CN103740658A - 美国红鱼抗病毒蛋白（viperin）及其制备和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及分子生物学领域，具体的说是一种美国红鱼viperin及其制备和应用。美国红鱼抗病毒蛋白序列为SEQ ID No.1中氨基酸所示。所述表达SEQ ID No.1中氨基酸的viperin的质粒pVip在抗病毒感染中的应用。本发明的viperin表达质粒注射鱼类后能够显著提高鱼类的抗病毒能力。

Description

美国红鱼抗病毒蛋白(viperin)及其制备和应用
技术领域
本发明涉及分子生物学领域，具体的说是一种美国红鱼viperin及其制备和应用。
背景技术
Viperin是一种与内质网相关的、受干扰素诱导的抗病毒蛋白，其分子量约为40kDa。从低等脊椎动物到哺乳动物viperin均呈现出高度的氨基酸序列保守性，其蛋白结构均包含一个SAM酶（S-adenosylmethionine-dependent radical enzymes）结构域和一个高度保守的C末端区域。Viperin通过其N-端α螺旋结构锚定在内质网膜或脂质体上。由于内质网和脂质体是病毒蛋白合成和病毒扩增所必需的场所，所以在这两个细胞器上的定位对于viperin行使抗病毒功能有着至关重要的作用。在正常情况下viperin的表达水平非常低，然而当受到病毒（包括DNA和RNA病毒）、脂多糖或者I型干扰素的刺激后viperin的表达水平会骤然上升。目前已知的哺乳类viperin抗病毒机制主要有（1）干扰破坏病毒出芽所必需的脂筏结构；（2）干扰病毒蛋白与宿主蛋白的相互作用从而影响病毒的组装。然而，鱼类viperin研究较少，其抗病毒作用尚不清楚。
发明内容
本发明目的在于提供一种美国红鱼viperin及其制备和应用。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：
一种美国红鱼抗病毒蛋白（viperin），美国红鱼抗病毒蛋白序列为SEQID No.1中氨基酸所示。
一种美国红鱼抗病毒蛋白的制备方法，以美国红鱼cDNA为模板，用引物F1和R1进行PCR扩增，PCR产物纯化后与质粒pCN3用T4DNA连接酶连接，连接液转化入大肠杆菌，筛选转化子提取质粒，即得到表达SEQ ID No.1中氨基酸的viperin的质粒pVip；所述F1为5’-GATATCATGCAGCTCTCCTCTATC-3’；R1为5’-GATATCCCACTCCAGCTTCATGT-3’。
一种美国红鱼抗病毒蛋白（viperin）的应用，所述表达SEQ ID No.1中氨基酸的viperin的质粒pVip在制备抗病毒感染的制剂中的应用。
本发明具有如下优点：本发明的viperin表达质粒注射鱼类后能够显著提高鱼类的抗病毒能力。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步说明。实施例旨在对本发明进行举例描述，而非以任何形式对本发明进行限制。
在本发明实施例中所涉及到的常规性实验方法均采用如下方法：
1.质粒提取、DNA(PCR)产物纯化、DNA片段从凝胶中回收皆使用“天根生化科技(北京)有限公司”的相应试剂盒。
2.大肠杆菌用Hanahan方法（Sambrook and Russell:MolecularCloning:A Laboratory Mannual.Cold Spring Harbor Laboratory Press2001）。
3.所有限制性内切酶和连接酶皆购自于“纽英伦生物技术有限公司”，北京。
实施例1
本发明的viperin为序列表SEQ ID No.1中的氨基酸序列。
序列表SEQ ID No.1为：
MQLSSIVASPKQLLQLCISTLHCLLASVFSKVSSWTAGTCKESTSPVSPVDGKLDQNKVQNATTPTSVNYHFTRKCNYKCGFCFHTAKTSFVLPLEEAKRGLKLLKESGMEKINFSGGEPFLHDKGEFLGKLVQFCKQDLQLPSVSIVSNGSMIKEKWFQKYGDYLDILAISCDSFDEETNQLIGRAQGRKSHLDNLYKIRNWCQQYKVAFKINSVINTFNVDEDMTESITQLSPVRWKVFQCLLIDGENAGEKALREAERFVISDQLFQEFLDRHSSVSCLVPESNEKMRNSYLILDEYMRFLDCREGRKDPSKSVLDVGVKEAICFSGFDEKMFLKRGGKYVWSKADMKLEW
（a）序列特征：
●长度：354（有效长度354）
●类型：氨基酸序列
●链型：单链
●拓扑结构：线性
（b）分子类型：蛋白质
（c）假设：否
（d）反义：否
（e）最初来源：美国红鱼
结构特点：该蛋白含有一个SAM家族蛋白结构域（氨基酸66－274）。
实施例2
Viperin表达质粒pVip的构建：
以美国红鱼cDNA为模板，用引物F1和R1进行PCR扩增。PCR条件为：94℃60s预变性模板DNA,然后94℃40s,60℃60s,72℃60s,5个循环后改为94℃40s,65℃60s,72℃60s,30个循环后再在72℃延伸反应7－10min。PCR产物用天根的相应试剂盒纯化。将表达载体pCN3（构建过程参见Jiao XD,Zhang M,Hu YH,Sun L.Construction and evaluation ofDNA vaccines encoding Edwardsiella tarda antigens.Vaccine2009;27:5195–202.）用限制性内切酶EcoRV酶切后回收5.4kb片段，将其与上述纯化的PCR产物用T4DNA连接酶连接，连接液转化入大肠杆菌DH5α，在含氨苄青霉素（100ug/ml）的LB培养基上培养18－24小时,筛选转化子提取质粒，命名为pVip。通过DNA测序分析证明了pVip为含有viperin序列的表达质粒。
所述LB组成成分按重量百分比计：1.0%蛋白胨,0.5%酵母粉,1.0%氯化钠,97.5％蒸馏水。所述F1为5’-GATATCATGCAGCTCTCCTCTATC-3’；R1为5’-GATATCCCACTCCAGCTTCATGT-3’。
实施例3
Viperin表达质粒pVip的应用
步骤1）质粒注射
将上述实施例1的pVip在PBS中稀释至200ug/ml，即为pVip稀释液。将20条美国红鱼（重约27g）随机分为2组，每组10条。将这2组分别命名为A和B。将A组的每条鱼分别注射100ul pVip稀释液，将B组(对照组)的每条鱼分别注射100ul PBS。
所述PBS组成成分按重量百分比计：0.8%NaCl,0.02%KCl,0.358%Na2HPO4.12H2O,0.024%NaH2PO4，余量为水。
步骤2）病毒悬液制备
将细胞肿大病毒RBIV-C1（具体制备方法见Zhang M,Xiao Z,Hu Y,SunL.Characterization of a megalocytivirus from cultured rock bream,Oplegnathus fasciatus(Temminck&Schlege),in China.Aquac Res.2012;43:556–64）于PBS中稀释至106copies/ml，即为病毒悬液。
步骤3）攻毒感染
在上述步骤1）注射后第3天，将A和B组的每条鱼注射100ul上述步骤2）的病毒悬液。在感染后5天和7天，取鱼脾脏组织。利用DNA提取试剂盒（购于天根生化科技(北京)有限公司”）从组织中提取DNA，用绝对定量PCR法检测组织中病毒含量（具体方法见上述参考文献）。结果表明，A组鱼5天和7天的病毒数（2.8x105和5.4x106）显著（P<0.01）低于B组鱼5天和7天的的病毒数（3.5x106和1.2x107）。
这些结果表明，viperin能够显著增强鱼类抵抗病毒的侵染。
Figure IDA0000462326590000011
Figure IDA0000462326590000021
Figure IDA0000462326590000031

Claims (3)

1.一种美国红鱼抗病毒蛋白（viperin），其特征在于：美国红鱼抗病毒蛋白序列为SEQ ID No.1中氨基酸所示。
2.一种权利要求1所述的美国红鱼抗病毒蛋白的制备方法，其特征在于：以美国红鱼cDNA为模板，用引物F1和R1进行PCR扩增，PCR产物纯化后与质粒pCN3用T4DNA连接酶连接，连接液转化入大肠杆菌，筛选转化子提取质粒，即得到表达SEQ ID No.1中氨基酸的viperin的质粒pVip；所述F1为5’-GATATCATGCAGCTCTCCTCTATC-3’；R1为5’-GATATCCCACTCCAGCTTCATGT-3’。
3.一种权利要求1所述的美国红鱼抗病毒蛋白（viperin）的应用，其特征在于：所述表达SEQ ID No.1中氨基酸的viperin的质粒pVip在制备抗病毒感染的制剂中的应用。
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