CN104402979B - 一种可破坏细菌细胞壁的蛋白及其制备方法 - Google Patents

一种可破坏细菌细胞壁的蛋白及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了属于基因工程领域的一种可破坏细菌细胞壁的蛋白。本发明可破坏细菌细胞壁的蛋白AUTO2由SEQ ID No：1所示的氨基酸序列组成；其编码基因由SEQ ID No：2所示的核苷酸序列组成。本发明还公开了该蛋白的制备方法。与已知的lmo1521基因相比，本发明AUTO2蛋白具有更高活性，AUTO2蛋白对自身单增李斯特菌有明显抑制作用，抑菌效果好，为食品、卫生行业提供了新的抑菌蛋白；其次，本发明制备方法采用超声波破碎细胞，目标蛋白存在于可溶相中，便于分离纯化，避免了包涵体的产生；此外，本发明制备方法中蛋白含有6XHis标签，便于采用Ni‑NTA柱分离，且所得AUTO2蛋白纯度高。

Description

一种可破坏细菌细胞壁的蛋白及其制备方法
技术领域
本发明属于基因工程领域，具体涉及一种可破坏细菌细胞壁的蛋白，以及该蛋白的制备方法。
背景技术
细菌的细胞壁是由多糖链和氨基酸肽链组成的肽聚糖网状结构，细菌自身表达的一类蛋白能够水解细菌细胞壁的肽聚糖结构，以满足伴随细菌细胞生长、分裂和鞭毛生长时细胞壁结构的动态变化，这类蛋白统称为肽聚糖水解酶。根据水解肽聚糖时水解酶切位点的不同，又可定义为N-乙酰葡糖胺酶(N-acetylglucosaminidases)、N-乙酰胞壁酸酶(N-acetylmuramidases)、酰胺酶(N-acetylmuramyl-L-alanine amidases)、肽链内切酶(Endopeptidases)等。这类肽聚糖水解酶因其能够降解细菌自身的细胞壁又称为自溶素。自溶素参与细菌的多种生物学功能，如降解细胞壁、促使细胞分裂及调节细胞壁更新。在感染宿主时自溶素可以协助细菌粘附并入侵宿主细胞，影响细菌在细胞内及细胞间的扩散力并诱导免疫细胞产生细胞因子。自溶素的生物学功能还体现在生物膜、鞭毛及孢子形成、遗传转化能力、蛋白分泌及自我溶解等，与细菌的致病力密切相关。
自溶素在细菌体内表达受到时间和空间上的严格调控，即可保证细胞壁适度降解满足细菌生存及侵染宿主的要求，又不会因其过度降解引起细菌自溶。但是如果细菌中的自溶素蛋白被过度表达，其表达产物保留了破坏细菌细胞壁的功能，又打破了细菌体内基因表达时空的调控限制，就可引起细菌自溶或破坏同类的细菌。因此，利用基因工程的方法克隆细菌的肽聚糖水解酶基因，转到大肠杆菌中诱导原核过表达，发酵培养，蛋白纯化，可获得持续高活性的肽聚糖水解酶。体外添加的肽聚糖水解酶可有效地破坏细菌细胞的正常繁殖与生长，达到抑制细菌生长的作用。
单核细胞增生李斯特菌(Listeria monocytogenesis)是一种在环境中普遍存在的革兰氏阳性菌，能引起人和动物严重的食源性感染。目前已从中鉴定出p60、p45、Ami、Auto、IspC、MurA、Lmo0327和FlaA等8种自溶素蛋白(李唤弟等.中华微生物学与免疫学杂志,2013,33(12):964-969；崔焕忠等.食品科学,2012,33(11):290-293)。通过比对单核细胞增生李斯特菌EGD-e菌株(1/2a血清型)全基因组序列信息，发现其Lmo1521基因拥有酰胺酶结构域，为假定的N-乙酰胞壁酸—L—丙氨酸酰胺酶功能，但是其基因的蛋白产物和功能尚未被生物化学实验证实。张红娟(张红娟.中国计量学院硕士学位论文,2012)参考单增李斯特菌野生型标准菌株EGD-e(血清型1/2a)的全基因序列(NC_003210)中lmo1521成熟蛋白序列，从增生李斯特菌菌株LM-CMCC54002(血清型1/2a)基因组中克隆了相应基因的ORF框，对比发现它与标准菌株EGD-e(NC_003210)中lmo1521只存在一个碱基的差异，翻译的氨基酸序列完全相同，其表达蛋白具有低活性的水解细胞壁的功能。
发明内容
本发明目的在于提供一种可破坏细菌细胞壁的蛋白。
本发明另一目的在于提供编码上述可破坏细菌细胞壁的蛋白的基因。
本发明第三目的在于提供含有上述基因的表达载体。
本发明第四目的在于提供上述蛋白的制备方法。
本发明第五目的在于提供上述蛋白在破坏细菌细胞壁方面的用途。
为实现上述目的，本发明的技术方案如下：
本发明一种可破坏细菌细胞壁的蛋白，命名为AUTO2，所述的蛋白由SEQ ID No：1所示的氨基酸序列组成。
编码上述可破坏细菌细胞壁的蛋白的基因，命名为auto2，所述的基因由SEQ IDNo：2所示的核苷酸序列组成。
含有上述可破坏细菌细胞壁的蛋白的基因的表达载体。
上述表达载体中所述的载体是指pET-22b、pET-28a或pET-28c等之一种。
上述可破坏细菌细胞壁的蛋白的制备方法，包括如下步骤：
(1)、以单核细胞增生李斯特菌菌株LM-CMCC54007(血清型4b)的基因组DNA为模板，以lmo1521-F和lmo1521-R为引物进行PCR扩增，得PCR扩增产物；所述的引物为：
lmo1521-F：CGCGGATCCGAATTCCGTTGTCGTCAAAGCAGAAG；(SEQ ID No:3)
lmo1521-R：CCCAAGCTTATTAGAGAAGTAATTAGATAGGCCGTCTG(SEQ ID No:4)；
(2)、表达载体的构建：将步骤(1)中所得的PCR扩增产物用BamH I和Hind III进行双酶切，得auto2基因片段；然后将双酶切后所得的auto2基因片段与载体pET-22b用T4DNA连接酶连接，得连接产物；将所得的连接产物转化大肠杆菌DH5α，提取重组质粒，测序，得含有auto2基因的重组质粒，将所得重组质粒命名为pET-22b-auto2；
(3)、auto2基因的原核表达：
用热激法将pET-22b-auto2重组质粒转化至大肠杆菌感受态细胞BL21(DE3)，将转化后的细胞涂布在含100ug/mL Amp的LB固体培养基中，在37℃培养24-48h；取阳性单菌落，接种于LB液体培养基中，在37℃、150～220rpm条件下培养4～6h，加甘油分装，-20℃冰箱保存；
(4)、取步骤(3)所得的转化菌株，接种于含100ug/mL Amp LB液体培养基，在37℃、150～220rpm条件下过夜培养；次日按1：80～120比例更换新鲜液体LB培养基，扩大培养细菌OD600到0.5～0.7时，添加异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)到终浓度0.5mmol/mL，在26～30℃、130～160rpm条件下培养3～6h；收集菌液转到离心管，在4℃、4000～5000rpm下离心8～10min，收集沉淀细胞；
(5)、细胞破碎与增溶：
按1:3～5(g/ml)的比例向步骤(4)所得的沉淀细胞添加1x裂解缓冲液，得混合液；将混合液置于冰水混合的水浴中超声破碎仪(超声功率为200W，超5s停5s)中破碎至细胞完全(溶液清亮透明)；加入聚乙二醇单辛基苯基醚(Triton X-100)至终浓度为0.1％，置于4℃冰箱中过夜；次日在4℃、8000rpm条件下离心15min，收集上清液；
(6)、Ni-NTA树脂纯化目标蛋白：
将步骤(5)所得上清液用0.22um滤膜过滤，取滤液；按0.5～1.5：1的体积比比例将滤液与50％Ni-NTA混合，在4℃、水平摇床上80rpm条件下结合3h，然后装入色谱柱，收集流出液；用1x漂洗缓冲液漂洗2～3个柱床体积后，更换为1x洗脱缓冲液用量为2个柱床体积，分步收集洗脱缓冲液加入后的流出液，SDS-PAGE电泳分析检测流出液的蛋白组分；收集47.5KD单一组分蛋白的流出液，弃去其他部分流出液；
(7)、蛋白脱盐、透析复性和冷冻保存：
用Ultra-15超滤离心管浓缩步骤(6)所得的洗脱液，浓缩条件为4℃、5000rpm离心20-30min；收集浓缩液转移至14kDa MWCO的透析袋，在超纯水中4℃透析24h，中间更换用超纯水3次；透析后的溶液-20℃冰箱冷冻过夜，冷冻干燥，得提纯的AUTO2蛋白冻干粉末；将所得的冻干粉末蛋白在-20℃冰箱保存。
上述制备方法步骤(3)中所述的LB固体培养基的组成成分及其比例为：蛋白胨10g/L、酵母浸膏5g/L、氯化钠10g/L、琼脂10g/L，去离子水补充到1L。
上述制备方法步骤(3)中所述的LB液体培养基的组成成分及其比例为：蛋白胨10g/L、酵母浸膏5g/L、氯化钠10g/L，去离子水补充到1L。
上述制备方法步骤(5)中所述的裂解缓冲液的组成成分为：10mM咪唑，5％的甘油，300mM NaCl，50mM NaH2PO4，0.1mM PMSF，pH8.0。
上述制备方法步骤(6)中所述的漂洗缓冲液的组成成分及其比例为：50mM咪唑，300mM NaCl，50mM NaH2PO4，去离子水补充到1L，pH8.0。
上述制备方法步骤(6)中所述的洗脱缓冲液的组成成分及其比例为：250mM咪唑，300mM NaCl，50mM NaH2PO4，去离子水补充到1L，pH8.0。
上述蛋白在破坏细菌细胞壁方面的用途。
本发明具有的优点和有益效果，(1)、本发明auto2基因和AUTO2蛋白与标准菌株EGD-e(NC_003210)中lmo1521在35个碱基和3个的氨基酸上存在差异，本发明AUTO2蛋白具有更高活性。(2)、本发明AUTO2蛋白对革兰氏阳性的自身单增李斯特菌有明显抑制作用，其抑菌效果好，为食品、卫生行业提供了一种新的抑菌蛋白。(3)、本发明制备方法中大肠杆菌表达的目标蛋白是非分泌型的，低速离心收集细胞培养物，目标蛋白存在于细胞中，便于高效分离得到。(4)本发明制备方法采用超声波破碎细胞，目标蛋白存在于的可溶相中，便于分离纯化。避免了包涵体的产生。(5)本发明制备方法中蛋白含有6XHis标签，便于采用Ni-NTA柱分离即可达到纯化效果。纯化方法相对简单。
附图说明
图1.auto2基因PCR扩增电泳图谱；其中M为Marker，1为auto2基因片段。
图2.AUTO2蛋白水解自身细胞壁的对比电泳图谱；其中M为蛋白分子量，1为考马斯亮兰染色，2为亚甲基蓝染色。
图3.AUTO2蛋白处理0min(对照)的单增李斯特菌活细胞显微照片。
图4.AUTO2蛋白处理15min的单增李斯特菌活细胞变化显微照片。
图5.AUTO2蛋白处理30min的单增李斯特菌活细胞变化显微照片。
图6.AUTO2蛋白处理90min的单增李斯特菌活细胞变化显微照片。
图7.未添加AUTO2蛋白单增李斯特菌的菌落生长照片。
图8.添加AUTO2蛋白的单增李斯特菌的菌落生长受到抑制照片。
具体实施方式
以下以具体实施例对本发明作进一步的详细说明，但是不对本发明的保护范围构成任何限制。如无特别说明，以下实施例中所用的试剂皆为常规试剂，所用的方法皆为本领域技术人员熟知的常规方法。下述实施例中pfu DNA聚合酶、Taq DNA聚合酶、高纯dNTPs、Trans 4K DNA marker、1Kb DNA marker购自北京全式金生物技术有限公司；T4DNA连接酶、FastAPTM碱性磷酸化酶、限制性内切酶BamH I和Hind III；AXYGEN DNA凝胶回收试剂盒、AXYGEN PCR清洁试剂盒、AXYGEN质粒小量制备试剂盒购自泽横生物技术有限公司；胰蛋白胨、酵母提取物购自杭州米克生物技术公司(英国OXOID公司产品)；IPTG、X-Gal、CTAB、Tris、Ni-NTA纯化树脂等购自上海生物工程有限公司。
实施例1本发明可破坏细菌细胞壁的蛋白的制备
按照如下方法进行：
(1)、以单核细胞增生李斯特菌菌株LM-CMCC54007(血清型4b)的基因组DNA为模板，以lmo1521-F和lmo1521-R为引物(由上海生工生物工程技术服务有限公司合成)进行PCR扩增，得PCR扩增产物；
所述的引物为：
lmo1521-F：CGCGGATCCGAATTCCGTTGTCGTCAAAGCAGAAG；(SEQ ID No:3)，
lmo1521-R：CCCAAGCTTATTAGAGAAGTAATTAGATAGGCCGTCTG(SEQ ID No:4)；
PCR反应体系(50μL)：模板2μL，pfu酶(5U/μL)0.5μL，10×pfu Buffer(含Mg2+)5μL，dNTPs(各2.5mM)2μL，lmo1521-F/lmo1521-R(10μM)2μL，加ddH2O至50μL。PCR反应条件：94℃5min；94℃30s，55℃50s，72℃3min(2.5min)，34个循环；72℃10min。
PCR产物经琼脂糖凝胶电泳(片段大小见图1)，然后用DNA切胶回收试剂盒回收纯化。
(2)、表达载体的构建：将步骤(1)中所得的PCR扩增产物用限制性内切酶BamH I和Hind III进行双酶切；PCR产物双酶切体系为(50μL)：10×BamH I buffer 5μL，BamH I 1μL，Hind III 2μL，PCR产物42μL。将酶切体系加入200μL离心管，充分混匀，37℃酶切3h。反应结束后65℃20min灭活限制性内切酶，用PCR清洁试剂盒纯化目的DNA，得auto2基因序列；然后将双酶切后所得的auto2基因片段与载体pET-22b用T4DNA连接酶连接，得连接产物；将所得的连接产物转化大肠杆菌DH5α，提取pET-22b-auto2重组质粒，将重组质粒转化至BL21(DE3)。重组载体测序，通过测序获得auto2基因的碱基序列(见SEQ ID No:2)和AUTO2蛋白氨基酸序列(见SEQ ID No:1)。将所得重组质粒命名为pET-22b-auto2；由LM-CMCC54007(血清型4b)菌株中克隆出的碱基序列与EGD-e菌株(NC_003210)中lmo1521基因比对，发现存在35个碱基差异，对应的编码蛋白仅存在3个氨基酸差异，分别是123位由A(丙氨酸)代替了S(丝氨酸)、271位由S(丝氨酸)代替了A(丙氨酸)404位由S(丝氨酸)代替了天冬酰胺；说明本发明auto2基因与现有基因完全不同，为一个新基因。
(3)、auto2基因的原核表达
用热激法将pET-22b-auto2重组质粒转化至大肠杆菌感受态细胞BL21(DE3)，将转化后的细胞涂布在含100ug/mL Amp的LB固体培养基(蛋白胨10g/L、酵母浸膏5g/L、氯化钠10g/L、琼脂10g/L，去离子水补充至1L)中，在37℃培养48h；取阳性单菌落，接种于LB液体培养基中，在37℃、220rpm条件下培养4h，加甘油分装，-20℃冰箱保存。
(4)、取保存的转化菌株，接种于含100ug/mL Amp LB液体培养基(蛋白胨10g/L、酵母浸膏5g/L、氯化钠10g/L，去离子水补充至1L)，在37℃、220rpm条件下过夜培养，次日按1:100比例更换新鲜液体LB培养基，扩大培养细菌OD600到0.7时，添加异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)到终浓度0.5mmol/mL，在28℃、160rpm条件下培养5h；收集菌液转到离心管，在4℃、4500rpm下离心9min，收集沉淀细胞。
(5)、细胞破碎与增溶
按1:4(g/ml)的比例向步骤(3)所得的沉淀细胞添加1x裂解缓冲液(裂解缓冲液的组成成分为：10mM咪唑，5％的甘油，300mM NaCl，50mM NaH2PO4，0.1mM PMSF pH8.0)，得混合液；将混合液置于冰水混合的水浴中超声破碎仪(超声功率为200W，超5s停5s)中破碎至细胞完全(溶液清亮透明)；加入聚乙二醇单辛基苯基醚(Triton X-100)至终浓度为0.1％，置于4℃冰箱中，过夜增加溶解度；次日在4℃、8000rpm条件下离心15min，收集上清液；SDS-PAGE电泳检测，所述的AUTO2蛋白的分子量为47.5KD。
(6)、Ni-NTA树脂纯化目标蛋白
将步骤(5)所得上清液用0.22um滤膜过滤，取滤液；按1.0：1的体积比比例将滤液与50％Ni-NTA混合，在4℃、水平摇床上80rpm条件下结合3h，然后装入色谱柱(室温10-30℃)，收集流出液；用1x漂洗缓冲液(50mM咪唑，300mM NaCl，50mM NaH2PO4，pH8.0)漂洗2-3个柱床体积(除去未与金属镍结合或结合较弱的其它蛋白)后(可参考紫外检测仪检测中至低280吸收值)；更换为1x洗脱缓冲液(250mM咪唑，300mM NaCl，50mM NaH2PO4，pH8.0)用量为2个柱床体积，分步收集洗脱缓冲液加入后的流出液(可参考紫外检测仪检测数据280高峰吸收值)，SDS—PAGE电泳分析检测流出液的蛋白组分；收集47.5KD单一组分蛋白的流出液，弃去其他部分流出液。
(6)、蛋白脱盐、透析复性和冷冻保存
合并Ni-NTA柱纯化洗脱缓冲液(250mM咪唑，300mM NaCl，50mM NaH2PO4，pH8.0)加入后淋洗出含单一AUTO2蛋白的洗脱液(SDS—PAGE电泳显示含近乎单一的47.5KD条带)；用Ultra-15(截留分子量MWCO：10kDa)离心过滤器(GE公司产品，不限)浓缩洗脱液，浓缩条件为4℃、5000rpm离心20-30min；收集浓缩液转移至14kDa MWCO的透析袋，在超纯水中4℃透析24h，中间更换用超纯水3次；透析后的溶液-20℃冰箱冷冻过夜，冷冻干燥，得提纯的AUTO2蛋白冻干粉末；制备的冻干粉末蛋白在-20℃冰箱保存。
实施例2本发明AUTO2蛋白水解自身单增李斯特菌细胞壁的试验
试验材料：单增李斯特菌LM－CMCC54007菌株的细胞壁和实施例1制备的AUTO2蛋白。
试验方法：
(1)、细菌细胞壁的制备：取过夜培养的野生型单增李斯特菌(CMCC54007)(来自杭州市疾控中心，本试验室保存)离心，收集细胞沉淀，0.9％的生理盐水洗涤细胞沉淀，100℃煮30min(或高压灭菌)，超声破碎(超声功率为300W，破碎7s，停3s)细胞1h，2000rpm，离心10min除去未破碎的菌体，取上清液在12000rpm下离心20min，收集沉淀，沉淀即为粗制的细胞壁，冻干保存备用。
(2)、按常规方法配置SDS-PAGE电泳4％的浓缩胶，在12％的分离胶中加入1.5％(wt/vol)的单增李斯特菌的细胞壁作为底物，配制成复性SDS-PAGE电泳胶。做水解活性分析的蛋白样品用非还原性上样缓冲液(250mMTris-HCl(pH6.8)，10％(w/v)SDS，0.5％(w/v)溴酚蓝，50％(v/v)甘油)处理，4℃、20mA恒流电泳。
(3)、在同一块添加了细胞壁底物的SDS-PAGE胶上将相同的电泳样品点在左右不同的区域。电泳结束后，将SDS-PAGE左右两侧切开，分别做考马斯亮蓝染色和复性处理。考马斯亮蓝染色一侧的凝胶含有分子量标记样品。将另外一侧的凝胶转移至250ml去离子水中，室温、80rpm漂洗30min，然后切除溴酚蓝指示剂以下胶，将指示剂以上部分转移至复性缓冲液中(0.1％Triton X-100，10mM MgCl2，25mM Tris-HCl，pH7.5)，室温、80rpm漂洗30min，更换新鲜的复性液中，37℃、80rpm孵育3-16h。孵育结束后用去离子水漂洗复性胶2-3次，用0.1％亚甲基蓝染色液(含0.01％的KOH)染色3h，用去离子水脱色8h，在凝胶成像系统分析结果。此时SDS-PAGE分离胶中的细菌细胞壁被亚甲基蓝染成不透明的蓝色。而含有水解细胞壁活性的AUTO2蛋白，则可把凝胶中的细菌细胞壁底物水解破坏掉，产生透明的区域。结果(见图2)在实施例1制备的AUTO2蛋白，添加单增李斯特菌细胞壁的SDS-PAGE电泳板上，用考马斯亮兰染色，结果(见图2，泳道1)显示主要为47.5kDa处的AUTO2蛋白。而经复性孵育水解16h亚甲基蓝染色，在对应的47.5kDa处有透明区域((见图2，泳道2，向左箭头所示)，说明AUTO2蛋白具有水解自身细胞壁活性。
实施例3：本发明AUTO2蛋白破坏单增李斯特菌活细胞试验
试验样品：单增李斯特菌活细胞(CMCC54007)(来自杭州市疾控中心，本试验室保存)；实施例1制备的AUTO2蛋白。
试验方法：低速离心收集过夜培养的单增李斯特菌活细胞(CMCC54007)，加水解反应缓冲液(0.1％Triton X-100,10mM MgCl2，25mM Tris-HCl，去离子水补充到1L，pH7.5)调至OD600＝1.0，105-106CFU左右，作为水解底物细菌悬浮液备用。
取用10mM PBS缓冲液溶解实施例1制备的AUTO2蛋白为浓度为15.0ug/ul的蛋白样品10ul与水解反应缓冲液中105-106CFU左右的单增李斯特菌活细胞悬浮液90ul混合均匀，在37℃、100rpm摇床上反应90min。分别在反应0min、15min、30min、90min时间点各取样5ul，立即均匀涂在载破片上烘干。采用革兰氏染色，用Nikon显微镜观察重组蛋白降解单增李斯特菌活细胞过程中细胞形态及密度变化。结果未加AUTO2蛋白(见图3,0min时对照)时，单增李斯特菌细胞菌体呈杆状，菌体细胞密集布满整个视野；反应15min时(见图4)，细胞形态开始发生变化，部分短杆状的单增李斯特菌变为球状，细胞密度开始降低；反应30min时(见图5)，细胞密度持续降低，细胞进一步变成球状并开始聚集；当反应至90min时(见图6)，几乎看不到完整的单一杆状菌体，细胞聚集成团状，显微镜视野中几乎观察不到单一的细菌菌体。说明本发明AUTO2蛋白具有破坏细菌活细胞的作用。
实施例4本发明AUTO2蛋白抑制单增李斯特菌生长试验
试验方法：用水解反应缓冲液(其组成成分及其比例为：0.1％Triton X-100,10mMMgCl2，25mM Tris-HCl，去离子水补充到1L，pH7.5)制备105-106CFU的新鲜培养的单增李斯特菌LM-CMCC54007(来自杭州市疾控中心，本实验室保存)细胞悬浮液。实验组添加实施例1制备的的AUTO2蛋白至终浓度为1.5ug/ul，对照组用PBS缓冲液代替蛋白液。反应30min时，实验组取10ul用涂布法接种于9cm培养皿的BHI固体培养基，反应60min时，对照组取10ul用涂布法接种于9cm培养皿的BHI固体培养基，实验组、对照组均设3个重复。两组平板在恒温培养箱中37℃倒置培养24h。
结果未添加AUTO2蛋白的对照组(见图7)平板菌落正常生长，而添加AUTO2蛋白的实验组(见图8)平板未见菌落生长。说明经过30min的本发明AUTO2蛋白处理，AUTO2蛋白破坏了单增李斯特菌的细胞壁，使单增李斯特菌细胞失去正常的生活能力。

Claims (4)

1.一种可破坏细菌细胞壁的蛋白，其特征在于所述的蛋白由SEQ ID No：1所示的氨基酸序列组成。
2.编码权利要求1所述的蛋白的基因，其特征在于所述的基因由SEQ ID No：2所示的核苷酸序列组成。
3.含有权利要求2所述的基因的表达载体。
4.按照权利要求3所述的表达载体，其特征在于所述的载体是指pET-22b、pET-28a或pET-28c之一种。
CN201410696091.7A 2014-11-26 2014-11-26 一种可破坏细菌细胞壁的蛋白及其制备方法 Active CN104402979B (zh)

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单增李斯特菌在蜂产品中快速检测方法的建立及其自溶素基因lmo1521的功能鉴定;张红娟;《中国优秀硕士学位论文全文数据库（电子期刊）农业科技辑》;CNKI;20130215(第02期);第21页第2段，第22页第3-4段，第23页第2段，第24页第2-3段，25页第2-6段，第26页第1段，第28页第3-4段，第29页第1段，第35页第1-3段和第46页第2段 *
单细胞核增生李斯特菌自溶素的功能与调控;李唤弟等;《中国微生物学与免疫学杂志》;CNKI;20131231;第33卷(第12期);第964-969页 *

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