CN102485907B - 干扰素治疗慢性丙型肝炎转归预测基因芯片 - Google Patents

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本发明涉及一种基因芯片，用于慢性丙型肝炎转归预测。该基因芯片包括ISG56、ISG20等12条基因片段。应用此项发明，在患者应用干扰素治疗的早期或治疗前，即对干扰素治疗的长期疗效进行预测，有助于慢性丙肝患者治疗方案的优化和选择，减少患者痛苦和治疗费用。检测方便，便于临床应用。

Description

干扰素治疗慢性丙型肝炎转归预测基因芯片
【技术领域】
本发明涉及一种基因芯片，具体来说涉及一种慢性丙型肝炎转归预测基因芯片。
【背景技术】
丙型肝炎病毒(HCV)感染是当前最重要的病毒感染性疾病之一。全球约1.7亿人慢性感染HCV，慢性HCV感染可能进一步发展为肝硬化甚至肝癌。由于当前尚无有效疫苗，目前每年仍新增三到四百万HCV感染者。干扰素α(IFN-α)和利巴韦林联合治疗是目前最为有效的治疗方法，但其需要皮下注射用药，用药周期很长，治疗费用昂贵，有多种药物副作用等不利因素；而干扰素治疗后的HCV持续病毒学应答仅约50％。因此发现可以对IFN-α治疗慢丙肝的预后进行预测判断的因素，无疑有助于减轻患者医疗痛苦和经济负担[1]。
基因芯片又称为DNA微阵列(DNA microarray)，可分为三种主要类型：1)固定在聚合物基片(尼龙膜，硝酸纤维膜等)表面上的核酸探针或cDNA片段，通常用同位素标记的靶基因与其杂交，通过放射显影技术进行检测。这种方法的优点是所需检测设备与目前分子生物学所用的放射显影技术相一致，相对比较成熟。但芯片上探针密度不高，样品和试剂的需求量大，定量检测存在较多问题。2)用点样法固定在玻璃板上的DNA探针阵列，通过与荧光标记的靶基因杂交进行检测。这种方法点阵密度可有较大的提高，各个探针在表面上的结合量也比较一致，但在标准化和批量化生产方面仍有不易克服的困难。3)在玻璃等硬质表面上直接合成的寡核苷酸探针阵列，与荧光标记的靶基因杂交进行检测。该方法把微电子光刻技术与DNA化学合成技术相结合，可以使基因芯片的探针密度大大提高，减少试剂的用量，实现标准化和批量化大规模生产，有着十分重要的发展潜力。
【发明内容】
本发明的目的是提供一种基因芯片，用于预测干扰素治疗慢性丙型肝炎效果。
干扰素抗病毒生物学功能的发挥主要依赖于干扰素信号通路激活后下游各种干扰素刺激基因(Interferon stimulate gene，ISG)的表达。I型干扰素与细胞表面受体结合后，通过激活JAK-STAT通路诱导下游干扰素刺激基因ISG的表达，而ISG在抑制病毒复制中可能起直接作用。病毒生活周期中的病毒进入细胞、转录、RNA定植、翻译、病毒成熟、装配及释放等多个环节，均可能成为IFN的作用靶点。既往的基因芯片分析显示IFNα诱导表达ISG数量可达近千个。对当前可查及的一些数据，如黑猩猩HCV感染模型、HCV感染者的肝组织样本和IFN-α处理的Huh7细胞检测的综合分析显示数十个ISGs的表达可能与HCV的清除有较密切相关[2-5]。而既往经证实对HCV复制有调节作用的ISG有以下几个：①2，5’-OAS/RNase L通路可降解HCV RNA[6]；②PKR可抑制HCVRNA的翻译过程[7]。③近年研究显示Viperin通过其N末端的α双性分子定位于脂滴，通过SAM区抑制HCV RNA复制[5，8]。④ISG56可抑制病毒蛋白的翻译而降低病毒水平[9]；⑤ISG20通过其外切酶活性减少HCV RNA的水平[10]。⑥ISG15和USP18可促进HCV的复制，并削弱了IFNa和利巴韦林联合治疗清除HCV的能力，siRNA敲除其表达可有助于加强IFN抑制HCV RNA复制的能力[11，12]。⑦我们研究发现BST2可以抑制HCV病毒的释放。
上述体内外研究揭示了ISG与HCV清除的相关性，但这些ISG在临床上干扰素治疗慢性丙肝患者中的意义并不明确。通过对临床样本的随访研究，我们发现干扰素治疗慢性丙肝患者肝组织或者外周血单个核细胞中以下12个ISG基因(表一)在治疗前后的表达改变，在治疗早期或治疗前预测IFN治疗的长期疗效有预测价值。
表一 对干扰素治疗慢性丙肝预后有预测功能的干扰素刺激基因列表
  基因序列编号   干扰素刺激基因   基因银行登录号/Genbank assession No.
  1   ISG56   ISG56NM_001548
  2   ISG20   ISG20NM_002201
  3   Viperin   AF442151
  4   PKR   NM_002759
  5   ISG15   NM_005101
  6   OAS1   NM_002534
  7   USP18   NM_017414
  8   BST2   NM_004335
  9   RPS28   NM_001031
  10   ATF-5   NM_012068
  11   CEB1   NM_016323
  12   DUSP1   NM_004417
注：上述ISG的序列见所附序列表。
据表一中的基因列表，设计合适的探针，并将之固定至基质上制成高通量的基因芯片。
采慢性丙肝患者治疗前和干扰素治疗早期(如第48h)的外周血单个核细胞，用Trizol试剂提取mRNA；或者在治疗前分离慢性丙肝患者的外周血单个核细胞行体外细胞培养，并进行干扰素诱导处理2天或不处理(对照组)，用Trizol试剂提取mRNA。
将待测样品mRNA用荧光或其它方法标记后作为靶分子，与基因芯片上的探针列阵杂交。杂交信号用激光共聚焦扫描显微镜检测，并用专用软件记录分析后得出检测结果。由于在基因芯片列阵中某一特定位置上的探针是已知的，所以对微列阵每一位点的荧光强度进行检测，并和内参基因Actin进行比较，即可对ISG的表达进行相对定量分析[13]。
对得到的治疗前后或诱导前后样本中ISG表达的相对定量结果，并进行如下述标准的评分计算处理。根据评分结果进行预测干扰素治疗后获得持续抗HCV应答的概率评估。
A：评分标准：
除ISG15和UPS18以外的各ISG：
基因表达水平变化值(治疗后/治疗前或IFN处理后/处理前)
＞＝3以3分计值
1-3分以实际分数计值
ISG15和USP18：
基因表达信号水平(治疗前或IFN处理前，以Actin水平为内参，ISG15或USP18/Actin＞1/5为高水平，1/5～1/10为中等水平，＜1/10为低水平)。
高水平表达：1分
中等水平表达：2分
低水平表达：3分
B：持续抗HCV应答的概率评估
对表一12个ISG表达计算分值进行加法计算。
通过大量的实验，发明人发现如下现象：
总分值31-36：一年后HCV持续清除概率80-100％
总分值25-30：一年后HCV持续清除概率50-80％
总分值19-24：一年后HCV持续清除概率25-50％
总分值12-18：一年后HCV持续清除概率＜25％
本发明的有益效果是：
1、应用此项发明，在患者应用干扰素治疗的早期或治疗前，即对干扰素治疗的长期疗效进行预测。有助于慢性丙肝患者治疗方案的优化和选择，减少患者痛苦和治疗费用。
2、基因芯片具有高通量，检测方便的特点，便于临床应用。
【具体实施方式】
下面通过具体的实施例来对本发明进行进一步的说明。
实施例：
12例慢性丙型肝炎患者在长效干扰素加利巴韦林治疗前取抗凝血10ml，Ficoll密度梯度离心法分离外周血单个核细胞，分离后的单个核细胞平均分为对照组和实验组。对照组用DMEM培养基普通培养48h，实验组用DMEM培养基普通培养含100U/ml的IFNα处理48小时，提取上述样本的mRNA。
用基因芯片进行检测。获得实验组和对照组ISG相对表达水平的变化值，并按上述评分标准对ISG总分值进行评估(结果见表二)。其中：
5例患者基因芯片的ISG表达总分值为31-36分(组1)，预测其在一年的长效干扰素加利巴韦林治疗后能获得持续病毒学应答概率大于80％。
4例患者基因芯片的ISG表达总分值为25-30分(组2)，预测其在一年的长效干扰素加利巴韦林治疗后能获得持续病毒学应答概率50-80％。
3例患者基因芯片的ISG表达分值为总分值12-18(组3)：预测治疗一年后HCV持续清除概率＜25％。
治疗一年后跟踪随访一年，以定量PCR的HCV RNA检测拷贝数(检测下限为500拷贝/ml)为预后判断指标。组1共有4例患者获得持续病毒学应答，HCV RNA结果低于检测下限，其持续病毒学应答率为80％；组2共有2例患者获得持续病毒学应答，其持续病毒学应答率为50％。组3无持续病毒学应答患者，其应答率为0％。随访结果符合预测结果。
Figure BSA00000374197200071
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Figure ISA00000374197300011
Figure ISA00000374197300021
Figure ISA00000374197300041
Figure ISA00000374197300051
Figure ISA00000374197300061
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Figure ISA00000374197300081
Figure ISA00000374197300101
Figure ISA00000374197300111
Figure ISA00000374197300121
Figure ISA00000374197300131

Claims (1)

1.一种基因芯片，包括根据如下基因序列设计的探针：
Figure FDA0000349643100000011
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