CN105254735A - 一种鱼类杀菌通透性增强蛋白及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及分子生物学领域，具体的说是一种鱼类(半滑舌鳎)杀菌通透性增强蛋白及其应用。鱼类杀菌通透性增强蛋白的重组蛋白为以半滑舌鳎cDNA为模板，经引物F1和R1进行PCR扩增杀菌通透性增强蛋白基因，扩增产物经诱导表达、纯化即为半滑舌鳎的杀菌通透性增强蛋白重组蛋白，该杀菌通透性增强蛋白能够结合多种细菌，并且能够显著提高鱼类的抗细菌和抗病毒能力。

Description

一种鱼类杀菌通透性增强蛋白及其应用
技术领域
本发明涉及分子生物学领域，具体的说是一种鱼类(半滑舌鳎)杀菌通透性增强蛋白及其应用。
背景技术
杀菌通透性增强蛋白(bactericidal/permeabilityincreasingprotein,BPI)是脂质转移/脂多糖结合蛋白家族成员，其在化学结构上与脂多糖结合蛋白(lipopolysacchridebindingprotein,LBP)具有同源性。主要存在于哺乳动物中性粒细胞的嗜天青颗粒内，也可微量表达于单核细胞表面。BPI可以结合并中和内毒素，抑制内毒素刺激单核细胞产生细胞因子和炎症介质，从而保护机体免受损伤。另外，BPI对许多革兰氏阴性菌具有细胞杀伤作用，它通过与革兰氏阴性菌表面脂多糖(LPS)结合，破坏LPS在细胞膜上的正常排列，显著增强细菌细胞膜的通透性进而裂解细菌。此外，BPI全蛋白能增强中性粒细胞对细菌的吞噬。因此，BPI是一种重要的天然免疫防御因子，在革兰氏阴性菌感染的治疗方面具有良好的发展前景。目前有关硬骨鱼类BPI的报道不多，其生物学功能研究更是知之甚少。
发明内容
本发明目的在于提供一种鱼类(半滑舌鳎)杀菌通透性增强蛋白及其应用。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：
一种鱼类杀菌通透性增强蛋白的重组蛋白，鱼类杀菌通透性增强蛋白的重组蛋白为以半滑舌鳎cDNA为模板，经引物F1和R1进行PCR扩增杀菌通透性增强蛋白基因，扩增产物经诱导表达、纯化即为半滑舌鳎的杀菌通透性增强蛋白重组蛋白，所述F1为5’-GATATCATGGTAGAAAACCCCGGGATTGAAA-3’；R1为5’-GATATCGAAAAACTCATGTGTGTGTTTGGGT-3’。
一种鱼类杀菌通透性增强蛋白的重组蛋白的应用，所述半滑舌鳎的杀菌通透性增强蛋白重组蛋白在与细菌特异性结合中的应用。
所述半滑舌鳎的杀菌通透性增强蛋白重组蛋白在与革兰氏阴性细菌特异性结合中的应用。
一种鱼类杀菌通透性增强蛋白的重组蛋白的应用，所述半滑舌鳎的杀菌通透性增强蛋白重组蛋白可应用于制备抑制革兰氏阴性细菌或病毒感染的制剂。
所述抗感染的细菌为荧光假单胞菌；病毒为细胞肿大病毒。
本发明具有如下优点：本发明的杀菌通透性增强蛋白能够结合多种革兰氏阴性细菌，并且能够显著提高鱼类的抗细菌和抗病毒能力。
附图说明
图1为本发明实施例提供的纯化的杀菌通透性增强蛋白电泳图。泳道1，分子量标准；泳道2,重组杀菌通透性增强蛋白rCsBPI。
图2为本发明实施例提供的重组杀菌通透性增强蛋白rCsBPI与细菌的结合能力检测结果。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步说明。实施例旨在对本发明进行举例描述，而非以任何形式对本发明进行限制。
在本发明实施例中所涉及到的常规性实验方法均采用如下方法：
1.质粒提取、DNA(PCR)产物纯化、DNA片段从凝胶中回收皆使用“天根生化科技(北京)有限公司”的相应试剂盒。
2.大肠杆菌用Hanahan方法(SambrookandRussell:MolecularCloning:ALaboratoryMannual.ColdSpringHarborLaboratoryPress2001)。
3.所有限制性内切酶和连接酶皆购自于“纽英伦生物技术有限公司”，北京。
实施例1
重组杀菌通透性增强蛋白rCsBPI的制备
1)表达rCsBPI的质粒pCsBPI的构建：
本发明的杀菌通透性增强蛋白CsBPI序列已公布(GenBankaccessionnumberXP_008316264.1)：
MLQPVILLFVLGTCSAVENPGIEITVNNKGLQYGKHAGADWIQGILGNITLPFMDGRIRVGCFSSLYYTFTDTRIRKCDLPEPSVEFSPEAAGLNMSISGLSVALTGEWMASFSFLQSVGSFNMALFSVDVTSVVKLDRDNNGHLSVSSVSCEAHVENVDISLSGGASWVFQALMNRHKSQFKQNIEDGICPQVEKSIANLEHYLQVMNVSFDVDHTLAVNLSLTASPDINPSSLNVGLKGEFFSIQTHNDPPFEAQPFTVPVQGDYMFSVVLSEYTVNSALYGYYSAGLFNIFINDSMIPPDFPVHLNTSSMGPYIPQLPKALLGLQMNLQVNATSVPMVTFQPDWAKQSFHATAEAFAVQPNGTQTPLFQLRADSAFSGQSWIDAGKVKGNVSVDNFTLTLISSDVGPVNTKTLAKSTREGIEMILTRVNEALSRGLDLPRLKRAKFVNSVLKVEQGFVSFFSDAEVWPTDRGFNRPKHTHEFF
CsBPI由486个氨基酸组成，含有一个BPI结构域，由233-466氨基酸残基组成。以半滑舌鳎cDNA为模板，用引物F1和R1进行PCR扩增CsBPI基因。PCR条件为：94℃60s预变性模板DNA,然后94℃40s,60℃60s,72℃60s,30个循环后再在72℃延伸反应7－10min。PCR产物用天根的相应试剂盒纯化。将表达载体pET259(构建过程参见HuYH,ZhengWW,SunL.Identificationandmolecularanalysisofaferritinsubunitfromreddrum(Sciaenopsocellatus).FishShellfishImmunol2010；28:678–86)用限制性内切酶EcoRV酶切后回收5.3kb片段，将其与上述纯化的PCR产物用T4DNA连接酶连接，连接液转化入大肠杆菌DH5a，在含卡那霉素(100ug/ml)的LB培养基上培养18－24小时,筛选转化子提取质粒，命名为pCsBPI。通过DNA测序分析证明了pCsBPI为含有上述BPI结构域的杀菌通透性增强蛋白序列的表达质粒，其中，pCsBPI质粒中杀菌通透性增强蛋白序列与GenBankaccession公开的numberXP_008316264序列一致。
所述LB组成成分按重量百分比计：1.0％蛋白胨,0.5％酵母粉,1.0％氯化钠,97.5％蒸馏水。所述F1为5’-GATATCATGGTAGAAAACCCCGGGATTGAAA-3’；R1为5’-GATATCGAAAAACTCATGTGTGTGTTTGGGT-3’。
2)重组杀菌通透性增强蛋白rCsBPI的诱导表达和纯化
将上述的质粒pCsBPI用常规方法转化大肠杆菌BL21(DE3)(购自于“天根生化科技有限公司”，北京)，在含有卡那霉素(50ug/ml)的LB固体培养基上培养18－24小时,挑取转化子，将其命名为BL21/pCsBPI。将BL21/pCsBPI于含有卡那霉素(50ug/ml)的LB液体培养基中过夜培养；取1ml过夜后的培养液,加入100ml新鲜的含有卡那霉素(50ug/ml)的LB液体培养基中，于37℃下转速200rpm摇动培养至OD600为0.6,加入终浓度为0.4mM的IPTG，28℃继续以转速160rpm摇动培养5h，而后以5000g，4℃离心10min，收集菌液，加入5ml裂解液，在室温于摇床上缓慢摇动1-2小时，直至菌悬液变澄清为止。将菌液以10000g，4℃离心30min，回收上清。将上清中的蛋白用亲和层析柱HisTrapHPColumns(购于美国GEHealthcare公司)回收纯化。将纯化的蛋白经SDS-PAGE电泳检测(8v/cm电压下电泳25－30min，随后15v/cm电压下电泳2－2.5h)，测定其分子量大小(参见图1)。发现它的蛋白质质量与杀菌通透性增强蛋白CsBPI相同。将此纯化的蛋白命名为rCsBPI。
所述裂解液为终浓度的10mMNaH2PO4、10mMTris和8M尿素,pH8.0。
实施例2
重组杀菌通透性增强蛋白rCsBPI的应用-与细菌相互作用
1)细菌悬液制备。在LB培养基中分别培养革兰氏阴性细菌荧光假单胞菌(Pseudomonasfluorescens)(保存于CGMCC，中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏单位地址为北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所；保藏日期为2008年1月9日，编号为CGMCCNo.2329)、迟缓爱德华氏菌(Edwardsiellatarda)(保存于CGMCC,中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏单位地址为北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所；保藏日期为2008年1月9日，编号为CGMCCNo.2330)、鳗弧菌(Vibrioanguillarum)(保存于CGMCC,中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏单位地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所；保藏日期为2012年6月21日，编号为CGMCCNo.6250)、哈氏弧菌(Vibrioharveyi)(保存于CGMCC，中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏单位地址为北京市海淀区中关村北一条13号，中国科学院微生物研究所；保藏日期为2007年3月22日,编号为CGMCCNo.1985)至OD600为0.8,离心(5000g，4℃离心10min)收集菌体，重新悬于包被液(包被液为0.159％Na2CO3,0.293％NaHCO3,pH9.6)至108CFU/ml。
2)酶联免疫吸附试验(enzyme-linkedimmunosorbentassay，ELISA)。将96孔ELISA板用包被液处理1h，随后用PBS洗三次。将上述步骤1)的各种细菌悬液加入ELISA板(每孔100ul)。将ELISA板于4℃保温15h，每孔加入200ul3％(重量/体积比)的脱脂奶粉，于37℃保温1h。将ELISA板用PBS洗三次。将上述实施例1纯化的rCsBPI在PBS中稀释至100ug/ml，即为rCsBPI稀释液。将rCsBPI稀释液或PBS(对照)加入ELISA板(每孔/100ul)，22℃保温2h。将ELISA板用PBS洗三次，随后每孔加入100ul鼠抗His抗体(购于“天根生化科技(北京)有限公司”)，于37℃保温1h。将ELISA板用PBS洗三次，随后每孔加入100ul羊抗鼠IgG－HRP抗体(购于“天根生化科技(北京)有限公司”)，于37℃保温1h。将ELISA板用PBS洗三次，用TMB试剂盒(购于北京“天根生化科技有限公司”)显色，随后在450nm测定吸光值。rCsBPI与细菌的结合指数(Bindingindex)计算如下：ELISA反应中含有rCsBPI的细菌的吸光值/含有PBS的细菌的吸光值。通常Bindingindex大于2即被认为是特异性结合。
结果表明，rCsBPI与所检测的细菌的Bindingindex皆大于5(参见图2)，说明杀菌通透性增强蛋白能够与多种革兰氏阴性细菌显著结合。
所述PBS组成成分按重量百分比计：0.8％NaCl,0.02％KCl,0.358％Na2HPO4.12H2O,0.024％NaH2PO4，余量为水。
实施例3
重组杀菌通透性增强蛋白rCsBPI的应用-抗菌作用
将上述实施例1纯化的rCsBPI在PBS中稀释至200ug/ml，即为rCsBPI稀释液。将荧光假单胞菌按照实施例2方法培养至OD600为0.8,然后离心(5000g，4℃，10min)，收集菌体，将其悬浮于PBS中至终浓度为107cfu/ml，即为细菌悬液。将细菌悬液与rCsBPI稀释液或PBS(对照)等体积(1：1)混合。将20条半滑舌鳎(重约13.3g)随机分为2组，每组10条。将这2组分别命名为A和B。将A组的每条鱼分别注射100ul细菌+rCsBPI稀释液，将B组(对照组)的每条鱼分别注射100ul细菌+PBS。在注射后第24h，取A和B组鱼肾脏和脾脏组织，在2mlPBS中匀浆，将100ul匀浆液涂布于LB平板。将平板置于28℃培养48h，计算出现的菌落数。结果表明A组鱼肾脏和脾脏的细菌数(分别为106和245)显著(P<0.01)低于B组鱼肾脏和脾脏的细菌数(分别为745和1617)
这些结果表明，本发明的杀菌通透性增强蛋白具有杀菌作用，能够显著增强鱼类抵抗革兰氏阴性细菌侵染。
实施例4
重组杀菌通透性增强蛋白rCsBPI的应用-抗病毒作用
将细胞肿大病毒RBIV-C1(具体制备方法见ZhangM,XiaoZ,HuY,SunL.Characterizationofamegalocytivirusfromculturedrockbream,Oplegnathusfasciatus(Temminck&Schlege),inChina.AquacRes.2012；43:55664)于PBS中稀释至106copies/ml，即为病毒悬液。将上述实施例1纯化的rCsBPI在PBS中稀释至200ug/ml，即为rCsBPI稀释液。将病毒悬液与rCsBPI稀释液或PBS(对照)等体积(1：1)混合。将20条半滑舌鳎(重约13.3g)随机分为2组，每组10条。将这2组分别命名为C和D。将C组的每条鱼分别注射100ul病毒+rCsBPI稀释液，将D组(对照组)的每条鱼分别注射100ul病毒+PBS。在注射后第3天，取鱼脾脏和肾脏组织。利用DNA提取试剂盒(购于天根生化科技(北京)有限公司”)从组织中提取DNA，用绝对定量PCR法检测组织中病毒含量(具体方法见上述参考文献)。结果表明，C组鱼脾脏和肾脏的病毒数(分别为2.7x105和9x103)显著(P<0.01)低于D组鱼脾脏和肾脏的病毒数(分别为1.7x106和1.5x104)。
这些结果表明，杀菌通透性增强蛋白能够显著增强鱼类抵抗病毒的侵染。

Claims (4)

1.一种鱼类杀菌通透性增强蛋白的重组蛋白，其特征在于：鱼类杀菌通透性增强蛋白的重组蛋白为以半滑舌鳎cDNA为模板，经引物F1和R1进行PCR扩增杀菌通透性增强蛋白基因，扩增产物经诱导表达、纯化即为半滑舌鳎的杀菌通透性增强蛋白重组蛋白，所述F1为5’-GATATCATGGTAGAAAACCCCGGGATTGAAA-3’；R1为5’-GATATCGAAAAACTCATGTGTGTGTTTGGGT-3’。
2.一种权利要求1所述的鱼类杀菌通透性增强蛋白的重组蛋白的应用，其特征在于：所述半滑舌鳎的杀菌通透性增强蛋白重组蛋白在与细菌特异性结合中的应用。
3.按权利要求2所述的鱼类杀菌通透性增强蛋白的重组蛋白的应用，其特征在于：所述半滑舌鳎的杀菌通透性增强蛋白重组蛋白在与革兰氏阴性细菌特异性结合中的应用。
4.一种权利要求1所述的鱼类杀菌通透性增强蛋白的重组蛋白的应用，其特征在于：所述半滑舌鳎的杀菌通透性增强蛋白重组蛋白可应用于制备抑制革兰氏阴性细菌或病毒感染的制剂。
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