CN101691397B - 乳链菌肽突变体蛋白及其编码基因与应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种乳链菌肽突变体蛋白。本发明提供的乳链菌肽突变体蛋白，是由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质。实验证明：本发明提供的乳链菌肽突变体蛋白与野生型乳链菌肽相比，有更广的抑菌谱和具有更高的稳定性。

Description

乳链菌肽突变体蛋白及其编码基因与应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别涉及乳链菌肽突变体蛋白及其编码基因与应用。

背景技术

乳链菌肽(nisin)是由某些乳酸菌菌株产生的细菌素，其可抑制多种革兰氏阳性细菌的生长繁殖，并对人体安全无毒。目前在自然界共发现了6种nisin的天然突变体，其中nisin A和nisin Z作为天然食品防腐剂已被广泛应用于食品行业。Nisin A与nisin Z都由34个氨基酸残基组成，其差别仅在于氨基酸顺序上第27位氨基酸的不同，nisin A是组氨酸(His)，而nisin Z是天冬酰胺(Asp)。

Nisin由核糖体生物合成，其翻译后修饰过程包括丝氨酸苏氨酸残基的脱水及与半胱氨酸形成硫醚环。Nisin分子主要由两个结构域组成：N-端结构域(包括A、B、C三个硫醚环)和C-端结构域(包括D和E两个相互缠绕的环及靠近C-端的柔性氨基酸尾巴)，两者通过一个柔性铰链区相连接。在氨基酸构成上，N-端的疏水氨基酸残基较多，C端则由于含有带正电荷的赖氨酸(Lys)和组氨酸(His)残基而相对亲水，这使nisin分子呈现两亲性。而NMR研究也发现nisin分子不但在氨基酸组成上呈现两性，其N-端结构域中的A、B和C环及C-端结构域中的D和E环还具有疏水面和亲水面的双亲结构。

Nisin不仅对引起食品腐败和对人体健康有害的许多革兰氏阳性菌有强烈抑制作用，且其经食用后能被α-胰凝乳蛋白酶等降解，无抗药性，也不会改变肠道正常菌群，对人体安全无毒，是一种被广泛应用的天然食品生物防腐剂。然而，随着乳链菌肽产品的日益推广使用，人们对其生产与应用的要求也越来越高，例如，乳链菌肽抑菌谱较窄，只能抑制革兰氏阳性菌，且只在物理(脉冲电场)或化学(EDTA)处理条件下才能抑制革兰氏阴性菌；乳链菌肽只在低pH条件下表现较高稳定性和溶解度，而在高pH条件下溶解度低也不稳定，易裂解失活等等。因此，在研究乳链菌肽的生物合成途径、代谢调控及其作用机制等基础上，利用微生物代谢工程、基因定点突变等手段，对乳链菌肽进行改造和优化，将很好地改善乳链菌肽产品性能，扩大乳链菌肽产品应用范围，提升产品竞争力。近年来，国内外研究者对乳链菌肽分子的结构与功能开展了较多的探索，主要是针对硫醚环的部分氨基酸进行了定点突变研究，但大多是负结果，只有铰链区氨基酸残基的定点突变取得了一些正面结果(Yuan J et al.Applied Microbiology and Biotechnology 64：806-815)。对nisin分子C-端的柔性氨基酸尾巴研究和关注较少。

发明内容

本发明的目的在于提供一种乳链菌肽突变体蛋白，该蛋白与野生型乳链菌肽相比，具有更广的抑菌谱以及更高的稳定性。

本发明提供的乳链菌肽突变体蛋白，是由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质。

上述蛋白的编码基因也属于本发明的保护范围之内。

上述基因是如下1)或2)或3)或4)的基因：

1)其编码序列是序列表中序列1自5’端的第313位到第417位所示的基因；

2)其编码序列是序列表中序列1自5’端的第244位到第417位所示的基因；

3)在严谨条件下与1)或2)限定的基因杂交且编码上述的蛋白的基因；

4)与1)或2)限定的基因具有90％以上的同源性且编码上述蛋白的基因。

上述严谨条件可为用0.1×SSPE(或0.1×SSC)，0.1％SDS的溶液，在DNA或者RNA杂交实验中65℃下杂交并洗膜。

含有上述基因的重组载体也属于本发明的保护范围之内。

上述重组载体是将含权利要求2或3所述基因的片段插入pMG36e的多克隆位点之间，得到重组表达载体；

所述含权利要求2或3所述基因的片段的核苷酸序列如序列表中序列1自5’端的第1位到第463位所示。

含有上述基因的重组菌或转基因细胞系也属于本发明的保护范围之内。

上述重组菌是将上述的重组载体导入乳酸菌中得到的重组乳酸菌；所述乳酸菌是L.lactis NZ9800。

上述的重组菌在生产上述乳链菌肽突变体蛋白中的应用也属于本发明的保护范围。

本发明的又一目的在于提供一种抑菌剂。所述抑菌是抑制革兰氏阳性菌。

所述革兰氏阳性菌为黄色微球菌、肺炎链球菌或表皮葡萄球菌。

实验证明：本发明提供的乳链菌肽突变体蛋白与野生型乳链菌肽相比抑菌谱扩大，并且与野生型乳链菌肽相比，具有更高的稳定性。

附图说明

图1为定点突变技术原理示意图。

图2为乳链菌肽第29位丝氨酸突变体表达质粒构建示意图；

图3为乳链菌肽突变体蛋白表达菌株乳酸菌转化子的菌落PCR鉴定图，其中1是含pMG36e空质粒菌株；2是含S29A的表达质粒菌株；3是Marker；

图4为乳链菌肽突变体蛋白纯化产物的SDS-PAGE图，其中1：Marker；2：S29A；3：标准品，购自西格玛公司；

图5为乳链菌肽突变体蛋白的HPLC分析图；

图6为乳链菌肽突变体蛋白抑菌活性图，其中A：对黄色微球菌Micrococcusflavus NCIB 8166；B：对肺炎链球菌Streptococcus pnenmoniae 1.1692；C：对表皮葡萄球菌Staphylococcus epidermdis 1.2429；CK为转化pLY000质粒、不产nisin的空载体对照菌株；WT为转化pHJ201质粒的产生野生型nisin的菌株；

图7为乳链菌肽突变体蛋白及野生型乳链菌肽在不同pH下对温度的稳定性，其中A是乳链菌肽突变体蛋白、B是野生型乳链菌肽。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，但本发明并不限于以下实施例。

下述实施例中，如无特殊说明，均为常规方法。

实施例1、表达乳链菌肽突变体蛋白的工程菌的构建以及该乳链菌肽突变体蛋白的功能检测

一、表达乳链菌肽突变体蛋白(S29A)的工程菌的构建

1、含S29A的编码基因的克隆载体的获得

根据乳酸菌偏爱密码子表，设计乳链菌肽第29位除丝氨酸外其余氨基酸的突变引物，引物序列如下：

引物Ft：5′-GCAACTTGTAATTGTGCAATTCACGTAAGCAAATAACC-3′；

引物Fs：5′-ATTCACGTAAGCAAATAACC-3′；

引物Rt：5′-TGCACAATTACAAGTTGCTGTTTTCATGTTACAACCCA-3′；

引物Rs：5′-TGTTTTCATGTTACAACCCA-3′。

模板质粒pYW101构建方法：用EcoRI和HindIII酶切pUC19质粒(pUC19购自Takara公司)，回收大片段，将序列如序列表中序列3所示nisZ前体基因(包含了启动子)的片段同样用EcoRI和HindIII酶切，与回收的pUC19的大片段相连，得到pYW101。

定点突变参照文献(Site-directed，Ligase-Independent Mutagenesis(SLIM)：a single-tube methodology approaching 100％efficiency in 4h，Joyce Chiu，Paul E.March，Ryan Lee and Daniel Tillett，Nucleic Acids Research，2004，Vol.32，No.21)中的方法。突变原理见图1。

以pYW101质粒为模板，以引物Ft、Fs、Rt和Rs进行PCR扩增，扩增条件为94℃30sec，54℃30sec，72℃6min，共30个循环。对PCR扩增产物用DpnI消化以去除模板质粒，然后以65℃2min，25℃15min共两个循环进行杂交。将杂交产物用氯化钙法转化大肠杆菌JM109感受态细胞，用含100ug/mL氨苄青霉素的LB抗性平板筛选阳性转化子，并测序鉴定，将含有序列1自5’端的第18位到第294位所示的核苷酸的质粒命名为pLY001。其中，序列1自5’端的第244位到第417位所示的核苷酸，命名为S29A，其所编码氨基酸经翻译后修饰加工为序列表中序列2的1-34位的蛋白(命名为S29A)，序列1自5’端的第141位到第190位是启动子序列。

2、含乳链菌肽突变体蛋白(S29A)的编码基因的表达载体的获得

图2为第29位丝氨酸突变体表达质粒构建过程。

将步骤1得到的pLY001用限制性内切酶EcoRI和HindIII进行酶切并回收含S29A的编码基因的片段(该片段的序列如序列表中序列1的自5’端的第1位到第463位所示)。

乳酸菌表达质粒pMG36e(购于荷兰NIZO研究所)用限制性内切酶EcoRI和HindIII进行酶切并回收长片段。

将回收的长片段与上述的含S29A的编码基因的片段用T4DNA连接酶在16℃下反应16小时进行连接，将连接产物用氯化钙法转化大肠杆菌JM109感受态细胞，用含100ug/mL红霉素的LB抗性平板筛选阳性转化子，并测序鉴定，验证正确的重组表达载体命名为pLY2902。

3、表达乳链菌肽突变体蛋白(S29A)的工程菌的构建

将步骤2得到的重组表达载体pLY2902电击转化乳酸乳球菌L.lactis NZ9800(购于荷兰NIZO研究所)，用含5μg/mL红霉素的GM17抗性平板(胰蛋白胨0.5％，大豆蛋白胨0.5％，牛肉浸膏0.5％，酵母提取物0.25％，葡萄糖0.5％，维生素C 0.05％，β-甘油磷酸钠1.9％，硫酸镁1mmol/L，琼脂粉1.2％)筛选阳性转化子，利用菌落PCR检测阳性克隆(见图3)，用与pMG36e质粒上EcoRI和HindIII酶切位点外侧序列互补的引物P5，P6可以扩增得到预期大小的片段，得到突变体表达菌株。

引物P5：5′-ATCTGCCTCCTCATCCTC-3′

引物P6：5′-CTGCCACCTTCGTTTTCA-3′

二、S29A的功能检测

1、S29A的获得

将表达菌株分别接种于含有5μg/mL红霉素的GM17液体培养基(胰蛋白胨0.5％，大豆蛋白胨0.5％，牛肉浸膏0.5％，酵母提取物0.25％，葡萄糖0.5％，维生素C 0.05％，β-甘油磷酸钠1.9％，硫酸镁1mmol/L)的试管中，30℃静置培养12小时，再按2％接种量接种于新鲜的GM17液体培养基中，30℃静置培养12小时，得到发酵菌液。

纯化及鉴定：

1)将上述得到的发酵菌液于8000rpm离心5分钟，得到突变体S29A发酵上清液，用60％硫酸铵沉淀蛋白；

2)离心收集沉淀，溶于50ml pH3.60.2mol/L醋酸钠缓冲液(以下简称A液)中，并于A液中透析除盐；

3)透析除盐后样品上CM Sephadex C-25色谱柱(预先用A液平衡)，上样结束后用A液冲洗至OD₂₂₀小于0.01，最后用含0-1M NaCl的A液进行梯度洗脱；

4)将收集的洗脱峰于pH3.0的ddH₂O(用浓盐酸调pH至pH3.0，以下简称B液)透析后，-80℃冷冻干燥并溶于B液中；然后上Sephadex G-25色谱柱，用B液洗脱收集，得到纯化的样品。

将纯化的样品进行SDS-PAGE检测，结果如图4(1号泳道为分子量Marker，2号为乳链菌肽标准品蛋白，3号为所纯化的变体乳链菌肽)所示，电泳结果显示得到分子量约3.4kD的突变体蛋白。

将纯化的样品进行HPLC分析，结果如图5所示。检测条件如下：色谱柱为SinoChrom ODS-BP 5μm 4.6×250mm；检测波长为220nm；柱温为25℃；流动相为30-70％梯度的乙腈/水(含0.1％TFA)；流速为1.0ml/min。

2、S29A的功能验证及其理化性质检测

空载体对照：将序列1的自5’端的第141位到第190位所示的启动子两端带上EcoRI和HindIII酶切位点，插入pMG36e中，得到pLY000质粒，转入乳酸乳球菌L.lactis NZ9800，构成空载体对照，然后按照步骤二的方法进行表达，得到的发酵上清液和纯化的样品。

野生型对照：将pHJ201质粒转入乳酸乳球菌L.lactisNZ9800，然后按照步骤二的方法进行表达并纯化，得到野生型乳链菌肽作为野生型对照。

其中pHJ201质粒的构建方法是：用EcoRI和HindIII酶切pMG36e质粒(购自荷兰NIZO研究所)，回收大片段，将nisZ前体基因(包含启动子，序列如序列表中序列3所示)的片段同样用EcoRI和HindIII酶切，与回收的pMG36e的大片段相连得到pHJ201。

1)S29A的功能验证

乳链菌肽活性检测：利用琼脂平板扩散法检测待检测样品对指示菌的抑菌活性。琼脂平板扩散法具体步骤为：

a、从培养指示菌的培养平皿中刮取菌体，溶于1ml无菌水中，振荡混匀后倒入冷却至50℃左右的相应培养基中，摇匀后倒平板；

b、用无菌打孔器在平板上均匀的打孔，然后将适量待检测样品加人孔中；

c、将平皿于各指示菌的适宜温度下培养，如样品对指示菌有抑制作用，则会在样品孔周围产生透明的抑菌圈。

其中，待检测样品是：步骤二中的突变体S29A发酵上清液、空载体对照表达出的发酵上清液和野生型对照；

指示菌是：肺炎链球菌Streptococcus pnenmoniae(CGMCC 1.1692)、表皮葡萄球菌Staphylococcus epidermdis(CGMCC 1.2429)(均购自中国普通微生物菌种保藏管理中心)和黄色微球菌Micrococcus luteus NCIB 8166(购自工业微生物菌种保藏管理中心，CICC 10269)。

结果如图6和表1所示，表1为乳链菌肽突变体S29A与野生型乳链菌肽抑菌活性的比较表，CK为转化pLY000质粒、不产nisin的空载体对照菌株；WT为转化pHJ201质粒的产生野生型nisin的菌株。

表1乳链菌肽突变体S29A与野生型乳链菌肽抑菌活性的比较

与空载体对照和野生型乳链菌肽相比，变体S29A对黄色微球菌及肺炎链球菌的抑菌活性明显增大；野生型对表皮葡萄球菌无抑制作用而变体S29A有很强抑菌活性；变体S29N对致病菌肺炎链球菌的抑菌活性也有显著增强。

2)S29A的理化性质检测

稳定性试验：将步骤二中的纯化的样品(经冻干，重溶并经蛋白浓度检测后再定量到1mg/ml的)和3毫克的野生型对照溶于3mL 0.02M HCl中，用0.2M HCl和0.2M NaOH调整pH分别为2、4、6、8、10、12，于25℃、55℃加热10min，100℃加热5min后，用琼脂平板扩散法测定其对于指示菌Micrococcus flavus NCIB 8166的抑制作用(见图7)。结果显示，与野生型乳链菌肽相比，变体S29A的热稳定性及pH稳定范围有明显的增强及扩大。

序列表

<110>中国科学院微生物研究所

<120>乳链菌肽突变体蛋白及其编码基因与应用

<130>CGGNARL92577

<160>3

<210>1

<211>463

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<230>

<400>1

gaattcgata taggtttatt gagtcttaga catacttgaa tgacctagtc ttataactat     60

actgacaata gaaacattaa caaatctaaa acagtcttaa ttctatcttg agaaagtatt    120

ggtaataata ttattgtcga taacgcgagc ataataaacg gctctgatta aattctgaag    180

tttgttagat acaatgattt cgttcgaagg aactacaaaa taaattataa ggaggcactc    240

aaaatgagta caaaagattt taacttggat ttggtatctg tttcgaagaa agattcaggt    300

gcatcaccac gcattacaag tatttcgcta tgtacacccg gttgtaaaac aggagctctg    360

atgggttgta acatgaaaac agcaacttgt aattgtgcaa ttcacgtaag caaataacca    420

aatcaaagga tagtattttg ttagttcaga catggataag ctt                      463

<210>2

<211>34

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<230>

<400>2

Ile Thr Ser Ile Ser Leu Cys Thr Pro Gly Cys Lys Thr Gly Ala Leu

1                   5                   10                  15

Met Gly Cys Asn Met Lys Thr Ala Thr Cys Asn Cys Ala Ile His Val

                20                  25                  30

Ser Lys

<210>3

<211>463

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<230>

<400>3

gaattcgata taggtttatt gagtcttaga catacttgaa tgacctagtc ttataactat     60

actgacaata gaaacattaa caaatctaaa acagtcttaa ttctatcttg agaaagtatt    120

ggtaataata ttattgtcga taacgcgagc ataataaacg gctctgatta aattctgaag    180

tttgttagat acaatgattt cgttcgaagg aactacaaaa taaattataa ggaggcactc    240

aaaatgagta caaaagattt taacttggat ttggtatctg tttcgaagaa agattcaggt    300

gcatcaccac gcattacaag tatttcgcta tgtacacccg gttgtaaaac aggagctctg    360

atgggttgta acatgaaaac agcaacttgt aattgtagta ttcacgtaag caaataacca    420

aatcaaagga tagtattttg ttagttcaga catggataag ctt                      463

Claims (11)

1.乳链菌肽突变体蛋白，是由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质。

2.权利要求1所述蛋白的编码基因。

3.根据权利要求2所述的基因，其特征在于：所述基因为编码序列是序列表中序列1自5’端的第313位到第417位所示的基因。

4.含有权利要求2或3所述基因的重组载体。

5.根据权利要求4所述的重组载体，其特征在于：所述重组载体是将核苷酸序列如序列表中序列1自5’端的第1位到第463位所示的片段插入pMG36e的多克隆位点之间，得到重组表达载体。

6.含有权利要求2或3所述基因的重组菌。

7.根据权利要求6所述的重组菌，其特征在于：所述重组菌是将权利要求4或5所述的重组载体导入乳酸菌中得到的重组乳酸菌；所述乳酸菌是L.lactis NZ9800。

8.权利要求6或7所述的重组菌在生产权利要求1所述的乳链菌肽突变体蛋白中的应用。

9.含有权利要求2或3所述基因的转基因细胞系。

10.一种抑菌剂，其活性成分是权利要求1所述的乳链菌肽突变体蛋白；所述抑菌是抑制革兰氏阳性菌。

11.根据权利要求10所述的抑菌剂，其特征在于：所述革兰氏阳性菌为黄色微球菌、肺炎链球菌或表皮葡萄球菌。

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