CN105175529A - 一种鱼类肿瘤坏死因子家族蛋白的重组蛋白及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及分子生物学领域，具体的说是一种鱼类(半滑舌鳎)肿瘤坏死因子家族蛋白(CsTNF)的重组蛋白及其应用。鱼类肿瘤坏死因子家族蛋白CsTNF重组蛋白为半滑舌鳎的肿瘤坏死因子家族蛋白CsTNF重组蛋白，其是以半滑舌鳎cDNA为模板，用引物TNFF1和TNFR1进行PCR扩增肿瘤坏死因子家族蛋白CsTNF基因，扩增产物经诱导表达、纯化即为重组蛋白，该肿瘤坏死因子家族蛋白能够显著提高鱼类的抗细菌或抗病毒能力。

Description

一种鱼类肿瘤坏死因子家族蛋白的重组蛋白及其应用
技术领域
本发明涉及分子生物学领域，具体的说是一种鱼类(半滑舌鳎)肿瘤坏死因子家族蛋白(CsTNF)的重组蛋白及其应用。
背景技术
肿瘤坏死因子(Tumornecrosisfactor,TNF)是一种重要的细胞因子，能调节脊椎动物和无脊椎动物器官发育、组织修复、造血作用以及炎症反应等多个生理过程。肿瘤坏死因子能够调控单核细胞、巨噬细胞、T淋巴细胞、B淋巴细胞和自然杀伤细胞的多种免疫反应，诱导细胞增殖、凋亡和坏死。肿瘤坏死因子家族分为三类：TNF-α、TNF-β和LT-β。TNF-α是一个26kDa的膜蛋白，被金属蛋白酶水解后形成游离的约17kDa的激活蛋白。激活形式的TNF-α与细胞表面的肿瘤坏死因子受体结合，发挥其免疫调控作用。目前，肿瘤坏死因子已在多种鱼类中发现，但是其功能和应用性研究尚缺乏。
发明内容
本发明目的在于提供一种鱼类肿瘤坏死因子家族蛋白(TNF-α型)的重组蛋白及其应用。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：
一种鱼类肿瘤坏死因子家族蛋白的重组蛋白，鱼类肿瘤坏死因子家族蛋白CsTNF重组蛋白为半滑舌鳎的肿瘤坏死因子家族蛋白CsTNF重组蛋白，其是以半滑舌鳎cDNA为模板，用引物TNFF1和TNFR1进行PCR扩增肿瘤坏死因子家族蛋白CsTNF基因，扩增产物经诱导表达、纯化即为重组蛋白，所述TNFF1为5’-GATATCATGAGGCAACATAATAGCTCACCT-3’；TNFR1为5’-GATATCCAAGGCGAACACGCCGAAG-3’。
一种鱼类肿瘤坏死因子家族蛋白的重组蛋白的应用，所述半滑舌鳎的肿瘤坏死因子家族蛋白CsTNF重组蛋白可应用于制备抑制细菌或病毒感染的制剂。
所述抗感染的细菌为荧光假单胞菌；病毒为细胞肿大病毒。
本发明具有如下优点：本发明的肿瘤坏死因子家族蛋白属于TNF-α型，能够显著提高鱼类的抗细菌和抗病毒能力。
附图说明
图1为本发明实施例提供的纯化的重组肿瘤坏死因子家族蛋白(命名为rCsTNF)电泳图。泳道1，分子量标准；泳道2,肿瘤坏死因子家族蛋白rCsTNF。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步说明。实施例旨在对本发明进行举例描述，而非以任何形式对本发明进行限制。
在本发明实施例中所涉及到的常规性实验方法均采用如下方法：
1.质粒提取、DNA(PCR)产物纯化、DNA片段从凝胶中回收皆使用“天根生化科技(北京)有限公司”的相应试剂盒。
2.大肠杆菌用Hanahan方法(SambrookandRussell:MolecularCloning:ALaboratoryMannual.ColdSpringHarborLaboratoryPress2001)。
3.所有限制性内切酶和连接酶皆购自于“纽英伦生物技术有限公司”，北京。
实施例1
肿瘤坏死因子家族蛋白重组蛋白rCsTNF的制备
1)表达肿瘤坏死因子家族蛋白重组蛋白rCsTNF的质粒pCsTNF的构建：
本发明的肿瘤坏死因子家族蛋白CsTNF属于TNF-α型，其序列已公布(GenBankaccessionnumberXP_008330028.1)：
MDSECRVQLDVTDRDGEVREEPTPGVQARSKLTKAVLVLTVCLAAAAALLLVFYRQHNSSPQEEDSFELHHTLRQMSHVRAAIHLQGVHNPKMTNSVEWQDEVEQTHSQGGLKLDNNEVVIPHHGLYFVYSQVSFQVSCGDADVGAVSSPQVHLSHTVQRWSSSFGSDKVKSYRTILHSARTVCQKTASADSADEGSSFAAVYMGAVFNLLKGDRLRTVMEENMLPFLEDDPGKSFFGVFAL
肿瘤坏死因子家族蛋白CsTNF由242个氨基酸组成，含有一个肿瘤坏死因子TNF结构域，由81-242氨基酸残基组成。以半滑舌鳎cDNA为模板，用引物TNFF1和TNFR1进行PCR扩增肿瘤坏死因子家族蛋白CsTNF基因。PCR条件为：94℃60s预变性模板DNA,然后94℃40s,60℃60s,72℃60s,30个循环后再在72℃延伸反应7－10min。PCR产物用天根的相应试剂盒纯化。将表达载体pET259(构建过程参见HuYH,ZhengWW,SunL.Identificationandmolecularanalysisofaferritinsubunitfromreddrum(Sciaenopsocellatus).FishShellfishImmunol2010；28:678–86)用限制性内切酶EcoRV酶切后回收5.3kb片段，将其与上述纯化的PCR产物用T4DNA连接酶连接，连接液转化入大肠杆菌DH5α，在含卡那霉素(100ug/ml)的LB培养基上培养18－24小时,筛选转化子提取质粒，命名为pCsTNF。通过DNA测序分析证明了pCsTNF为含有上述TNF结构域的肿瘤坏死因子家族蛋白CsTNF序列的表达质粒。
所述LB组成成分按重量百分比计：1.0％蛋白胨,0.5％酵母粉,1.0％氯化钠,97.5％蒸馏水。所述TNFF1为5’-GATATCATGAGGCAACATAATAGCTCACCT-3’；TNFR1为5’-GATATCCAAGGCGAACACGCCGAAG-3’。
2)肿瘤坏死因子家族蛋白CsTNF重组蛋白的诱导表达和纯化
将上述的质粒pCsTNF用常规方法转化大肠杆菌BL21(DE3)(购自于“天根生化科技有限公司”，北京)，在含有卡那霉素(50ug/ml)的LB固体培养基上培养18－24小时,挑取转化子，将其命名为BL21/pCsTNF。将BL21/pCsTNF于含有卡那霉素(50ug/ml)的LB液体培养基中过夜培养；取1ml过夜后的培养液,加入100ml新鲜的含有卡那霉素(50ug/ml)的LB液体培养基中，于37℃下转速200rpm摇动培养至OD600为0.6,加入终浓度为1mM的IPTG，18℃继续以转速160rpm摇动培养12h，而后以5000g，4℃离心10min，收集菌液，加入5ml裂解液，在室温于摇床上缓慢摇动1-2小时，直至菌悬液变澄清为止。将菌液以10000g，4℃离心30min，回收上清。将上清中的蛋白用亲和层析柱HisTrapHPColumns(购于美国GEHealthcare公司)回收纯化。将纯化的蛋白经SDS-PAGE电泳检测(8v/cm电压下电泳25－30min，随后15v/cm电压下电泳2－2.5h)，测定其分子量大小(参见图1)。发现它的蛋白质质量与肿瘤坏死因子家族蛋白CsTNF相同。
所述裂解液为终浓度的10mMNaH2PO4、10mMTris和8M尿素,pH8.0。
实施例2
肿瘤坏死因子家族蛋白CsTNF的抗菌作用
将上述实施例1纯化的肿瘤坏死因子家族蛋白CsTNF蛋白在PBS中稀释至100ug/ml，即为CsTNF稀释液。在LB培养基中培养荧光假单胞菌(Pseudomonasfluorescens)(保存于CGMCC，中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，编号为CGMCCNo.2329，保藏单位地址为北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所，保藏日期为2008年1月9日)至OD600为0.8,然后离心(5000g，4℃，10min)，收集菌体，将其悬浮于PBS中至终浓度为2×107cfu/ml，即为细菌悬液。将细菌悬液与CsTNF稀释液或PBS(对照)等体积(1：1)混合。将20条半滑舌鳎(重约13.6g)随机分为2组，每组10条。将这2组分别命名为A和B。将A组的每条鱼分别注射100ul细菌+CsTNF稀释液，将B组(对照组)的每条鱼分别注射100ul细菌+PBS。在注射后第24h和48h，取A和B组鱼脾脏组织，在2mlPBS中匀浆，将100ul匀浆液涂布于LB平板。将平板置于28℃培养48h，计算出现的菌落数。结果表明在24h和48h，A组鱼脾脏的细菌数(分别为1066和2133)显著(P<0.01)低于B组鱼脾脏的细菌数(分别为3133和5133)
这些结果表明，本发明的肿瘤坏死因子家族蛋白CsTNF能够显著增强鱼类抵抗细菌侵染。
所述PBS组成成分按重量百分比计：0.8％NaCl,0.02％KCl,0.358％Na2HPO4.12H2O,0.024％NaH2PO4，余量为水。
实施例3
肿瘤坏死因子家族蛋白CsTNF的抗病毒作用
将细胞肿大病毒RBIV-C1(具体制备方法见ZhangM,XiaoZ,HuY,SunL.Characterizationofamegalocytivirusfromculturedrockbream,Oplegnathusfasciatus(Temminck&Schlege),inChina.AquacRes.2012；43:55664)于PBS中稀释至106copies/ml，即为病毒悬液。将上述实施例1纯化的CsTNF蛋白在PBS中稀释至100ug/ml，即为CsTNF稀释液。将病毒悬液与CsTNF稀释液或PBS(对照)等体积(1：1)混合。将20条半滑舌鳎(重约13.6g)随机分为2组，每组10条。将这2组分别命名为C和D。将C组的每条鱼分别注射100ul病毒+CsTNF稀释液，将D组(对照组)的每条鱼分别注射100ul病毒+PBS。在注射后第6天和9天，取鱼脾脏组织。利用DNA提取试剂盒(购于天根生化科技(北京)有限公司”)从组织中提取DNA，用绝对定量PCR法检测组织中病毒含量(具体方法见上述参考文献)。结果表明，在第6天和9天，C组鱼脾脏的病毒数(分别为345和117)显著(P<0.01)低于D组鱼脾脏的病毒数(分别为1.2x105和8.9x105)。
这些结果表明，肿瘤坏死因子家族蛋白CsTNF能够显著增强鱼类抵抗病毒的侵染。

Claims (3)

1.一种鱼类肿瘤坏死因子家族蛋白的重组蛋白，其特征在于：鱼类肿瘤坏死因子家族蛋白CsTNF重组蛋白为半滑舌鳎的肿瘤坏死因子家族蛋白CsTNF重组蛋白，其是以半滑舌鳎cDNA为模板，用引物TNFF1和TNFR1进行PCR扩增肿瘤坏死因子家族蛋白CsTNF基因，扩增产物经诱导表达、纯化即为重组蛋白，所述TNFF1为5’-GATATCATGAGGCAACATAATAGCTCACCT-3’；TNFR1为5’-GATATCCAAGGCGAACACGCCGAAG-3’。
2.一种权利要求1所述的鱼类肿瘤坏死因子家族蛋白的重组蛋白的应用，其特征在于：所述半滑舌鳎的肿瘤坏死因子家族蛋白CsTNF重组蛋白可应用于制备抑制细菌或病毒感染的制剂。
3.权利要求2所述的鱼类肿瘤坏死因子家族蛋白CsTNF重组蛋白的应用，其特征在于：所述抗感染的细菌为荧光假单胞菌；病毒为细胞肿大病毒。
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