CN101750474A - 一种用于预测干扰素治疗丙型肝炎疗效的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种用于预测丙型肝炎病人对干扰素治疗是否有效的体外预测方法，属生物医药体外诊断试剂类，是基于目前一个在申请专利的实质性改进。仅有50％的丙肝患者对干扰素治疗有效。临床上缺乏丙肝治疗前疗效预测方法。利用免疫组化技术对丙肝病人治疗开始前肝组织内ISG15或MxA蛋白表达定位分析发现，对干扰素治疗有效和无效病人肝组织内ISG15和MxA的分布不同：这些基因在肝细胞内表达预示病人对干扰素治疗无效；在巨噬细胞内表达预示病人对于扰素治疗有效。利用该方法对31例丙肝病人干扰素治疗进行疗效预测，准确率达100％。该发明可预测丙型肝炎病人干扰素治疗前是否对干扰素治疗敏感，从而优化病人管理。
Description
技术领域 生物医药体外诊断试剂类
背景技术
我国是病毒性肝炎大国，其中绝大部分是由乙型肝炎病毒(hepatitis Bvirus，HBV)和丙型肝炎病毒(hepatitis C virus，HCV)感染引起，一般人群的乙肝表面抗原HBsAg阳性率为9.09％，丙型肝炎抗体的流行率是3.2％[1]。保守估计，目前我国有2000万的乙肝患者，4000万丙肝病毒感染者。但其中超过八成的患者接受的却是不规范的治疗，不仅影响了健康，还浪费了钱财。据统计，我国每年用在肝炎对症治疗的直接医疗费用超过500亿元。美国仅用于丙肝治疗的药物每年花费就在19.8亿美元以上。HBV和HCV感染的持续存在极易导致肝病进展成为肝硬化或原发性肝细胞性肝癌。因此，及时应用有效的抗病毒治疗对于最大限度地长期抑制或消除肝病毒，减少和防止肝功能失代偿、肝硬化、肝癌及其并发症的发生具有重要意义。
目前，慢性乙型肝炎和慢性丙型肝炎的抗病毒治疗包括干扰素α(interferon-α，IFN-α)治疗和核苷(酸)类似物治疗[2，3]，但治疗的效果并不令人满意。以丙肝治疗为例，目前聚乙二醇化干扰素联合利巴韦林已成为疗效最佳的抗病毒方案。但是治疗时间长，通常需要48周，治疗经费昂贵，常常在6万元以上。即使坚持全程足量用药，对I型病毒感染者(在中国和美国，占所有感染者中75％以上)也仅有50％的患者获得抗病毒应答效应[4]。更不用说很多患者由于不堪忍受长期抗病毒治疗时药物的毒副作用以及经济原因而中途停药。据报道，有40％的丙肝病人中途停药，仅22％的病人坚持全程足量用药，还有30％的病人由于不知道自己是否对干扰素治疗敏感而完全拒绝治疗。因此，不能完成全程足量用药治疗、中途停药以及拒绝治疗使大量本可治愈的丙肝患者变为病毒携带者及肝功能失代偿、肝硬化、肝癌而加重今后的医疗负担。在治疗开始前，医生并不知道哪些病人会对干扰素治疗有效，哪些病人会对干扰素治疗无效，因而通行的原则是对每一个有适应症的病人都治疗，这样的结果是有一半以上的病人不仅浪费昂贵的药费开支(6万元以上)，而且长期忍受对他们来说毫无用处的药物的毒副作用。基于此，目前临床上在对病毒性肝炎病人的管理上存在两大急需解决的问题：一是开发用于在治疗开始前预测病人对干扰素治疗是否有效的预测方法；二是研制更加有效的抗病毒药物。
干扰素(IFN)是一类有抗病毒、抗增殖及免疫调节等多种作用的细胞因子家族。根据来源和理化性质，可将其分为α、β和γ三种类型，IFN-α/β也称为I型IFN，IFN-γ称为II型IFN。其中，IFN-α的抗病毒作用最强，IFN-γ最弱，而免疫调节作用则以IFN-γ最强。IFN-α/β均与相同的膜受体，即干扰素α受体(interferon alpha receptor，IFNAR)结合，通过激活JAK-STAT信号传导系统而发挥其生物学作用[5]。
自1976年Greenberg首次用IFN治疗慢性乙型肝炎以来，各国学者纷纷致力于干扰素抗病毒治疗的研究，并为IFN治疗慢性乙肝/丙肝的分子机制研究以及临床治疗积累了丰富的经验。但是，其疗效差异大、无应答率高、副作用大以及价格昂贵等缺点一直困扰着各国科研工作者和临床工作者。因此，积极探索干扰素治疗无应答的分子机制对于寻找预测干扰素治疗疗效的指标以及寻求新的治疗方法有重要的意义。
国内外许多研究表明，IFN抗病毒治疗是否有效与治疗前病毒载量、病毒基因型、病毒基因组的点突变以及宿主II类HLA基因的多态性等因素有关[6-9]。但至今为止，临床上缺乏一种在治疗开始前能够预测干扰素治疗疗效的方法。这与IFN治疗无应答的内在机制尚未完全明确有关，国内外研究者仍致力于该项研究，尤其在慢性丙型肝炎(chronic hepatitis C，CHC)IFN治疗无应答的分子机制研究方面已取得了引人注目的成绩。
2003年完成的人类基因组计划使科学家拥有一张接近完整的人类基因组图谱，人类已经步入后基因组时代，人们研究的重点由发现基因转向探索基因的功能，目前对基因和基因组的结构和功能这个领域的研究，国际竞争十分激烈。但是面对成千上万的基因和蛋白序列分析的数据，常规的研究方法显然不能适应研究的需要，因此必须采用一种高通量的检测技术来解决这一难题。
基因芯片技术(microarray technology)就是近年发展起来的一项新技术，被评为1998年度世界十大科技进展之一，它通过微加工工艺在厘米见方的芯片上集成有大量的基因探针，在一次实验中可以对成千上万个基因的表达水平进行快速、准确、高效的检测，因此该技术已成为后基因组时代功能基因组研究的主要工具之一。相信随着研究的不断深入和该技术的日趋成熟，包括基因治疗的分子机制等诸多一直困惑我们的“盲区”应该会逐一得到澄清，而有关机制的阐明对细胞增殖、分化、凋亡、表型改变以及多种疾病的预防、诊治和研制开发新药具有重要意义.
对慢性病毒性肝炎干扰素治疗无应答者与应答者治疗前的肝细胞基因谱表达差异的研究，本专利的发明者以慢性丙型肝炎为研究对象，用基因芯片技术分析了对干扰素治疗有效与无效病人治疗开始前肝细胞基因表达谱的差异，发现对治疗无效者的肝细胞中ISG15，USP18、OAS2基因、MX1基因及IFI6-16基因等16个基因的表达上调，ETEF1基因和STXBP5基因的表达被抑制[10]。对其中8个基因在病人肝脏内表达水平的检测可以精确的预测病人是否对干扰素治疗有效，准确率在95％以上[11]。
基于以上发现，本专利的发明人及申请人等申请了美国发明专利(Publicationnumber：WO/2006/044017 International Application No.：PCT/US2005/028964)，该专利目前正在审理中。
本专利的申请人在前一专利的基础上，做了实质性的改进，在世界上首次发现一些基因在肝脏内的表达具有细胞特异性：通过免疫组化的方法，对肝穿活检样本中的基因表达产物-蛋白在不同细胞内的分布的检测，从而在治疗开始前对病人对干扰素治疗是否有效作出预测。该方法较前一专利(Publication number：WO/2006/044017 International Application No.：PCT/US2005/028964)基于检测多个基因mRNA表达水平预测疗效具有操作简便，可与现行的用免疫组化检测病人肝组织内的炎性程度和纤维化程度的常规检测方法结合使用，从而极大的简化流程，缩短预测时间，降低成本。
目前在美国已经有相似的用于预测治疗疗效或肿瘤复发的产品问世。例如，2006年二月六日，美国药检局(FDA)批准用于预测乳腺癌治疗后5-10年内是否复发的MammaPrint[12]，该检测同样基于基因芯片技术对基因表达水平的检测。Celera公司从一大学研究所引进并开发成功Corrhosis Risk Score用于预测肝炎病人进展为肝硬化的可能性[13]。Genome Health的Oncotype Dx BreastCancer Assay是在这一领域最成功的代表，通过对乳腺癌组织内22个差异表达基因的检测结合数据分析软件，用于预测乳腺癌对治疗的敏感性及治疗后复发的可能性[14]。仅2006年，就有14,000例病人进行了该检测；2008年全年有100,000例乳腺癌病人接受该检测，收入达到3.8亿美元。预测Herceptin对乳腺癌病人治疗是否有效的检测方法(SPOT-Light)2008年7月获FDA批准。Herceptin是一种化疗药物，特异性地作用于HER-2基因。因此该化疗药物仅对HER-2基因阳性的乳腺癌病人有效。但在所有乳腺癌病人中，仅20％的乳腺癌由HER-2异常(＞2 copies)引起。SPOT-Light用于检测这20％病人，从而避免对80％的病人应用Herceptin治疗无效。该成果被评为2008年医学界十大重大发现之一。
发明内容
本发明涉及一种应用免疫组化技术，通过检查丙型肝炎病人肝组织内一些干扰素敏感基因(如ISG15，MxA等)在不同细胞内的表达，对丙肝病人治疗开始前对干扰素治疗是否有效(敏感)做出预测。治疗前的疗效预测属个体化医疗(personalized medicine)领域，是当今医学发展的必然方向。疗效预测病人对特定治疗有效，可以极大的坚定病人坚持全程足量用药的信心，从而提高治愈率；如果预测无效，可以帮助医生更好的选择其它治疗方案，达到降低治疗成本，更加有效的管理病人的目的。
附图说明
图1：对干扰素治疗有效和无效的丙肝病人肝脏中ISG15蛋白表达的细胞特异性(免疫组化检测结果)
A.对干扰素治疗无效病人肝脏组织内ISG15蛋白的表达主要集中在肝细胞内(50X)
B.对干扰素治疗无效病人肝脏组织内ISG15蛋白的表达主要集中在肝细胞内(400X)
C.对干扰素治疗有效病人肝脏组织内ISG15蛋白的表达主要集中在巨噬细胞内(50X)
D.对干扰素治疗有效病人肝脏组织内ISG15蛋白的表达主要集中在巨噬细胞内(400X)
图2：对干扰素治疗有效和无效的丙肝病人肝脏中MxA蛋白表达的细胞特异性(免疫组化检测结果)
A.对干扰素治疗无效病人肝脏组织内MxA蛋白的表达主要集中在肝细胞内(50X)
B.对干扰素治疗无效病人肝脏组织内MxA蛋白的表达主要集中在肝细胞内(400X)
C.对干扰素治疗有效病人肝脏组织内MxA蛋白的表达主要集中在巨噬细胞内(50X)
D.对干扰素治疗有效病人肝脏组织内MxA蛋白的表达主要集中在巨噬细胞内(400X)
图3：巨噬细胞特异性染色(CD68)
用针对巨噬细胞表面特异性抗原CD68的抗体作为第一抗体来证明在对治疗有效的病人肝脏组织中表达ISG15蛋白的细胞为巨噬细胞
A.对干扰素治疗有效病人肝脏组织内ISG15蛋白的典型表达细胞(400X)
B.对干扰素治疗有效病人肝脏组织内ISG15蛋白表达细胞不是星型胶质细胞(stellate cells，smooth muscle actin，SMA染色)
C.对干扰素治疗有效病人肝脏组织内ISG15蛋白表达细胞是巨噬细胞(巨噬细胞特异性CD68染色)
图4：免疫组化预测干扰素治疗丙肝疗效流程图
具体实施方式
应用免疫组化对肝穿活检样品组织中的ISG15或MxA蛋白表达的细胞特异性差异预测干扰素治疗丙肝病毒感染者的疗效
该专利的发明人及申请人研究发现，干扰素治疗开始前，肝脏组织内特定蛋白的表达存在细胞特异性。例如，ISG15或MxA等干扰素刺激(敏感)基因的表达产物(蛋白)如果主要集中在肝细胞内，则该病人对即将开始的干扰素治疗无效；如果这些蛋白的表达主要集中在巨噬细胞内，则该病人对干扰素的治疗有效。
具体的实施方式如下：
1.丙肝病人肝穿活检样本的获取：现行的临床操作规范要求在治疗前常规取肝穿活检样本，用以评估病人肝脏的炎性化、纤维化程度；本检测可以用该常规方法获取的肝穿活检样本而不需要重新肝穿取肝组织。
2.肝穿活检样本用10％福尔马林固定，石蜡包埋后，切成4m厚的薄片。用hematoxylin/eosin常规染色。
3.ISG15或MxA染色：上述病理切片经Tris-EDTA(pH9.0)(MxA)或磷酸缓冲液(pH6.0)(ISG15)处理后，分别用鼠抗人MxA单克隆抗体(1∶300稀释)或兔抗人ISG15抗血清(1∶300稀释)为第一抗体作用1小时后用通用的显色试剂盒MACH 4 Universal AP Polymer Kit(BiocareMedical，Concord，CA)进行显色。
4.在显微镜下(50x和400x)观察ISG15或MxA蛋白在不同细胞内的分布。
5.疗效预测：如果ISG15或MxA蛋白主要分布在肝细胞内，则该病人对干扰素治疗不敏感(无效)；如果ISG15或MxA蛋白主要分布在巨噬细胞内，则该病人对干扰素治疗敏感(有效)；见图1-2
巨噬细胞特异性抗原(CD68)染色证实了对干扰素治疗有效的病人肝组织内的着色细胞为巨噬细胞而不是与其形态相似的星型胶质细胞(图3)。
利用该方法对31例丙肝病毒感染者(其中15例对干扰素治疗有效，16例对干扰素治疗无效)进行疗效预测，准确率100％。
疗效预测流程见图4。
Claims (6)
1.一种治疗开始前用于预测病人对特定治疗用药物是否敏感或有效的方法。通过检测病人样本中特定物质生物学含量的改变或在不同细胞中的分布不同对特定的治疗药物的疗效进行预测。本专利的专有特征是利用一些干扰素敏感基因的表达具有细胞特异性发明了一种简单，快速，准确的预测干扰素治疗丙肝病毒感染者是否有效的方法。
2.权利要求1中，丙肝病毒感染者对干扰素治疗有效和无效者之间治疗开始前肝脏组织内，部分或全部干扰素刺激/敏感基因(Interferon Stimulated/Sensitive Gene，ISG)蛋白表达的细胞特异性。
3.权利要求1中，基于ISG15蛋白表达细胞特异性而开发出的用于预测丙肝病人对干扰素治疗是否敏感(有效)的疗效预测方法：包括但不限于应用免疫组化(Immunohistochemistry)检测ISG15蛋白表达的细胞特异性(说明书附图1)。
4.权利要求1中，基于MxA蛋白表达细胞特异性而开发出的用于预测丙肝病人对干扰素治疗是否敏感(有效)的疗效预测方法：包括但不限于应用免疫组化(Immunohistochemistry)检测MxA蛋白表达的细胞特异性(说明书附图2)。
5.权利要求1中，基于ISG15和MxA蛋白表达细胞特异性而开发出的用于预测丙肝病人对干扰素治疗是否敏感(有效)的疗效预测方法：包括但不限于应用免疫组化(Immunohistochemistry)检测MxA蛋白表达的细胞特异性(说明书附图1，2)。
6.权利要求1中，基于其它干扰素敏感基因蛋白表达细胞特异性而开发出的用于预测丙肝病人对干扰素治疗是否敏感(有效)的疗效预测方法：包括但不限于应用免疫组化(Immunohistochemistry)检测这些蛋白表达的细胞特异性。
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