的灵敏度，降低了由于结肠癌早期症状不明显而漏诊的发生率。

可选的，所述外泌体膜蛋白来源于血清。

通过采用上述技术方案，外泌体广泛存在于各种体液中，例如血液、淋巴液、唾液、尿液、精液和乳汁等，由于其他体液外泌体中CD33及CD147蛋白含量较低或难以测定，所以本申请将血液作为样本来源，检测血清外泌体的CD33及CD147两种膜蛋白含量，可以提高检测结果的准确性，且检测样本易于获得。

可选的，所述检测试剂为针对外泌体膜蛋白的特异性抗体。

通过采用上述技术方案，本申请采用针对外泌体膜蛋白的特异性抗体对外泌体膜蛋白进行检测，利用抗原和抗体的特异性结合的原理，降低了假阳性率，从而提高了检测结果的特异性和准确性。

可选的，所述针对外泌体膜蛋白的特异性抗体为CD33抗体和抗CD33抗体。

通过采用上述技术方案，本申请的针对外泌体膜蛋白的特异性抗体选用CD33抗体及其二抗，所述CD33抗体能够特异性的与外泌体中的CD33蛋白结合，而抗CD33抗体又能与CD33抗体特异性结合，从而达到检测外泌体中CD33含量的目的，具有极高的检测特异性，降低了非特异性结合的发生率。

可选的，所述针对外泌体膜蛋白的特异性抗体为CD147抗体和抗CD147抗体。

通过采用上述技术方案，本申请的针对外泌体膜蛋白的特异性抗体选用CD147抗体及其二抗，所述CD147抗体能够特异性的与外泌体中的CD147蛋白结合，而抗CD147抗体又能与CD147抗体特异性结合，从而达到检测外泌体中CD147含量的目的，具有极高的检测特异性，降低了非特异性结合的发生率。

第二方面，本申请提供一种结肠癌早期诊断试剂盒，通过以下技术方案得以实现的：

一种结肠癌早期诊断试剂盒，所述试剂盒包括免疫磁珠、兔抗人CD33抗体、鼠抗人CD147抗体、羊抗兔荧光二抗、羊抗鼠荧光二抗和缓冲液。

通过采用上述技术方案，本申请的试剂盒采用荧光免疫技术特异性的检测外泌体中CD33及CD147蛋白，包括针对外泌体CD33蛋白的兔抗人CD33抗体和羊抗兔荧光二抗以及针对外泌体CD147蛋白的鼠抗人CD147抗体和羊抗鼠荧光二抗，通过CD33蛋白与其抗体和二抗的特异性结合以及CD147蛋白与其抗体和二抗的特异性结合，可以对结肠癌早期进行诊断，检测结果具有较高的特异性、灵敏度和准确性。

另外，本申请试剂盒中的免疫磁珠能够与外泌体上的蛋白进行共价或者非共价偶联，在外加磁场的吸引下可做定向移动，达到纯化外泌体的效果，从而降低待测样本中杂质的干扰，提高检测结果的准确性。

可选的，所述试剂盒通过将待测样本中Exo-CD33+及Exo-CD147+所占的数量百分比之和与阈值进行比较，对结肠癌进行定性预判；所述阈值为17.74%，若Exo-CD33+及Exo-CD147+所占的数量百分比之和小于17.74%，判定为结肠癌阴性；若Exo-CD33+及Exo-CD147+所占的数量百分比之和大于等于17.74%，判定为结肠癌阳性。

通过采用上述技术方案，本申请将荧光免疫技术与流式检测进行结合，可实现对外泌体中CD33 及CD147蛋白的定量检测。另外，本申请通过绘制ROC曲线，将特异性+敏感度取最大时对应的阈值作为最佳阈值，再将流式检测获得的Exo-CD33+和Exo-CD147+的含量与最佳阈值进行比对，从而简单判定待测样本结肠癌的阴阳性，在此最佳阈值下结肠癌诊断的灵敏度为89%，特异性为91%，显著高于作为肿瘤检测金标准的CA19-9的检测结果，具有非常好的灵敏度和特异性。

综上，本申请试剂盒将荧光免疫技术与流式细胞术进行结合，可以通过简单的数值比较达到对早期结肠癌的预判，且预判结果准确可靠。

可选的，所述免疫磁珠为标记有CD63抗体的聚苯乙烯磁珠，粒径为4-5 μm。

通过采用上述技术方案，本申请的免疫磁珠优选为标记有CD63抗体的聚苯乙烯磁珠，标记有CD63抗体的聚苯乙烯磁珠中的CD63抗体能够特异性的与外泌体的CD63蛋白进行结合，从而将外泌体结合在磁珠上，最后在磁力的作用下，实现对外泌体特定亚群的纯化，从而提高检测样本的纯度，便于后续的检测操作，减少杂质的干扰，提高检测结果的准确性。

可选的，所述缓冲液为含有0.1% BSA的PBS溶液，PBS溶液浓度为0.008-0.012 M。优选的，PBS溶液浓度为0.01 M。

通过采用上述技术方案，本申请在0.008-0.012 M PBS溶液中加入0.1% BSA，一方面可以维持抗体的稳定性，另一方面可以对磁珠进行洗涤，对反应体系进行稀释，从而达到平衡反应体系，保证蛋白与抗体结合反应顺利进行的目的。

可选的，所述兔抗人CD33抗体的浓度为0.00953-0.01906mg/ml；鼠抗人CD147抗体的浓度为0.008-0.016mg/ml；羊抗鼠荧光二抗和羊抗兔荧光二抗的浓度均为0.01-0.02mg/ml。

通过采用上述技术方案，本申请进一步限定试剂盒中一抗和二抗的浓度，保证抗体可以与蛋白有效的结合，从而实现对待测样本的准确检测。

综上所述，本申请具有以下有益效果：

1、本申请通过实验确定了外泌体的CD33和CD147蛋白可以作为结肠癌诊断标志物，对其进行检测可以实现对结肠癌的早期精确诊断；

2、本申请的结肠癌早期诊断试剂盒结合流式细胞术可以对待测样本血清外泌体的CD33和CD147蛋白进行定量检测，并通过与阈值进行简单比较，便可判定待测样本结肠癌的阴阳性，检测结果的特异性、灵敏度高。

附图说明

图1是本申请不同细胞系外泌体中鉴定到的蛋白韦恩图；

图2是本申请Western Blot检测各临床样本外泌体中CD33及CD147的表达情况图；

图3是本申请四组临床样本中典型病例Exo-CD33+及Exo-CD147+的流式检测结果图；

图4是本申请结肠癌早期患者、肠道息肉、肠炎和健康献血者血清外泌体中Exo-CD33+及Exo-CD147+的含量统计结果图；

图5是本申请试剂盒以及CA19-9检测试剂盒的ROC曲线图。

具体实施方式

以下结合附图对本申请作进一步详细说明。

本申请的流式细胞仪购自美国Beckman Coulter公司，型号：CytoFLEX S；

本申请的外泌体分离纯化试剂盒购自赛默飞世尔科技公司（ThermoFisher），货号4478359、4478360；

本申请的RIPA裂解液购自上海碧云天生物技术有限公司（Beyotime）；

本申请的聚偏二氟乙烯膜购自美国默克密理博公司（Merck Millipore）；

本申请的辣根过氧化物酶连接的IgG二抗购自艾博抗（上海）贸易有限公司（Abcam），货号：ab6721、ab6789；

本申请的CA19-9检测试剂盒购自深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司。

实施例1

外泌体膜蛋白CD33和CD147作为结肠癌诊断标志物的确定

具体实验步骤如下：

1. 培养结肠癌细胞系HCT-116、SW-480以及正常细胞系NCM460、HCoEpiC、HDF，待细胞密度达到70%-90%时，将培养基替换成新鲜的不含血清的培养基，继续培养24h，收集培养基，利用外泌体分离纯化试剂盒提取外泌体；

2. 用RIPA裂解液提取外泌体中的总蛋白并通过BCA法检测蛋白浓度，从中吸取100μg蛋白溶液，蛋白溶液样品中加入1μmol/L DTT（二硫苏糖醇），在60℃反应1h去除游离的半胱氨酸，之后加入1mol/L碘代乙酰胺，室温条件下避光反应10min，10KD超滤管离心15min去除多余的小分子，用100mmol/L三甲基铵重碳酸盐缓冲液至超滤管中洗涤蛋白，4℃、12000rpm离心20min，重复上述步骤2次，向洗涤后的蛋白中加入2μg测序级胰蛋白酶，37℃消化过夜；之后在4℃、12000rpm条件下离心20min收集肽段序列，并通过脱盐柱进行脱盐处理；

3. 将收集到的肽段序列用液相色谱流动相A相溶解后使用EASY-nLC 1200超高效液相系统进行分离。分离具体条件为：

流动相A：水溶液（0.1%甲酸和2%乙腈）；

流动相B：水溶液（0.1%甲酸和90%乙腈）；

液相梯度：0-60 min，5%~20%B；60-80 min，20%~35%B；80-85 min，35%~85%B；85-90min，85% B；流速维持在450.00nL/min；

4.肽段经由超高效液相系统分离后被注入NSI离子源中进行电离，然后进HF-X_NJ2质谱进行分析；离子源电压设置为2.1 kV，肽段母离子及其二级碎片都使用高分辨的Orbitrap进行检测和分析。质谱条件：

一级质谱扫描范围：300-1800 m/z，扫描分辨率：120000.00；

二级质谱扫描范围则固定起点为100 m/z，二级扫描分辨率：15000.00；

数据采集模式使用数据依赖型扫描程序，自动增益控制设置为5E4，信号阈值设置为2.5E5ions/s，最大注入时间设置为50ms，串联质谱扫描的动态排除时间设置为30 s。

二级质谱数据使用Maxquant 1.6.15.0进行检索。检索参数设置：数据库为Homo_sapiens_9606（20336条序列），添加了反库以计算随机匹配造成的假阳性率（FDR），并且在数据库中加入了常见的污染库；酶切方式设置为Trypsin/P；漏切位点数设为2；肽段最小长度设置为7个氨基酸残基；肽段最大修饰数设为5；First search和Main search的一级母离子质量误差容忍度分别设为20.0 ppm和5 ppm，二级碎片离子的质量误差容忍度为20.0ppm。将半胱氨酸烷基化Carbamidomethyl(C)设置为固定修饰，可变修饰为['Acetyl(Protein N-term)', 'Oxidation (M)', 'Deamidation (NQ)']。定量方法设置为LFQ，蛋白鉴定、PSM鉴定的FDR都设置为1%。随后对蛋白进行注释，具体包括：GO分析、蛋白结构域注释、KEGG通路注释、亚细胞定位，最终分析得到差异蛋白。

实验结果如图1所示，本申请对鉴定到的蛋白进行分析，发现有5种蛋白在结肠癌细胞系外泌体中均能被鉴定到，而在正常细胞系中均未能鉴定到，通过细胞定位发现，这5种蛋白中有两种膜蛋白，即CD33及CD147蛋白。因此，初步将CD33和CD147阳性的外泌体作为结肠癌的潜在判断指标。

实施例2

外泌体膜蛋白CD33和CD147作为结肠癌诊断标志物的验证

具体实验步骤如下：

1. 分离结肠癌、肠道息肉、肠炎和健康献血者血清，利用外泌体分离纯化试剂盒提取外泌体；

2.用RIPA裂解液提取外泌体中的总蛋白并利用BCA法检测蛋白浓度，使用10％SDS-PAGE凝胶上样并分离40μg蛋白质，然后将蛋白质转移至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜。用5％脱脂乳封闭膜后，将膜与兔抗人CD33抗体和鼠抗人CD147抗体（以1：1000的比例稀释至5％脱脂牛奶）在4℃下孵育过夜。第二天，将膜与辣根过氧化物酶连接的IgG二抗（以1：1000的比例稀释至5％脱脂牛奶）在室温下孵育1小时，用ECL缓冲液进行曝光，并用ImageJ软件进行蛋白质条带分析。

实验结果如图2所示，通过Western Blot检测各临床样本外泌体中CD33及CD147的表达情况，发现CD33及CD147蛋白在结肠癌患者外泌体中高表达，而在肠道息肉、肠炎和健康人血清外泌体中不表达或低表达，从而进一步确认血清外泌体中的CD33及CD147蛋白可以作为结肠癌诊断标志物。

实施例3

一种结肠癌早期诊断试剂盒，包括标记有CD63抗体的聚苯乙烯磁珠、兔抗人CD33抗体、鼠抗人CD147抗体、羊抗鼠荧光二抗、羊抗兔荧光二抗和缓冲液；

其中，本实施例的标记有CD63抗体的聚苯乙烯磁珠购自艾博抗（上海）贸易有限公司（Abcam），货号：ab239686，粒径约4-5 μm，浓度1×10⁷ beads/ml；

本实施例的兔抗人CD33抗体购自艾博抗（上海）贸易有限公司（Abcam），货号：ab134115，浓度为0.953 mg/ml。使用时，兔抗人CD33抗体的孵育比例为50/1-100/1，浓度为0.00953-0.01906mg/ml；具体到本实施例，兔抗人CD33抗体的孵育比例为100/1，浓度为0.00953mg/ml；

本实施例的鼠抗人CD147抗体购自艾博抗（上海）贸易有限公司（Abcam），货号：ab230921，浓度为0.8 mg/ml。使用时，孵育比例为50/1-100/1，浓度为0.008-0.016mg/ml；具体到本实施例，鼠抗人CD147抗体的孵育比例为50/1，浓度为0.016mg/ml；

本实施例的羊抗鼠荧光二抗选用Alexa Fluor 594羊抗鼠荧光二抗，购自艾博抗（上海）贸易有限公司（Abcam），货号：ab150116，浓度为2 mg/ml。使用时，孵育比例为100/1-200/1，浓度为0.01-0.02mg/ml；具体到本实施例，Alexa Fluor 594羊抗鼠荧光二抗的孵育比例为100/1，浓度为0.02 mg/ml；

本实施例的羊抗兔荧光二抗选用Alexa Fluor 488羊抗兔荧光二抗，购自艾博抗（上海）贸易有限公司（Abcam），货号：ab150077，浓度为 2 mg/ml。使用时，孵育比例为100/1-200/1，浓度为；0.01-0.02mg/ml；具体到本实施例，Alexa Fluor 488羊抗兔荧光二抗的孵育比例为200/1，浓度为0.01mg/ml；

本实施例的缓冲液为含有0.1% BSA的PBS溶液，PBS溶液浓度为0.01M，并采用0.22µm滤膜过滤；

本实施例试剂盒通过将待测样本中Exo-CD33+及Exo-CD147+所占的数量百分比之和与阈值进行比较，对结肠癌进行定性预判；所述阈值为17.74%，若Exo-CD33+及Exo-CD147+所占的数量百分比之和小于17.74%，判定为结肠癌阴性；若Exo-CD33+及Exo-CD147+所占的数量百分比之和大于等于17.74%，判定为结肠癌阳性。

应用例

本申请采用实施例3的试剂盒对结肠癌早期患者（n=72）、肠道息肉（n=35）、肠炎（n=48）和健康献血者（n=50）血清外泌体中的CD33和CD147蛋白进行检测。

所述结肠癌早期诊断试剂盒的使用方法，包括以下步骤：

a. 收集待测血清样本并采用外泌体分离纯化试剂盒分离提取外泌体；

b. 将标记有CD63抗体的聚苯乙烯磁珠充分混匀后吸取20μL置于离心管中，加入缓冲液200μL充分吹打后置于磁力架上静置1分钟，吸去上清，加入步骤a提取的外泌体100μL，室温振荡孵育2小时；

c. 再次将离心管置于磁力架上静置1分钟，吸去上清，加入缓冲液充分洗涤3次，置于磁力架上静置1分钟；

d. 向步骤c得到的磁珠中加入200μL缓冲液，分成两份，一份加入兔抗人CD33抗体和鼠抗人CD147抗体各2μL，混匀后室温静置孵育30min；另一份直接室温静置孵育30min，作为阴性对照品；

e. 再次将离心管置于磁力架上静置1分钟，吸去上清，加入缓冲液充分洗涤3次，置于磁力架上静置1分钟；

f. 向步骤e的两种磁珠中分别加入100μL缓冲液，再向每一种磁珠中加入AlexaFluor 594羊抗鼠荧光二抗和Alexa Fluor 488羊抗兔荧光二抗各1μL，混匀后室温避光孵育30min；

g.调节流式细胞仪参数：FSC 50/SSC 50/FITC 135/PE 145/流速中等，设定读取10000个磁珠；

h.利用阴性对照品设定门，在FSC/SSC图中选中FSC/SSC信号值均在50左右的分群，对分群中的磁珠进行进一步分析，以CD33为横坐标，以CD147为纵坐标，设定门的位置为恰好所有的阴性对照磁珠都落在CD33及CD147阴性的区域（即左下角象限），在同样的条件下对步骤f孵育后的待测样本进行流式细胞检测。

流式检测结果如图3所示，图3显示了一位正常人、一例肠道息肉患者、一例肠炎患者以及一例早期结肠癌患者的血清外泌体中CD33及CD147的含量，从图3中可以看出，正常人、肠道息肉患者以及肠炎患者外泌体磁珠大多集中在CD33及CD147阴性区域（即左下角象限），而早期结肠癌患者的外泌体磁珠有很大一部分分布在CD33和/或CD147阳性区域（即左上角、右上角、右下角象限）。

然后本申请对流式检测结果进行统计，统计Exo-CD33+CD147-所占的数量百分比（X1）、Exo-CD147+CD33-所占的数量百分比（X2）以及Exo-CD33+CD147+所占的数量百分比（X3），并设定p=X1+X2+X3，比较不同组血清样本p值。实验结果如图4所示，从图4中可以看出结肠癌早期患者Exo-CD33+CD147-、Exo-CD147+CD33-和Exo-CD33+CD147+外泌体占总外泌体数量的比例远高于正常人、肠道息肉患者及肠炎患者，具有统计学意义(p<0.001，图4中用“****”表示)。

最后本申请依次将p值作为阈值，使用GraphPad软件绘制ROC曲线（横坐标为1-特异性，纵坐标为敏感性），参见图5，选取特异性+敏感度值最大时的p值作为阈值，最终确定阈值为17.74%，并设定p值<17.74%时，判定为结肠癌阴性，p值≥17.74%时，判定为结肠癌阳性，建议复查肠镜；此阈值下结肠癌诊断的灵敏度为89%，特异性为91%。

本申请同时采用CA19-9检测试剂盒对上述样本进行检测，同样采用GraphPad软件绘制ROC曲线（参见图5，下方曲线），此种方法结肠癌诊断的灵敏度为73.61%，特异性为80.45%。

以上实验结果表明，采用本申请试剂盒诊断早期结肠癌具有很好的灵敏度和特异性，显著高于肿瘤检测的金标准，提高了临床检测的准确度。

本具体实施方式的实施例均为本申请的较佳实施例，并非依此限制本申请的保护范围，故：凡依本申请的结构、形状、原理所做的等效变化，均应涵盖于本申请的保护范围之内。

Claims (5)

1.一种外泌体膜蛋白的检测试剂在制备用于结肠癌诊断的产品中的应用，其特征在于：所述检测试剂包括免疫磁珠、兔抗人CD33抗体、鼠抗人CD147抗体、羊抗兔荧光二抗、羊抗鼠荧光二抗和缓冲液；

将待测样本与检测试剂进行反应，并进行流式检测与统计，统计Exo-CD33+CD147-所占的数量百分比（X1）、Exo-CD147+CD33-所占的数量百分比（X2）以及Exo-CD33+CD147+所占的数量百分比（X3），并设定p=X1+X2+X3，将P值与阈值进行比较，所述阈值设为17.74%，若p值<17.74%，判定为结肠癌阴性；若p值≥17.74%，判定为结肠癌阳性。

2.根据权利要求1所述的一种外泌体膜蛋白的检测试剂在制备用于结肠癌诊断的产品中的应用，其特征在于：所述免疫磁珠为标记有CD63抗体的聚苯乙烯磁珠，粒径为4-5 μm。

3.根据权利要求1所述的一种外泌体膜蛋白的检测试剂在制备用于结肠癌诊断的产品中的应用，其特征在于：所述缓冲液为含有0.1% BSA的PBS溶液，PBS溶液浓度为0.008-0.012 M。

4.根据权利要求1所述的一种外泌体膜蛋白的检测试剂在制备用于结肠癌诊断的产品中的应用，其特征在于：所述兔抗人CD33抗体的浓度为0.00953-0.01906mg/ml；鼠抗人CD147抗体的浓度为0.008-0.016mg/ml；羊抗鼠荧光二抗和羊抗兔荧光二抗的浓度均为0.01-0.02mg/ml。

5.根据权利要求1所述的一种外泌体膜蛋白的检测试剂在制备用于结肠癌诊断的产品中的应用，其特征在于：所述待测样本为血清外泌体。

Images