CN105541987A - 半滑舌鳎补体成分C5a的重组蛋白及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及分子生物学领域，具体的说是半滑舌鳎补体成分C5a(CsC5a)的重组蛋白及其应用。半滑舌鳎补体成分C5a的重组蛋白以半滑舌鳎cDNA为模板，用引物C5F1和C5R1进行PCR扩增补体成分CsC5a基因，扩增产物经诱导表达、纯化即为重组蛋白。本发明补体成分CsC5a重组蛋白能够显著促进免疫细胞吞噬作用，提高鱼类的抗细菌或抗病毒能力。

Description

半滑舌鳎补体成分C5a的重组蛋白及其应用
技术领域
本发明涉及分子生物学领域，具体的说是半滑舌鳎补体成分C5a(CsC5a)的重组蛋白及其应用。
背景技术
补体因子5(Complementfactor5,C5)是补体系统的一个成分。人类C5蛋白由α、β两条多肽链通过二硫键组成,分子量为190kDa。C5靠近N端的第74-75位精氨酸-亮氨酸键为C5转化酶作用的部位。补体系统通过三条途径(经典途径、旁路途径和凝集素途径)激活后，均生成C5转化酶。C5蛋白在C5转化酶的作用下裂解为C5a和C5b两个片段。C5a是C5的α链的N端约8-10kD的肽段，是炎症反应的重要介质和趋化因子。C5a通过与细胞表面的C5a受体结合而激活相应的信号通路，剌激白细胞产生呼吸爆发、趋化效应等炎症反应，从而辅助激活机体的先天性免疫，促进获得性免疫应答。目前，C5和C5a已经在虹鳟和鲤鱼等鱼类中报道，但是它们在鱼类中的应用性研究尚缺乏。
发明内容
本发明目的在于提供一种半滑舌鳎补体成分C5a的重组蛋白及其应用。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：
一种半滑舌鳎补体成分C5a的重组蛋白，半滑舌鳎补体成分C5a的重组蛋白以半滑舌鳎cDNA为模板，用引物C5F1和C5R1进行PCR扩增补体成分CsC5a基因，扩增产物经诱导表达、纯化即为重组蛋白，所述C5F1为5’-GATATCATGGAGAAGAGGATAAAAGCGGCA-3’；C5R1为5’-GATATCGCCGAGGACGAGGGTTTCCTCT-3’。
一种半滑舌鳎补体成分C5a的重组蛋白的应用，所述半滑舌鳎补体成分C5a的重组蛋白可用于制备增强外周血淋巴细胞的吞噬作用的制剂。
一种半滑舌鳎补体成分C5a的重组蛋白的应用，所述半滑舌鳎补体成分C5a的重组蛋白可用于制备抑制细菌或病毒感染的制剂。
细菌为哈氏弧菌，是鱼类常见的致病性细菌，能感染多种养殖鱼类包括牙鲆、大菱鲆、半滑舌鳎等。
病毒为细胞肿大病毒，是一种严重危害养殖鱼类的病毒，能感染大菱鲆、条石鲷、半滑舌鳎等。
本发明具有如下优点：本发明的补体成分C5a重组蛋白，能够显著提高外周血淋巴细胞的吞噬能力和增强鱼类的抗细菌及抗病毒能力。
附图说明
图1为本发明实施例提供的重组补体成分C5a(命名为rCsC5a)电泳图。泳道1，分子量标准；泳道2,补体成分rCsC5a。
图2为本发明实施例提供的重组补体成分rCsC5a的促吞噬作用。A,半滑舌鳎外周血淋巴细胞(peripheralbloodleukocytes，PBL)。B，PBL+FITC-标记的哈氏弧菌。C,PBL+FITC-标记的哈氏弧菌+rCsC5a。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步说明。实施例旨在对本发明进行举例描述，而非以任何形式对本发明进行限制。
在本发明实施例中所涉及到的常规性实验方法均采用如下方法：
1.质粒提取、DNA(PCR)产物纯化、DNA片段从凝胶中回收皆使用“天根生化科技(北京)有限公司”的相应试剂盒。
2.大肠杆菌用Hanahan方法(SambrookandRussell:MolecularCloning:ALaboratoryMannual.ColdSpringHarborLaboratoryPress2001)。
3.所有限制性内切酶和连接酶皆购自于“纽英伦生物技术有限公司”，北京。
实施例1
补体成分C5a重组蛋白rCsC5a的制备
1)表达补体成分C5a重组蛋白rCsC5a的质粒pCsC5a的构建：
本发明的补体成分rCsC5a为半滑舌鳎补体成分C5的一部分(氨基酸685-751)，C5序列已公布(GenBankaccessionnumberXP_008334663.1)。
CsC5a由67个氨基酸组成，具有典型的anaphylatoxin结构。
以半滑舌鳎cDNA为模板，用引物C5F1和C5R1进行PCR扩增补CsC5a基因。PCR条件为：94℃60s预变性模板DNA,然后94℃40s,62℃60s,72℃65s,30个循环后再在72℃延伸反应7－10min。PCR产物用天根的相应试剂盒纯化。将表达载体pET259(构建过程参见HuYH,ZhengWW,SunL.Identificationandmolecularanalysisofaferritinsubunitfromreddrum(Sciaenopsocellatus).FishShellfishImmunol2010；28:678–86)用限制性内切酶EcoRV酶切后回收5.3kb片段，将其与上述纯化的PCR产物用T4DNA连接酶连接，连接液转化入大肠杆菌DH5α，在含卡那霉素(100ug/ml)的LB培养基上培养18－24小时,筛选转化子提取质粒，命名为pCsC5a。通过DNA测序分析证明了pCsC5a为含有上述C5结构域的补体成分CsC5a序列的表达质粒。
所述LB组成成分按重量百分比计：1.0％蛋白胨,0.5％酵母粉,1.0％氯化钠,97.5％蒸馏水。所述C5F1为5’-GATATCATGGAGAAGAGGATAAAAGCGGCA-3’；C5R1为5’-GATATCGCCGAGGACGAGGGTTTCCTCT-3’。
2)rCsC5a的诱导表达和纯化
将上述的质粒pCsC5a用常规方法转化大肠杆菌BL21(DE3)(购自于“天根生化科技有限公司”，北京)，在含有卡那霉素(50ug/ml)的LB固体培养基上培养18－24小时,挑取转化子，将其命名为BL21/pCsC5a。将BL21/pCsC5a于含有卡那霉素(50ug/ml)的LB液体培养基中过夜培养；取1ml过夜后的培养液,加入100ml新鲜的含有卡那霉素(50ug/ml)的LB液体培养基中，于37℃下转速200rpm摇动培养至OD600为0.6,加入终浓度为1mM的IPTG，16℃继续以转速160rpm摇动培养16h，而后以5000g，4℃离心10min，收集菌液，加入5ml裂解液，在室温于摇床上缓慢摇动1-2小时，直至菌悬液变澄清为止。将菌液以10000g，4℃离心30min，回收上清。将上清中的蛋白用亲和层析柱HisTrapHPColumns(购于美国GEHealthcare公司)回收纯化。将纯化的蛋白经SDS-PAGE电泳检测(8v/cm电压下电泳25－30min，随后15v/cm电压下电泳2－2.5h)，测定其分子量大小(参见图1)。发现rCsC5a的蛋白质质量与补体成分CsC5a相同。
所述裂解液为终浓度的10mMNaH2PO4、10mMTris和8M尿素,pH8.0。
实施例2
rCsC5a的促吞噬作用
在LB培养基中培养哈氏弧菌(Vibrioharveyi)(保存于CGMCC，编号为CGMCC1985)至OD600为0.8,然后离心(5000g，40C，10min)，收集菌体，将其悬浮于100ug/mlfluoresceinisothiocyanate(FITC)(购于天根生化科技(北京)有限公司”)中至终浓度为1×108cfu/ml，37℃保温2h，然后用上述方法离心收集菌体。将菌体悬浮于L－15-medium(购于ThermoScientificHyClone,北京)中至终浓度为1×108cfu/ml，即为FITC-标记细菌。利用Percoll方法制备半滑舌鳎外周血淋巴细胞(peripheralbloodleukocytes，PBL)，具体参见文献ZhouZX,ZhangJ,SunL.Poly(I:C)inducesantiviralimmuneresponsesinJapaneseflounder(Paralichthysolivaceus)thatrequireTLR3andMDA5andisnegativelyregulatedbyMyd88.PLoSOne2014；9:e112918。将细胞置于含有L－15-medium的1.5ml离心管中(每管107个细胞)，每管加入100ul上述FITC-标记细菌和上述实施例1纯化的rCsC5a至终浓度为40ug/ml。对照细胞加入同样体积的PBS。将细胞于22℃暗处保温1h，然后用上述方法离心收集菌体。将菌体悬浮于1ml0.125％台盼蓝(购于北京索莱宝科技有限公司),22℃保温5min，然后用上述方法离心收集菌体。将菌体悬浮于1mlPBS。随后用常规的流式细胞仪(PartecGmbH,Munster,Germany)检测吞噬。具体参见文献ZhouZJ,SunL.CsCTL1,ateleostC-typelectinthatpromotesantibacterialandantiviralimmunedefenseinamannerthatdependsontheconservedEPNmotif.DevCompImmunol2015；50:69–77。结果表明，与没有rCsC5a处理的PBL的吞噬值(M1＝23.5％)相比，用rCsC5a处理的PBL的吞噬值(M1＝43.5％)显著上升(参见图2)，说明rCsC5a对PBL吞噬细菌有显著促进作用。
所述PBS组成成分按重量百分比计：0.8％NaCl,0.02％KCl,0.358％Na2HPO4.12H2O,0.024％NaH2PO4，余量为水。
实施例3
rCsC5a的抗菌作用
将上述实施例1纯化的rCsC5a蛋白在PBS中稀释至100ug/ml，即为rCsC5a稀释液。在LB培养基中培养哈氏弧菌至OD600为0.8,然后离心(5000g，4℃，10min)，收集菌体，将其悬浮于PBS中至终浓度为2×106cfu/ml，即为细菌悬液。将细菌悬液与rCsC5a稀释液或PBS(对照)等体积(1：1)混合。将20条半滑舌鳎(重约12.7g)随机分为2组，每组10条。将这2组分别命名为A和B。将A组的每条鱼分别注射100ul细菌+rCsC5a稀释液，将B组(对照组)的每条鱼分别注射100ul细菌+PBS。在注射后第24h，取A和B组鱼脾脏组织，在1mlPBS中匀浆，稀释后将50ul匀浆液涂布于LB平板。将平板置于28℃培养48h，计算出现的菌落数。结果表明，A组鱼脾脏的细菌数(43±5)显著(P<0.01)低于B组鱼脾脏的细菌数(118±12)
这些结果表明，本发明的补体成分rCsC5a能够显著增强鱼类抵抗细菌侵染。
实施例4
rCsC5a的抗病毒作用
将细胞肿大病毒RBIV-C1(具体制备方法见ZhangM,XiaoZ,HuY,SunL.Characterizationofamegalocytivirusfromculturedrockbream,Oplegnathusfasciatus(Temminck&Schlege),inChina.AquacRes.2012；43:556–64)于PBS中稀释至106copies/ml，即为病毒悬液。将上述实施例1纯化的rCsC5a蛋白在PBS中稀释至100ug/ml，即为rCsC5a稀释液。将病毒悬液与rCsC5a稀释液或PBS(对照)等体积(1：1)混合。将20条半滑舌鳎(重约12.7g)随机分为2组，每组10条。将这2组分别命名为C和D。将C组的每条鱼分别注射100ul病毒+rCsC5a稀释液，将D组(对照组)的每条鱼分别注射100ul病毒+PBS。在注射后第3天，取鱼脾脏组织。利用DNA提取试剂盒(购于天根生化科技(北京)有限公司”)从组织中提取DNA，用绝对定量PCR法检测组织中病毒含量(具体方法见上述参考文献)。结果表明，C组鱼脾脏的病毒数(257±14)显著(P<0.01)低于D组鱼脾脏的病毒数(4.16x104±5076)。
这些结果表明，rCsC5a能够显著增强鱼类抵抗病毒的侵染。

Claims (3)

1.一种半滑舌鳎补体成分C5a的重组蛋白，其特征在于：半滑舌鳎补体成分C5a的重组蛋白以半滑舌鳎cDNA为模板，用引物C5F1和C5R1进行PCR扩增补体成分CsC5a基因，扩增产物经诱导表达、纯化即为重组蛋白，所述C5F1为5’-GATATCATGGAGAAGAGGATAAAAGCGGCA-3’；C5R1为5’-GATATCGCCGAGGACGAGGGTTTCCTCT-3’。
2.一种权利要求1所述的半滑舌鳎补体成分C5a的重组蛋白的应用，其特征在于：所述半滑舌鳎补体成分C5a的重组蛋白可用于制备增强外周血淋巴细胞的吞噬作用的制剂。
3.一种权利要求1所述的半滑舌鳎补体成分C5a的重组蛋白的应用，其特征在于：所述半滑舌鳎补体成分C5a的重组蛋白可用于制备抑制细菌或病毒感染的制剂。
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