CN116718536A - 一种活性外泌体定量检测方法及试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种活性外泌体定量检测方法及试剂盒，首次实现了外泌体活性和精确定量检测，特异性强，仅需少量样本即可检测。本发明创新性地以外泌体浓度为单位，以精确的微球定量方式，对微球结合的外泌体进行客观定量，并采用特异性抗体CD63和CD81对外泌体进行双靶点识别，不仅避免了原有以蛋白定量间接检测带来的非特性蛋白干扰问题，而且仅需少量样本即可完成检测。此外，本发明所述检测方法能对活性外泌体进行区分，这是目前其他检测方法都无法实现的，对将来外泌体质控及精确剂量掌握具有重要意义。
Description
技术领域
本发明属于外泌体检测技术领域，具体涉及一种外泌体定量检测方法及应用。
背景技术
外泌体是由细胞主动分泌释放到细胞外的腔内囊泡，其蛋白、RNA和脂肪成分特异，且携带了一些重要的信号分子，有望在多种疾病的早期诊断中发挥作用，这使得外泌体检测市场也在快速扩展，并成为热门的研究对象。
目前，外泌体的检测方法主要有如下几种：（1）纳米微粒追踪分析术（NTA）是常用的外泌体研究方法，可追踪液体中单个粒子的运动，通过计数确定其浓度，但是NTA具有非特异性，会检测所有粒径在检测范围内的粒子；（2）Fluorocet与Exocet检(SystemBiosciences)是专用于外泌体的检测方法，基于外泌体所含的乙酰胆碱酯酶，分别检测荧光与吸光度，但两种检测方法均无法排除细胞培养用的血清中的乙酰胆碱酯酶的影响；（3）ExoELISA试剂盒是基于ELISA技术的外泌体定量检测方法，可检测人的外泌体，但由于不同种类的体液与细胞系的蛋白表达不同，往往需要对样品进行多次检测，导致样品量需求很大，且存在不同检测批次间差异；（4）总蛋白检测(Total protein assays)，如Bradford检测方法，可通过检测不同样品间的蛋白总量以比较外泌体含量，但这类检测方法无法区分非外泌体蛋白与外泌体蛋白，Bradford检测只能用于外泌体表面的蛋白定量；（5）Westernblotting可以批量地检测外泌体标记物与内含蛋白，但是对外泌体的最低含量要求较高。
外泌体的意义在于其活性状态将来用于组织修复以及免疫调节，因而外泌体的完整与活性是外泌体检测的重要信息，并且将来要用于临床，外泌体浓度检测也必将是未来掌握剂量尤其是活性成分剂量的重要环节。然而，上述方法当前只能通过蛋白对外泌体进行间接推测定量，不仅缺乏特异性，而且无法对活性外泌体进行区分。此外，外泌体往往含量甚微，蛋白检测需要达到较高水平才能进行准确定量，存在样本大量浪费的弊端。
发明内容
本发明的目的是针对上述外泌体检测方法只能通过蛋白间接推定测量，无法同时满足外泌体检测的特异性、精确定量以及活性监测的弊端，提出一种外泌体检测方法，以实现对活性外泌体的定量检测。同时提供了一种活性外泌体定量检测试剂盒，检测结果特异性强，仅需少量样本即可进行，且操作简便、快捷。
本发明解决其技术问题是采取以下技术方案实现的：
一种活性外泌体定量检测方法，包括以下步骤：
（1）取外泌体样品，加入PBS缓冲液稀释至外泌体样品浓度低于 CD63 微球浓度，得外泌体样品稀释液；将外泌体样品稀释液与CD63微球等体积混合，2-8°C孵育，混匀，得混合液A；
（2）向混合液A中加入CD81-PE抗体和钙黄绿素乙酰氧基甲基酯(Calceinacetoxymethyl ester，Caclein-AM)工作溶液，室温避光孵育，混匀，离心，弃上清，得混合沉淀B；
（3）向混合沉淀B中加入PBS缓冲液，定容至300-400µL，得外泌体检测液；
（4）将外泌体检测液置于流式细胞仪上计数，得到双染微球百分比，按下式计算活性外泌体的浓度：
活性外泌体浓度=双染微球百分比×CD63微球浓度×稀释倍数；
所述双染微球百分比为标记有CD81-PE抗体且被Caclein-AM染色的微球数量占CD63微球总数量的百分比；所述稀释倍数为外泌体样品稀释液体积/外泌体样品体积。
进一步，步骤（1）所述CD63微球为包被有CD63抗体的磁性微球，优选Exosome-Human CD63 Isolation微球。
所述CD63微球的浓度由下述方法获取：
将已知浓度的Flow-Count荧光微球与CD63微球等体积混合，在流式细胞仪上计数，按下式计算：
CD63微球浓度=Flow-Count荧光微球浓度×（微球总计数-Flow-Count荧光微球计数）/Flow-Count荧光微球计数；
所述微球总计数为Flow-Count荧光微球与CD63微球总数。
进一步，步骤（2）所述Calcein-AM工作溶液的制备方法如下：
先将Calcein-AM与二甲基亚砜（DMSO）进行重组，制备成一定浓度的Calcein-AM原液；然后用PBS缓冲液稀释Calcein-AM原液，制备一定稀释浓度的Calcein-AM工作溶液。
进一步，步骤（1）所述孵育时间为18-22小时，以400-500r/min震荡混匀；优选450r/min。
进一步，步骤（2）所述避光孵育时间为10-15min；优选10min。
进一步，步骤（2）所述离心转速为1000-1200r/min，时间5-8min；优选离心转速为1000r/min，时间5min。
本发明还提供根据上述活性外泌体定量检测方法构建的试剂盒，包括Calcein-AM、CD81-PE抗体、包被有CD63抗体的磁性微球、DMSO和PBS缓冲液；所述DMSO为无水溶剂级。
优选地，本发明所述试剂盒，包括5瓶 50µg/瓶的Calcein-AM、50µL CD81-PE抗体和1mL 浓度为2680个/µL的Exosome-HumanCD63 Isolation微球。
上述试剂盒的使用方法如下：
（1）取外泌体样品10µL，加入90µL PBS缓冲液稀释，得外泌体样品稀释液；将100µL外泌体样品稀释液与100µL Exosome-Human CD63 Isolation微球，2-8°C孵育18-22小时，混匀，得混合液A；
（2）向混合液A中加入2µL CD81-PE抗体和1µM Calcein-AM工作溶液，室温避光孵育10-15min，混匀，离心，弃上清，得混合沉淀B；
（3）向混合沉淀B中加入PBS缓冲液，定容至300µL，混匀，得外泌体检测液；
（4）将外泌体检测液置于流式细胞仪上计数，得到双染微球百分比，按下式计算活性外泌体的浓度：
活性外泌体浓度=双染微球百分比×CD63微球浓度×稀释倍数；
所述双染微球百分比为标记有CD81-PE抗体且被Caclein-AM染色的微球数量占CD63微球总数量的百分比；所述CD63微球浓度为2680个/µL，所述稀释倍数为10。
进一步，所述Calcein-AM工作溶液的制备方法如下：
（1）取1瓶冻干的Calcein-AM与50µL DMSO进行重组，制备1 mM的Calcein-AM原液；所述DMSO为无水溶剂级；
（2）用1mL PBS缓冲液稀释1µL 1mM Calcein-AM原液，制备1µM的Calcein-AM工作溶液。
本发明与现有技术相比的有益效果：
本发明首次实现了外泌体活性和精确定量检测，特异性强，仅需少量样本即可检测。
本定量检测方法创新性地以外泌体浓度为单位，以精确的微球定量方式，对微球结合的外泌体进行客观定量，并采用特异性抗体CD63和CD81对外泌体进行双靶点识别，不仅避免了原有以蛋白定量间接检测带来的非特性蛋白干扰问题，更加真实反映待测样本中外泌体的数量差别，而且仅需少量样本即可完成检测，相对于蛋白检测可最大限度节省外泌体用量。
此外，本发明所述定量检测方法能将破损的外泌体残片排除在外，避免非活性外泌体对检测的干扰，这样不仅可以了解外泌体数量，还能对外泌体完整性进行区分，避免非活性外泌体对检测的干扰，完美解决外泌体活性监测问题，这是目前其他检测方法都无法实现的，对将来外泌体质控及精确剂量掌握具有重要意义。
附图说明
图1是人脐带MSC样本外泌体检测双参数点图（图1a）和微球含量分布图（图1b），其中，Q1为仅标记CD81-PE抗体的微球，表示无活性破损外泌体，Q2为标记有CD81-PE抗体且被Calcein-AM染色的微球，表示完整有活性的外泌体，P1表示CD63微球。
图2是人血清样本外泌体检测双参数点图（图1a）和微球含量分布图（图1b），其中，Q1为仅标记CD81-PE抗体的微球，表示无活性破损外泌体，Q2为标记有CD81-PE抗体且被Calcein-AM染色的微球，表示完整有活性的外泌体，P1表示CD63微球。
具体实施方式
以下结合具体实施方式对本发明做进一步详述，以下实施例只是描述性的，不是限定性的，不能以此限定本发明的保护范围。实施例中所用原料或试剂除另有说明外均为市售品，可通过商业渠道购得。
所需原料：
Exosome-Human CD63 Isolation微球（购自Invitrogen公司，浓度：2680个/µL）、Calcein-AM（购自Biolegend公司）、CD81-PE抗体（购自Biolegend公司）、二甲基亚砜(DMSO)(无水溶剂级)、PBS缓冲液。
所需设备：
流式细胞仪、涡旋混合仪。
试剂准备：
（1）取1瓶50µL的冻干的Calcein-AM与50µL无水DMSO进行重组，制备1 mM的Calcein-AM原液；
（2）用1mL PBS缓冲液稀释1µL 1mM Calcein-AM原液，制备1µM的Calcein-AM工作溶液。
实施例1 人脐带MSC样本外泌体含量检测
（1）取人脐带MSC待测外泌体样品10µL加入90µL PBS缓冲液稀释至100µL，得到外泌体样品稀释液；将100µL 外泌体样品稀释液与100µL 的Exosome-Human CD63 Isolation微球混合，2-8°C孵育过夜（18-22h），以450r/min在涡旋混合仪上充分混匀，得混合液A；
（2）向混合液A中加入CD81-PE抗体和Calcein-AM工作溶液，室温避光孵育10min，混匀，以1000r/min离心5min，弃上清，得混合沉淀B；
（3）向混合沉淀B中加入PBS缓冲液，定容至300µL，得外泌体检测液；
（4）将外泌体检测液置于流式细胞仪中，按正常程序打开流式细胞仪(美国BD公司，型号：FACSCanto II)，首先，建立FSC/SSC散点图，调节合适的电压，圈定CD63微球，设门P1；建立横轴为Calcein-AM，纵轴为CD81-PE抗体的双参数点图。然后，利用流式细胞仪分析软件DIVA对数据进行分析，分析后可得到待检测外泌体样本的双染微球百分比，按下式计算活性外泌体的浓度：
活性外泌体浓度=双染微球百分比×CD63微球浓度×稀释倍数。
双参数点图中Q2表示完整有活性的外泌体，Q1表示无活性破损外泌体。如图1a所示，人脐带MSC待测样本中完整有活性的外泌体数量要多于无活性破损外泌体。微球含量分布图中，P1表示CD63微球，Q2表示双染微球（标记有CD81-PE抗体且被Calcein-AM染色的微球）。如图1b所示，双染微球数量占CD63微球总数量的百分比为69.6%，稀释倍数为10，根据上述公式可计算出该待测样本中外泌体含量具体为18650个/µL 。
实施例2 人血清样本外泌体含量检测
（1）取人血清待测外泌体样品10µL加入90µL PBS缓冲液稀释至100µL，得到外泌体样品稀释液；将100µL 外泌体样品稀释液与100µL 的Exosome-Human CD63 Isolation微球混合，2-8°C孵育过夜（18-22h），以450r/min在涡旋混合仪上充分混匀，得混合液A；
（2）向混合液A中加入CD81-PE抗体和Calcein-AM工作溶液，震荡混匀，室温避光孵育10min，以1000r/min离心5min，弃上清，得混合沉淀B；
（3）向混合沉淀B中加入PBS缓冲液，定容至300µL，得外泌体检测液；
（4）将外泌体检测液置于流式细胞仪中，按正常程序打开流式细胞仪(美国BD公司，型号：FACSCanto II)，首先，建立FSC/SSC散点图，调节合适的电压，圈定CD63微球，设门P1；建立横轴为Calcein-AM，纵轴为CD81-PE抗体的双参数点图。然后，利用流式细胞仪分析软件DIVA对数据进行分析，分析后可得到待检测外泌体样本的双染微球百分比，按下式计算活性外泌体的浓度：
活性外泌体浓度=双染微球百分比×CD63微球浓度×稀释倍数。
如图2a所示，人血清待测样本中完整有活性的外泌体数量较少，其中，由图2b可得双染微球数量占CD63微球总数量的百分比为11.4%，稀释倍数为10，根据上述公式可计算出该待测样本中外泌体含量具体为305个/µL 。
进一步的，对于本领域的技术人员，对本发明针对的构思及技术要点进行变形，相应的改变应属于本发明所请求的权利要求。
Claims (10)
1.一种活性外泌体定量检测方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
（1）取外泌体样品，加入PBS缓冲液稀释至外泌体样品浓度低于 CD63 微球浓度，得外泌体样品稀释液；将外泌体样品稀释液与CD63微球等体积混合，2-8°C孵育，混匀，得混合液A；
（2）向混合液A中加入CD81-PE抗体和Caclein-AM工作溶液，室温避光孵育，混匀，离心，弃上清，得混合沉淀B；
（3）向混合沉淀B中加入PBS缓冲液，定容至300-400µL，得外泌体检测液；
（4）将外泌体检测液置于流式细胞仪上计数，得到双染微球百分比，按下式计算活性外泌体的浓度：
活性外泌体浓度=双染微球百分比×CD63微球浓度×稀释倍数；
所述双染微球百分比为标记有CD81-PE抗体且被Caclein-AM染色的微球数量占CD63微球总数量的百分比；所述稀释倍数为外泌体样品稀释液体积/外泌体样品体积。
2.根据权利要求1所述的一种活性外泌体定量检测方法，其特征在于，步骤（1）所述CD63微球为包被有CD63抗体的磁性微球。
3.根据权利要求1所述的一种活性外泌体定量检测方法，其特征在于，步骤（1）所述CD63微球的浓度由下述方法获取：
将已知浓度的Flow-Count荧光微球与CD63微球等体积混合，置于流式细胞仪上计数，按下式计算：
CD63微球浓度=Flow-Count荧光微球浓度×（微球总计数-Flow-Count荧光微球计数）/Flow-Count荧光微球计数。
4.根据权利要求1所述的一种活性外泌体定量检测方法，其特征在于，步骤（2）所述Caclein-AM工作溶液的制备方法如下：
（1）将Caclein-AM与 DMSO重组，制备Caclein-AM原液；
（2）用PBS缓冲液对 Caclein-AM原液进行稀释，制备Caclein-AM工作溶液。
5.根据权利要求1所述的一种活性外泌体定量检测方法，其特征在于，步骤（1）所述孵育时间为18-22小时，以400-500r/min震荡混匀。
6.根据权利要求1所述的一种活性外泌体定量检测方法，其特征在于，步骤（2）所述避光孵育时间为10-15min，所述离心转速为1000-1200r/min，离心时间5-8min。
7.根据权利要求1-6任意一项所述方法构建的定量检测活性外泌体的试剂盒，其特征在于，包括Caclein-AM、CD81-PE抗体、包被有CD63抗体的磁性微球、DMSO和PBS缓冲液。
8.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，包括5瓶 50µg/瓶的Caclein-AM、50µLCD81-PE抗体和1mL 浓度为2680个/µL的Exosome-Human CD63 Isolation微球。
9.权利要求8所述试剂盒的使用方法，其特征在于，所述方法步骤如下：
（1）取外泌体样品10µL，加入90µL PBS缓冲液，得外泌体样品稀释液；将100µL外泌体样品稀释液与100µL Exosome-Human CD63 Isolation微球混合，2-8°C，孵育18-22小时，混匀，得混合溶液A；
（2）向混合溶液A中加入2µL CD81-PE抗体和1µM Caclein-AM工作溶液，室温避光孵育10-15min，混匀，离心，弃上清，得混合沉淀B；
（3）向混合沉淀B中加入PBS缓冲液，定容至300µL，得外泌体检测液；
（4）将外泌体检测液置于流式细胞仪上计数，得到双染微球百分比，按下式计算活性外泌体的浓度：
活性外泌体浓度=双染微球百分比×CD63微球浓度×稀释倍数；
所述双染微球百分比为标记有CD81-PE抗体且被Caclein-AM染色的微球数量占CD63微球总数量的百分比；所述CD63微球浓度为2680个/µL，所述稀释倍数为10。
10.根据权利要求9所述的使用方法，其特征在于，所述Caclein-AM工作溶液的制备方法如下：
（1）取50µg Caclein-AM与50µL DMSO进行重组，制备1 mM的Caclein-AM原液；
（2）用1mL PBS缓冲液稀释1µL 1mM Caclein-AM原液，制备1µM的Caclein-AM工作溶液。
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