CN115505580A - 一种降解呕吐毒素的山梨糖脱氢酶及其突变体 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种具有降解呕吐毒素特性的山梨糖脱氢酶SDH，其核苷酸序列和氨基酸序列分别为SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2。以及酶活提高的定向改造酶SDHF103L，其核苷酸序列和氨基酸序列分别为SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4。与野生型相比，本发明突变酶具有更高的酶活特性，该酶可将脱氧雪腐镰刀菌烯醇(DON)降解成其弱毒产物。本发明属于农业生物技术领域，可应用于DON脱毒制剂的制备，在DON的脱毒领域具有广阔的应用前景。

Description

一种降解呕吐毒素的山梨糖脱氢酶及其突变体
技术领域
本发明涉及黄芪甲苷的新用途，具体涉及黄芪甲苷用作农作物农药、动物饲料添加剂和人保健品缓解T-2毒素致线粒体损伤中的应用。
本发明属于农业生物技术领域和基因工程技术领域，具体涉及一种用于呕吐毒素降解应用的山梨糖脱氢酶SDH及其突变体。
背景技术
脱氧雪腐镰刀菌烯醇(Deoxynivalenol，DON)又称呕吐毒素，是目前世界分布最为广泛、影响较大的真菌毒素之一。全球大约有25％的农产品受到了霉菌和霉菌毒素的污染，霉菌毒素污染已然成为了世界性难题。摄食DON毒素污染的食物会导致人的免疫力下降，还会造成贫血、头痛、恶心及腹痛等病理反应，动物摄食后可导致拒食、呕吐、生长阻滞及生殖紊乱等不良反应。
目前，呕吐毒素脱毒方法主要有物理吸附和微生物脱毒等方式。物理吸附的方式不具备特异性，在吸附过程种会引起营养物质的丢失。微生物脱毒法的有效性已经有诸多报道，但是该方法在食品加工和饲料生产中具有潜在微生物污染风险等问题，因此应用过程中存在一定局限性。酶是一种绿色催化剂，具有特异性强、效率高等特点。在实际饲料脱毒应用中不影响饲料适口性和营养物质，具有很高的研究价值。然而，目前可以降解呕吐毒素的酶资源较少，有报道锰过氧化物酶有降解呕吐毒素的作用，但目前还不能确定其代谢产物。此外，已知产物的仅有来源于德沃斯氏菌的脱氢酶(DepA和QDDH)和醛酮还原酶(DepB、AKR13B2 和AKR6D1)可以将呕吐毒素分步异构化脱毒，并且DepA与QDDH还有DepB与AKR13B2 分别编码了相同的氨基酸序列。
DON毒素污染引起的粮食和饲料污染一直备受关注，开发具有高效降解活性的酶制剂对实际生产应用有巨大经济价值。
发明内容
本发明的目的是挖掘呕吐毒素降解酶资源，发现来源于生酮基古龙酸菌(Ketogulonogenium vulgare)的山梨糖脱氢酶SDH同时具备降解呕吐毒素潜力。
本发明的第二个目的在于在SDH具有降解呕吐毒素潜力的基础上，进一步定向改造，提供一种呕吐毒素降解活性提高的突变体编码基因。
本发明的第三个目的在于提供一种含有编码SDH及其突变体的基因的载体。
本发明的第四个目的在于提供含有上述编码基因的重组菌株或细胞。
本发明上述目的通过以下技术方案实现：
本发明所述的具有脱毒功能的呕吐毒素降解酶SDH的核苷酸序列和氨基酸序列可以为：分别为SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2
本发明所述突变体的核苷酸序列和氨基酸序列分别为SEQ ID NO.3和SEQ IDNO.4。
在本发明的一种实施方式中，所述将第103位的氨基酸进行突变。
在一种实施方式中，所述载体为pET22b载体。
在一种实施方式中，所述重组菌可以是以大肠杆菌、芽孢杆菌、酵母为宿主构建得到的。
本发明还提供了SDH和SDHF103L在代谢DON中的应用。
具体地，所述应用是将DON降解为3-keto-DON。
优选的，用于代谢DON时，SDHF103L具有更高效的降解效率。
优选的，SDHF103L的孵育温度为10℃～40℃，pH为6～9。
本发明具有以下优点和效果：
本发明发现一种山梨糖脱氢酶SDH具有降解呕吐毒素的潜力，通过半理性设计改造出降解活性大幅度提高的突变体酶。此突变体酶在1小时内的降解率可达到75％以上，同时具有较宽的温度和pH适用性，在10-40℃温度和pH6-9范围内都保持较高活性。此外，突变体酶还具有极强的热稳定性，在95℃处理10min后，降解率仍能达到50％以上，4℃放置2个月代谢效果基本不发生改变。本发明是第一个通过酶工程的方式改造出具有高效降解呕吐毒素的酶，基于其较广的适用条件和较强的稳定性，该酶在呕吐毒素生物脱毒领域有良好的应用前景。
附图说明
图1为SDH和SDHF103L的表达和纯化的SDS-PAGE图。其中：M、蛋白质分子量标准，条带自上至下大小为97.2KD，66.4KD，44.3KD，29.0KD，20.1KD，15.0KD；泳道1-5为 Pet22b-SDH样品，1、诱导前全菌；2、诱导后全菌；3、细菌破碎后上清；4、细菌破碎后沉淀；5、表达产物的纯化；泳道6-10为Pet22b-SDHF103L样品，6、诱导前全菌；7、诱导后全菌；8、细菌破碎后上清；9、细菌破碎后沉淀；10、表达产物的纯化；
图2为SDHF103L对DON的催化作用(a为失活SDHF103L对DON处理组，b为SDHF103L对DON处理组，Compond A和CompondB是DON的降解产物)；
图3为不同时间下SDH和SDHF103L对DON的降解率的变化；
图4为温度对SDH和SDHF103L降解DON活性的影响；
图5为pH对SDH和SDHF103L降解DON活性的影响；
图6为SDHF103L热处理不同时间后DON降解率的影响；
图7为SDHF103L在4℃放置不同时间后对DON降解率的影响；
图8为SDHF103L处理后可以降低DON对HEK293T细胞毒性。
具体实施方式
以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
实施例1山梨糖脱氢酶SDH和SDHF103L表达载体构建
pET22b-SDH质粒由上海生工生物有限公司合成，其中质粒pET22b-SDH中的山梨糖脱氢酶SDH的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示(氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示)。
重组质粒pET22b-SDHF103L的构建，基于103位氨基酸位点，设计并合成定点突变的引物。正向引物：5′-ACATTGCAACCCTGAACTCCCTGGGTGAACCGACCCGTGG-3′，反向引物：5′-CCACGGGTCGGTTCACCCAGGGAGTTCAGGGTTGCAATGT-3′。
以含有SDH基因的质粒pET22b-SDH为模板，使用以上引物进行PCR，反应条件为：94℃ 2min；98℃30s，54℃30s，68℃7min，30个循环；对其PCR产物进行DnPI酶消化，将其转化入DH5α感受态，通过抗生素筛选提取阳性克隆子的质粒并送去测序；将测序正确的表达质粒pET22b-SDHF103L转化入表达菌株BL21中，即可成功构建SDH突变体的表达工程菌。
实施例2 SDH和SDHF103L表达纯化
将工程菌接种于10mL含氨苄霉素50μg/mL的LB培养基中，于37℃，200rpm摇菌。菌液浑浊后按1：100的比例接入500mL含氨苄霉素50μg/mL的新鲜LB培养基中，37℃， 200rpm摇菌。待菌液OD600值达到0.5-0.6时，加入终浓度为0.5mM诱导剂IPTG，根据预实验结果于25℃，150rpm诱导24h后收菌。将诱导后的菌液置于冰上预冷半个小时，4℃， 5000rpm离心10min，收集菌体。收集的菌体用预冷的ddH2O重悬，4℃，5000rpm离心 10min，弃上清留菌体。按每1g菌体用20mL缓冲液(50mM Tris-HCl，1mM EDTA，2mM DTT，0.4mM PMSF)重悬，在低温状态下超声破碎细胞。破碎至菌液清亮后，于4℃，5000 rpm离心30min，取上清过0.22μm滤膜。
采用蛋白纯化仪FPLC系统以及GE公司His TrapTMHP(5mL)柱子进行纯化。平衡缓冲液的配方为：50mM Tris-Hcl，50mM NaCl，0.5mM EDTA，15mM咪唑，pH 8.0；所述洗脱缓冲液的配方为50mM Tris-Hcl，50mM NaCl，0.5mM EDTA，500mM咪唑，pH 8.0。将收集到的蛋白，透析过夜降低咪唑浓度，透析液的配方为：50mM Tris-Hcl，0.5mM EDTA， 2mM DTT，20％甘油，pH 8.0。透析后用10kDa超滤管超滤浓缩。采用SDS-PAGE电泳检测目的蛋白表达纯化结果。
结果如图1所示，Marker左侧为SDH表达纯化结果，右侧为SDHF103L表达纯化结果。重组菌株表达的蛋白质位于66.4KD下，与理论分子量大小一致。
实施例3不同时间下SDH和SDHF103L对DON的降解率
按如下200μL反应体系进行孵育实验：终浓度为50mM Tris-Hcl缓冲液(pH 7.0)，10μM PQQ，1mM Cacl2，1mM PMS，SDH/SDHF103L蛋白(40μg)，15μg/mL DON。以未加入蛋白的体系作为对照。反应在25℃条件下分别反应15min，1h，4h，16h。随后加入600μL乙酸乙酯充分震荡萃取，12000rpm离心1min，取上层乙酸乙酯氮气吹干，用200μL的50％甲醇重悬，0.22μm滤膜过滤，采用高效液相色谱法检测体系中残留的DON含量。
使用安捷伦1260HPLC对底物和产物进行检测，流动相为水和乙腈，洗脱程序：O-15min，乙腈浓度由12％增加到33％；15-16min，乙腈浓度由33％增加到90％；16-18min，乙腈浓度不变；18-19min，乙腈浓度由90％降回12％；再平衡4min。
DON的降解率(％)＝(1-处理组中剩余DON量/对照组中DON量)×100％
结果如图2所示，为SDHF103L代谢DON的液相图，可以明显看到DON水平降低，和产物A和B的生成。
结果如图3所示，SDH与DON孵育4小时，DON毒素降解率约为17％，而将103位点的苯丙氨酸突变为亮氨酸后，突变体SDHF103L与DON毒素孵育1h时降解率可达到75％以上，酶活得到大幅度提高。
实施例4温度对SDH和SDHF103L降解DON活性的影响
分别将SDH和SDHF103L与DON毒素在不同温度(10、15、20、25、30、35、40、45℃) 条件下孵育4h。采用案例实施2所用的反应体系及检测方法。
SDH结果以20℃条件下酶的活性为100％，SDHF103L结果以35℃条件下酶的活性为100％，其它温度条件下以相对活性表示。
结果如图4所示，SDH降解DON最适温度为20℃，SDHF103L降解DON最适温度为35℃，SDHF103L在10-40℃范围内都具有较高活性，具有较宽的温度适用范围。
实施例5 pH对SDH和SDHF103L降解DON活性的影响
分别将SDH和SDHF103L与DON毒素在不同pH(3、4、5、7、8、9、10、11)条件下孵育 4h。pH(3、4、5)采用甘氨酸-盐酸缓冲液，pH(7、8)采用Tris-盐酸缓冲液，pH(9、1O、11)采用甘氨酸-氢氧化钠缓冲液，体系中其他成分和检测方法如案例实施2所示。
SDH和SDHF103L结果以pH 7条件下酶的活性为100％，其它pH条件下以相对活性表示。结果如图5所示，SDH和SDHF103L降解DON最适pH为7，SDHF103L在pH 4-9范围内都具有较高活性，具有较宽的pH适用范围。
实施例6 SDHF103L热处理不同时间后对DON降解率的影响
将SDHF103L在95℃下处理不同时间(10min、30min、1h、2h)，放置冰上冷却后，20℃与DON孵育4h。采用案例实施2所用的反应体系及检测方法。
结果如图6所示，95℃下处理10min，SDHF103L对DON的降解率约为52％，95℃下处理30min，SDHF103L对DON的降解率为26％。95℃下处理1h后SDHF103L完全失去降解活性。实施例7SDHF103L在4℃存放时间后对DON降解率的影响
将SDHF103L在4℃下长时间放置，每月检测酶活变化。采用案例实施2所用的反应体系及检测方法。
结果如图7所示，SDHF103L在4℃下放置2个月，对酶活性没有明显变化。
实施例8代谢产物细胞毒性检测
取同量DON在相同体系下，一份加SDHF103L处理，一份不加SDHF103L处理，20℃孵育16小时后。同时用乙酸乙酯萃取后，加入等量DMSO重悬，两份样品分别取1μL液相检测。SDHF103L处理与不加SDHF103L处理的样品中DON减少了86.4％。待96孔板中HEK 293T细胞贴壁生长后，在HEK 293T中分别加入等倍稀释的DMSO重悬液，按照原始DON含量计算，培养基中终浓度为60、120、240、480ng/mL。培养24h后，加入cck8检测液，继续培养1-2h，酶标仪检测450nm处吸光度。
结果如图8所示，SDHF103L处理组与未处理组相比，细胞毒性大幅度降低，约为未处理组的1/8。由于处理后还残留13.6％DON，表明产物可能接近于无毒。
Figure RE-ISB0000201144570000011
Figure RE-ISB0000201144570000021
Figure RE-ISB0000201144570000031
Figure RE-ISB0000201144570000041
Figure RE-ISB0000201144570000051
Figure RE-ISB0000201144570000061
Figure RE-ISB0000201144570000071
Figure RE-ISB0000201144570000081

Claims (6)

1.一种山梨糖脱氢酶SDH用于降解呕吐毒素的应用。其特征在于，具有：
(I)如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所述的核苷酸序列和氨基酸序列，且此序列用于呕吐毒素脱毒；或
(II)与(I)所述序列具有至少80％核苷酸序列或氨基酸序列一致性，且此序列用于呕吐毒素脱毒。
2.一种降解呕吐毒素活性提高的山梨糖脱氢酶SDH的突变体SDHF103L，其特征在于，具有：
(I)所述突变体的氨基酸序列是在SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列的基础上将第103位的氨基酸进行突变。
(II)其核苷酸序列和氨基酸序列分别为SEQ ID No.3和SEQ ID No.4。
(III)与(II)所述序列具有至少80％核苷酸序列或氨基酸序列一致性，且此序列用于呕吐毒素脱毒。
3.一种包含根据权利要求1和2所述的核苷酸和氨基酸序列的重组表达载体，所述表达载体应用于呕吐毒素脱毒。
4.一种能降解呕吐毒素的重组菌，其特征在于，所述重组菌表达权利要求1和2所述脱毒酶。
5.一种呕吐毒素生物降解剂，其特征在于，包括根据权利要求1所述的山梨糖脱氢酶SDH，以及生理上可接受的配伍载体。
6.一种呕吐毒素生物降解剂，其特征在于，包括根据权利要求2所述的山梨糖脱氢酶突变体，以及生理上可接受的配伍载体。
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