CN106556592B - 定量检测人tk1的化学发光试剂盒及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及检测人TK1的化学发光试剂盒及其制备方法。所述试剂盒采用双抗体夹心法检测人TK1并且包含化学发光底物,所述双抗体夹心法采用第一TK1抗体作为捕获抗体,所述第一TK1抗体来源于序列表SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所述的序列中的一者;并且所述双抗体夹心法采用第二TK1抗体作为检测抗体,所述第二TK1抗体来源于序列表SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所述的序列中的另一者。本发明的化学发光法试剂盒,主要具有灵敏度高、特异性强、试剂盒价格低廉、试剂盒稳定且有效期长、方法稳定快速、检测范围宽、操作简单自动化程度高等优点。
Description
技术领域
本发明属于多肽化学和免疫学领域,具体涉及人胸苷激酶1(TK1)抗原表位肽、用该抗原表位肽制备的TK1特异性抗原和相应的单克隆抗体或多克隆抗体、所述抗体在制备人TK1体外诊断试剂盒上的应用、人TK1体外诊断试剂盒、以及一种用于定量检测待测物中人TK1的化学发光试剂盒及其制备方法。
背景技术
TK1是一种与细胞DNA合成密切相关的激酶,在正常人体内含量极低或检测不出来。当体内发生异常增殖如肿瘤时,血清中TK1浓度大幅上升。因此通过检测TK1的变化可以提前预示肿瘤的发生,可用于肿瘤早期风险筛查、预后及治疗监测。
胸腺嘧啶核苷激酶(TK)是胸腺嘧啶核苷(简称胸苷)合成DNA的关键酶之一。TK以两种同工酶的形式出现:细胞质胸苷激酶(TK1)和线粒体胸苷激酶(TK2),但只有TK1的升高或降低是评估增殖细胞的增殖度的重要标志,TK1和DNA的合成升高成正相关。恶性肿瘤细胞中DNA的合成剧增导致肿瘤细胞的急剧增殖,TK1的升高与肿瘤细胞生长状态密切相关。正常成年人的静止细胞及血清中的TK1酶活性和浓度极微,一旦细胞发生癌变,TK1酶的活性和含量会大大超过正常水平。恶性肿瘤细胞中DNA的合成剧增导致肿瘤细胞的急剧增殖,实验证明,在95%的恶性肿瘤细胞中都发现TK1有不同程度的升高,TK1的升高与肿瘤细胞生长状态紧密相关。因此TK1升高与细胞周期、细胞增殖状态密切相关,是一广谱性的细胞增殖标志物。临床上可用于肿瘤早期筛查、肿瘤患者治疗疗效监控以及预后与复发风险评估。
目前采用影像学的肿瘤检测手段对于早期肿瘤几乎无能为力,检测血清中的TK1水平的最理想的方法为免疫检测。此外,应用TK1抗体和先进的酶免疫、化学发光技术,通过常规抽血即可检查在多种治疗方案(如手术、化疗、放疗及生物治疗等)前后体内细胞增殖的活动能力,从而起到监控治疗和预后评估的效果。因此,寻找合适的具有免疫原性的TK1抗原表位肽、制备特异性的TK1抗原及抗体、以及开发定量检测TK1的试剂盒即成了重点。
发明内容
为解决上述现有技术中所存在的问题,本发明提供了一种用于定量检测待测物中人TK1的化学发光试剂盒及其制备方法。
具体而言,本发明提供了:
一种用于定量检测待测物中人TK1蛋白的化学发光试剂盒,所述试剂盒采用双抗体夹心法检测所述人TK1蛋白,并且所述试剂盒包含化学发光底物,其中:
所述双抗体夹心法采用第一抗TK1抗体作为捕获抗体,所述第一抗TK1抗体来源于人TK1抗原表位肽(1)和(2)中的一者;并且
所述双抗体夹心法采用第二抗TK1抗体作为检测抗体,所述第二抗TK1抗体来源于人TK1抗原表位肽(1)和(2)中的另一者;
所述人TK1抗原表位肽(1)和(2)分别为:
(1)Tyr-Lys-Ser-Thr-Pro-Gly-Ser-Pro-Ser-Lys-Thr-Arg-Gly-Gln;
(2)Tyr-Arg-Gly-Thr-Glu-Lys-Glu-Val-Glu-Val-Ile-Gly-Gly-Ala-Asp-Lys。
优选地,所述第一抗TK1抗体是由第一TK1抗原制备而成的,该第一TK1抗原是通过使所述人TK1抗原表位肽(1)和(2)中的一者与载体蛋白偶联制备而成的;并且
所述第二抗TK1抗体是由第二TK1抗原制备而成的,该第二TK1抗原是通过使所述人TK1抗原表位肽(1)和(2)中的另一者与载体蛋白偶联制备而成的。
优选地,所述捕获抗体为单克隆抗体,所述检测抗体为多克隆抗体。
优选地,所述捕获抗体是与磁珠偶联的。
优选地,所述捕获抗体的浓度为0.2ng/ml至0.4ng/ml。
优选地,所述检测抗体的浓度为0.6ng/ml至0.8ng/ml。
优选地,所述化学发光试剂盒包含鲁米诺盐系统作为所述化学发光底物,所述鲁米诺盐系统包含过氧化脲、鲁米诺、4-碘苯酚和吐温-20。
优选地,在所述鲁米诺盐系统中,所述鲁米诺的浓度为0.6g/L-0.9g/L;所述4-碘苯酚的浓度为0.1g/L-0.3g/L;吐温-20的浓度为0.3ml/L-0.6ml/L;过氧化脲的浓度为:0.3g/L-0.5g/L。
优选地,所述化学发光试剂盒用于定量检测血清和血浆中的人TK1蛋白。
本发明还提供了一种制备根据本发明所述的化学发光试剂盒的方法,其包括以下步骤:
1)提供第一抗TK1抗体作为捕获抗体;
2)提供第二抗TK1抗体作为检测抗体;以及
3)提供化学发光底物。
优选地,在步骤1)中,所述捕获抗体的浓度为0.2ng/ml至0.4ng/ml。
优选地,在步骤1)中,将所述第一抗TK1抗体与磁珠偶联,并且所述第一抗TK1抗体的浓度为0.2ng/ml至0.4ng/ml,所述第一抗TK1抗体与所述磁珠的用量比为(0.1-0.4ng):(1-3mg)。
优选地,在步骤2)中,所述检测抗体的浓度为0.6ng/ml至0.8ng/ml。
优选地,在步骤3)中,所述化学发光底物为鲁米诺盐系统,所述鲁米诺盐系统包含过氧化脲、鲁米诺、4-碘苯酚和吐温-20。
优选地,在所述鲁米诺盐系统中,所述鲁米诺的浓度为0.6g/L-0.9g/L;所述4-碘苯酚的浓度为0.1g/L-0.3g/L;吐温-20的浓度为0.3ml/L-0.6ml/L;过氧化脲的浓度为0.3g/L-0.5g/L。
本发明与现有技术相比具有以下优点和积极效果:
1.本发明的人TK1抗原表位肽具有良好的抗原性,用由其制备的抗原(免疫原)免疫动物能够产生高度特异性的单克隆抗体和多克隆抗体。
2.用本发明制备的TK1单克隆抗体和多克隆抗体能够高度特异地与血液样本(特别是血清和血浆样本)中的TK1结合。
3.本发明的人TK1化学发光试剂盒可以有效地检测血液样本(特别是血清样本)中的TK1的水平,可用于肿瘤的早期筛查,肿瘤患者治疗疗效监控以及预后与复发风险评估。
4.本发明将化学发光技术与双抗体夹心法相结合,提供了一种用于定量检测待测物中人TK1的化学发光试剂盒,用该试剂盒检测待测物中的人TK1,操作简便、快速,并且检测准确度和精密度好、特异性高、灵敏度好、稳定性好,能够迅速及时地帮助诊断病情,监测预后。
5.本发明在制备所述人TK1的化学发光试剂盒的过程中,通过大量的试验摸索,优化了各方面的制备条件,使得用本发明的化学发光试剂盒进行检测时,检测灵敏度和结果可信度得到提高;此外,本发明试剂盒在单一发光底物的基础上加入了增强剂及稳定剂,这与传统的只有一种发光底物成分(例如鲁米诺)的情况相比,增强了发光强度和时间,克服了原有发光试剂不稳定,不易保存的缺点。本发明试剂盒可保存一年以上。
具体实施方式
以下通过具体实施方式的描述对本发明作进一步说明,但这并非是对本发明的限制,本领域技术人员根据本发明的基本思想,可以做出各种修改或改进,但是只要不脱离本发明的基本思想,均在本发明的范围之内。
一、人TK1抗原表位肽
本文中所述的人TK1蛋白是本领域已知的,其氨基酸序列是本领域已知的,可以在NCBI等专业数据库中查到。
本发明提供了人TK1抗原表位肽(1)和(2),其氨基酸序列分别如序列表SEQ IDNo.1和SEQ ID No.2所示,为:
(1)Y-K-S-T-P-G-S-P-S-K-T-R-G-Q和
(2)Y-R-G-T-E-K-E-V-E-V-I-G-G-A-D-K。
本发明的发明人经过大量的理论研究和实验摸索,最终筛选得到两种具有良好的抗原性的抗原表位肽。
TK1抗原表位肽(1)包含人TK1蛋白(NCBI登录号AAH07986.1)N端第11至第20位的肽段,并且在该肽段的N末端加上Y、K、S和T,从而构成含14个氨基酸的TK1抗原表位肽(1)。
TK1抗原表位肽(2)包含人TK1蛋白(NCBI登录号AAH07986.1)C端第167位至第180位的肽段,并且在该肽段的N末端加上Y和R,从而构成含16个氨基酸的TK1抗原表位肽(2)。
这两个肽段均具有亲水性、抗原性强并且易于合成的特点。
目前,本发明研究发现,本发明的TK1抗原表位肽具有如下功能:
1.具有抗原性;2.与载体蛋白连接后作为免疫原刺激动物产生特异性的抗体;3.用抗原表位肽制备的抗体可特异性地与人TK1结合。
本发明的TK1抗原表位肽的制备方法可用化学合成法:利用美国ABI431A型多肽自动合成仪,通过固相法合成抗原表位肽。本发明的抗原表位肽(1)和(2)的分子量分别为1727.83、2021.15,可用质谱进行确定,并通过多肽序列测定鉴定所合成的抗原表位肽序列。肽段的纯度可用薄层色谱和高效液相色谱进行评定,并测定抗原表位肽的浓度。
二、TK1抗原
本发明还提供了TK1抗原,其通过使本发明的人TK1抗原表位肽(1)和(2)中的一者与载体蛋白偶联制备而成。具体而言,本发明提供了TK1抗原(1)和(2),所述TK1抗原(1)通过使本发明的人TK1抗原表位肽(1)与载体蛋白偶联制备而成;所述TK1抗原(2)通过使本发明的人TK1抗原表位肽(2)与载体蛋白偶联制备而成。本发明的TK1抗原具有免疫原性和特异性,是一种免疫原,可用来免疫动物从而制备特异性的TK1抗体。在本发明中,可用的载体蛋白的例子包括KLH(钥孔血蓝蛋白)、牛血清白蛋白(BSA)、卵清蛋白OVA等。由于KLH(钥孔血蓝蛋白)免疫原性强,结合位点多,免疫效果较好,并且与免疫动物亲缘关系较远,用其作为载体蛋白不易引起交叉反应,因此是优选的。
三、TK1单克隆抗体、TK1多克隆抗体和人TK1体外诊断试剂盒
本发明还提供了人TK1单克隆抗体和人TK1多克隆抗体,所述抗体可以各自利用本发明的TK1抗原(1)或(2)(免疫原)免疫动物制备而得。制备方法可采用本领域的常规技术,具体可参见实施例2。
本发明的TK1单克隆抗体和多克隆抗体可以用于制备人TK1体外诊断试剂盒,该试剂盒可以基于免疫方法对人体组织、细胞或体液中的TK1进行检测,优选对血液标本,特别是血清和血浆中的TK1进行检测。
因此,本发明提供了一种人TK1体外诊断试剂盒,其包含本发明的人TK1单克隆抗体或多克隆抗体。
目前已知可用于临床检验的免疫实验方法主要包括以下几种:ELISA法、化学发光法、荧光层析法、胶体金免疫测定法等。
而ELISA法包括以下几种类型:双抗体夹心法检测抗原、双抗原夹心法检测抗体、间接法测抗体、竞争法测抗体、竞争法测抗原、捕获包被法测抗体等。
本发明的人TK1体外诊断试剂盒优选采用ELISA双抗体夹心法来检测TK1蛋白。该试剂盒可以包含包被抗体、结合抗体、酶标记的第二抗体和/或必要的工具和试剂等。
优选的是,所述人TK1体外诊断试剂盒采用本发明的人TK1单克隆抗体作为包被抗体。在此,术语“包被抗体”是指包被于固相的酶标板上的抗体。此外,所述人TK1体外诊断试剂盒还优选包含人TK1多克隆抗体以作为结合抗体,其中,当所述包被抗体来源于本发明的人TK1抗原表位肽(1)和(2)中的一者时,所述结合抗体来源于所述抗原表位肽(1)和(2)中的另一者。在此,术语“结合抗体”是指试剂盒中可与待测抗原及酶标记的抗抗体结合的特异性抗体。所述试剂盒还可以包含酶标记的抗抗体,该抗抗体可以为羊抗兔IgG抗体,所述酶标记可以为辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶等。
本发明的人TK1体外诊断试剂盒优选对血清中的TK1进行检测。
在本发明的试剂盒中,还可以包含检测所需的任何试剂或工具,例如预包被板、洗涤液、显色剂、终止液等。
四、用于定量检测人TK1的化学发光试剂盒
本发明还提供了一种用于定量检测待测物中人TK1蛋白的化学发光试剂盒,所述试剂盒采用双抗体夹心法检测所述人TK1蛋白,并且所述试剂盒包含化学发光底物,其中:
所述双抗体夹心法采用第一抗TK1抗体作为捕获抗体,所述第一抗TK1抗体来源于人TK1抗原表位肽(1)和(2)中的一者;并且
所述双抗体夹心法采用第二抗TK1抗体作为检测抗体,所述第二抗TK1抗体来源于人TK1抗原表位肽(1)和(2)中的另一者;
所述人TK1抗原表位肽(1)和(2)分别为:
(1)Tyr-Lys-Ser-Thr-Pro-Gly-Ser-Pro-Ser-Lys-Thr-Arg-Gly-Gln;
(2)Tyr-Arg-Gly-Thr-Glu-Lys-Glu-Val-Glu-Val-Ile-Gly-Gly-Ala-Asp-Lys。
在本发明中,在双抗体夹心法化学发光试剂盒中,术语“捕获抗体”是指能够从待测物中特异性识别并结合待测抗原的抗体。
在本发明中,术语“检测抗体”是指另一种能够特异性识别待测抗原的抗体,其与捕获抗体分别特异性识别同一待测抗原分子上的不同抗原表位。检测抗体可与检测物(例如酶标记的抗抗体)结合,或者其本身标记有检测物(例如酶标记),从而实现待测抗原的检测。检测抗体可以为多克隆抗体。
在一些实施方案中,所述试剂盒包含酶标记的抗抗体,该抗抗体可以为羊抗兔IgG抗体,所述酶标记可以为辣根过氧化物酶(HRP)、碱性磷酸酶等,其中优选为辣根过氧化物酶。在另一些实施方案中,所述结合抗体本身带有酶标记,例如HRP。
在本发明中,所述第一抗TK1抗体可以由第一TK1抗原制备而成,该第一TK1抗原可以通过使所述人TK1抗原表位肽(1)和(2)中的一者与载体蛋白偶联制备而成;并且所述第二抗TK1抗体可以由第二TK1抗原制备而成,该第二TK1抗原可以通过使所述人TK1抗原表位肽(1)和(2)中的另一者与载体蛋白偶联制备而成。
在本发明中,可用的载体蛋白的例子包括KLH(钥孔血蓝蛋白)、牛血清白蛋白(BSA)、卵清蛋白OVA等。由于KLH(钥孔血蓝蛋白)免疫原性强,结合位点多,免疫效果较好,并且与免疫动物亲缘关系较远,用其作为载体蛋白不易引起交叉反应,因此是优选的。
本发明的发明人通过大量的实验摸索,对本发明的化学发光试剂盒中的各个成分进行了优化,从而使其能够针对人TK1蛋白获得符合临床检测要求的结果,即,准确度和精密度好、特异性高、灵敏度好、稳定性好。
在本发明中,所述捕获抗体优选为单克隆抗体,并且优选是与磁珠偶联的。优选采用下文所述的方法将捕获抗体与磁珠偶联。所述检测抗体可以为多克隆抗体。
优选地,在本发明的化学发光试剂盒中,所述捕获抗体的浓度为0.2ng/ml至0.4ng/ml,更优选为0.25ng/ml至0.4ng/ml,最优选为0.3ng/ml。
优选地,在本发明的化学发光试剂盒中,所述检测抗体的浓度为0.6ng/ml至0.8ng/ml,更优选为0.65ng/ml至0.75ng/ml,最优选为0.7ng/ml。
优选地,本发明的化学发光试剂盒中所用的化学发光底物是鲁米诺盐系统。鲁米诺的化学名称为5-氨基-2,3-二氢-1,4酞嗪二酮,其发光为氧化反应发光,它在碱性条件下通过HRP催化,被过氧化脲氧化而生成3-氨基邻苯二酸的激发态中间体,当其回到基态时发出光子,辐射出最大发射波长为425nm的化学发光。
本发明对鲁米诺盐系统的组成和各组分的用量比例进行了优化。优选地,所述鲁米诺盐系统包含过氧化脲、鲁米诺、4-碘苯酚(4-Iodophenol,线性分子式:IC6H4OH)和吐温-20。其中过氧化脲作为氧化剂,鲁米诺作为发光剂,4-碘苯酚作为增强剂,吐温-20作为稳定剂。本发明的发明人惊奇地发现,这种组合既增强了发光强度和时间,又克服了常规发光剂不稳定,不易保存的缺点,使得本发明的化学发光底物可保存一年以上。
优选地,在本发明的鲁米诺盐系统中,鲁米诺的浓度为0.6g/L至0.9g/L,更优选为0.7g/L至0.9g/L,最优选为0.8g/L。优选地,在本发明的鲁米诺盐系统中,4-苯酚的浓度为0.1g/L至0.3g/L,更优选为0.2g/L。优选地,在本发明的鲁米诺盐系统中,过氧化脲的浓度为0.3g/L至0.5g/L,更优选为0.4g/L。优选地,在本发明的鲁米诺盐系统中,吐温-20的浓度为0.3ml/L至0.6ml/L,更优选为0.5ml/L。
优选地,本发明的化学发光试剂盒还包含校准品,校准品的浓度梯度优选为20pM、10pM、5pM、2pM、1pM、0pM,校准品来源于用TK1单克隆抗体纯化的TK1,可以从例如Abcan公司购买获得。
本发明的化学发光试剂盒优选对血清和血浆中的TK1进行检测。
在一个具体的实施方案中,本发明的化学发光试剂盒在使用时,将待测血液(优选为血清或血浆)样品与偶联有TK1单克隆抗体(即捕获抗体)的磁珠混合,样品中的待测抗原(TK1)与捕获抗体特异性结合为捕获抗体-待测抗原复合物。然后洗涤去除未结合的成分,从而分离捕获抗体-待测抗原复合物。然后加入本发明的检测抗体,该检测抗体与捕获抗体-待测抗原复合物中的待测抗原特异性结合,形成捕获抗体-待测抗原-检测抗体复合物。然后洗涤去除未结合的成分,从而分离捕获抗体-待测抗原-检测抗体复合物。然后加入辣根过氧化物酶(HRP)标记的抗抗体,其与捕获抗体-待测抗原-检测抗体复合物中检测抗体结合。洗涤去除未结合的抗抗体,然后加入本发明所述的鲁米诺盐系统,利用化学反应释放的自由能激发中间体,从基态回到激发态,能量以光子的形式释放。之后,用化学发光仪检测光子释放的发光值,根据发光值计算TK1的浓度值。
在另一个方面,本发明提供了一种制备本发明所述的用于定量检测待测物中人TK1蛋白的化学发光试剂盒的方法,其包括以下步骤:
1)提供第一抗TK1抗体作为捕获抗体;
2)提供第二抗TK1抗体作为检测抗体;以及
3)提供化学发光底物。
本发明的发明人通过大量的试验摸索,优化了制备本发明的用于检测人TK1蛋白的化学发光试剂盒的方法的各个步骤的条件,包括将捕获抗体与磁珠偶联,确定捕获抗体和检测抗体的浓度,选择合适的化学发光底物等,由此使得本发明的化学发光试剂盒能够针对人TK1蛋白获得符合临床检测要求的结果,即,准确度和精密度好、特异性高、灵敏度好、稳定性好。
优选地,作为所述捕获抗体的第一抗TK1抗体的浓度为0.2ng/ml至0.4ng/ml,更优选为0.25ng/ml至0.4ng/ml,最优选为0.3ng/ml。
还优选地,在步骤1)中,将所述第一抗TK1抗体与磁珠偶联,并且所述第一抗TK1抗体的浓度为0.2ng/ml至0.4ng/ml,所述第一抗TK1抗体与所述磁珠的用量比为(0.1ng至0.4ng):(1mg至3mg),更优选为(0.2ng至0.4ng):(1mg至2.5mg),最优选为0.3ng:2mg。
优选地,作为所述检测抗体的第二抗TK1抗体的浓度为0.6ng/ml至0.8ng/ml,更优选为0.65ng/ml至0.75ng/ml,最优选为0.7ng/ml。
优选地,在步骤3)中,使用鲁米诺盐系统作为所述化学发光底物,所述鲁米诺盐系统包含过氧化脲、鲁米诺、4-碘苯酚和吐温-20。
还优选地,在所述鲁米诺盐系统中,鲁米诺的浓度为0.6g/L-0.9g/L,更优选为0.8g/L。优选地,在所述鲁米诺盐系统中,4-碘苯酚的浓度为0.1g/L至0.3g/L,更优选为0.2g/L。优选地,在本发明的鲁米诺盐系统中,过氧化脲的浓度为0.3g/L至0.5g/L,更优选为0.4g/L。优选地,在本发明的鲁米诺盐系统中,吐温-20的浓度为0.3ml/L至0.6ml/L,更优选为0.5ml/L。
在本发明的一个具体实施方案中,所述步骤1)包括:从4℃冰箱取出磁珠,超声洗涤2分钟;取200μl磁珠置于磁架上,去掉上清液,余下约20μl磁珠;向磁珠中加入2.5倍体积的初洗液(9.76g MES(一水吗啉乙磺酸),溶解于500ml水中,调节pH到6.0),超声洗涤1分钟,反复3次;加入300μl初洗液;再分别配制25mg/ml EDC(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐)溶液和NHS(N-羟基琥珀酰亚胺)溶液,EDC和NHS溶液按1:1体积的比例各加入100μl;室温反应30分钟,去上清液,洗涤;加入偶联缓冲液(H3BO31.24g,加入到100ml的水中,配成溶液①,Na2B4O7·10H2O 1.91g,加入到100ml水中,配成溶液②,取50ml溶液①和14.5ml溶液②,混合,加入100ml水,使用2N氢氧化钠调整pH为8.5,定容到200ml),3倍磁珠体积,洗3次后去上清液;加入0.3ng/ml的TK1抗体,反应2小时,去上清液;加入4倍体积的1%(w/v)BSA封闭液,室温反应1小时,去上清液;加入0.1M的Tris终洗液,2.5倍体积洗3次,最后3倍体积定容。
在本发明的一个具体实施方案中,为确定合适的捕获抗体浓度和检测抗体浓度,将捕获抗体浓度设为0.3ng/ml,将TK1抗原校准品浓度设为0、1、2、5、10、20pM,检测抗体在0.6ng/ml-0.8ng/ml的范围内分别取0.6ng/ml、0.65ng/ml、0.7ng/ml、0.75ng/ml、0.8ng/ml这几个浓度进行试验,最终确定检测抗体最佳浓度。由比较结果可知,检测抗体浓度优选为0.65ng/ml至0.75ng/ml,最优选为0.7ng/ml。类似地,将检测抗体浓度设为0.7ng/ml,将捕获抗体浓度分别设为0.1ng/ml、0.15ng/ml、0.2ng/ml、0.25ng/ml、0.3ng/ml、0.35ng/ml、0.4ng/ml和0.45ng/ml,进行对比,最终确定捕获抗体浓度。由比较结果可知,捕获抗体浓度优选为0.2ng/ml至0.4ng/ml,最优选为0.3ng/ml。
在本发明的一个具体实施方案中,鲁米诺的氧化反应在碱性缓冲液中进行,因此优选以0.1mol/L pH8.6硼酸盐缓冲液(0.05mol/L的Na2B4O7和0.2mol/L的H3BO3按照5.5:4.5的体积比配制而成,pH=8.6)作底物液。鲁米诺和过氧化脲在无HRP催化时也能缓慢自发发光,从而在最后光强度测定中造成空白干扰,因此优选将发光底物分开配制成两部分,即:A液和B液,A液包含过氧化脲、缓冲液;B液包含4-碘苯酚、鲁米诺、吐温-20、缓冲液(A液和B液中的缓冲液均可以为上述0.1mol/L pH8.6硼酸盐缓冲液),在使用前将A液和B液即刻混合。另外,HRP发光增强剂如某些酚试剂(如邻碘酚)或萤火虫荧光素酶可增强HRP催化鲁米诺氧化的反应和延长发光时间,提高发光敏感度。本系统中采用4-碘苯酚作为增强剂。
以下通过例子的方式进一步解释或说明本发明的内容,但这些例子不应被理解为对本发明的保护范围的限制。
实施例
除非另有说明,以下所述溶液均为水溶液,溶液中的百分数均为体积百分数。
实施例1:TK1抗原表位肽(1)和(2)的制备。
制备方法用化学合成法:利用美国ABI431A型多肽自动合成仪,通过固相法分别合成TK1抗原表位肽(1)和(2)。抗原表位肽的纯度用高效液相色谱进行评定,并测定肽段的浓度。本发明的抗原表位肽(1)和(2)的分子量分别为1727.83、2021.15,利用质谱进行确定,通过多肽序列测定鉴定所合成的多肽序列。
一、TK1抗原表位肽(1)和(2)的合成
上述肽段采用固相法合成。固相肽合成的主要思想是:先将所要合成肽链的羧基末端氨基酸的羧基以共价键形式同一个不溶性的高分子化合物(树脂)相连接,然后以此结合在固相载体上的氨基酸作为氨基组份,经过脱去氨基保护基并同过量的活化羧基组份反应,接长肽链。这样的步骤可以反复地多次进行下去,最后达到所需要合成的肽链的长度。这个合成过程如下所示。
本发明的TK1抗原表位肽(1)和(2)的各自的具体制备步骤如下:
1.所用原料:
HMP树脂(P-羟甲基苯氧甲基多聚乙烯树脂,可购自sigma公司)
Fmoc-AA(9-芴基甲氧羰酰基保护的氨基酸,可购自Merck公司)
NMP(氮甲基吡咯烷酮,可购自sigma公司)
DCM(二氯甲烷,可购自中原化工公司)
MeoH(甲醇,可购自中原化工公司)
哌啶(Piperidine,可购自sigma公司)
DMAP(二甲基氨基吡啶,可购自sigma公司)
HOBT(羟基苯并三唑,可购自sigma公司)
DCC(二环已基碳二亚胺,可购自sigma公司)
TFA(三氟乙酸,可购自sigma公司)
EDT(1,2-乙二硫醇,可购自sigma公司)
硫代苯甲醚,可购自广州伟伯化工有限公司
结晶苯酚,可购自国药集团化学试剂有限公司
乙腈,可购自国药集团化学试剂有限公司
2.使用仪器:
多肽自动合成仪,型号431A,可购自ABI公司
旋转蒸发仪,型号R-201,可购自上海申顺公司
高效液相色谱仪,Waters 600,可购自美国Waters公司
冷冻干燥机,型号VFD-2000,可购自北京博医康公司
3.合成方法和过程:
称取HMP树脂100mg,取代当量是1.0meq,即将0.1mmol置于美国ABI431A型多肽自动合成仪的反应腔内,由合成仪自动将特定的氨基酸按不同的顺序连接起来,偶联率达99%。反应如下:
(1)氨基酸的活化(HOBt/DCC法)
(2)连接氨基酸到树脂上
(3)脱去氨基酸的Fmoc保护基
(4)另一氨基酸的活化(HOBt/DCC法)
(5)偶联
(6)重复步骤(3)至(5)直至合成结束。
分别得到TK1肽段(1)的肽树脂215mg和TK1肽段(2)的肽树脂168mg。
(7)裂解肽树脂:
用TFA(三氟乙酸)切割肽链,用EDT(2.5体积%)、硫代苯甲醚(2.5体积%)作清除剂,在室温下反应3.0小时,除去切割试剂,再用乙醚萃取,分别得到TK1肽段(1)和(2)的粗品。
二、TK1抗原表位肽(1)和(2)粗品的纯化:
采用高效液相色谱分离纯化:
条件:色谱柱:C810×100mm,可购自美国Waters公司
色谱仪:Waters 600,美国Waters公司
流动相:A:0.1%TFA(三氟乙酸)水溶液
B:0.1%TFA(三氟乙酸)于60%乙腈
检测波长:214nm
流速:4ml/分钟
洗脱梯度:20-60%B,30分钟
HPLC(高效液相色谱)分析
色谱柱:C184.6×150mm,可购自美国Waters公司
流动相:A:0.1%TFA(三氟乙酸)水溶液
B:0.1%TFA(三氟乙酸)于乙腈
检测波长:214nm
流速:1ml/分钟
洗脱梯度:0-60%B,30分钟
肽段分析结果显示本发明的TK1抗原表位肽(1)和(2)的纯度均为95%以上。
三、TK1抗原表位肽(1)和(2)的鉴定
1.利用质谱分别测定纯化所得的TK1抗原表位肽(1)和(2)的分子量。
(1)试剂原料
TFA(三氟乙酸,可购自sigma公司)
HCCA(α-氰基-4-羟基肉桂酸,可购自sigma公司)
乙腈(可购自国药集团化学试剂有限公司)
(2)仪器
基质辅助激光解析电离飞行时间质谱仪MALDI-TOF-MS(型号:REFLEX III,德国Bruker公司);
(3)基质液:将α-CCA溶于含0.1%TFA的50%ACN溶液中,制成饱和溶液,离心,取上清;
(4)仪器检测条件:反射检测方式;飞行管长3m;氮激光器:波长337nm,加速电压20KV;反射电压23KV。
(5)操作步骤:分别取1μL上述纯化多肽(1)和(2)的样品,各自与1μL的饱和基质上清液混合等体积混合,分别取1μL点在样品靶上,送入离子源中进行检测。
结果,测得所得TK1抗原表位肽(1)的分子量为1727.6,TK1抗原表位肽(2)的分子量为2020.9,与理论分子量1727.83、2021.15一致,证明合成多肽即为目的产物。
2.通过多肽序列测定分别鉴定所得TK1抗原表位肽(1)和(2)的序列。
(1)原理:多肽氨基酸序列分析的基本原理是Edman降解,是一个循环式的化学反应过程。包括三个主要的化学步骤:(1)偶联:异硫氰酸苯酯与蛋白质和多肽的N-端残基反应,形成苯氨基硫甲酰(PTC)衍生物,即PTC-肽。(2)环化裂解:PTC-肽环化裂解。(3)转化:噻唑呤酮苯氨(ATZ)转化为苯异硫尿氨基酸(PTH-氨基酸)。留在溶液中的减少了一个氨基酸残基的肽再重复进行上述反应过程,整个测序过程现在都是通过测序仪自动进行。
(2)仪器:美国ABI公司491型蛋白质/多肽N-末端氨基酸序列分析仪
(3)试剂原料
异硫氰酸苯酯PITC,可购自sigma公司
正庚烷,可购自国药集团化学试剂有限公司
三甲胺TMA水溶液,可购自国药集团化学试剂有限公司
TFA(三氟乙酸,可购自sigma公司)
乙酸乙酯,可购自国药集团化学试剂有限公司
氯丁烷,可购自sigma公司
乙腈,可购自国药集团化学试剂有限公司
(4)测定
按仪器说明书进行。
结果:经鉴定,所得TK1抗原表位肽(1)和(2)的序列分别为:
(1)Y-K-S-T-P-G-S-P-S-K-T-R-G-Q和
(2)Y-R-G-T-E-K-E-V-E-V-I-G-G-A-D-K。
该结果与目标合成肽段一致。
实施例2:分别将实施例1所得的TK1抗原表位肽(1)和(2)与载体蛋白连接以制备TK1抗原(1)和(2),利用所得抗原(1)和(2)分别免疫动物,从而利用抗原(1)制备特异性的单克隆抗体和多克隆抗体,并且利用抗原(2)制备特异性的单克隆抗体和多克隆抗体。
1.抗原的制备:用BDB(Bis-diazotizedbenzidine dichloride)法将TK1肽段(1)和(2)分别与载体蛋白KLH(钥孔血蓝蛋白)(购自sigma公司)连接制备成TK1抗原(1)和(2)。
取TK1肽段(1)或(2)10.0mg,用1ml 0.1M PBS缓冲液(pH 7.4)溶解;KLH 10mg,用0.2M硼酸盐缓冲液(pH 8.6)20ml溶解;然后将两者混合,冷却至0℃,取BDBCl2110μL,室温下反应1.5h,透析过夜后分装,-20℃保存。
在各实施例中,PBS缓冲液(如果使用)的配方为:0.2mol/L的Na2HPO481ml加0.2mol/L的NaH2PO419ml混合而成。
硼酸盐缓冲液的配方为:0.05mol/L硼砂80ml,加0.2mol/L硼酸20ml混合而成。
2.免疫动物制备单克隆抗体:
2.1.取上述制备的TK1抗原(1)和(2)(免疫原)分别与等体积的弗氏完全佐剂(购自上海源聚生物公司)充分混合后,免疫Balb/c小鼠,50μg抗原/只,皮下多点注射。4周后测血清效价,选择免疫反应性好的小鼠再加强免疫:取抗原与等体积的不完全弗氏佐剂(购自上海源聚生物公司)充分混合后,抗原剂量25μg/只,皮下多点注射,加强免疫的次数为6次,每次间隔2-3周,融合前另外连续加强免疫两次,每次间隔1-2周,之后取脾细胞与Sp2/0骨髓瘤细胞按常规方法用50%PEG(MW4000)(购自中原化工公司)介导进行融合,并用HAT条件培养基(购自sigma公司)选择培养。融合后放入CO2培养箱中37℃培养9~11天后,孔内出现较大的细胞克隆。11天开始用间接ELISA进行筛选。对初筛阳性的孔利用有限稀释法进行4次克隆化培养(即使筛选后的细胞大量分裂繁殖),之后扩增细胞、冻存、制备腹水。
2.2.将Balb/c小鼠用降植烷(购自sigma公司)0.5ml/只处理,一周后腹腔接种杂交瘤细胞2×106个/只,10天后收集腹水。
2.3.测定抗体效价:用间接ELISA方法测定利用TK1抗原(1)制备的单克隆抗体(1)的效价,结果显示单抗的效价达到1:32000以上。
利用TK1抗原(2)制备的单克隆抗体(2)的效价也利用相同的方法进行测定,其效价也达到1:32000以上。
3.免疫动物制备多克隆抗体:
3.1.选用三个月龄、体重约为2kg左右的新西兰白兔作为免疫动物。基础免疫中,将1-2mg上述制备的TK1抗原(1)和(2)(免疫原)分别与等体积的完全弗氏佐剂(购自sigma生物公司)混合-充分乳化后在兔子背部进行多点皮下注射。每隔4周加强免疫一次,共加强免疫6次,抗原与不完全弗氏佐剂充分乳化后,以100μg/只于背部多点皮下注射。末次加强免疫后第10天颈动脉放血,分离血清。
3.2.测定抗体效价:用间接ELISA法测定利用TK1抗原(1)制备的多克隆抗体(1)的效价,结果显示抗体效价达到1:32000以上。
利用TK1抗原(2)制备的多克隆抗体(2)的效价也利用相同的方法进行测定,其效价也达到1:32000以上。
3.3.取血及分离血清:颈动脉插管取血,分离血清。
4.分离纯化抗体:硫酸铵沉淀后,再经Protein G(购自sigma公司)亲和纯化。
5.抗体分装后冻干,低温保存。
实施例3:人TK1单克隆抗体(1)和(2)的特异性鉴定
以ELISA进行检测。分别以人TK1蛋白、TK2蛋白、S-100B蛋白、神经元特异性烯醇化酶NSE(均购自上海联硕公司)为检测抗原包被ELISA板,通过ELISA分别检测所制备的TK1单克隆抗体(1)和(2)与该人TK1蛋白的特异性反应,以正常BALB/c小鼠血清作阴性对照,PBS液作空白对照。
结果:TK1单克隆抗体(1)和(2)分别只与TK1反应为阳性(P/N>2.1),而与S-100B蛋白、神经元特异性烯醇化酶NSE、TK2蛋白反应为阴性,说明本发明的TK1单克隆抗体(1)和(2)分别具有特异性。
实施例4:人TK1多克隆抗体(1)和(2)的特异性鉴定
利用与上述鉴定单克隆抗体特异性相同的方法进行鉴定。
结果显示:TK1多克隆抗体(1)和(2)分别与TK1反应为阳性(P/N>2.1),而与S-100B蛋白、神经元特异性烯醇化酶NSE、TK2蛋白反应为阴性,说明本发明的TK1多克隆抗体(1)和(2)分别具有特异性。
实施例5:利用TK1单克隆抗体和TK1多克隆抗体制备TK1体外诊断试剂盒。
在本实施例中,将实施例2中利用TK1抗原表位肽(1)制备的单克隆抗体(1)作为本试剂盒中的包被抗体;将实施例2中利用TK1抗原表位肽(2)制备的多克隆抗体(2)作为结合抗体。
TK1体外诊断试剂盒的制备和操作如下:
1.各种缓冲液及试剂的配制:
A、包被缓冲液:0.050M、pH9.6的CB(碳酸盐缓冲液)
Na2CO3:16.0克
NaHCO3:29.0克
蒸馏水溶至1000ml
B、样品/洗涤缓冲液:pH7.2的10×PBS-Tween 20
Na2HPO4·12H2O:58克
KH2PO4:4克
NaCl:100克
KCl:4克
蒸馏水溶至1000ml
加Tween 20:20ml
C、酶标记物稀释液
10×PBS-Tween 20:10ml
FCS(小牛血清):20ml
蒸馏水溶至1000ml
酶稳定剂(可购自上海西宝公司):1克
生物防腐剂(可购自上海西宝公司):1ml
D、显色剂A:
柠檬酸:35.5克
过氧化脲:10克
蒸馏水溶至1000ml
Tween 20:10ml
E、显色剂B:
柠檬酸:120克
EDTA-2Na:1克
TMB·2HCl:2克
蒸馏水溶至1000ml
F、终止液:2M H2SO4
浓硫酸(95-98%):22.2ml
蒸馏水:177.3ml
配时将浓硫酸缓慢滴入蒸馏水中,边加边摇匀。
2.预包被板的制备:
将TK1单克隆抗体(1)溶于pH=9.6的0.05M的碳酸盐缓冲液中,制成预包被液,在酶标板(可购自深圳金灿华公司)上每孔按0.1μg/孔加入100μl,置4℃放置18-24小时,取出,甩掉包被液,用样品/洗涤缓冲液洗涤,经1(w/v)%BSA-0.05M乙醇胺封闭16小时、过夜干燥后装入铝铂袋中抽真空密封,并置于4℃保存。
3.结合抗体(TK1多克隆抗体(2))和酶联物(辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG抗体)(购自北京中杉金桥公司)的稀释比例均由方阵滴定实验确定,辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG抗体使用酶标记物稀释液稀释。
4.试剂盒的组成:
预包被板:48/96孔
TK1校准品(原料购自Abcan公司):6个:6×1.0ml(浓度分别为20pM、10pM、5pM、2pM、1pM、0pM)
TK1结合抗体:1×10ml(经1:5000稀释)
酶联物:1×10ml(经1:5000稀释)
浓缩洗涤液(25×PBS-Tween 20):1×20ml
显色剂A:1×6.0ml
显色剂B:1×6.0ml
终止液:1×6.0ml
5.试剂盒的操作步骤:
在预包被板的各孔中分别加入待检血清以及校准品100μl/孔,均为双孔,37℃孵育60分钟,用1×洗涤缓冲液洗涤5次,拍干。在各孔内加入TK1结合抗体100μl/孔,37℃孵育30分钟,用1×洗涤缓冲液洗涤5次,拍干。再在各孔内加入酶联物100μl/孔,37℃孵育30分钟,用1×洗涤缓冲液洗涤5次,拍干。加入显色剂A、B液,每孔各50μl,混匀,37℃孵育15分钟。加终止液50μl/孔终止反应,用酶联检测仪(型号RT-6000,可购自雷杜公司)用双波长(450nm、620nm)检测吸光度。
6.结果判定:
表1:校准品浓度和对应的平均吸光度(OD)值
浓度pM | 0 | 1 | 2 | 5 | 10 | 20 |
平均OD值 | 0.066 | 0.127 | 0.215 | 0.374 | 0.714 | 1.236 |
以校准品浓度和对应吸光度的对数值绘制标准曲线,标准曲线的R2=0.977。
根据标准曲线计算所检测的标本中的TK1浓度结果。
对54例肿瘤病人和103例健康者按上述方式进行血清TK1检测,肿瘤病人血清中的TK1含量明显高于健康对照组,差异有统计学意义(P<0.01),见表2。
表2:两组样本TK1浓度比较
由以上数据可知,本发明的试剂盒可有效且特异性地检测血清中的TK1含量,从而检测出肿瘤病人和正常人之间的TK1含量差异,由此可判断肿瘤的发生。
实施例六:用于检测待测物中人TK1的化学发光试剂盒的制备。
在本实施例中,将实施例2中利用TK1抗原表位肽(1)制备的单克隆抗体(1)作为本试剂盒中的捕获抗体;将实施例2中利用TK1抗原表位肽(2)制备的多克隆抗体(2)作为检测抗体。
TK1化学发光试剂盒的制备和操作如下:
1.缓冲液配制
A、初洗缓冲液
称取MES(一水吗啉乙磺酸)9.76克,溶于500毫升水中,调节PH到6.0。
B、偶联缓冲液
称取硼酸(H3BO3)1.24克,溶于100毫升水中,配制成溶液1;
称取四硼酸钠(硼砂)1.91克,溶于100毫升水中,配制成溶液2;
取50毫升溶液1和14.5毫升溶液2,混合,加入100毫升水;
使用2N氢氧化钠调整PH到8.5,定容至200毫升。
C、封闭缓冲液
取乙醇胺,配制成0.08M溶液;
向该溶液中加入BSA,并使其最终固含量达到1%(w/v)。
D、终洗缓冲液
在纯化水中加入吐温-20,至溶液浓度0.2%(v/v);
向溶液中加入BSA,并使其最终固含量达到1%。
2.磁珠与捕获抗体的偶联:
从4℃冰箱取出磁珠(购自天津倍斯乐公司,产品货号3412),超声洗涤2分钟;取200μl磁珠置于磁架上,去掉上清液,余下约20μl磁珠;向磁珠中加入2.5倍体积的初洗缓冲液,超声洗涤1分钟,反复3次;加入300μl初洗缓冲液;再分别配制25mg/ml EDC(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐)溶液和NHS(N-羟基琥珀酰亚胺)溶液,EDC和NHS溶液按1:1体积的比例各加入100μl;室温反应30分钟,去上清液,洗涤;加入偶联缓冲液,3倍磁珠体积,洗3次后去上清液;加入0.3ng/ml的TK1抗体80μl,室温反应2小时,去上清液;加入4倍体积的封闭缓冲液,室温反应1小时,去上清液;加入0.1M的终洗缓冲液,2.5倍体积洗3次,最后3倍体积定容。
3.检测抗体(TK1多克隆抗体(2))和酶联物(辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG抗体)(购自北京中杉金桥公司)的浓度和稀释比例均由方阵滴定实验确定,辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG抗体使用酶标记物稀释液以1:5000进行稀释。
4.试剂盒的组成:
与捕获抗体偶联的磁珠:1×2ml
TK1校准品(原料购自Abcan公司):6个,6×1.0pM(浓度分别为20pM、10pM、5pM、2pM、1pM、0pM)
TK1检测抗体(TK1多克隆抗体(2)):1×10ml(浓度为0.7ng/ml)
酶联物:1×20ml
浓缩洗涤液(25×PBS-Tween 20):1×20ml
发光底物(A液包含0.4g/L过氧化脲、0.1mol/L pH8.6硼酸盐缓冲液;B液包含0.2g/L 4-碘苯酚、0.8g/L鲁米诺、0.5ml/L吐温-20、0.1mol/L pH8.6硼酸盐缓冲液):2×6.0ml
5.试剂盒的操作步骤:
自4℃冰箱取出试剂,室温平衡15分钟;浓缩洗涤液1:25稀释成工作液。将待测的血清、血浆样品及校准品分别定位于含20ul磁珠的反应杯中,校准品各浓度各设一杯,另设一杯作空白对照。样品或校准品于相应反应杯分别加100μl,置37℃恒温反应60分钟,洗涤。吸除反应杯中的反应液,各反应杯加入洗涤液约400μl,静置20秒左右,除去其中液体,洗涤。如此共洗三次,最后一遍将反应杯中液体吸干。除空白反应杯外,各反应杯加TK1多克隆抗体(2)100μl,置37℃恒温反应60分钟。吸除反应杯中的反应液,各反应杯加入洗涤液约400μl,静置20秒左右,除去其中液体,洗涤。如此共洗三次,最后一遍将反应杯中液体吸干。每反应杯加入化学发光底物A、B液各50μl。于加底物后的第10分钟测定各孔的发光值RLU(检测仪器:江苏泽成公司生产的化学发光分析仪,型号CIA600)。
6.结果判定:
表3:校准品浓度和对应的平均发光值RLU
以校准品浓度和对应发光值的对数值绘制标准曲线,标准曲线的R2=0.976。根据标准曲线计算所检测的样品中的TK1浓度结果。
由于标准曲线的R2=0.976,因此用本发明的TK1化学发光试剂盒检测的校准品浓度与校准品的实际浓度拟合程度较高,这说明本发明的化学发光试剂盒的检测准确性和可信度优良。
其他浓度的捕获抗体和检测抗体的检测结果如表4所示。
表4
不同含量的鲁米诺盐发光系统(过氧化脲浓度0.4g/L)的检测结果如表5所示。
表5
7.TK1化学发光试剂盒性能评价
1)灵敏度:对0pM校准品进行20次重复测定,计算发光值RLU值,用标准曲线反算出其x+2s对应的浓度值,结果是0.156pM,表明本发明的TK1化学发光试剂盒灵敏度良好。
2)准确度:用回收试验测定,对TK1浓度为1pM和20pM的2份血清样品,各加入TK1蛋白9pM和1pM,测定回收率为85~115%,表明本发明的TK1化学发光试剂盒准确度良好。
3)精密度:用本发明的TK1化学发光试剂盒分别检测TK1浓度分别为1pM和20pM的血清,重复检测10次,进行批内精密度测定。
每天对上述2个浓度的三个不同批次的样本进行测定,1天1次,连续测20天,进行批间精密度测定。结果批内CV(变异系数)分别是4.5%和5.7%,批间CV分别是9.4%和9.0%。批内CV和批间CV均小于10%,说明本发明的TK1化学发光试剂盒精密性良好。
4)稳定性:用本发明的TK1化学发光试剂盒在37℃保温箱中放置3天、5天、7天,用这些试剂盒做测试结果标准曲线,观察到放置3天、5天与放置0天无明显区别,放置7天后,最大A值较低,且线性较差,利用阿伦尼乌斯方程换算得知本发明的TK1化学发光试剂盒在出厂后12个月内稳定性良好。
5)特异性:用本发明的TK1化学发光试剂盒,检测含抗甲状腺球蛋白(TG)且TK1阴性的临床血清和血浆样本,用校准品稀释液(PBS、10%(w/v)小牛血清及0.03%(w/v)生物防腐剂配制而成)稀释,测定发光值RLU,计算与TG的交叉反应情况。试验结果表明,与TG的交叉反应率为0.23%,本发明的TK1化学发光试剂盒特异性良好。
Claims (15)
1.一种用于定量检测待测物中人TK1蛋白的化学发光试剂盒,所述试剂盒采用双抗体夹心法检测所述人TK1蛋白,并且所述试剂盒包含化学发光底物,其中:
所述双抗体夹心法采用第一抗TK1抗体作为捕获抗体,所述第一抗TK1抗体来源于人TK1抗原表位肽(1)和(2)中的一者;并且
所述双抗体夹心法采用第二抗TK1抗体作为检测抗体,所述第二抗TK1抗体来源于人TK1抗原表位肽(1)和(2)中的另一者;
所述人TK1抗原表位肽(1)和(2)分别为:
(1)Tyr-Lys-Ser-Thr-Pro-Gly-Ser-Pro-Ser-Lys-Thr-Arg-Gly-Gln;
(2)Tyr-Arg-Gly-Thr-Glu-Lys-Glu-Val-Glu-Val-Ile-Gly-Gly-Ala-Asp-Lys。
2.根据权利要求1所述的化学发光试剂盒,其中所述第一抗TK1抗体是由第一TK1抗原制备而成的,该第一TK1抗原是通过使所述人TK1抗原表位肽(1)和(2)中的一者与载体蛋白偶联制备而成的;并且
所述第二抗TK1抗体是由第二TK1抗原制备而成的,该第二TK1抗原是通过使所述人TK1抗原表位肽(1)和(2)中的另一者与载体蛋白偶联制备而成的。
3.根据权利要求1所述的化学发光试剂盒,其中所述捕获抗体为单克隆抗体,所述检测抗体为多克隆抗体。
4.根据权利要求1所述的化学发光试剂盒,其中所述捕获抗体是与磁珠偶联的。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的化学发光试剂盒,其中所述捕获抗体的浓度为0.2ng/ml至0.4ng/ml。
6.根据权利要求1-4中任一项所述的化学发光试剂盒,其中所述检测抗体的浓度为0.6ng/ml至0.8ng/ml。
7.根据权利要求1-4中任一项所述的化学发光试剂盒,其中所述化学发光试剂盒包含鲁米诺盐系统作为所述化学发光底物,所述鲁米诺盐系统包含过氧化脲、鲁米诺、4-碘苯酚和吐温-20。
8.根据权利要求7所述的化学发光试剂盒,其中在所述鲁米诺盐系统中,所述鲁米诺的浓度为0.6g/L-0.9g/L;所述4-碘苯酚的浓度为0.1g/L-0.3g/L;吐温-20的浓度为0.3ml/L-0.6ml/L;过氧化脲的浓度为:0.3g/L-0.5g/L。
9.根据权利要求1所述的化学发光试剂盒,其中所述化学发光试剂盒用于定量检测血清和血浆中的人TK1蛋白。
10.一种制备根据权利要求1至9中任意一项所述的化学发光试剂盒的方法,其包括以下步骤:
1)提供第一抗TK1抗体作为捕获抗体;
2)提供第二抗TK1抗体作为检测抗体;以及
3)提供化学发光底物。
11.根据权利要求10所述的方法,其中在步骤1)中,所述捕获抗体的浓度为0.2ng/ml至0.4ng/ml。
12.根据权利要求10所述的方法,其中在步骤1)中,将所述第一抗TK1抗体与磁珠偶联,并且所述第一抗TK1抗体的浓度为0.2ng/ml至0.4ng/ml,所述第一抗TK1抗体与所述磁珠的用量比为(0.1-0.4ng):(1-3mg)。
13.根据权利要求10所述的方法,其中在步骤2)中,所述检测抗体的浓度为0.6ng/ml至0.8ng/ml。
14.根据权利要求10所述的方法,其中在步骤3)中,所述化学发光底物为鲁米诺盐系统,所述鲁米诺盐系统包含过氧化脲、鲁米诺、4-碘苯酚和吐温-20。
15.根据权利要求14所述的方法,其中在所述鲁米诺盐系统中,所述鲁米诺的浓度为0.6g/L-0.9g/L;所述4-碘苯酚的浓度为0.1g/L-0.3g/L;吐温-20的浓度为0.3ml/L-0.6ml/L;过氧化脲的浓度为0.3g/L-0.5g/L。
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