CN112526134A

CN112526134A - 一种壳多糖酶3样蛋白1测定试剂盒

Info

Publication number: CN112526134A
Application number: CN202011551411.1A
Authority: CN
Inventors: 彭勇; 郝立颖; 刘洁
Original assignee: Beijing Bioassay Technologies Co ltd
Current assignee: Beijing Bioassay Technologies Co ltd
Priority date: 2020-12-24
Filing date: 2020-12-24
Publication date: 2021-03-19

Abstract

本发明公开了一种壳多糖酶3样蛋白1测定试剂盒，涉及生物分析技术领域，包括试剂R1和试剂R2；试剂R1包含：柠檬酸钠50～300mmol/L、氯化钠0.05～0.5mol/L、防腐剂0.02～5％，试剂R2包含：柠檬酸钠50～300mmol/L、牛血清白蛋白0.5～5％、吐温200.2～2％、防腐剂0.02～5％、包被有抗壳多糖酶3样蛋白1抗体胶乳颗粒0.5％～5％。本发明的有益效果是本发明的试剂盒具有灵敏度高、特异性强、操作简便等优点，能够应用于各种全自动生化分析仪进行大批量的测定，适于在临床推广，降低医院检测成本。

Description

一种壳多糖酶3样蛋白1测定试剂盒

技术领域

本发明属生物分析技术领域，具体涉及一种壳多糖酶3样蛋白1(CHI3L1)高效测定试剂盒(胶乳免疫比浊法)。

背景技术

壳多糖酶3样蛋白1(Chitinase-3-like 1，CHI3L1)属于糖基水解酶家族18，多种细胞可以表达分泌CHI3L1，如巨噬细胞、中性粒细胞、软骨细胞、成纤维细胞、肿瘤细胞和呼吸道上皮细胞。CHI3L1能够参与炎症、细胞增殖和分化、保护细胞凋亡、促进血管生成及细胞外基质重构等病理过程。CHl3Ll在肝脏中的表达水平远远高出其他组织，是肝特异性或高度肝富集基因，CHl3L1是一个很好的肝脏纤维化血清学指标，来区分慢性乙型肝炎(CHB)和肝硬化。

目前，临床上诊断肝硬化常用组织病理学检查、血清学诊断以及影像学诊断等方法。但以上检测方法都有低灵敏度和特异性差的缺陷，造成诊断出现很高的假阳性和假阴性。因此，准确且高效地测定CHI3L1，在肝硬化疾病的诊断中起着至关重要的作用。

发明内容

本发明的目的在于至少解决现有技术中存在的技术问题之一，提供一种利用胶乳免疫比浊方法体外定量测定人血清中壳多糖酶3样蛋白1(CHI3L1)含量的试剂盒，以解决现有技术中的检测方法低灵敏度和特异性差的缺陷。

本发明的技术解决方案如下：

一种壳多糖酶3样蛋白1测定试剂盒，包括试剂R1和试剂R2；

所述试剂R1包含：

柠檬酸钠 50～300mmol/L

氯化钠 0.05～0.5mol/L

防腐剂 0.02～5％

所述试剂R2包含：

在本发明的一个具体实施方式中，

所述试剂R1包含：

柠檬酸钠 100mmol/L

氯化钠 0.15mol/L

防腐剂 0.03％

所述试剂R2包含：

在本发明的一个具体实施方式中，所述包被有抗壳多糖酶3样蛋白1抗体胶乳颗粒的制备方法包括：将胶乳微球加入第一反应缓冲液中，混合均匀后加入第二反应缓冲液，在28～37℃下混合，得到胶乳微球溶液；然后往胶乳微球溶液中加入壳多糖酶3样蛋白1抗体，在28～37℃下反应60～120min；继续加入EDC.HCI溶液和NHS溶液，在28～37℃下搅拌60～120min；继续加入封闭液，在28～37℃下搅拌60～120min，然后离心，继续加入储存缓冲液，在28～37℃下搅拌60～120min，使颗粒完全分散，过夜保存，得到包被有抗壳多糖酶3样蛋白1抗体胶乳颗粒。

在本发明的一个具体实施方式中，所述乳胶微球的浓度为1～2％，胶乳微球粒径为150～300nm，羧基密度80～150％。优选地，所述乳胶微球的粒径为250nm。

在本发明的一个具体实施方式中，所述乳胶微球为聚苯乙烯胶乳颗粒。

在本发明的一个具体实施方式中，所述第一反应缓冲液包括MES·H₂O 4.888g/L、NaOH 0.39g/L，pH为6.0-6.5；或/和所述第二反应缓冲液包括硼酸3.0915g/L、四硼酸钠0.8586g/L，pH为7.2-7.3；或/和所述封闭液包括吐温20 2mL/L、BSA 1g/L，pH为7.2-7.3；或/和所述储存缓冲液包括吐温20 2ml/L、BSA 1g/L和proclin300 0.5ml/L，pH为7.2-7.3；或/和所述EDC.HCI溶液的浓度为0.01-0.1g/L；或/和所述NHS的浓度为0.1-0.5g/L。

在本发明的一个具体实施方式中，所述EDC.HCl溶液的浓度为0.05g/L，和/或所述NHS溶液的浓度为0.3g/L，和/或所述乳胶微球的浓度为1.5％。

在本发明的一个具体实施方式中，所述胶乳微球、第一反应缓冲液和第二反应缓冲液的体积比为1:4:16，所述胶乳微球的体积与所述EDC.HCl溶液和NHS溶液的总体积比为1:1。

在本发明的一个具体实施方式中，所述抗壳多糖酶3样蛋白1抗体为鼠源单克隆抗体。

在本发明的一个具体实施方式中，还包括校准品，所述校准品包含50％人血清、25mmol/L三羟甲基氨基甲烷缓冲液、5％保护剂、0.15mol/L氯化钠、0.03％防腐剂以及靶值浓度范围为425～600ng/mL壳多糖酶3样蛋白1。

在本发明的一个具体实施方式中，还包括质控品，所述质控品包含50％人血清、25mmol/L三羟甲基氨基甲烷缓冲液、5％保护剂、0.15mol/L氯化钠、0.03％防腐剂以及壳多糖酶3样蛋白1，壳多糖酶3样蛋白1的水平1目标范围浓度为50～75ng/mL，壳多糖酶3样蛋白1的水平2目标范围浓度为100～300ng/mL。

在本发明的一个具体实施方式中，所述试剂R1和R2按照体积比1～6:1进行免疫凝集反应；免疫凝集反应时浊度的检测波长的主波长500-700nm，更优选地，按照体积比3:1进行免疫凝集反应，免疫凝集反应在37℃进行，免疫凝集反应时浊度的检测波长的主波长为600nm。

检测样本时，本发明提供的试剂中包被有CHI3L1抗体的胶乳颗粒和样品中的CHI3L1抗原相结合，形成不溶性免疫复合物，使反应液产生浑浊。根据浊度吸光度变化，可以计算出被测样品中CHI3L1的含量。

本发明至少具有以下有益效果之一：

本发明所述的试剂盒采用胶乳免疫比浊法测定血清中CHI3L1，使用本发明的试剂盒检测样本时，试剂中包被有CHI3L1抗体的胶乳颗粒和样品中的CHI3L1抗原相结合，形成不溶性免疫复合物，使反应液产生浑浊，根据浊度吸光度变化，可以计算出被测样品中CHI3L1的含量。并且，本发明通过将壳多糖酶3样蛋白1抗体与胶乳微球制备成抗体胶乳颗粒，有利于抗体与抗原更加充分反应，从而能够显著提高所制备复合物的灵敏度、敏感性、抗干扰性以及稳定性。与现有技术相比，采用本发明试剂盒进行检测具有灵敏度高、特异性强、操作简便等优点，能够应用于各种全自动生化分析仪进行大批量的测定，适于在临床推广，降低医院检测成本。

附图说明

图1为实施例中在37℃条件下的定标曲线。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。需要注意的是，本领域专业人员在没有进行创造性劳动的前提下做出的基于本发明的其他实施例，都属于本发明的权利保护范围。

下述实施例中所用的材料和试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1试剂盒的制备

表1试剂盒

1、R1、R2的配制

(1)按照表1配制试剂R1。

(2)试剂R2的配制按照以下方法进行配制：

步骤1、将250μl粒径150～300nm的胶乳微球加入1mL的第一反应缓冲液中，混合均匀后加入4mL的第二反应缓冲液，在28℃下混合，得到胶乳微球溶液；本实施例中，第一反应缓冲液和第二反应缓冲液的具体配制方法如下：

第一反应缓冲液：pH 6.0-6.5

MES·H2O 4.888g/L

NaOH 0.39g/L

第二反应缓冲液：pH 7.2-7.3

硼酸 3.0915g/L

四硼酸钠 0.8586g/L。

步骤2、往步骤1中的反应体系加入250μl浓度为10mg/ml的CHI3L1单克隆抗体；

CHI3L1单克隆抗体可以为市售抗体或者通过骨髓瘤细胞杂交获得。本实施例中采用骨髓瘤细胞杂交获得的鼠源单克隆抗体。

步骤3、在28℃条件下，搅拌90min。

步骤4、吸附抗体后，向步骤3的反应体系依次加入125μL 0.05g/L EDC.HCl溶液和125μL 0.3g/LNHS溶液，NHS溶液现用现配。

步骤5、向步骤4的反应体系加入5ml封闭液，其中，封闭液包括浓度为2mL/L的吐温20和浓度为1g/L的BSA，封闭液的pH 7.2-7.3；在28℃下搅拌90min，1500g×30分钟离心去除封闭液后；

步骤6、向步骤5的反应体系加入5ml储存缓冲液重新分散；储存缓冲液包括浓度为2mL/L的吐温20、浓度为1g/L的BSA和浓度为0.5mL/L的proclin300，储存缓冲液pH为7.2-7.3；28℃下搅拌90min，超声处理使颗粒完全分散；

步骤7、为稳定抗体在颗粒上的构象，37℃保存过夜，即得包被有抗壳多糖酶3样蛋白1抗体胶乳颗粒；

步骤8、然后加入100mmol/L柠檬酸钠、1％牛血清白蛋白、1％吐温20和0.03％防腐剂，得到试剂R2。

2、校准品、质控品的制备

将CHI3L1抗原用校准品(500U/mL)稀释液配制成一系列校准品，浓度分别为0U/mL，62.5U/mL，125U/mL，250U/mL，500U/mL。

质控品使用前用1.00mL的纯化水复溶，置10℃～30℃30分钟，使冻干物完全溶解后，轻轻混合即可作为质控品溶液使用。

3、定标曲线的建立

将5个CHI3L1校准品，浓度从0到500U/mL，分别与配制的CHI3L1胶乳单试剂在反应杯中反应，用生化分析仪进行检测，记录反应度。检测波长为600nm，采用终点法检测，图1是按实施例1得到的胶乳试剂建立的定标曲线。

实施例2试剂盒的检测方法

1、试剂准备

液体双试剂开瓶即用。试剂开瓶在2～8℃条件下避光储存，可稳定30天。校准品、质控品使用前需用1.00mL的纯化水复溶，置10～30℃30分钟，使冻干物完全溶解后，轻轻混合即可作为原校准品溶液和质控品溶液使用。用纯化水将原校准品溶液按下表稀释(体积比)，稀释成五个浓度梯度，稀释方法如下：

表2原校准品稀释配比

序号	1	2	3	4	5
						纯化水：原液	1:0	7:1	3:1	1:1	0:1

2、参数设置

检验方法：终点法检测温度：37℃

检测波长：600nm 比色杯光径：1cm

以水作为空白对照

3、检测步骤

4、校准程序

采用多点定标校正。

5、质控程序

每天对样本进行检测之前，须进行质量控制，以保障测试系统的稳定性。

6、计算

对实施例2的试剂盒进行各项指标的检测。

一、空白限

空白限：试剂盒的空白限≤9ng/mL。

二、线性范围

本试剂盒线性范围为10～500ng/mL。

在10～500ng/mL区间内，线性相关系数r≥0.990；

在10～100ng/mL区间内，线性绝对偏差不超过±15ng/mL；

在100～500ng/mL区间内，线性相对偏差不超过±15％。

三、精密度

测试高、低两浓度样本，其结果的变异系数CV≤10％。

随机抽取三批试剂盒，测试同一份样本，批间相对极差(R)≤15％。

校准品、质控品瓶间变异系数CV≤10％。

四、干扰能力的评价

胆红素≤20mg/dL、血红蛋白≤2g/L、甘油三酯≤270mg/dL、抗坏血酸≤20mg/dL、脂肪乳≤750mg/dL、类风湿因子≤500IU/mL。

五、质控品赋值有效性

质控品检测结果应在其质控范围内。

实施例3对实施例1的试剂盒进行线性范围等指标的检测

1.线性范围

配制标准样品，每个浓度的样本用实施例1中的试剂盒测定3次取平均值。对测定值进行相关分析，如图1所示，R＝0.9999且P＜0.05。本实验验证的CHI3L1分析测量范围为0～500.50U/mL，结果见表3。

表3检测结果

2.精密度

用实施例1中制备的试剂测定批内精密度和日间精密度。选择低值(63.04)和高值(199.25)两个水平的质控血清作为评价样本，批内精密度：在较短的时间内及稳定的条件下连续重复测定20次，记录每次的测定结果并计算均值(Mean)、标准差(SD)、变异系数(CV)；日间精密度：每天测定1次评价样本，累积20次结果，计算均值(Mean)、标准差(SD)、变异系数(CV)，见表4。

表4检测结果

由表4可以得出，试剂盒的批内CV最高为2.58％，日间CV最高为2.58％，符合试剂≤4％的技术要求。

3.准确度

通过加入被测定组分的纯物质进行回收试验来确定准确度，见表5。

表5准确度

4.试剂开瓶稳定性

将高、低值的两份无溶血、黄疸、脂血的新鲜血清标本分别分装30份，于-80℃冷冻保存备用，检测前从冰箱取出恢复至室温混匀。在全自动生化仪(东芝40)相应的试剂仓内装载R1与R2试剂，在仪器试剂仓允许温度范围内开盖放置，当天做完校准后不再更换试剂和校准，每天测定质控合格后测定高、低值血清标本各1份，分别重复3次，计算均值及相对偏差。以相对偏差＜±10％作为该试剂稳定性的判断限，结果见表6。

表6试剂盒开瓶稳定性检测结果

由表6可以得出，试剂的稳定性良好。

5.分析干扰能力的评价

依据CLSI EP7-A2指南的建议，采用添加外源性干扰物的方式来进行CHI3L1抗干扰性能评估。选择CHI3L1浓度分别为高低值的两份无溶血、黄疸、脂血的新鲜血清标本，取干扰物(胆红素、血红蛋白、甘油三酯、抗坏血酸、脂肪乳和类风湿因子)和生理盐水分别与高值血清标本按1：9比例混合为标本A、标本B，A与B按3：0、2：1、1：2、0：3比例混合为4份待测标本，每份标本重复测三次。用同样方法做低值血清的干扰实验。将每份标本各组的均值减去未加干扰物相应组的均值即可得出干扰值，并计数出干扰率，以相对偏差＜10％作为该检测方法对干扰物的判断限，在范围内判断为无明显干扰，否则为有明显干扰。干扰率(％)＝干扰值/基础值×100％，结果见表7～12。

表7胆红素干扰试验结果

表8血红蛋白干扰试验结果

表9甘油三酯干扰试验结果

表10抗坏血酸干扰试验结果

表11脂肪乳干扰试验结果

表12类风湿因子干扰试验结果

由表7～12可以得出，试剂盒在检测含有以下浓度干扰物的样本时，胆红素≤20mg/dL、血红蛋白≤2g/L、甘油三酯≤270mg/dL、抗坏血酸≤20mg/dL、脂肪乳剂≤750mg/dL、类风湿因子≤500IU/mL，对检测结果无影响。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims

1.一种壳多糖酶3样蛋白1测定试剂盒，其特征在于，包括试剂R1和试剂R2；

所述试剂R1包含：

柠檬酸钠 50～300mmol/L

氯化钠 0.05～0.5mol/L

防腐剂 0.02～5％

所述试剂R2包含：

2.根据权利要求1所述的一种壳多糖酶3样蛋白1测定试剂盒，其特征在于，

所述试剂R1包含：

柠檬酸钠 100mmol/L

氯化钠 0.15mol/L

防腐剂 0.03％

所述试剂R2包含：

3.根据权利要求1或2所述的一种壳多糖酶3样蛋白1测定试剂盒，其特征在于，所述包被有抗壳多糖酶3样蛋白1抗体胶乳颗粒的制备方法包括：将胶乳微球加入第一反应缓冲液中，混合均匀后加入第二反应缓冲液，在28～37℃下混合，得到胶乳微球溶液；然后往胶乳微球溶液中加入壳多糖酶3样蛋白1抗体，在28～37℃下反应；继续加入EDC.HCI溶液和NHS溶液，在28～37℃下搅拌；继续加入封闭液，在28～37℃下搅拌分散，然后离心，继续加入储存缓冲液，在28～37℃下搅拌使颗粒完全分散，过夜保存，得到包被有抗壳多糖酶3样蛋白1抗体胶乳颗粒。

4.根据权利要求3所述的一种壳多糖酶3样蛋白1测定试剂盒，其特征在于，所述乳胶微球的浓度为1～2％，胶乳微球粒径为150～300nm，羧基密度为80～150％。

5.根据权利要求3所述的一种壳多糖酶3样蛋白1测定试剂盒，其特征在于，所述第一反应缓冲液包括MES·H₂O 4.888g/L、NaOH 0.39g/L，pH为6.0-6.5；或/和所述第二反应缓冲液包括硼酸3.0915g/L、四硼酸钠0.8586g/L，pH为7.2-7.3；或/和所述封闭液包括吐温202mL/L、BSA 1g/L，pH为7.2-7.3；或/和所述储存缓冲液包括吐温20 2ml/L、BSA 1g/L和proclin300 0.5ml/L，pH为7.2-7.3；或/和所述EDC.HCI溶液的浓度为0.01-0.1g/L；或/和所述NHS的浓度为0.1-0.5g/L。

6.根据权利要求3所述的一种壳多糖酶3样蛋白1测定试剂盒，其特征在于，所述胶乳微球、第一反应缓冲液和第二反应缓冲液的体积比为1:4:16，所述胶乳微球的体积与所述EDC.HCl溶液和NHS溶液的总体积比为1:1。

7.根据权利要求1或2所述的一种壳多糖酶3样蛋白1测定试剂盒，其特征在于，所述抗壳多糖酶3样蛋白1抗体为鼠源单克隆抗体。

8.根据权利要求1或2所述的一种壳多糖酶3样蛋白1测定试剂盒，其特征在于，还包括校准品，所述校准品包含50％人血清、25mmol/L三羟甲基氨基甲烷缓冲液、5％保护剂、0.15mol/L氯化钠、0.03％防腐剂以及靶值浓度范围为425～600ng/mL壳多糖酶3样蛋白1。

9.根据权利要求1或2所述的一种壳多糖酶3样蛋白1测定试剂盒，其特征在于，还包括质控品，所述质控品包含50％人血清、25mmol/L三羟甲基氨基甲烷缓冲液、5％保护剂、0.15mol/L氯化钠、0.03％防腐剂以及壳多糖酶3样蛋白1，壳多糖酶3样蛋白1的水平1目标范围浓度为50～75ng/mL，壳多糖酶3样蛋白1的水平2目标范围浓度为100～300ng/mL。

10.根据权利要求1或2所述的一种壳多糖酶3样蛋白1测定试剂盒，其特征在于，所述试剂R1和R2按照体积比1～6:1进行免疫凝集反应。