CN102942624B - 一种半乳糖凝集素-3结合蛋白及其制备和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及分子生物学领域，具体的说是一种半乳糖凝集素-3结合蛋白及其制备和应用。半乳糖凝集素-3结合蛋白为序列表SEQ I D No.1中的氨基酸序列所示。制备方法：以半滑舌鳎cDNA为模板，用引物F1和R1进行PCR扩增，PCR产物连接表达载体后得质粒pETG3BP，将其转化BL21DE3)，获得转化子BL21/pETG3BP，经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷诱导后，利用亲和层析柱纯化重组蛋白，即为半乳糖凝集素-3结合蛋白。所述半乳糖凝集素-3结合蛋白具有显著的结合多种细菌的能力。
Description
技术领域
本发明涉及分子生物学领域，具体的说是一种半乳糖凝集素-3结合蛋白及其制备和应用。
背景技术
半乳糖凝集素-3结合蛋白(galectin-3b inding protein,G3BP)是一种分泌至胞外的糖蛋白，它能够结合半乳糖凝集素-3（galectin-3）以及其它胞外蛋白，如胶原蛋白（collagen）、纤维连接蛋白（fibronectin）、β1整合蛋白（β1 integrins）等。目前研究最多的是人类G3BP，发现它在分子结构上含有一个清道夫受体（Scavenger receptor）功能域，该功能域与靶分子结合有关。人类G3BP在免疫组织和细胞中表达，并且在病毒感染以及某些癌症病人血清中表达上调，因此可能参与机体的免疫抵抗、炎症反应、肿瘤发生等过程。迄今G3BP只在两种鱼类（斑马鱼和大西洋鲑）中发现，但其功能则完全未知。
发明内容
本发明目的在于提供一种半乳糖凝集素-3结合蛋白及其制备和应用。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：
一种半乳糖凝集素-3结合蛋白，半乳糖凝集素-3结合蛋白为序列表SEQID No.1中的氨基酸序列所示。
半乳糖凝集素-3结合蛋白的制备，
1）质粒pETG3BP的构建：
以半滑舌鳎cDNA为模板，用引物F1和R1进行PCR扩增，PCR产物纯化后与T-Simple连接，连接混合液转化大肠杆菌后在含安卡青霉素、Xgal、异丙基-β-D-硫代半乳糖苷的LB培养基上培养2－8h,筛选转化子提取质粒，得重组质粒pTSG3BP；
将pTSG3BP用SmaI酶切，回收1.6kb片段，连接于pET259，连接液转化入大肠杆菌，在含卡那霉素的LB培养基上培养18－24小时,筛选转化子提取质粒，即为pETG3BP；
2）半乳糖凝集素-3结合蛋白的制备
将上述步骤1）的质粒pETG3BP转化BL21(DE3)，在含有卡那霉素的LB培养基上培养,筛选转化子即为BL21/pETG3BP；将BL21/pETG3BP用终浓度为1mM的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷诱导表达后，采用亲和层析柱纯化重组蛋白，即为序列表SEQ ID No.1中的氨基酸序列所示的半乳糖凝集素-3结合蛋白。
所述步骤1）中F1为5’-CCCGGGGCCACCATGGCTTTTACATTTGACCTGTTC-3’；R1为5’-CCCGGGGACTCGGACGTACACTGGTCT-3’。
半乳糖凝集素-3结合蛋白的应用，所述半乳糖凝集素-3结合蛋白能够结合细菌，继而作为细菌的抑制剂。
所述半乳糖凝集素-3结合蛋白能够结合革兰氏阴性细菌或革兰氏阳性细菌。
所述革兰氏阴性细菌为荧光假单胞菌（Pseudomonas fluorescens）、迟缓爱德华氏菌（Edwardsiella tarda）、大肠杆菌（Escherichia coli）或鳗弧菌（Vibrio anguillarum）；革兰氏阳性细菌为海豚链球菌（Streptococcus iniae）或枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）。
本发明具有如下优点：本发明的半乳糖凝集素-3结合蛋白能够与多种革兰氏阴性细菌和革兰氏阳性细菌显著性结合。本发明所得自半滑舌鳎中克隆获得了G3BP，其与多种细菌具有显著性结合能力，本发明乳糖凝集素-3结合蛋白能够与多种革兰氏阴性细菌和革兰氏阳性细菌显著性结合；因此该蛋白具有在抗细菌感染中应用的潜能。
附图说明
图1为本发明实施例提供的纯化得到的半乳糖凝集素-3结合蛋白电泳图谱（其中，纯化得到的半乳糖凝集素-3结合蛋白为泳道2；泳道1：分子量marker）。
图2为本发明实施例提供的半乳糖凝集素-3结合蛋白与各种细菌的结合能力检测结果。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步说明。实施例旨在对本发明进行举例描述，而非以任何形式对本发明进行限制。
在本发明实施例中所涉及到的常规性实验方法均采用如下方法：
1.质粒提取、DNA(PCR)产物纯化、DNA片段从凝胶中回收皆使用“天根生化科技(北京)有限公司”的相应试剂盒。
2.大肠杆菌用Hanahan方法（Sambrook and Russell:MolecularCloning:A Laboratory Mannual.Cold Spring Harbor Laboratory Press2001）；酵母转化按Invitrogen公司的方法（Catalog no.V175-20）；聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS－PAGE）按照Sambrook and Russell:MolecularCloning:A Laboratory Mannual.Cold Spring Harbor Laboratory Press2001。
3.所有限制性内切酶和连接酶皆购自于“纽英伦生物技术有限公司”，北京。
实施例1
本发明的半乳糖凝集素-3结合蛋白为序列表SEQ ID No.1中的氨基酸序列。
序列表SEQ ID No.1为：
MQTHQNFCRIWVLLLLLHVADGAFTFDLFENIAAPKEGDVRLAGSRSSSEGRVEVYHDGRWGTVCDDGWDIAEAQVVCRQLRFSGAKGVQVGQPYGEATGPIWMDDMICQGTEKHLLNCAFKSWGVTDCTHKEDVGIICENNDNNSKNAIYSLDHSFSLSDELGQLFDSEVGCDFLIILRSPTGHRFEYETEEMICAHKMILLLVPRFNASQGVSNITVDISQSCKPYFPTFLRYIYTRQIDVDLSSIHCLHWMASMFEVKHLMEGTARLFSEVLPEDTLFHTQVSIYNYAVETEDLVLQENCLQYLSWNFQNLTNSPAWPDISVKLLRAILVRSDLVVPNEYFVLQSVENWITDKDEAISLEDQALILNCLRFPMIPVEKLYVLETNSSLYNNHSKLYSEKILKAFQFNVLLFSDLLTNPKFDREERDYHPRLYVDYPWSVTISPSYSSRSLSTPSHNSLIFRSKTINWEANIYRSHYDCSNRRLQCKSLPMARLASHSHYHGNNIVYQNQLLLSCQGKYICHIQDFKSDLAYVTKNATHGLTYPCPDSQYTYQFVVRPVYVRV
（a）序列特征：
●长度：565
●类型：氨基酸序列
●链型：单链
●拓扑结构：线性
（b）分子类型：蛋白质
（c）假设：否
（d）反义：否
（e）最初来源：半滑舌鳎
结构特点：该蛋白含有一个清道夫受体功能域（由氨基酸40－140组成）。
实施例2
半乳糖凝集素-3结合蛋白G3BP的制备方法：
1）质粒pETG 3BP的构建：
以半滑舌鳎cDNA为模板，用引物F1和R1进行PCR扩增。PCR条件为：94°C 60s预变性模板DNA,然后94°C 40s,60°C 60s,72°C 60s,5个循环后改为94°C 40s,65°C 60s,72°C 60s,30个循环后再在72°C延伸反应7－10min。PCR产物用天根的PCR产物纯化试剂盒纯化后与质粒T-Simple(购于北京全式金生物技术有限公司)于室温连接2－8小时，连接混合液转化大肠杆菌DH5α后在含安卡青霉素(100ug/ml)、Xgal(40ug/ml)、异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(24ug/ml)的LB培养基上培养18－24小时,筛选转化子提取质粒，得重组质粒pTSG3BP。
将pTSG3BP用Sma I酶切，回收1.6kb片段。将表达载体pET259（pET259构建过程参见Zheng,W.J.,Hu,Y.H.,Sun,L.,2010.Cloning andanalysis of a ferritin subunit from turbot(Scophthalmus maximus).Fish.Shellfish.Immunol.28,829–836）用SwaI酶切后回收5.4kb片段，将其与回收的1.6kb片段用T4DNA连接酶连接，连接液转化入大肠杆菌DH5α，在含卡那霉素（30ug/ml）的LB培养基上培养18－24小时,筛选转化子提取质粒，即为pETG3BP。
所述LB组成成分按重量百分比计：1.0％蛋白胨,0.5％酵母粉,1.0％氯化钠,97.5％蒸馏水。所述F1为5’-CCCGGGGCCACCATGGCTTTTACATTTGACCTGTTC-3’；R1为5’-CCCGGGGACTCGGACGTACACTGGTCT-3’。
2）重组半乳糖凝集素-3结合蛋白G3BP的表达和制备
将步骤1）的质粒pETG3BP转化BL21(DE3)（购于“天根生化科技(北京)有限公司”），在含有卡那霉素（30ug/ml）的LB培养基上培养,筛选转化子即为BL21/pETG 3BP。将BL21/pETG3BP在含有卡那霉素的LB培养基中于37℃培养至OD600为0.6,加入异丙基-β-D-硫代半乳糖苷使其终浓度达到1mM，37℃继续摇动培养4-5小时，而后用GE Healthcare（美国）公司的Ni-NTA金属亲和层析填料（nickel-nitrilotriacetic acid）亲和层析柱纯化重组蛋白（层析条件：用4－5ml洗涤液洗柱两次，随后用0.5－1ml洗脱缓冲液洗柱，收集所有洗脱液）。将重组蛋白用聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS－PAGE）分析，发现其分子量与表SEQ ID No.1中序列的G3BP分子量一致（参见图1）。
上述洗涤液成分为：50mM NaH2PO4,300mM NaCl,20mM imidazole,pH8.0;上述洗脱缓冲液成分为：50mM NaH2PO4,300mM NaCl,250mM imidazole,pH 8.0.
实施例3
半乳糖凝集素-3结合蛋白G3BP的细菌结合作用
1）细菌悬液制备。在LB培养基中分别培养革兰氏阴性细菌荧光假单胞菌（Pseudomonas fluorescens）（保存于CGMCC，保藏日期2008年1月9日，编号为CGMCC 2329）、迟缓爱德华氏菌（Edwardsiella tarda）（保存于CGMCC，保藏日期2008年1月9日，编号为CGMCC 2330）、大肠杆菌（Escherichia coli）（DH5α,购于“天根生化科技(北京)有限公司”）、鳗弧菌（Vibrio anguillarum）（保存于CGMCC，保藏日期2012年6月21日，编号为CGMCC 6250,保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号）以及革兰氏阳性细菌海豚链球菌（Streptococcus iniae）(保存于CGMCC，编号为CGMCC1984,保藏日2007年3月22）和枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）（购买自CGMCC，编号为CGMCC 1.460）至OD600为0.8,离心（5000g，4°C离心10min）收集菌体，重新悬于包被液(包被液为0.159％Na2CO3,0.293％NaHCO3,pH 9.6)至108CFU/ml。
2）酶联免疫吸附试验（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)。将96孔ELISA板用包被液处理1h，随后用PBS洗三次。将上述步骤1）的各种细菌悬液加入ELISA板（每孔100ul）。将ELISA板于4℃保温15h，每孔加入200ul 3％（重量/体积比）的脱脂奶粉，于37℃保温1h。将ELISA板用PBS洗三次，随后每孔加入100ul上述实施例2步骤2）制备的半乳糖凝集素-3结合蛋白G3BP或者PBS（对照）。将ELISA板用PBS洗三次，随后每孔加入100ul鼠抗His抗体（购于“天根生化科技(北京)有限公司”），于37℃保温1h。将ELISA板用PBS洗三次，随后每孔加入100ul羊抗鼠IgG－HRP抗体（购于“天根生化科技(北京)有限公司”），于37℃保温1h。将ELISA板用PBS洗三次，用TMB试剂盒（购于北京“天根生化科技有限公司”）显色，随后在450nm测定吸光值。半乳糖凝集素-3结合蛋白G3BP与细菌的结合指数（Binding index）计算如下：ELISA反应中含有G3BP的细菌的吸光值/含有PBS的细菌的吸光值。通常Binding index大于2即被认为是有意义的（positive reading）。
结果表明，半乳糖凝集素-3结合蛋白G3BP与所检测的细菌的Bindingindex皆大于5（参见图2），说明G3BP能够与多种革兰氏阴性细菌和革兰氏阳性细菌发生显著结合。因此G3BP可望在细菌性疾病的防控中应用。
所述PBS组成成分按重量百分比计：0.8％ NaCl,0.02％ KCl,0.358％Na2HPO4.12H2O,0.024％ NaH2PO4，余量为水。
Claims (3)
1.一种结合细菌的蛋白，其特征在于：结合细菌的蛋白如序列表SEQID No.1中的氨基酸序列所示。
2.一种权利要求1所述结合细菌的蛋白的制备方法，其特征在于：
1）质粒pETG3BP的构建：
以半滑舌鳎cDNA为模板，用引物F1和R1进行PCR扩增，PCR产物纯化后与T-Simple连接，连接混合液转化大肠杆菌后在含安卡青霉素、Xgal、异丙基-β-D-硫代半乳糖苷的LB培养基上培养2－8h,筛选转化子提取质粒，得重组质粒pTSG3BP；
将pTSG3BP用SmaI酶切，回收1.6kb片段，连接于pET259，连接液转化入大肠杆菌，在含卡那霉素的LB培养基上培养18－24小时,筛选转化子提取质粒，即为pETG3BP；
2）结合细菌的蛋白的制备
将上述步骤1）的质粒pETG3BP转化BL21(DE3)，在含有卡那霉素的LB培养基上培养,筛选转化子即为BL21/pETG3BP；将BL21/pETG3BP用终浓度为1mM的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷诱导表达后，采用亲和层析柱纯化重组蛋白，即为序列表SEQ ID No.1中的氨基酸序列所示的结合细菌的蛋白；
所述步骤1）中F1为5’-CCCGGGGCCACCATGGCTTTTACATTTGACCTGTTC-3’；R1为5’-CCCGGGGACTCGGACGTACACTGGTCT-3’。
3.按权利要求1所述的结合细菌的蛋白的非疾病诊断治疗目的的应用，其特征在于：所述结合细菌的蛋白能够结合革兰氏阴性细菌或革兰氏阳性细菌；
所述革兰氏阴性细菌为荧光假单胞菌（Pseudomonas fluorescens）、迟缓爱德华氏菌（Edwardsiella tarda）、大肠杆菌（Escherichia coli）或鳗弧菌（Vibrio anguillarum）；革兰氏阳性细菌为海豚链球菌（Streptococcus iniae）或枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）。
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