CN114805586A - 抗MxA单克隆抗体组合物及其应用 - Google Patents

抗MxA单克隆抗体组合物及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种抗MxA单克隆抗体组合物及其应用。所述抗MxA单克隆抗体组合物包括：第一抗MxA单克隆抗体，其能够识别MxA蛋白第77～84位氨基酸并与MxA蛋白第77～84位氨基酸中的任一位点结合；第二抗MxA单克隆抗体，其能够识别MxA蛋白第574～662位氨基酸并与MxA蛋白第574～662位氨基酸中的任一位点结合；所述第一抗MxA单克隆抗体与所述第二抗MxA单克隆抗体的个数比为1:0.8～1.2。所解决的技术问题是通过抗MxA单克隆抗体组合物识别并结合MxA蛋白中的特异性位点，可增强该单克隆抗体的免疫特异性；包含所述抗MxA单克隆抗体组合物的试剂用于生化仪或特定蛋白仪检测MxA蛋白时，可将检测时间控制在10min内，同时可将MxA蛋白的检测灵敏度提升至1ng/mL，且重复性不高于10％。

Description

抗MxA单克隆抗体组合物及其应用
技术领域
本发明涉及MxA检测技术领域，具体涉及一种抗MxA单克隆抗体组合物及其应用。
背景技术
Mx蛋白属于大GTP酶的动态蛋白(dynamin)超家族，是由I型干扰素(IFNα/β)诱导宿主细胞所产生的抗病毒蛋白中的一种,具有广泛的抗病毒作用。人类细胞用I型IFN处理会产生两种Mx蛋白，分别命名为MxA和MxB。MxA有广谱抗病毒活性，不仅可以抗RNA病毒，还可以抗DNA病毒，而MxB则没有抗病毒活性。
人类的MxA蛋白至少由3个区域组成：(1)N端结构，由约300个氨基酸组成，是GTP酶的活性区，包含3个GTP结合结构域，由GxxxxGKS、DxxG和TKxD构成，x可以是任何氨基酸；(2)中间结构域：约含有150个氨基酸；(3)C端结构域：是GTP酶效应区(GTPase effect domain，GED)，约含有100个氨基酸，其中含2个氨基酸拉链结构，有形成两性分子双螺旋的作用。
MxA蛋白的研究及相关检测试剂的开发可为临床病毒性疾病的诊断、病毒和细菌感染的鉴别诊断、IFNα/β效价测定及IFNα/β临床疗效判定、MxA蛋白表达与疾病发生和发展的相关性等提供了快速、简便、敏感的测定方法。
目前，抗病毒蛋白MxA的检测方法有酶联免疫法、磁微粒化学发光法、胶乳增强免疫比浊法，但是酶联免疫法、磁微粒化学发光法检测抗病毒蛋白MxA表现出耗时长、灵敏度低等缺陷，胶乳增强免疫比浊法检测抗病毒蛋白MxA也表现出灵敏度低等缺陷，限制了MxA抗体及其检测试剂的推广应用。
发明内容
有鉴于此，本发明的主要目的在于提供一种抗MxA单克隆抗体组合物及其应用；所解决的技术问题是通过抗MxA单克隆抗体组合物识别并结合MxA蛋白中的特异性位点，可增强该单克隆抗体的免疫特异性；包含所述抗MxA单克隆抗体组合物的试剂用于生化仪或特定蛋白仪检测MxA蛋白时，可将检测时间控制在10min内，同时可将MxA蛋白的检测灵敏度提升至1ng/mL，且重复性不高于10％。
本发明的目的及解决其技术问题是采用以下技术方案来实现的。依据本发明提出的一种抗MxA单克隆抗体组合物，其包括：
第一抗MxA单克隆抗体，其能够识别MxA蛋白第77～84位氨基酸并能够结合MxA蛋白第77～84位氨基酸中的任一位点；
第二抗MxA单克隆抗体，其能够识别MxA蛋白第574～662位氨基酸并能够结合MxA蛋白第574～662位氨基酸中的任一位点；所述第一抗MxA单克隆抗体与所述第二抗MxA单克隆抗体的个数比为1:0.8～1.2。
本发明的目的及解决其技术问题还可采用以下技术方案来实现。依据本发明提出的一种如前述的抗MxA单克隆抗体组合物在检测MxA蛋白中的应用。
本发明的目的及解决其技术问题还可采用以下技术方案来实现。依据本发明提出的一种胶乳颗粒，其包被有如前述的抗MxA单克隆抗体组合物。
本发明的目的及解决其技术问题还可采用以下技术方案来实现。依据本发明提出的一种抗MxA单克隆抗体组合物包被的胶乳颗粒的制备方法，其包括以下步骤：
1)将150～250nm的羧基化聚苯乙烯微球用PBS溶液稀释；
2)加入2倍羧基量的EDC，搅拌，离心，除去上清液，保留胶乳颗粒的沉淀；将胶乳颗粒的沉淀用PBS溶液复溶；
3)向复溶的胶乳颗粒中加入如权利要求1所述的抗MxA单克隆抗体组合物，搅拌，离心，除去上清液，保留胶乳颗粒沉淀；用R2缓冲液将沉淀重悬，得到抗MxA单克隆抗体组合物包被的胶乳颗粒；所述R2缓冲液为包含PBS、NaCl、BSA和Proclin300的溶液。
本发明的目的及解决其技术问题还可采用以下技术措施进一步实现。
优选的，前述的制备方法，其中所述抗MxA单克隆抗体组合物的包被量为每毫克胶乳颗粒上包被15微克抗MxA单克隆抗体组合物。
本发明的目的及解决其技术问题还可采用以下技术方案来实现。依据本发明提出的一种试剂，其包含如前述的抗MxA单克隆抗体组合物。
本发明的目的及解决其技术问题还可采用以下技术措施进一步实现。
优选的，前述的试剂，其包括R1试剂和R2试剂；其中，R1试剂为含有PBS、NaCl、Triton X-100、NP-40、PEG6000和Proclin300的溶液；R2试剂为含有如权利要求1所述的抗MxA单克隆抗体组合物包被的胶乳颗粒、PBS、NaCl、BSA和Proclin300的溶液。
优选的，前述的试剂，其中所述R1试剂中各组分含量如下：PBS的浓度为40～100mM，NaCl的浓度为0.9％～1.8％，Triton X-100的浓度为0.3％～1.0％，NP-40的浓度为0.05％～0.3％，PEG6000的浓度为1.0％～4.0％，Proclin300的浓度为0.02％～0.2％；其中PBS的pH值为7.0～7.4；上述百分比为溶质的质量与PBS溶液的体积之比，其中溶质的质量单位为克，PBS溶液的体积单位为毫升。
优选的，前述的试剂，其中所述R2试剂中各组分含量如下：抗MxA单克隆抗体组合物包被的胶乳颗粒的浓度为1.0～2.0mg/mL，PBS的浓度为40～100mM，NaCl的浓度为0.9％～1.8％，BSA的浓度为0.5％～2.0％，Proclin300的浓度为0.02％～0.2％；其中PBS的pH值为7.0～7.4；上述百分比为溶质的质量与PBS溶液的体积之比，其中溶质的质量单位为克，PBS溶液的体积单位为毫升。
本发明的目的及解决其技术问题还可采用以下技术方案来实现。依据本发明提出的一种如前述的试剂在检测MxA蛋白中的应用。
借由上述技术方案，本发明提出的一种抗MxA单克隆抗体组合物及其应用至少具有下列优点：
本发明所提供的抗MxA单克隆抗体组合物，其能够识别并结合MxA蛋白中的特异性位点，可增强该单克隆抗体的免疫特异性；应用所述抗MxA单克隆抗体制备MxA胶乳检测试剂，使用该试剂检测MxA蛋白时，可将MxA蛋白的检测灵敏度提升至1ng/mL，且检测重复性不高于10％；同时，使用该试剂在生化仪或特定蛋白仪上检测MxA蛋白时，可将检测时间控制在10min内。
上述说明仅是本发明技术方案的概述，为了能够更清楚了解本发明的技术手段，并可依照说明书的内容予以实施，以下以本发明的较佳实施例详细说明如后。
附图说明
图1为实施例中采用Logistic四参数拟合的标准曲线。
具体实施方式
为更进一步阐述本发明为达成预定发明目的所采取的技术手段及功效，以下结合附图及较佳实施例，对依据本发明提出的一种抗MxA单克隆抗体组合物及其应用，其具体实施方式、结构、特征及其功效，详细说明如后。
本发明提出一种抗MxA单克隆抗体组合物，其包括第一抗MxA单克隆抗体，其能够识别MxA蛋白第77～84位氨基酸并能够结合MxA蛋白第77～84位氨基酸中的任一位点；其还包括第二抗MxA单克隆抗体，其能够识别MxA蛋白第574～662位氨基酸并能够结合MxA蛋白第574～662位氨基酸中的任一位点；所述第一抗MxA单克隆抗体与所述第二抗MxA单克隆抗体的个数比原则上为1:1；从计量成本以及操作误差考虑，本发明限定所述第一抗MxA单克隆抗体与所述第二抗MxA单克隆抗体的个数比为1:0.8～1.2，也即二者在比例上允许有5％的波动。
所述第一抗MxA单克隆抗体与第二抗MxA单克隆抗体的长度大致为150～160kD，也即两种抗MxA单克隆抗体的分子量相差不大，为了方便计量，一般操作时会以重量比进行计量。
上述MxA蛋白的Uniprot(Universal Protein的英文缩写，是信息最丰富、资源最广的蛋白质数据库)识别号为P20591-1，其分子量为75.5kD，共含有662个氨基酸，其氨基酸序列如下：
MVVSEVDIAK(10)ADPAAASHPL(20)LLNGDATVAQ(30)KNPGSVAENN(40)LCSQYEEKVR(50)PCIDLIDSLR(60)ALGVEQDLAL(70)PAIAVIGDQS(80)SGKSSVLEAL(90)SGVALPRGSG(100)IVTRCPLVLK(110)LKKLVNEDKW(120)RGKVSYQDYE(130)IEISDASEVE(140)KEINKAQNAI(150)AGEGMGISHE(160)LITLEISSRD(170)VPDLTLIDLP(180)GITRVAVGNQ(190)PADIGYKIKT(200)LIKKYIQRQE(210)TISLVVVPSN(220)VDIATTEALS(230)MAQEVDPEGD(240)RTIGILTKPD(250)LVDKGTEDKV(260)VDVVRNLVFH(270)LKKGYMIVKC(280)RGQQEIQDQL(290)SLSEALQREK(300)IFFENHPYFR(310)DLLEEGKATV(320)PCLAEKLTSE(330)LITHICKSLP(340)LLENQIKETH(350)QRITEELQKY(360)GVDIPEDENE(370)KMFFLIDKVN(380)AFNQDITALM(390)QGEETVGEED(400)IRLFTRLRHE(410)FHKWSTIIEN(420)NFQEGHKILS(430)RKIQKFENQY(440)RGRELPGFVN(450)YRTFETIVKQ(460)QIKALEEPAV(470)DMLHTVTDMV(480)RLAFTDVSIK(490)NFEEFFNLHR(500)TAKSKIEDIR(510)AEQEREGEKL(520)IRLHFQMEQI(530)VYCQDQVYRG(540)ALQKVREKEL(550)EEEKKKKSWD(560)FGAFQSSSAT(570)DSSMEEIFQH(580)LMAYHQEASK(590)RISSHIPLII(600)QFFMLQTYGQ(610)QLQKAMLQLL(620)QDKDTYSWLL(630)KERSDTSDKR(640)KFLKERLARL(650)TQARRRLAQF(660)PG
由上述氨基酸序列可见，所述MxA蛋白第77～84位氨基酸为GDQSSGKS，其属于GTP结合结构域；所述MxA蛋白第574～662位氨基酸为MEEIFQHLMAYHQEASKRISSHIPLIIQFFMLQTYGQQLQKAMLQLLQDKDTYSWLLKERSDTSDKRKFLKERLARLTQARRRLAQFPG，属于GTP酶效应区GED。
所述抗MxA单克隆抗体组合物与MxA蛋白抗原结合时，第一抗MxA单克隆抗体需要与MxA蛋白抗原的第77-84位氨基酸中的任一位点结合，第二抗MxA单克隆抗体需要与MxA蛋白抗原的第574-662位氨基酸中的任一位点结合。所述第一抗MxA单克隆抗体和第二抗MxA单克隆抗体同时与MxA蛋白抗原反应，形成“第一抗MxA单克隆抗体-MxA蛋白抗原-第二抗MxA单克隆抗体”的复合物，且，反应时使所述第一抗MxA单克隆抗体和第二抗MxA单克隆抗体均过量投放，从而使几乎全部的MxA蛋白抗原均能够参与反应形成复合物，然后通过测量反应开始至反应预设时间之间的光强度变化值并与标准曲线比对，得到复合物的浓度值，也即MxA蛋白抗原的浓度值。
本发明的抗MxA单克隆抗体与MxA蛋白抗原结合时，其表位单一，特异性强，生成的“第一抗MxA单克隆抗体-MxA蛋白抗原-第二抗MxA单克隆抗体”复合物结构一致，不存在不同表位结合生成的复合物多样的情况，不存在多表位结合的假性数据，因此应用本发明的抗MxA单克隆抗体组合物进行MxA蛋白抗原浓度检测时，其检验结果准确，检测灵敏度可高达1ng/mL。
本发明优选所述第一抗MxA单克隆抗体与所述第二抗MxA单克隆抗体的个数比为1:1，该种精准计量条件下的等量投放抗体，在反应时投放的抗体量在满足大于MxA抗原数量的基础上，会尽可能减少抗体的投放量，可以节约抗体的材料成本。
所述第一抗MxA单克隆抗体、第二抗MxA单克隆抗体与MxA蛋白抗原的结合位点可以通过测量OD 450值进行确认。上述抗MxA单克隆抗体组合物应用于MxA蛋白检测时具有较好的效果，检测灵敏度高达1ng/mL，其在1ng/mL的MxA蛋白抗原浓度水平下的检测重复性＜10％，且，检测快捷高效，10min之内即可获得检测结果。
本发明还提出一种胶乳颗粒，所述胶乳颗粒包被有前述的抗MxA单克隆抗体组合物。所述胶乳颗粒包被抗MxA单克隆抗体组合物后，可以用于配制MxA蛋白的胶乳检测试剂。
本发明还提出一种抗MxA单克隆抗体包被的胶乳颗粒的制备方法，其包括以下步骤：将150～250nm的羧基化聚苯乙烯微球用PBS溶液按体积比稀释20倍；所述PBS溶液又称磷酸盐缓冲溶液，一般选择Na2HPO4和KH2PO4配制；设置稀释胶乳颗粒的目的是为后续工序中EDC活化胶乳颗粒以及抗体包被胶乳颗粒这两步化学反应提供合适的反应条件；所述胶乳颗粒粒径范围的设置主要是依据MxA检测试剂的校准浓度的范围，再根据日常实验经验进行判断和选择。向其中加入2倍羧基量的EDC，搅拌，离心，除去上清液，保留胶乳颗粒的沉淀；所述EDC是1-(3-Dimethyl aminopropyl)-3-ethylcarbo-diimide的缩写，中文名称是1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺，是可溶于水的碳二亚胺；加入EDC的目的是为了活化羧基化聚苯乙烯胶乳颗粒上的羧基，降低胶乳颗粒上的羧基与抗体上的伯氨基进行化学反应时的活化能。将胶乳颗粒的沉淀用PBS溶液复溶；再向其中加入前述的抗MxA单克隆抗体组合物，搅拌，离心，除去上清液，保留胶乳颗粒的沉淀；加入抗MxA单克隆抗体组合物后，抗体上的伯氨基与经EDC活化的羧基产生化学反应，形成酰胺键，从而固定在胶乳颗粒表面。最后用R2缓冲液将沉淀重悬，至胶乳颗粒的使用浓度，得到抗MxA单克隆抗体组合物包被的胶乳颗粒；所述R2缓冲液为包含PBS、NaCl、BSA和Proclin300的溶液；R2缓冲液中添加PBS和NaCl的目的是为了提供一个稳定的胶乳颗粒和抗体的储存环境；添加BSA的目的是为了封闭胶乳颗粒表面的裸露位点，提升胶乳颗粒的悬浮能力，以保护抗体免受液体中自由基的氧化而破坏；添加Proclin300的目的是作为防腐剂使用。
上述抗MxA单克隆抗体组合物包被的胶乳颗粒被重悬于R2缓冲液中，且抗MxA单克隆抗体组合物包被的胶乳颗粒的浓度被调整为胶乳颗粒的使用浓度，可以用作MxA蛋白的检测试剂。
优选的，所述抗MxA单克隆抗体组合物的包被量为每毫克胶乳颗粒上包被15微克抗MxA单克隆抗体组合物。
本发明还提出一种试剂，其包含前述的抗MxA单克隆抗体组合物。
优选的，所述试剂同时包括R1试剂和R2试剂。
所述R1试剂为含有PBS、NaCl、TritonX-100、NP-40、PEG6000和Proclin300的溶液；其中各组分含量如下：PBS的浓度为40～100mM，NaCl的浓度为0.9％～1.8％，TritonX-100的浓度为0.3％～1.0％，NP-40的浓度为0.05％～0.3％，PEG6000的浓度为1.0％～4.0％，Proclin300的浓度为0.02％～0.2％；其中PBS的pH值为7.0～7.4；上述的百分比浓度的单位为质量体积百分比，也即溶质的质量比上PBS溶液的体积，其中溶质的质量单位为克，PBS溶液的体积单位为毫升。
R1试剂中添加PBS缓冲液和NaCl的使用是为了提供一个合适的抗原、抗体反应的环境；添加Triton X-100和NP40的作用都是为了裂解人血液样本中细胞膜，保障细胞内MxA抗原蛋白的快速释放，以及降低抗原、抗体结合时的非特异性反应；添加PEG的作用是加快抗原、抗体反应的速度；添加Proclin300的作用是作为防腐剂。
所述R2试剂为含有前述的抗MxA单克隆抗体组合物包被的胶乳颗粒、PBS、NaCl、BSA和Proclin300的溶液；其中各组分含量如下：抗MxA单克隆抗体组合物包被的胶乳颗粒的浓度为1.0～2.0mg/mL，PBS的浓度为40～100mM，NaCl的浓度为0.9％～1.8％，BSA的浓度为0.5％～2.0％，Proclin300的浓度为0.02％～0.2％；其中PBS的pH值为7.0～7.4；上述的百分比浓度的单位为质量体积百分比，也即溶质的质量比上PBS溶液的体积，其中溶质的质量单位为克，PBS溶液的体积单位为毫升。
R2试剂中添加PBS缓冲液和NaCl的使用是为了提供一个稳定的胶乳颗粒和抗体的储存环境；添加BSA的作用是为封闭胶乳颗粒表面的裸露位点，提升胶乳颗粒的悬浮能力，保护抗体免受液体中自由基的氧化破坏；添加Proclin300的作用是作为防腐剂。
本发明还提出一种如前述的试剂在检测MxA蛋白中的应用。
下面将结合具体实施例对本发明作进一步说明，但不能理解为是对本发明保护范围的限制，该领域的技术人员根据上述本发明的内容对本发明作出的一些非本质的改进和调整，仍属于本发明的保护范围。
若无特殊说明，以下所涉及的材料、试剂等均为本领域技术人员熟知的市售商品；若无特殊说明，所述方法均为本领域公知的方法。除非另外定义，所使用的技术术语或者科学术语应当为本发明所属领域内的普通技术人员所理解的通常意义。
实施例1：试剂配制
配制R1试剂：
向浓度为100mM、pH值为7.2的PBS溶液中加入NaCl、Triton X-100、NP-40、PEG6000和Proclin300，使各组分的质量体积百分含量如下：NaCl含量为0.9％、Triton X-100含量为0.4％、NP-40含量为0.1％、PEG6000含量为2％和Proclin300含量为0.1％；上述的百分比浓度的单位为质量体积百分比，也即溶质的质量比上PBS溶液的体积，其中溶质的质量单位为克，PBS溶液的体积单位为毫升。
上述试剂中，所述Triton X-100为聚乙二醇辛基苯基醚，是一种非离子型表面活性剂(或称去污剂)，其中文名为曲拉通X-100，分子量为646.86，化学结构式为C34H62O11，它能溶解脂质以增加细胞膜对抗体的通透性。所述NP-40是试剂Nonidet P 40的缩写，其中文名称为乙基苯基聚乙二醇，它是一种温和的非离子型去垢剂，结合特定的缓冲液可以获得胞浆蛋白，用于防止物质分子疏水间相互作用，确保蛋白的充分溶解和结构稳定，尤其用于膜蛋白的非变性条件下的溶解。所述PEG6000中文名称为聚乙二醇6000，英文名称为Macrogol 6000，其在水或乙醇中易溶。所述Proclin300是一种防腐剂，其能够迅速穿透细胞膜，抑制对细胞呼吸至关重要的特定酶，适用于体外医学诊断。
配制R2缓冲液：
向浓度为100mM、pH值为7.2的PBS溶液中加入NaCl、BSA和Proclin300，使各组分的质量体积百分含量如下：NaCl含量为1.25％、BSA含量为2％和Proclin300含量为0.1％；上述的百分比浓度的单位为质量体积百分比，也即溶质的质量比上PBS溶液的体积，其中溶质的质量单位为克，PBS溶液的体积单位为毫升。
上述试剂中，所述BSA是牛血清白蛋白，又称第五组分，是牛血清中的一种白蛋白，包含583个氨基酸残基。与前文相同的试剂不再赘述。
制备抗MxA单克隆抗体组合物包被的胶乳颗粒：
取200nm羧基化聚苯乙烯微球(购自JSR，货号P0113)0.6mL(包含60mg干微球)，与11.4mL的50mM、pH值7.2的PBS溶液混合均匀。向其中加入1.73mg的EDC，室温条件下以300rpm的速度搅拌3h，以10000rpm的速度离心20min，除去上清液，保留胶乳颗粒的沉淀，用24mL的PBS溶液复溶前述的胶乳颗粒沉淀。将2株分别针对不同表位的抗MxA单克隆抗体各0.45mg，共计0.9mg混合后，将混合的抗MxA单克隆抗体加入上述复溶的胶乳颗粒中，在室温条件下以300rpm的速度搅拌3h，以10000rpm的速度离心20min，除去上清液，保留胶乳颗粒的沉淀；最后用R2缓冲液重悬前述的胶乳颗粒的沉淀，使胶乳颗粒的浓度为1.5mg/mL。
上述2株分别针对不同表位的抗MxA单克隆抗体的获取方法如下：
1)脾细胞制备
将100μg MxA-KLH(MxA偶联的血蓝蛋白)与弗氏完全佐剂等体积充分混合，制备成200μL混悬液，注射入BALB/c小鼠(白变种实验室老鼠)后腿肌肉。
于小白鼠第一次注射混悬液的第14天、第28天、第35天，分别将100μgMxA-KLH(MxA偶联的血蓝蛋白)与弗氏不完全佐剂等体积充分混合，制备成200μL混悬液，注射入该BALB/c小鼠的后腿肌肉中进行加强免疫。在末次免疫的一周后进行采血。
在酶标板孔内包被100ng MxA蛋白，采用间接ELISA法检测血清中抗体效价，血清稀释104倍后OD值为1.085，随后进行抗原冲击，3天后做脾细胞融合。
2)脾细胞与杂交瘤细胞融合
在细胞融合前3天，扩大培养小鼠骨髓瘤细胞SP2/0并计数。
处死小鼠，分离小鼠脾脏，制备小鼠脾细胞悬液并计数。
脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0按细胞数比例2：1混匀，离心后弃上清液。
低速涡旋状态下，缓慢滴加37℃预热的PEG4000，滴加数量同所弃上清液的体积。
于37℃条件下静置90s，再加入37℃预热的无血清IMDM培养基，滴加数量为PEG4000体积量的20倍。
静置10min后，离心，收集细胞，加入HAT培养基重悬细胞。
将融合后的细胞加入96孔细胞培养板，100μL/孔，置于37℃5％CO2细胞培养箱内培养，每3天换1次培养基，待杂交瘤细胞长至孔底面积10％以上时，取培养上清进行ELISA检测，一共得到6株抗MxA单克隆抗体，按照其在96孔细胞培养板上的横纵坐标分别将抗体编号计为1A1、1A4、2B6、3D2、3E7和4F4。
3)抗MxA单克隆抗体结合抗原表位筛选
合成生物素标记的MxA蛋白片段多肽，测定抗人MxA单克隆抗体在MxA上的结合区域，本实施例设置结合区域分为四个区域，分别为P1(aa：1-76)、P2(aa：77-84)、P3(aa：85-573)、P4(aa：574-662)。采用ELISA方法分析抗MxA单克隆抗体的结合抗原表位，结果如表1所示。
表1抗MxA单克隆抗体结合表位筛选结果(OD450值)
Figure BDA0003596621250000111
由表1的测试数据可知，抗MxA单克隆抗体1A1与P2多肽片段的OD 450值为2.159，结合于P2，不与P1、P3、P4反应；1A4与P4多肽片段的OD 450值为2.486，结合于P4，不与P1、P2、P3反应；本实施例中筛选出的针对P2序列结合的抗MxA单克隆抗体为1A1号抗体，针对P4序列结合的抗MxA单克隆抗体为1A4号抗体。
实施例2：标准曲线建立
稀释MxA蛋白抗原，使其浓度分别为0ng/mL、5ng/mL、20ng/mL、80ng/mL、200ng/mL、500ng/mL，以上述稀释的MxA蛋白抗原作为校准品，分别计为S20、S21、S22、S23、S24、S25。
使用天津华科泰生物技术有限公司的Savant-A310特定蛋白仪进行反应度检测。
将R1试剂200μL、测试样本5μL和R2试剂40μL进行混合，使其反应5分钟后进行反应度检测。检测结果如下表2所示。
表2实施例2的校准浓度和反应度
Figure BDA0003596621250000112
Figure BDA0003596621250000121
采用Logistic四参数进行曲线拟合，得到的标准曲线如附图1所示。标准曲线的方程如下：
y＝(18939.25151-61.09797)/[1+(x/266.67069)^(-0.98602)]+61.09797
上述标准曲线的相关系数R为0.9999。
实施例3：灵敏度检测
将浓度为5ng/mL的MxA蛋白抗原的校准品S1稀释5倍，使其浓度低至1ng/mL。
将R1试剂200μL、测试样本5μL和R2试剂40μL进行混合，使其反应5分钟后再使用天津华科泰生物技术有限公司的Savant-A310特定蛋白仪进行反应度检测；重复检测10次，记录检测结果如下表3所示。
表3实施例3的检测结果
Figure BDA0003596621250000122
Figure BDA0003596621250000131
由上述表3的测试数据可见，共重复检测10次，其中最大值1.1ng/Ml,最小值0.85ng/mL，平均值M为0.976ng/mL，总体标准差SD为0.093595，重复性CV为9.59％。
上述平均值M为检测结果的算术平均值，在excel中的函数符号为AVERAGE(检测结果1，检测结果2，……)。
上述SD为给定样本的标准偏差函数，能反映一个数据集相对于平均值(mean)的离散程度，是用来计算研究对象的标准差，在excel中的函数符号为STDEV(检测结果1，检测结果2，……)。
所述重复性CV是指相对标准偏差，是用检测数据的标准偏差和平均值的比值计算而得，一般检测仪器对重复性的要求为小于10％。
通过表2的测试数据可知，本发明提供的抗MxA单克隆抗体组合物包被于胶乳颗粒得到抗MxA单克隆抗体组合物包被的胶乳颗粒，将其在R2缓冲液中重悬得到R2试剂，其与R1试剂一起用于检测浓度为1ng/mL的MxA蛋白抗原样本时，其重复性CV，也即变异系数较低，仅为9.59％，不高于10％，说明，本发明提供的MxA胶乳检测试剂的灵敏度可达1ng/mL。
本实施例的检测方法检测MxA蛋白抗原浓度时，其耗时小于10min。
实施例4：试剂配制
配制R1试剂：
向浓度为40mM、pH值为7.0的PBS溶液中加入NaCl、Triton X-100、NP-40、PEG6000和Proclin300，使各组分的质量体积百分含量如下：NaCl含量为0.9％、Triton X-100含量为0.3％、NP-40含量为0.05％、PEG6000含量为4％和Proclin300含量为0.02％；上述的百分比浓度的单位为质量体积百分比，也即溶质的质量比上PBS溶液的体积，其中溶质的质量单位为克，PBS溶液的体积单位为毫升。
配制R2缓冲液：
向浓度为40mM、pH值为7.0的PBS溶液中加入NaCl、BSA和Proclin300，使各组分的质量体积百分含量如下：NaCl含量为0.9％、BSA含量为0.5％和Proclin300含量为0.02％；上述的百分比浓度的单位为质量体积百分比，也即溶质的质量比上PBS溶液的体积，其中溶质的质量单位为克，PBS溶液的体积单位为毫升。
制备抗MxA单克隆抗体组合物包被的胶乳颗粒：
取246nm羧基化聚苯乙烯胶乳颗粒(购自JSR，货号P0221)0.6mL(包含60mg干微球)，与11.4mL的40mM、pH值7.0的PBS溶液混合均匀。向其中加入1.73mg的EDC，室温条件下以300rpm的速度搅拌3h，以10000rpm的速度离心20min，除去上清液，保留胶乳颗粒的沉淀，用24mL的PBS溶液复溶前述的胶乳颗粒沉淀。将2株分别针对不同表位的抗MxA单克隆抗体各0.45mg，共计0.9mg混合后，将混合的抗MxA单克隆抗体加入上述复溶的胶乳颗粒中，在室温条件下以300rpm的速度搅拌3h，以10000rpm的速度离心20min，除去上清液，保留胶乳颗粒的沉淀；最后用R2缓冲液重悬前述的胶乳颗粒的沉淀，使胶乳颗粒的浓度为1.0mg/mL。本实施例中的2株分别针对不同表位的抗MxA单克隆抗体同实施例2。
实施例5：标准曲线
稀释MxA蛋白抗原，使其浓度分别为0ng/mL、5ng/mL、20ng/mL、80ng/mL、200ng/mL、500ng/mL，以上述稀释的MxA蛋白抗原作为校准品，分别计为S50、S51、S52、S53、S54、S55。
使用天津华科泰生物技术有限公司的Savant-A310特定蛋白仪进行反应度检测。
将R1试剂200μL、测试样本5μL和R2试剂40μL进行混合，使其反应5分钟后进行反应度检测。检测结果如下表4所示。
表4实施例5的校准浓度和反应度
Figure BDA0003596621250000141
Figure BDA0003596621250000151
采用Logistic四参数进行曲线拟合，得到的标准曲线的方程如下：
y＝(14855.65719–186.21314)/[1+(x/202.19551)^(-1.15792)]+186.21314
上述标准曲线的相关系数R为0.9989。
实施例6：灵敏度检验
将浓度为5ng/mL的MxA蛋白抗原的校准品S1稀释5倍，使其浓度低至1ng/mL。
将R1试剂200μL、测试样本5μL和R2试剂40μL进行混合，使其反应5分钟后再使用天津华科泰生物技术有限公司的Savant-A310特定蛋白仪进行反应度检测；重复检测10次，记录检测结果如下表5所示。
表5实施例6的检测结果
测试序号 检测结果(单位：ng/mL)
1 0.95
2 0.89
3 0.94
4 1.08
5 0.93
6 0.94
7 0.97
8 0.88
9 1.02
10 1.08
平均值M 0.968
SD 0.07068
CV 7.30％
由上述表5的测试数据可见，共重复检测10次，其中最大值1.08ng/Ml,最小值0.89ng/mL，平均值M为0.968ng/mL，总体标准差SD为0.07068，重复性CV为7.30％。
通过表5的测试数据可知，本发明提供的抗MxA单克隆抗体组合物包被于胶乳颗粒得到抗MxA单克隆抗体组合物包被的胶乳颗粒，将其在R2缓冲液中重悬得到R2试剂，其与R1试剂一起用于检测浓度为1ng/mL的MxA蛋白抗原样本时，其重复性CV，仅为7.30％，不高于10％，说明，本发明提供的MxA胶乳检测试剂的灵敏度可达1ng/mL。
本实施例的检测方法检测MxA蛋白抗原浓度时，其耗时小于10min。
实施例7：试剂配制
配制R1试剂：
向浓度为100mM、pH值为7.4的PBS溶液中加入NaCl、Triton X-100、NP-40、PEG6000和Proclin300，使各组分的质量体积百分含量如下：NaCl含量为1.8％、Triton X-100含量为1.0％、NP-40含量为0.3％、PEG6000含量为1％和Proclin300含量为0.2％；上述的百分比浓度的单位为质量体积百分比，也即溶质的质量比上PBS溶液的体积，其中溶质的质量单位为克，PBS溶液的体积单位为毫升。
配制R2缓冲液：
向浓度为100mM、pH值为7.4的PBS溶液中加入NaCl、BSA和Proclin300，使各组分的质量体积百分含量如下：NaCl含量为1.8％、BSA含量为2％和Proclin300含量为0.2％；上述的百分比浓度的单位为质量体积百分比，也即溶质的质量比上PBS溶液的体积，其中溶质的质量单位为克，PBS溶液的体积单位为毫升。
制备抗MxA单克隆抗体组合物包被的胶乳颗粒：
取168nm羧基化聚苯乙烯胶乳颗粒(购自JSR，货号P0118)0.6mL(包含60mg干微球)，与11.4mL的100mM、pH值7.4的PBS溶液混合均匀。向其中加入1.73mg的EDC，室温条件下以300rpm的速度搅拌3h，以10000rpm的速度离心20min，除去上清液，保留胶乳颗粒的沉淀，用24mL的PBS溶液复溶前述的胶乳颗粒沉淀。将2株分别针对不同表位的抗MxA单克隆抗体各0.45mg，共计0.9mg混合后，将混合的抗MxA单克隆抗体加入上述复溶的胶乳颗粒中，在室温条件下以300rpm的速度搅拌3h，以10000rpm的速度离心20min，除去上清液，保留胶乳颗粒的沉淀；最后用R2缓冲液重悬前述的胶乳颗粒的沉淀，使胶乳颗粒的浓度为2.0mg/mL。本实施例中的2株分别针对不同表位的抗MxA单克隆抗体同实施例2。
实施例8：标准曲线
稀释MxA蛋白抗原，使其浓度分别为0ng/mL、5ng/mL、20ng/mL、80ng/mL、200ng/mL、500ng/mL，以上述稀释的MxA蛋白抗原作为校准品，分别计为S80、S81、S82、S83、S84、S85。
使用天津华科泰生物技术有限公司的Savant-A310特定蛋白仪进行反应度检测。
将R1试剂200μL、测试样本5μL和R2试剂40μL进行混合，使其反应5分钟后进行反应度检测。检测结果如下表6所示。
表6实施例8的校准浓度和反应度
校准品编号 校准浓度(单位：ng/mL) 反应度
S80 0 3
S81 5 498
S82 20 1597
S83 80 4546
S84 200 8614
S85 500 13625
采用Logistic四参数进行曲线拟合，得到的标准曲线的方程如下：
y＝(25203.75942-35.26239)/[1+(x/418.17296)^(-0.90666)]+35.26239
上述标准曲线的相关系数R为0.9999。
实施例9：灵敏度检验
将浓度为5ng/mL的MxA蛋白抗原的校准品S1稀释5倍，使其浓度低至1ng/mL。
将R1试剂200μL、测试样本5μL和R2试剂40μL进行混合，使其反应5分钟后再使用天津华科泰生物技术有限公司的Savant-A310特定蛋白仪进行反应度检测；重复检测10次，记录检测结果如下表7所示。
表7实施例9的检测结果
测试序号 检测结果(单位：ng/mL)
1 1.04
2 0.94
3 0.91
4 0.95
5 0.96
6 1.05
7 1.04
8 0.92
9 1.03
10 1.11
平均值M 0.995
SD 0.067206
CV 6.75％
由上述表7的测试数据可见，共重复检测10次，其中最大值1.11ng/Ml,最小值0.91ng/mL，平均值M为0.995ng/mL，总体标准差SD为0.067206，重复性CV为6.75％。
通过表7的测试数据可知，本发明提供的抗MxA单克隆抗体组合物包被于胶乳颗粒得到抗MxA单克隆抗体组合物包被的胶乳颗粒，将其在R2缓冲液中重悬得到R2试剂，其与R1试剂一起用于检测浓度为1ng/mL的MxA蛋白抗原样本时，其重复性CV为6.75％，不高于10％，说明，本发明提供的MxA胶乳检测试剂的灵敏度可达1ng/mL。
本实施例的检测方法检测MxA蛋白抗原浓度时，其耗时小于10min。
本发明权利要求和/或说明书中的技术特征可以进行组合，其组合方式不限于权利要求中通过引用关系得到的组合。通过权利要求和/或说明书中的技术特征进行组合得到的技术方案，也是本发明的保护范围。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明技术方案的范围内。

Claims (10)

1.一种抗MxA单克隆抗体组合物，其特征在于，其包括：
第一抗MxA单克隆抗体，其能够识别MxA蛋白第77～84位氨基酸并与MxA蛋白第77～84位氨基酸中的任一位点结合；
第二抗MxA单克隆抗体，其能够识别MxA蛋白第574～662位氨基酸并与MxA蛋白第574～662位氨基酸中的任一位点结合；所述第一抗MxA单克隆抗体与所述第二抗MxA单克隆抗体的个数比为1:0.8～1.2。
2.一种如权利要求1所述的抗MxA单克隆抗体组合物在检测MxA蛋白中的应用。
3.一种胶乳颗粒，其特征在于，其包被有如权利要求1所述的抗MxA单克隆抗体组合物。
4.一种抗MxA单克隆抗体组合物包被的胶乳颗粒的制备方法，其特征在于，其包括以下步骤：
1)将150～250nm的羧基化聚苯乙烯微球用PBS溶液稀释；
2)加入2倍羧基量的EDC，搅拌，离心，除去上清液，保留胶乳颗粒沉淀；将胶乳颗粒沉淀用PBS溶液复溶；
3)向复溶的胶乳颗粒中加入如权利要求1所述的抗MxA单克隆抗体组合物，搅拌，离心，除去上清液，保留胶乳颗粒沉淀；用R2缓冲液将沉淀重悬，得到抗MxA单克隆抗体组合物包被的胶乳颗粒；所述R2缓冲液为包含PBS、NaCl、BSA和Proclin300的溶液。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述抗MxA单克隆抗体组合物的包被量为每毫克胶乳颗粒上包被15微克抗MxA单克隆抗体组合物。
6.一种试剂，其包含如权利要求1所述的抗MxA单克隆抗体组合物。
7.根据权利要求6所述的试剂，其特征在于，其包括R1试剂和R2试剂；其中，R1试剂为含有PBS、NaCl、Triton X-100、NP-40、PEG6000和Proclin300的溶液；R2试剂为含有如权利要求1所述的抗MxA单克隆抗体组合物包被的胶乳颗粒、PBS、NaCl、BSA和Proclin300的溶液。
8.根据权利要求7所述的试剂，其特征在于，所述R1试剂中各组分含量如下：PBS的浓度为40～100mM，NaCl的浓度为0.9％～1.8％，Triton X-100的浓度为0.3％～1.0％，NP-40的浓度为0.05％～0.3％，PEG6000的浓度为1.0％～4.0％，Proclin300的浓度为0.02％～0.2％；其中PBS的pH值为7.0～7.4；上述百分比为溶质的质量与PBS溶液的体积之比，其中溶质的质量单位为克，PBS溶液的体积单位为毫升。
9.根据权利要求8所述的试剂，其特征在于，所述R2试剂中各组分含量如下：抗MxA单克隆抗体组合物包被的胶乳颗粒的浓度为1.0～2.0mg/mL，PBS的浓度为40～100mM，NaCl的浓度为0.9％～1.8％，BSA的浓度为0.5％～2.0％，Proclin300的浓度为0.02％～0.2％；其中PBS的pH值为7.0～7.4；上述百分比为溶质的质量与PBS溶液的体积之比，其中溶质的质量单位为克，PBS溶液的体积单位为毫升。
10.一种如权利要求6至9任一项所述的试剂在检测MxA蛋白中的应用。
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