CN111157740A - 一种iv型胶原蛋白的检测试剂盒及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种IV型胶原蛋白的检测试剂盒及其制备方法，该技术方案以其特点在于，运用组合型偶联剂，将Ⅳ型胶原蛋白抗体交联于羧基胶乳微球上，形成Ⅳ型胶原蛋白抗体胶乳颗粒，实现抗体与胶乳微球的高效偶联。在37℃恒温，波长为600nm下，测定吸光度，计算出样品IV型胶原蛋白含量。与传统偶联方法相比，本试剂盒抗体利用率高，精密度高，能有效控制批间差，值得进一步推广使用。

Description

一种IV型胶原蛋白的检测试剂盒及其制备方法
技术领域
本发明涉及医学检测及体外诊断领域，具体涉及一种IV型胶原(IVC)的检测试剂盒及其制备方法。
背景技术
IV型胶原蛋白(IVC)属于非原纤维胶原蛋白，是基底膜网状结构的主要成分之一，不但在BMs骨架形成过程中起重要作用，而且还具有参与细胞黏附、迁移、生长、增殖和分化等重要生理过程的功能，因此，IV型胶原蛋白(IVC)的生物学特性与肿瘤、肾病等多种重大疾病密切相关。
作为肝细胞基底膜的核心结构，在肝纤维化形成过程中起主要作用。Ⅳ型胶原蛋白在肝纤维化时有显著变化，在轻度肝损伤合并肝纤维化内胶原总量增加尚不明显时，血清Ⅳ型胶原蛋白含量即可明显增加，其含量的变化能较好的反应肝纤维化、肝细胞损伤及程度。
目前市场上IV型胶原蛋白(IVC)检测技术常用的方法有如下几种：酶联免疫检测法(ELISA)、放射免疫分析法、时间分辨荧光免疫分析方法、胶乳免疫比浊法、化学发光法等。其中酶联免疫检测法(ELISA)需要特定设备，耗时；放射免疫分析技术法需要搭配昂贵的设备，存在放射线辐射和污染等问题；时间分辨荧光免疫分析方法需要用稀有金属进行标记；化学发光法需要特定设备，且仅能一次发光且易受环境干扰。胶乳免疫比浊法属于普通免疫比浊技术的衍生技术，克服了普通免疫比浊技术信号量非常有限的缺点，使抗体体积有了数量级上的增长，大幅提升了可检测性，但该方法也存在技术难点，即抗体与胶乳微球的偶联效率无法保证，易出现偶联不上、偶联速度慢及后期脱落等情况，使得其活性及稳定性不能保证。
大部分的抗体与胶乳微球偶联所使用的偶联剂以碳二亚胺(EDC)为主，合成反应活性、偶联效率、和偶联的稳定性不能得到保证，因此，找到一种抗体与胶乳微球间高效偶联的偶联剂，是本领域亟需解决的技术问题。
发明内容
为解决现有技术存在的问题和不足，本发明的目的是提供一种IV型胶原蛋白的检测试剂盒，该试剂盒中运用组合型偶联剂，将Ⅳ型胶原蛋白抗体交联于羧基胶乳微球上，形成Ⅳ型胶原蛋白抗体胶乳颗粒，实现抗体与胶乳微球的高效偶联。
为实现上述目的，本发明的技术方案是提供一种IV型胶原蛋白的检测试剂盒，包括有试剂R1和试剂R2，所述的试剂1与试剂2的体积比为3:1；
所述的试剂R1包括以下组分：
pH6.0-6.5的醋酸盐缓冲液 50mmol/L
牛血清白蛋白 0.9g/L
叠氮钠 0.01％
所述的试剂R2包括以下组分：
Figure BDA0002343137460000021
所述的Ⅳ型胶原蛋白抗体胶乳颗粒为通过组合型偶联剂，将Ⅳ型胶原蛋白抗体交联于羧基胶乳微球上，形成Ⅳ型胶原蛋白抗体胶乳颗粒；
所述的组合型偶联剂包括有以下组分：
碳二亚胺、O-苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲四氟硼酸和O-苯并三氮唑-四甲基脲六氟磷酸盐三者质量比为1.2﹕1.2﹕1。
另外，本发明还提供一种如权利要求1所述的检测试剂盒的制备方法，其特征在于包括以下步骤：
(1)Ⅳ型胶原蛋白抗体胶乳颗粒的制备，包括以下子步骤
(1.1)用50mmol/L，pH6.0-6.5醋酸盐缓冲液悬浮10％(w/v)且粒径100-200nm羧基胶乳微球，室温搅拌30min混合均匀，10000rpm转速下离心15min，去除上清液后用50mmol/L，pH6.0-6.5醋酸盐缓冲液重悬浮，室温搅拌30min混合均匀，使其质量体积浓度为2％；
(1.2)取上述悬浮微球，边室温搅拌，边加入组合偶联剂；该组合偶联剂的成分为碳二亚胺、O-苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲四氟硼酸和O-苯并三氮唑-四甲基脲六氟磷酸盐；
其对应质量比例为微球溶液﹕碳二亚胺﹕O-苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲四氟硼酸﹕O-苯并三氮唑-四甲基脲六氟磷酸盐＝10﹕1.2﹕1.2﹕1；O-苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲四氟硼酸和O-苯并三氮唑-四甲基脲六氟磷酸盐在加入前分别用1％醋酸溶液37℃超声10min溶解完全；
加入顺序为先加入碳二亚胺室温搅拌20min，再同时加入含O-苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲四氟硼酸的醋酸溶液与含O-苯并三氮唑-四甲基脲六氟磷酸盐的醋酸溶液，室温搅拌30min；
(1.3)用50mmol/L，pH6.0-6.5醋酸盐缓冲液溶解鼠抗人Ⅳ型胶原蛋白单克隆抗体，使其浓度为5mg/ml；
(1.4)边搅拌边快速将上述溶解后的抗体按照体积比抗体﹕胶乳微球＝1﹕5加入到经过处理的胶乳微球中，室温持续搅拌30min后，调pH至6.5，室温孵育3h；
(1.5)孵育完成后在10000rpm转速下离心10min，去除上清液，用50mmol/L、pH6.0-6.5醋酸盐缓冲液洗涤，再次10000rpm转速下离心10min，重复6次，完成最后一次离心，去上清液后用50mmol/L、pH6.0-6.5醋酸盐缓冲液重悬浮，室温搅拌1h混合均匀，使其质量体积浓度为1％；
(1.6)加入3％质量体积浓度的牛血清白蛋白室温持续搅拌30min，静置封闭24h；
(1.7)时间到后，将封闭好的胶乳微球在10000rpm转速下离心10min，去除上清液，用50mmol/L，pH6.0-6.5醋酸盐缓冲液洗涤，再次在10000rpm转速下离心10min，重复2次，用50mmol/L、pH6.0-6.5醋酸盐缓冲液重悬浮，室温搅拌1h混合均匀，得到质量体积浓度为1％的Ⅳ型胶原蛋白抗体胶乳颗粒；
(2)按照试剂R1和试剂R2的组分比例配置双试剂。
采用上述方案，本发明的有益效果在于：利用组合型偶联剂，有效地促进有空间位阻的酰胺键的形成，减少副反应及反应后副产物的产生，显著提高了抗体与胶乳微球间偶联的合成反应活性、偶联效率、和偶联的稳定性，提高了抗体利用率。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，根据这些附图获得其他的附图仍属于本发明的范畴。
附图1为本发明具体实施例3所制得的IV型胶原测定试剂盒与市售试剂盒的线性相关图。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明作进一步地详细描述。
制备实施例：
本发明具体步骤操作如下：
1.用50mmol/L，PH6.0-6.5醋酸盐缓冲液悬浮10％(w/v)羧基胶乳微球(粒径100-200nm)，室温搅拌30min混合均匀，离心(10000rpm，15min)，去除上清液后用50mmol/L，PH6.0-6.5醋酸盐缓冲液重悬浮，室温搅拌30min混合均匀，使其浓度为2％(w/v)。
2.取上述悬浮微球，边室温搅拌，边加入组合偶联剂。组合偶联剂的成分为碳二亚胺(EDC)、O-苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲四氟硼酸(TBTU)和O-苯并三氮唑-四甲基脲六氟磷酸盐(HBTU)，三者比例为1.2﹕1.2﹕1。其对应质量比例为微球溶液﹕EDC﹕TBTU﹕HBTU＝10﹕1.2﹕1.2﹕1。TBTU与HBTU在加入前分别用1％醋酸溶液37℃超声10min溶解完全。加入顺序为先加入EDC室温搅拌20min，再同时加入含TBTU的醋酸溶液与含HBTU的醋酸溶液，室温搅拌30min。
3.用50mmol/L，PH6.0-6.5醋酸盐缓冲液溶解鼠抗人Ⅳ型胶原蛋白单克隆抗体，使其浓度为5mg/ml。
4.边搅拌边快速将上述溶解后的抗体按照抗体﹕胶乳微球＝1﹕5(体积比)加入到经过处理的胶乳微球中，室温持续搅拌30min后，调PH至6.5，室温孵育3h。
5.孵育完成后离心(10000rpm，10min)，去除上清液，用50mmol/L，PH6.0-6.5醋酸盐缓冲液洗涤，再次离心(10000rpm，10min)，重复6次。完成最后一次离心，去上清液后用50mmol/L，PH6.0-6.5醋酸盐缓冲液重悬浮，室温搅拌1h混合均匀，使其浓度为1％(w/v)。
6.加入3％(w/v)BSA室温持续搅拌30min，静置封闭24h。
7.时间到后，将封闭好的胶乳微球离心(10000rpm，10min)，去除上清液，用50mmol/L，PH6.0-6.5醋酸盐缓冲液洗涤，再次离心(10000rpm，10min)，重复2次。用50mmol/L，PH6.0-6.5醋酸盐缓冲液重悬浮，室温搅拌1h混合均匀，得到浓度为1％(w/v)Ⅳ型胶原蛋白抗体胶乳颗粒，2-8℃密封保存。
8.试剂盒的制备：试剂1与试剂2的体积比为3:1。具体成分如下试剂1：
醋酸盐缓冲液(PH6.0-6.5) 50mmol/L
牛血清白蛋白 0.9g/L
叠氮钠 0.01％
试剂2：
Figure BDA0002343137460000051
Figure BDA0002343137460000061
试验例
以下实施例描述的IV型胶原(IVC)测定试剂盒可配套适用于雅培C16000、贝克曼AU(480/5800)全自动生化分析仪等机型上。
待测血清：不溶血血清。
具体检测程序：
Figure BDA0002343137460000062
校准程序：多点定标，采用非线性校准模式。
结果计算：以测定管ΔA，根据校准曲线可求得IVC含量。
实施例1按照上述试剂盒的配制程序对组合型偶联剂的成分比例进行筛选，检测结果见表1，通过低值，高值的实际浓度与理论浓度比较结果表明，五种不同的比例相比较以EDC﹕TBTU﹕HBTU＝1.2﹕1.2﹕1差异较小。
上述EDC系碳二亚胺简称；TBTU系O-苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲四氟硼酸的简称；HBTU系O-苯并三氮唑-四甲基脲六氟磷酸盐简称。
表1组合型偶联剂的成分不同比例检测结果
Figure BDA0002343137460000063
Figure BDA0002343137460000071
实施例2精密度测定：
批内精密度：对同一样品连续抽取20次进行测定，计算测定值的均数、标准差和变异系数，
Figure BDA0002343137460000072
表2中CV值为1.65％，差异较小。
表2批内精密度检测结果
Figure BDA0002343137460000073
Figure BDA0002343137460000081
批间精密度：分别配制3批试剂盒，标记为①、②、③，每个批号对同一样品测试3次，分别计算每批3次检测的均值xT(i＝1,2,3),按以下公式计算相对偏差R。
Figure BDA0002343137460000082
式中：
Figure BDA0002343137460000083
中的最大值；
Figure BDA0002343137460000084
中的最小值；
Figure BDA0002343137460000085
——3批试剂检测均值。
表3批间精密度检测结果
Figure BDA0002343137460000086
本试剂盒3个批号经检测批间差为5.3％，差异较小。
实施例3本发明试剂盒与市售试剂盒的性能指标比较：
对照的市售试剂盒，其信息如下：
产品名称：IV型胶原蛋白测定试剂盒(胶乳增强免疫比浊法)(安徽伊普诺康生物技术股份有限公司)
线性相关：分别采用本发明试剂盒与市售试剂盒，采用AU5800全自动生化分析仪，对50份样本(包含正常和异常样本)，按各自参数进行测定，并对测定值进行相关分析(结果见图1，X轴表示的是本发明试剂盒的测定值，Y轴表示的是市售试剂盒的测定值)。相关系数：r2＝0.9921，线性方程为：y＝0.976x+0.214，结果表明本发明试剂盒与市售试剂盒相关性良好。
表4线性相关检测结果
Figure BDA0002343137460000091
Figure BDA0002343137460000101
以上所揭露的仅为本发明较佳实施例而已，当然不能以此来限定本发明之权利范围，因此依本发明权利要求所作的等同变化，仍属本发明所涵盖的范围。

Claims (2)

1.一种IV型胶原蛋白的检测试剂盒，包括有试剂R1和试剂R2，其特征在于：
所述的试剂1与试剂2的体积比为3:1；
所述的试剂R1包括以下组分：
pH6.0-6.5的醋酸盐缓冲液 50mmol/L
牛血清白蛋白 0.9g/L
叠氮钠 0.01％
所述的试剂R2包括以下组分：
Figure FDA0002343137450000011
所述的Ⅳ型胶原蛋白抗体胶乳颗粒为通过组合型偶联剂，将Ⅳ型胶原蛋白抗体交联于羧基胶乳微球上，形成Ⅳ型胶原蛋白抗体胶乳颗粒；
所述的组合型偶联剂包括有以下组分：
碳二亚胺、O-苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲四氟硼酸和O-苯并三氮唑-四甲基脲六氟磷酸盐三者质量比为1.2﹕1.2﹕1。
2.一种如权利要求1所述的检测试剂盒的制备方法，其特征在于包括以下步骤：
(1)Ⅳ型胶原蛋白抗体胶乳颗粒的制备，包括以下子步骤
(1.1)用50mmol/L，pH6.0-6.5醋酸盐缓冲液悬浮10％(w/v)且粒径100-200nm羧基胶乳微球，室温搅拌30min混合均匀，10000rpm转速下离心15min，去除上清液后用50mmol/L，pH6.0-6.5醋酸盐缓冲液重悬浮，室温搅拌30min混合均匀，使其质量体积浓度为2％；
(1.2)取上述悬浮微球，边室温搅拌，边加入组合偶联剂；该组合偶联剂的成分为碳二亚胺、O-苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲四氟硼酸和O-苯并三氮唑-四甲基脲六氟磷酸盐；
其对应质量比例为微球溶液﹕碳二亚胺﹕O-苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲四氟硼酸﹕O-苯并三氮唑-四甲基脲六氟磷酸盐＝10﹕1.2﹕1.2﹕1；
O-苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲四氟硼酸和O-苯并三氮唑-四甲基脲六氟磷酸盐在加入前分别用1％醋酸溶液37℃超声10min溶解完全；
加入顺序为先加入碳二亚胺室温搅拌20min，再同时加入含O-苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲四氟硼酸的醋酸溶液与含O-苯并三氮唑-四甲基脲六氟磷酸盐的醋酸溶液，室温搅拌30min；
(1.3)用50mmol/L，pH6.0-6.5醋酸盐缓冲液溶解鼠抗人Ⅳ型胶原蛋白单克隆抗体，使其浓度为5mg/ml；
(1.4)边搅拌边快速将上述溶解后的抗体按照体积比抗体﹕胶乳微球＝1﹕5加入到经过处理的胶乳微球中，室温持续搅拌30min后，调pH至6.5，室温孵育3h；
(1.5)孵育完成后在10000rpm转速下离心10min，去除上清液，用50mmol/L、pH6.0-6.5醋酸盐缓冲液洗涤，再次10000rpm转速下离心10min，重复6次，完成最后一次离心，去上清液后用50mmol/L、pH6.0-6.5醋酸盐缓冲液重悬浮，室温搅拌1h混合均匀，使其质量体积浓度为1％；
(1.6)加入3％质量体积浓度的牛血清白蛋白室温持续搅拌30min，静置封闭24h；
(1.7)时间到后，将封闭好的胶乳微球在10000rpm转速下离心10min，去除上清液，用50mmol/L，pH6.0-6.5醋酸盐缓冲液洗涤，再次在10000rpm转速下离心10min，重复2次，用50mmol/L、pH6.0-6.5醋酸盐缓冲液重悬浮，室温搅拌1h混合均匀，得到质量体积浓度为1％的Ⅳ型胶原蛋白抗体胶乳颗粒；
(2)按照试剂R1和试剂R2的组分比例配置双试剂。
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