CN111197040A

CN111197040A - 壳多糖酶3样蛋白1（chi3l1）抗原表位肽、抗原、抗体、用途及试剂盒

Info

Publication number: CN111197040A
Application number: CN202010072196.0A
Authority: CN
Inventors: 朱建安; 黄仁杰
Original assignee: Fujian Yitong Biotechnology Co Ltd
Current assignee: Fujian Yitong Biotechnology Co Ltd
Priority date: 2020-01-21
Filing date: 2020-01-21
Publication date: 2020-05-26
Anticipated expiration: 2040-01-21
Also published as: CN111197040B

Abstract

本发明涉及壳多糖酶3样蛋白1（CHI3L1）抗原表位肽、抗原、抗体、用途及试剂盒；本发明的CHI3L1抗原表位肽的氨基酸序列，所述CHI3L1抗原表位肽的氨基酸链片段为如下Tyr‑Arg‑Lys‑Ser‑Val‑Pro‑Pro‑Phe‑Leu‑Arg‑Thr和Tyr‑Arg‑Ser‑Ala‑Ala‑Leu‑Ser‑Ala‑Gly‑Lys‑Val‑Thr‑Ile‑Asp两者之一；本发明的CHI3L1抗原由CHI3L1抗原表位肽与蛋白载体偶联制得；本发明的CHI3L1单克隆抗体或多克隆抗体由本发明的CHI3L1抗原制得；本发明的CHI3L1单克隆抗体或多克隆抗体用于制备CHI3L1体外诊断试剂盒；本发明的CHI3L1抗原表位肽具有良好的抗原性，用其制备的抗原（免疫原）免疫动物能够产生高度特异性的单克隆抗体和多克隆抗体，从而可应用于人CHI3L1的体外检测。

Description

壳多糖酶3样蛋白1(CHI3L1)抗原表位肽、抗原、抗体、用途及试剂盒

技术领域

本发明属于多肽化学和免疫学领域，具体涉及壳多糖酶3样蛋白1(CHI3L1) 抗原表位肽、用该抗原表位肽制备的CHI3L1特异性抗原和相应的单克隆抗体或多克隆抗体、所述抗体在制备人CHI3L1体外诊断试剂盒上的用途，以及CHI3L1体外诊断试剂盒。

背景技术

壳多糖酶3样蛋白1(chitinase-3-like protein 1，CHI3L1)，即YKL-40 蛋白，是壳质酶蛋白家族的一种糖蛋白，约40kDa大小。CHI3L1最早是在非泌乳期牛的乳汁分泌物中发现的，可由多种细胞分泌，主要包括：①关节炎患者的软骨细胞和成纤维样滑膜细胞。②活化的巨噬细胞和分化晚期的巨噬细胞。③中性粒细胞。④其他，人骨肉瘤细胞(MG-63)、分化型血管平滑肌细胞、乳腺上皮细胞、巨噬细胞的亚群、不同炎症组织的平滑肌细胞等多种细胞也可检测到CHI3L1表达。

CHI3L1蛋白是由CHI3L1基因编码，CHI3L1 mRNA在软骨细胞和肝脏中表达强烈，在脑、肾、心脏等表达较弱或不表达。

目前的研究资料表明，CHI3L1的生物学功能主要包括：①促进结缔组织细胞生长，在软骨细胞和成骨细胞的增殖、分化方面发挥着重要作用。② 调节血管内皮细胞形态，在新生血管形成中发挥重要作用。③调节基质重构。 ④可以帮助细胞去适应生长环境的变化以及缺氧等病理损伤的修复，促进细胞的增殖和生存使细胞免受凋亡。⑤可以启动结缔组织细胞中的信号级联反应，导致细胞增殖，促进组织纤维化。

血清CHI3L1浓度在慢性肝病患者增加，大多数有酒精性肝硬化或肝炎后肝硬化患者的血清CHI3L1升高，非肝硬化纤维化患者的血清CHI3L1含量范围由正常开始范围逐渐增加。血清CHI3L1与纤维化程度密切相关，由病理患者的中度至重度纤维化最高水平来确定。轻微纤维化患者血清CHI3L1升高到较小程度，但这种升高是仍然显著大于无纤维化患者。故 CHI3L1水平可反映肝纤维化程度，能够作为肝纤维化的诊断性标志物。

检测血清中的CHI3L1水平的最理想的方法为免疫检测。因此，寻找合适的具有免疫原性的CHI3L1抗原表位肽、制备特异性的CHI3L1抗原及抗体即成为了重点。

发明内容

为解决上述现有技术中所存在的问题，本发明提供了一种CHI3L1抗原表位肽，用该抗原表位肽制备的CHI3L1特异性抗原和相应的单克隆抗体或多克隆抗体，其在制备CHI3L1试剂盒上的用途，以及CHI3L1体外诊断试剂盒。

具体而言，本发明提供了：

一种CHI3L1抗原表位肽，所述CHI3L1抗原表位肽的氨基酸链片段为如下两者之一：

(1)Tyr-Arg-Lys-Ser-Val-Pro-Pro-Phe-Leu-Arg-Thr；

(2)Tyr-Arg-Ser-Ala-Ala-Leu-Ser-Ala-Gly-Lys-Val-Thr-Ile-Asp。

本发明还提供了一种CHI3L1抗原，通过使用CHI3L1抗原表位肽(1) 与载体蛋白偶联制备而成，或通过使用CHI3L1抗原表位肽(2)与载体蛋白偶联制备而成。

本发明还提供了一种CHI3L1抗体，由所述的CHI3L1抗原制备而成的单克隆抗体或多克隆抗体。

本发明还提供了根据所述的CHI3L1抗体在制备CHI3L1体外诊断试剂盒上的用途。

本发明还提供了一种CHI3L1体外诊断试剂盒，包含所述的CHI3L1抗体作为包被抗体。

优选的，一种CHI3L1体外诊断试剂盒还包含结合抗体，所述结合抗体为所述的CHI3L1抗体，并且当所述结合抗体来源于CHI3L1抗原表位肽(1) 或(2)中的一者时，所述包被抗体来源于CHI3L1抗原表位肽(1)或(2)中的另一者。

优选的，所述试剂盒还包含酶标记的第二抗体。

优选的，所述包被抗体为单克隆抗体。

优选的，所述结合抗体为多克隆抗体。

本发明与现有技术相比具有以下优点和积极效果：

1.本发明的CHI3L1抗原表位肽具有良好的抗原性，用其制备的抗原 (免疫原)免疫动物能够产生高度特异性的单克隆抗体和多克隆抗体。

2.用本发明制备的CHI3L1单克隆抗体和多克隆抗体能够高度特异地与血液样本中的CHI3L1结合。

3.本发明的CHI3L1体外诊断试剂盒可以有效地检测血液中的壳多糖酶3样蛋白1(CHI3L1)的水平，可用来判断肝纤维化程度。

具体实施方式

以下通过具体实施方式的描述对本发明作进一步说明，但这并非是对本发明的限制，本领域技术人员根据本发明的基本思想，可以做出各种修改或改进，但是只要不脱离本发明的基本思想，均在本发明的范围之内。

一、CHI3L1抗原表位肽

本发明中所述的CHI3L1蛋白是本领域已知的，其氨基酸序列是本领域已知的，可以在NCBI等专业数据库中查到。

本发明中CHI3L1蛋白的氨基酸序列分别如序列表SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示，为：

SEQ ID No.1：Y-R-K-S-V-P-P-F-L-R-T；

SEQ ID No.2：Y-R-S-A-A-L-S-A-G-K-V-T-I-D；

本发明的发明人经过大量的理论研究和实验摸索，最终从中筛选得到两种具有良好的抗原性的CHI3L1抗原表位肽(1)和(2)，CHI3L1抗原表位肽(1) 和(2)，其氨基酸链片段如下所示：

(1)Tyr-Arg-Lys-Ser-Val-Pro-Pro-Phe-Leu-Arg-Thr；

(2)Tyr-Arg-Ser-Ala-Ala-Leu-Ser-Ala-Gly-Lys-Val-Thr-Ile-Asp；

其中，CHI3L1抗原表位肽(1)是CHI3L1蛋白N端第121至129位的一段含9个氨基酸的肽段加Y、R两个亲水氨基酸而成；CHI3L1抗原表位肽(2) 是CHI3L1蛋白N端第175至186位的一段含12个氨基酸的肽段加Y、R两个亲水氨基酸而成；上述两个肽段均具有亲水性、抗原性强并且易于合成的特点。

目前，本发明研究发现，本发明的CHI3L1抗原表位肽具有如下功能：

1.具有抗原性；2.与载体蛋白连接后作为免疫原刺激动物产生特异性的抗体；3.用抗原表位肽制备的抗体可特异性地与CHI3L1结合。

本发明的CHI3L1抗原表位肽的制备方法可用化学合成法：利用美国 ABI431A型多肽自动合成仪，通过固相法合成抗原表位肽。本发明的抗原表位肽(1)和(2)的分子量分别为1363.61、1451.62，建议给出计算公式可用质谱进行确定，并通过多肽序列测定鉴定所合成的抗原表位肽序列。肽段的纯度用薄层色谱和高效液相色谱进行评定，并测定抗原表位肽的浓度。

二、CHI3L1抗原

本发明还提供了一种CHI3L1抗原，通过使用CHI3L1抗原表位肽(1) 与载体蛋白偶联制备而成，或通过使用CHI3L1抗原表位肽(2)与载体蛋白偶联制备而成；

具体而言，本发明提供了CHI3L1抗原(1)和(2)；所述CHI3L1抗原(1) 通过使本发明的CHI3L1抗原表位肽(1)与载体蛋白偶联制备而成；所述 CHI3L1抗原(2)通过使本发明的CHI3L1抗原表位肽(2)与载体蛋白偶联制备而成；本发明的CHI3L1抗原(1)和CHI3L1抗原(2)具有免疫原性和特异性，是一种免疫原，可用来免疫动物从而制备特异性的CHI3L1抗体；在本发明中，可用的载体蛋白的例子包括KLH(钥孔血蓝蛋白)、牛血清白蛋白(BSA)、卵清蛋白OVA等；由于KLH(钥孔血蓝蛋白)免疫原性强，结合位点多，免疫效果较好，并且与免疫动物亲缘关系较远，用其作为载体蛋白不易引起交叉反应，因此是优选的。

三、CHI3L1单克隆抗体、CHI3L1多克隆抗体和CHI3L1体外诊断试剂盒

本发明还提供了CHI3L1单克隆抗体和CHI3L1多克隆抗体，由所述的 CHI3L1抗原(1)或CHI3L1抗原(2)(免疫原)制备而成的单克隆抗体或多克隆抗体；制备方法可采用本领域的常规技术，具体可参见实施例2。

本发明的CHI3L1抗体可以用于制备CHI3L1体外诊断试剂盒，该试剂盒可以基于免疫方法对人体组织、细胞或体液中的CHI3L1进行检测，优选对血液标本中的CHI3L1进行检测。

因此，本发明提供了一种CHI3L1体外诊断试剂盒，其包含所述的 CHI3L1单克隆抗体或多克隆抗体。

目前已知可用于临床检验的免疫实验方法主要包括以下几种：ELISA 法、化学发光法、荧光层析法、胶体金免疫测定法等。

而ELISA法包括以下几种类型：双抗体夹心法检测抗原、双抗原夹心法检测抗体、间接法测抗体、竞争法测抗体、竞争法测抗原、捕获包被法测抗体等。

本发明的CHI3L1体外诊断试剂盒优选采用ELISA双抗体夹心法来检测CHI3L1蛋白。该试剂盒可以包含包被抗体、结合抗体、酶标记的第二抗体和/或必要的工具和试剂等。

优选的是，所述CHI3L1体外诊断试剂盒采用本发明的CHI3L1单克隆抗体作为包被抗体。在此，术语“包被抗体”是指包被于固相的酶标板上的抗体；此外，所述CHI3L1体外诊断试剂盒还优选包含CHI3L1多克隆抗体以作为结合抗体，其中，当所述结合抗体来源于本发明的CHI3L1抗原表位肽(1)和(2)中的一者时，所述包被抗体来源于所述抗原表位肽(1)和(2)中的另一者；在此，术语“结合抗体”是指试剂盒中可与待测抗原及酶标记第二抗体结合的特异性抗体；所述试剂盒还可以包含酶标记的第二抗体，该第二抗体可以为羊抗兔IgG抗体，所述酶标记可以为辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶等。

在本发明的试剂盒中，还可以包含检测所需的任何试剂或工具，例如预包被板、洗涤液、显色剂、终止液等。

用本发明的CHI3L1体外诊断试剂盒进行临床研究，对65例不同类别的血清标本进行检测；结果23例健康对照组的血清CHI3L1蛋白浓度为 35.1±7.2pg/ml；42例肝病患者中，其中肝纤维化患者15例，血清CHI3L1 浓度为89.4±15.3ng/ml；肝硬化患者浓度为130.4±20.6ng/ml，肝癌患者浓度为282±27.5ng/ml；分析可知，肝病患者和健康对照组相比，血清CHI3L1 浓度有显著差异；而肝纤维化、肝硬化、肝癌患者之间血清CHI3L1浓度也有明显差异。说明血清CHI3L1水平可用于肝病诊断，并和肝病严重程度呈正相关。

以下通过各实施例进一步解释或说明本发明的内容：

除非另有说明，以下所述溶液均为水溶液，溶液中的百分数均为体积百分数。

实施例1：CHI3L1抗原表位肽(1)和(2)的制备。

制备方法用化学合成法：利用美国ABI431A型多肽自动合成仪，通过固相法分别合成CHI3L1抗原表位肽(1)和(2)。抗原表位肽的纯度用高效液相色谱进行评定，并测定肽段的浓度。本发明的抗原表位肽(1)和(2)的分子量分别为1363.61、1451.62，利用质谱进行确定，通过多肽序列测定鉴定所合成的多肽序列。

一、CHI3L1抗原表位肽(1)和(2)的合成

上述肽段采用固相法合成。固相肽合成的主要思想是：先将所要合成肽链的羧基末端氨基酸的羧基以共价键形式同一个不溶性的高分子化合物(树脂)相连接，然后以此结合在固相载体上的氨基酸作为氨基组份，经过脱去氨基保护基并同过量的活化羧基组份反应，接长肽链。这样的步骤可以反复地多次进行下去，最后达到所需要合成的肽链的长度。这个合成过程如下所示。

(1)

(2)

(3)

(4)

本发明的CHI3L1抗原表位肽(1)和(2)的各自的具体制备步骤如下：

1.所用原料：

HMP resin(P-羟甲基苯氧甲基多聚乙烯树脂，购自sigma公司)

Fmoc-AA(9-芴基甲氧羰酰基保护的氨基酸，购自Merck公司)

NMP(氮甲基吡咯烷酮，购自sigma公司)

DCM(二氯甲烷，购自中原化工公司)

MeoH(甲醇，购自中原化工公司)

Piperidine(哌啶，购自sigma公司)

DMAP(二甲基氨基吡啶，购自sigma公司)

HOBT(羟基苯并三唑，购自sigma公司)

DCC(二环已基碳二亚胺，购自sigma公司)

TFA(三氟乙酸，购自sigma公司)

EDT(1，2-乙二硫醇，购自sigma公司)

硫代苯甲醚，购自广州伟伯化工有限公司

结晶苯酚，购自国药集团化学试剂有限公司

乙腈，购自国药集团化学试剂有限公司

2.使用仪器：

多肽自动合成仪，型号431A，购自ABI公司

旋转蒸发仪，型号R－201，购自上海申顺公司

高效液相色谱仪，Waters 600，购自美国Waters公司

冷冻干燥机，型号VFD-2000，购自北京博医康公司

3.合成方法和过程：

称取HMP树脂100mg，取代当量是1.0meq，即将0.1mmol置于美国 ABI431A型多肽自动合成仪的反应腔内，由合成仪自动将特定的氨基酸按不同的顺序连接起来。反应如下：

(1)氨基酸的活化(HOBt/DCC法)

(2)连接氨基酸到树脂上

(3)脱去氨基酸的Fmoc保护基

(4)另一氨基酸的活化(HOBt/DCC法)

(5)偶联

(6)重复步骤(3)至(5)直至合成结束

分别得到CHI3L1肽段(1)的肽树脂152.9mg和CHI3L1肽段(2)的肽树脂 143.71mg。

(7)裂解肽树脂

用TFA(三氟乙酸)切割肽链，用EDT(2.5体积％)、硫代苯甲醚(2.5 体积％)作清除剂，在室温下反应3.0小时，除去切割试剂，再用乙醚萃取，分别得到CHI3L1肽段(1)和(2)的粗品。

二、CHI3L1抗原表位肽(1)和(2)粗品的纯化：

采用高效液相色谱分离纯化：

条件：色谱柱：C8 10×100mm，购自美国Waters公司

色谱仪：Waters 600，美国Waters公司

流动相：A：0.1％TFA(三氟乙酸)水溶液

B：0.1％TFA(三氟乙酸)于60％乙腈

检测波长：214nm

流速：4ml/分钟

洗脱梯度：20-60％B，30分钟

HPLC(高效液相色谱)分析

色谱柱：C18 4.6×150mm，购自美国Waters公司

流动相：A：0.1％TFA(三氟乙酸)水溶液

B：0.1％TFA(三氟乙酸)于乙腈

检测波长：214nm

流速：1ml/分钟

洗脱梯度：0-60％B，30分钟

肽段分析结果显示本发明的CHI3L1抗原表位肽(1)和(2)的纯度均为 95％以上。

三、CHI3L1抗原表位肽(1)和(2)的鉴定

1.利用质谱分别测定纯化所得的CHI3L1抗原表位肽(1)和(2)的分子量：

(1)试剂原料

TFA(三氟乙酸，购自sigma公司)

HCCA(α-氰基-4-羟基肉桂酸，购自sigma公司)

乙腈(购自国药集团化学试剂有限公司)

(2)仪器

基质辅助激光解析电离飞行时间质谱仪MALDI-TOF-MS(型号： REFLEX III，德国Bruker公司)；

(3)基质液：将α-CCA溶于含0.1％TFA的50％ACN溶液中，制成饱和溶液，离心，取上清；

(4)仪器检测条件：反射检测方式；飞行管长3m；氮激光器：波长 337nm，加速电压20KV；反射电压23KV；

(5)操作步骤：分别取1μL上述纯化多肽(1)和(2)的样品，各自与1μL 的饱和基质上清液混合等体积混合，分别取1μL点在样品靶上，送入离子源中进行检测；

结果，测得所得CHI3L1抗原表位肽(1)的分子量1361.52，CHI3L1抗原表位肽(2)的分子量为1452.13，与理论分子量1476.76、1451.62一致，证明合成多肽即为目的产物。

2.通过多肽序列测定分别鉴定所得CHI3L1抗原表位肽(1)和(2)的序列。

(1)原理：多肽氨基酸序列分析的基本原理是Edman降解，是一个循环式的化学反应过程，包括三个主要的化学步骤：

偶联：异硫氰酸苯脂与蛋白质和多肽的N-端残基反应，形成苯氨基硫甲酰(PTC)衍生物，即PTC-肽；

环化裂解：PTC-肽环化裂解；

转化：噻唑呤酮苯氨(ATZ)转化为苯异硫尿氨基酸(PTH-氨基酸)，留在溶液中的减少了一个氨基酸残基的肽再重复进行上述反应过程，整个测序过程现在都是通过测序仪自动进行。

(2)仪器：美国ABI公司491型蛋白质/多肽N-末端氨基酸序列分析仪

(3)试剂原料：

异硫氰酸苯酯PITC，购自sigma公司

正庚烷，购自国药集团化学试剂有限公司

三甲胺TMA水溶液，购自国药集团化学试剂有限公司

TFA(三氟乙酸，购自sigma公司)

乙酸乙酯，购自国药集团化学试剂有限公司

氯丁烷，购自sigma公司

乙腈，购自国药集团化学试剂有限公司

(4)测定：

按仪器说明书进行。

结果，经鉴定，所得CHI3L1抗原表位肽(1)和(2)的序列分别为：

(1)Y-R-K-S-V-P-P-F-L-R-T；

(2)Y-R-S-A-A-L-S-A-G-K-V-T-I-D。

该结果与目标合成肽段一致。

实施例2：分别将实施例1所得的CHI3L1抗原表位肽(1)和(2)与载体蛋白连接以制备CHI3L1抗原(1)和(2)，利用所得抗原(1)和(2)分别免疫动物，从而利用抗原(1)制备特异性的单克隆抗体和多克隆抗体，并且利用抗原(2) 制备特异性的单克隆抗体和多克隆抗体；

1.抗原的制备：用BDB(Bis-diazotizedbenzidine dichloride)法将CHI3L1 肽段(1)和(2)分别与载体蛋白KLH(钥孔血蓝蛋白)连接制备成CHI3L1抗原(1)和(2)；

取CHI3L1肽段(1)或(2)10.0mg，用1ml 0.1M PBS缓冲液(pH 7.4)溶解；KLH10mg，用0.2M硼酸盐缓冲液(pH 9.0)20ml溶解；然后将两者混合，冷却至0℃，取BDBCl₂110μL，室温下反应1.5h，透析过夜后分装，-20℃保存；

在本实施例中，PBS缓冲液的配方为：0.2mol/L的Na₂HPO₄ 81ml加 0.2mol/L的NaH₂PO₄ 19ml混合而成；

硼酸盐缓冲液的配方为：0.05mol/L硼砂80ml，加0.2mol/L硼酸20ml 混合而成。

2.免疫动物制备单克隆抗体：

2.1取上述制备的CHI3L1抗原(1)和(2)(免疫原)分别与等体积的弗氏完全佐剂(购自上海源聚生物公司)充分混合后，免疫Balb/c小鼠，50μg 抗原/只，皮下多点注射；4周后测血清效价，选择免疫反应性好的小鼠再加强免疫：取抗原与等体积的弗氏不完全佐剂充分混合后，抗原剂量25μg/只，皮下多点注射，加强免疫的次数为6次，融合前连续加强免疫两次，之后取脾细胞与Sp2/0骨髓瘤细胞按常规方法用50％PEG(MW4000)(购自中原化工公司)介导进行融合，并用HAT条件培养基(购自sigma公司)选择培养；融合后放入CO₂培养箱中37℃培养9～11天后，孔内出现较大的细胞克隆；11天开始用间接ELISA进行筛选；对初筛阳性的孔利用有限稀释法进行4次克隆化培养(即使筛选后的细胞大量分裂繁殖)，之后扩增细胞、冻存、制备腹水。

2.2将Balb/c小鼠用降植烷(购自sigma公司)0.5ml/只处理，一周后腹腔接种杂交瘤细胞2×10⁶个/只，10天后收集腹水。

2.3测定抗体效价：用间接ELISA方法测定利用CHI3L1抗原(1)制备的单克隆抗体(1)的效价，结果显示单抗的效价达到1:32000以上。

利用CHI3L1抗原(2)制备的单克隆抗体(2)的效价也利用相同的方法进行测定，其效价也达到1:32000以上。

3.免疫动物制备多克隆抗体：

3.1选用三个月龄、体重约为2kg左右的新西兰白兔作为免疫动物；基础免疫中，将1-2mg上述制备的CHI3L1抗原(1)和(2)(免疫原)分别与等体积的弗氏完全佐剂混合-充分乳化后在兔子背部进行多点皮下注射；每隔4 周加强免疫一次，抗原与不完全弗氏佐剂充分乳化后，以100μg/只于背部多点皮下注射。末次加强免疫后第10天颈动脉放血，分离血清。

3.2测定抗体效价：用间接ELISA法测定利用CHI3L1抗原(1)制备的多克隆抗体(1)的效价，结果显示抗体效价达到1:32000以上；

利用CHI3L1抗原(2)制备的多克隆抗体(2)的效价也利用相同的方法进行测定，其效价也达到1:32000以上。

3.3取血及分离血清：颈动脉插管取血，分离血清。

4.分离纯化抗体：硫酸铵沉淀后，再经Protein G(购自sigma公司)亲和纯化。

5.抗体分装后冻干，低温保存。

实施例3：人CHI3L1单克隆抗体(1)和(2)的特异性鉴定

以ELISA进行检测，分别以层粘蛋白LN、壳三糖酶Chit1、透明质酸 HA、Ⅲ型前胶原PCⅢ、Ⅳ胶原CⅣ(均购自上海联硕公司)为检测抗原包被ELISA板，通过ELISA分别检测所制备的CHI3L1单克隆抗体(1)和(2)与该人CHI3L1蛋白的特异性反应，以正常BALB/c小鼠血清作阴性对照，PBS 液作空白对照；

结果：CHI3L1单克隆抗体(1)和(2)分别只与CHI3L1反应为阳性 (P/N>2.1)，而与LN、酶Chit1、HA、PCⅢ、CⅣ反应均为阴性，说明本发明的CHI3L1单克隆抗体(1)和(2)均具有特异性。

实施例4：人CHI3L1多克隆抗体(1)和(2)的特异性鉴定

利用与上述鉴定单克隆抗体特异性相同的方法进行鉴定；

结果显示：CHI3L1多克隆抗体(1)和(2)分别与CHI3L1反应为阳性 (P/N>2.1)，而与LN、酶Chit1、HA、PCⅢ、CⅣ反应均为阴性，说明本发明的CHI3L1多克隆抗体(1)和(2)分别具有特异性。

实施例5：利用CHI3L1单克隆抗体和CHI3L1多克隆抗体制备CHI3L1 体外诊断试剂盒；

在本实施例中，将实施例2中利用CHI3L1抗原表位肽(1)制备的单克隆抗体(1)作为本试剂盒中的包被抗体；将实施例2中利用CHI3L1抗原表位肽 (2)制备的多克隆抗体(2)作为结合抗体；

CHI3L1体外诊断试剂盒的制备和操作如下：

1.各种缓冲液及试剂的配制：

A、包被缓冲液：0.050M、pH9.6的CB(碳酸盐缓冲液)

Na₂CO₃：16.0克

NaHCO₃：29.0克

蒸馏水溶至1000ml

B、样品/洗涤缓冲液：pH7.2的10×PBS-Tween 20

Na₂HPO₄·12H₂O：58克

KH₂PO₄：4克

NaCl：100克

KCl：4克

蒸馏水溶至1000ml

加Tween 20：20ml

C、酶标记物稀释液：

10×PBS-Tween 20：10ml

FCS(小牛血清)：20ml

蒸馏水溶至1000ml

酶稳定剂(购自上海西宝公司)：1克

生物防腐剂(购自上海西宝公司)：1ml

D、显色剂A：

柠檬酸：35.5克

过氧化脲：10克

蒸馏水溶至1000ml

Tween 20：10ml

E、显色剂B：

柠檬酸：120克

EDTA-2Na：1克

TMB·2HCl：2克

蒸馏水溶至1000ml

F、终止液：2M H₂SO₄

浓硫酸(95-98％)：22.2ml

蒸馏水：177.3ml

配时将浓硫酸缓慢滴入蒸馏水中，边加边摇匀。

2.预包被板的制备：

将CHI3L1单克隆抗体(1)溶于pH＝9.6的0.05M的碳酸盐缓冲液中，制成预包被液，在酶标板(购自深圳金灿华公司)上每孔按0.1μg/孔加入100μl，置4℃放置18-24小时，取出，甩掉包被液，洗涤，经BSA封闭16小时、过夜干燥后装入铝铂袋中抽真空密封，并置于4℃保存。

3.结合抗体(CHI3L1多克隆抗体(2))和酶联物(辣根过氧化物酶)标记的羊抗兔IgG抗体(购自北京中杉金桥公司)的稀释比例均由方阵滴定实验确定。

4.试剂盒的组成：

预包被板：48/96孔

CHI3L1校准品(重组人YKL-40/CHI3L1蛋白，购自abcam公司)：7 个：7×1.0ml(浓度分别为25ng/ml、10ng/ml、5ng/ml、2.5ng/ml、1ng/ml、 0.5ng/ml、0.25ng/ml)；

CHI3L1结合抗体：1×10ml(经1:5000稀释)

酶联物：1×10ml(经1:5000稀释)

浓缩洗涤液(25×PBS-Tween 20)：1×20ml

显色剂A：1×6.0ml

显色剂B：1×6.0ml

终止液：1×6.0ml；

5.试剂盒的操作步骤：

在预包被板的各孔中分别加入待检血样以及标准品100μl/孔，均为双孔，37℃孵育60分钟，用1×洗涤缓冲液洗涤5次，拍干；在各孔内加入CHI3L1 结合抗体100μl/孔，37℃孵育30分钟，用1×洗涤缓冲液洗涤5次，拍干；再在各孔内加入酶联物100μl/孔，37℃孵育30分钟，用1×洗涤缓冲液洗涤 5次，拍干；加入显色剂A、B液，每孔各50μl，混匀，37℃孵育15分钟；加终止液50μl/孔终止反应，用酶联检测仪(型号RT-6000，购自雷杜公司) 用双波长(450nm、620nm)检测吸光度。

6.结果判定：

表1：标准品浓度和对应的平均吸光度(OD)值

浓度ng/ml	20	40	80	160	320
						平均OD值	0.201	0.346	0.678	1.112	1.856

以标准品浓度和对应吸光度的对数值绘制标准曲线，标准曲线的 R²＝0.988；

根据标准曲线计算所检测的标本中的CHI3L1浓度结果；

对35例健康组42例肝病患者进行血清CHI3L1检测，肝病患者血清中的CHI3L1水平明显高于健康对照组，差异有统计学意义(P<0.01)，肝病不同组之间CHI3L1水平也有明显差异，见表2；

表2：四组样本CHI3L1浓度比较

组别	人数	CHI3L1浓度(ng/ml)
			肝纤维化	17	89.4±15.3
肝硬化	15	130.4±20.6
			肝癌	10	282±27.5
对照组	35	35.1±7.2

以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书内容所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其他相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。

Claims

1.一种CHI3L1抗原表位肽，其特征在于，所述CHI3L1抗原表位肽的氨基酸链片段为如下两者之一：

(1) Tyr-Arg-Lys-Ser-Val-Pro-Pro-Phe-Leu-Arg-Thr；

(2) Tyr-Arg-Ser-Ala-Ala-Leu-Ser-Ala-Gly-Lys-Val-Thr-Ile-Asp。

2.一种CHI3L1抗原，其特征在于：通过使用权利要求1所述的CHI3L1抗原表位肽(1)与载体蛋白偶联制备而成，或通过使用权利要求1所述的CHI3L1抗原表位肽(2)与载体蛋白偶联制备而成。

3.一种CHI3L1抗体，其特征在于：由权利要求2所述的CHI3L1抗原制备而成的单克隆抗体或多克隆抗体。

4.根据权利要求3所述的CHI3L1抗体在制备CHI3L1体外诊断试剂盒上的用途。

5.一种CHI3L1体外诊断试剂盒，其特征在于：包含权利要求3所述的CHI3L1抗体作为包被抗体。

6.根据权利要求5所述的CHI3L1体外诊断试剂盒，其特征在于：还包含结合抗体，所述结合抗体为权利要求3所述的CHI3L1抗体，并且当所述结合抗体来源于所述权利要求1中的CHI3L1抗原表位肽(1)或(2)中的一者时，所述包被抗体来源于所述权利要求1中的所述的CHI3L1抗原表位肽(1)或(2)中的另一者。

7.根据权利要求6所述的CHI3L1体外诊断试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包含酶标记的第二抗体。

8.根据权利要求7所述的CHI3L1体外诊断试剂盒，其特征在于：所述包被抗体为单克隆抗体。

9.根据权利要求7所述的人CHI3L1体外诊断试剂盒，其特征在于：所述结合抗体为多克隆抗体。