CN112322599B

CN112322599B - 一种转氨酶upta、制备方法和应用

Info

Publication number: CN112322599B
Application number: CN202011000860.7A
Authority: CN
Inventors: 李中媛; 张同存; 潘昆岗; 罗学刚; 宋亚囝
Original assignee: Tianjin University of Science and Technology
Current assignee: Tianjin University of Science and Technology
Priority date: 2020-09-22
Filing date: 2020-09-22
Publication date: 2022-08-05
Anticipated expiration: 2040-09-22
Also published as: CN112322599A

Abstract

本发明涉及一种转氨酶UPTA，所述转氨酶UPTA的氨基酸序列为SEQ ID NO.1。在合适温度及pH下，本发明的转氨酶UPTA对HFB1的降解率为100％；本发明转氨酶UPTA性质优良，该酶可以应用于农业、饲料和食品等工业，减少伏马毒素FB1对动物及人类健康的危害。

Description

一种转氨酶UPTA、制备方法和应用

技术领域

本发明属于农业生物技术领域，尤其是一种转氨酶UPTA、制备方法和应用。

背景技术

伏马毒素是一类由串珠镰刀菌、多育镰刀菌等镰刀菌属在特定条件下产生的次级代谢产物，是一种污染分布较为普遍的真菌毒素，目前已鉴定出28种伏马毒素类似物，被分为A、B、C和P四个系列。其中FB1的污染最广泛，且毒性最强。它会引起马的白质脑软化和猪的肺水肿，也会影响家禽的肝脏和免疫系统。

消除食品和饲料中伏马毒素污染的缓解策略分为物理方法、化学方法和生物方法。物理方法，包括加工过程处理法、热处理法、辐照处理法和吸附法。然而，这些策略或因为使用仪器昂贵，而且会造成饲料中某些营养成分的损失，因此存在局限性。氨化和碱化是最常见的化学脱毒方法，但由于其潜在的毒性和对原料的口感与营养品质存在负面影响，其应用也受到限制。生物脱毒技术可以在不影响食品和饲料质量的前提下降低霉菌毒素毒性，被认为是一种很有前途的脱毒策略。酶制剂在存贮方面相比于微生物制剂而言具有更高的稳定性，因此，研发降解真菌毒素的酶制剂，可以很好地遏制被污染的粮食作物中的毒素的产生，挽回经济损失。

通过检索，尚未发现与本发明专利申请相关的专利公开文献。

发明内容

本发明目的在于克服现有技术的不足之处，提供一种转氨酶UPTA、制备方法和应用，该转氨酶UPTA能够降解伏马毒素中的氨基以解除其毒性。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：

一种转氨酶UPTA，所述转氨酶UPTA的氨基酸序列为SEQ ID NO.1。

如上所述的转氨酶UPTA的制备方法，步骤如下：

⑴用包含编码所述转氨酶UPTA的基因的重组载体转化宿主细胞，得到重组菌株；

⑵培养重组菌株，诱导转氨酶UPTA表达；

⑶分离纯化获得的转氨酶UPTA。

而且，所述步骤⑴中宿主细胞为大肠细胞、啤酒酵母细胞或多型逊酵母细胞。

如上所述的转氨酶UPTA在降解伏马毒素方面中的应用。

一种编码如上所述的转氨酶UPTA的转氨酶UPTA基因。

而且，所述基因的核苷酸序列为SEQ ID NO.2。

包含如上所述的转氨酶UPTA基因的重组载体。

包含如上所述的转氨酶UPTA基因的重组载体pET28a(+)-UPTA。

包含如上所述的转氨酶UPTA基因的重组菌株。

而且，所述重组菌株为大肠杆菌。

本发明取得的优点和积极效果为：

本发明转氨酶UPTA可以降解催化水解伏马毒素FB1(HFB1)的氨基，消除伏马毒素的活性。由于氨基是使得伏马毒素具有毒性作用的关键官能团之一，因此去除氨基是解除伏马毒素毒性的关键点。本发明的转氨酶UPTA具有降解水解伏马毒素HFB1的活性，可以应用于农业、饲料和食品等工业，减少伏马毒素对动物及人类健康的危害。

附图说明

图1为本发明中转氨酶UPTA的SDS-PAGE蛋白洗脱图；其中，M：蛋白marker；1:转氨酶UPTA未纯化蛋白；2：转氨酶UPTA纯化蛋白；

图2为本发明中显示转氨酶UPTA的降解效果示意图；其中，(a)为缓冲液与HFB1的混合溶液；(b)为酶液与HFB1的反应；

具体实施方式

下面详细叙述本发明的实施例，需要说明的是，本实施例是叙述性的，不是限定性的，不能以此限定本发明的保护范围。

本发明中所使用的原料，如无特殊说明，均为常规的市售产品；本发明中所使用的方法，如无特殊说明，均为本领域的常规方法。

一种转氨酶UPTA，所述转氨酶UPTA的氨基酸序列为SEQ ID NO.1。

如上所述的转氨酶UPTA的制备方法，步骤如下：

⑵培养重组菌株，诱导转氨酶UPTA表达；

⑶分离纯化获得的转氨酶UPTA。

较优地，所述步骤⑴中宿主细胞为大肠细胞、啤酒酵母细胞或多型逊酵母细胞，优选为大肠杆菌BL21(DE3)。

如上所述的转氨酶UPTA在降解伏马毒素方面中的应用。

一种编码如上所述的转氨酶UPTA的转氨酶UPTA基因。

较优地，所述基因的核苷酸序列为SEQ ID NO.2。

包含如上所述的转氨酶UPTA基因的重组载体。

包含如上所述的转氨酶UPTA基因的重组载体pET28a(+)-UPTA。

包含如上所述的转氨酶UPTA基因的重组菌株。

较优地，所述重组菌株为大肠杆菌。

具体地，所述转氨酶UPTA，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示：

SEQ ID NO.1：

MAWTNKRALELRDRAEQVIPGGMYGHEATTLMPAEFPQFFSRGKGARLWDADDNEYVDFLCAWGPNLLGYGFEPVEAAAAAQQARGDTLTGPSEVMIDLAEAFTGMVSHADWAMFCKNGTDATSMAMVTARAHTGRKTILVARGAYHGAAPWCTPRTAGILPEDRAHVVHYDYNDADSLADAFKAHEGDVAGVFATPFRHEVLADQHDALLEYALAARALCDQTGALLIVDEVRAGFRLARDSSWSTLGVKPDLSTWGKCFANGYPISALLGANVAREAAKQIFVTGSFWFSATPMAAAVETLRQIRETDYLERLIGAGRRFREGLQQQAASHGFGLRQTGPVQMPQILFEDDPDFRIGYGWVSECLKRGVYLSPYHNMFLSSAHSEADIAQTLAATDEAFEALKTRVGRLEPHPALIALMAG

其中，该酶基因编码423个氨基酸，没有信号肽，因此，成熟的转氨酶UPTA的理论分子量为46.19kDa。

本发明提供了编码上述转氨酶UPTA。该基因的基因组序列如SEQ ID NO.2所示：

SEQ ID NO.2：

ATGGCTTGGACTAACAAGAGAGCCTTGGAGTTGAGAGACAGAGCTGAGCAAGTTATCCCAGGTGGTATGTACGGTCACGAGGCTACTACTTTGATGCCAGCTGAGTTCCCACAGTTCTTCTCAAGAGGTAAGGGTGCTAGATTGTGGGATGCTGACGACAACGAATACGTTGACTTCTTGTGTGCTTGGGGTCCAAACTTGCTTGGTTACGGTTTCGAACCAGTTGAAGCTGCTGCTGCCGCTCAACAAGCTAGAGGTGATACTTTGACTGGTCCATCCGAGGTCATGATTGATTTGGCTGAGGCTTTCACCGGTATGGTTTCTCATGCTGATTGGGCCATGTTCTGCAAGAACGGTACTGACGCTACTTCTATGGCTATGGTTACTGCTAGAGCCCACACTGGTAGAAAGACTATCTTGGTTGCCAGAGGTGCTTACCACGGTGCTGCACCTTGGTGTACTCCAAGAACTGCTGGTATTTTGCCTGAGGACAGAGCCCATGTTGTTCACTACGATTACAACGACGCTGACTCTTTGGCTGATGCCTTTAAGGCTCACGAAGGTGATGTTGCTGGTGTTTTCGCTACTCCATTCAGACACGAAGTTTTGGCTGACCAACACGACGCTTTGTTGGAATACGCTTTGGCTGCAAGAGCTTTGTGTGACCAAACTGGTGCCTTGCTGATCGTTGACGAAGTTAGAGCTGGTTTCAGATTGGCTAGAGACTCTTCCTGGTCCACCTTGGGTGTTAAGCCAGATTTGTCTACCTGGGGTAAGTGTTTCGCTAACGGTTACCCAATTTCCGCCTTGTTGGGTGCTAACGTTGCTAGAGAAGCTGCCAAGCAGATTTTCGTTACTGGTTCCTTCTGGTTCTCCGCCACTCCAATGGCAGCTGCTGTTGAAACTTTGAGACAGATCAGAGAGACTGACTACTTGGAGAGATTGATCGGTGCCGGTAGAAGATTCAGAGAGGGTCTGCAACAACAAGCTGCTTCTCACGGTTTCGGTTTGAGACAAACTGGTCCAGTTCAGATGCCACAGATTTTGTTCGAAGATGACCCCGACTTCAGAATCGGTTACGGATGGGTTTCTGAGTGCTTGAAGAGAGGTGTTTACTTGTCCCCATACCACAACATGTTCTTGTCCTCTGCTCACTCCGAAGCTGACATTGCTCAAACATTGGCTGCTACTGACGAGGCTTTCGAGGCTCTTAAGACTAGAGTTGGTAGATTGGAGCCACATCCAGCTTTGATCGCTTTGATGGCTGGT

本发明通过PCR的方法分离克隆了转氨酶UPTA，DNA全序列分析结果表明，转氨酶UPTA基因开放阅读框架序列(ORF)全长1269bp。

本发明还提供了包含上述转氨酶UPTA的重组载体，将优选重组载体命名为pET28a-UPTA。将本发明的转氨酶UPTA基因插入到表达载体合适的限制性酶切位点之间，使其核苷酸序列可操作的与表达调控序列相连接。作为本发明的一个最优选的实施方案，优选为将本发明的解毒酶基因插入到质粒pET28a上的EcoRI和NotI限制性酶切位点之间，使该核苷酸序列位于T7启动子的下游并受其调控，得到重组大肠表达质粒pET28a-UPTA。

更具体地，相关制备及检测如下：

试验材料和试剂：

1、菌株及载体：本发明得到一种新的转氨酶UPTA。大肠杆菌表达载体pET28a(+)及菌株BL21(DE3)为实验室保存。

2、酶类及其它生化试剂：内切酶购自TaKaRa公司，连接酶购自Invitrogen公司。购自Sigma公司，其它都为国产试剂(均可从普通生化试剂公司购买得到)。

3、培养基：

大肠杆菌培养基LB(1％蛋白胨、0.5％酵母提取物、1％NaCl，pH 7.0)。

说明：以下未作具体说明的分子生物学实验方法，均参照《分子克隆实验指南》(第三版)J.萨姆布鲁克一书中所列的具体方法进行，或者按照试剂盒和产品说明书进行。

一、转氨酶UPTA的克隆

利用人工化学合成的方法获得转氨酶UPTA的基因片段，并在5’端引入内切酶位点EcoR I、在3’端引入内切酶位点NotI。

二、重组转氨酶UPTA的制备

将编码转氨酶UPTA的基因及表达载体pET28a进行双酶切(EcoRI+NotI)，将切出转氨酶的基因片段UPTA经PCR扩增验证后，再经切胶回收纯化验证，将验证过的目的基因与大肠杆菌表达载体pET28a连接，获得含有转氨酶基因UPTA的重组质粒pET28a-UPTA并转化大肠杆菌BL21(DE3)，获得重组大肠杆菌菌株BL21/UPTA。

取含有质粒的BL21(DE3)菌株，接种于5ml试管，经过37℃、220rpm振荡培养活化12h后，按百分之一接种量接种于100mL LB培养液中，37℃、220rpm振荡培养约1.5h后，加入1mM IPTG，置于25℃、160rpm进行诱导，约20h后测定胞内的转氨酶活力。在胞内检测到的转氨酶酶的活性，经过镍柱纯化，SDS-PAGE结果表明，重组转氨酶得到了表达。如图1所示，泳道2为纯化后的结果。

三、重组转氨酶的性质测定

高效液相色谱检测转氨酶的酶活，具体方法如下：

(1)HFB1标准储备液：配制成浓度为100μg/mL的标准液，-20℃保存。

(2)样品的制备：取纯化好的转氨酶酶液850μL，加入100μL的HFB1标准储备液和50μL的丙酮酸溶液，使HFB1的终浓度为10μg/mL，37℃，220rpm，避光放置20min。

(3)样品衍生化：取待测样品100μL，加入400μL 50％乙腈水，500μL OPA衍生液，混匀30s，衍生2min内进样，过滤膜待测。通过与HFB1的标品的峰图对比，来确定转氨酶UPTA的酶活性。

测定伏马毒素降解酶的降解能力，具体方法如下：

在900μL的转氨酶UPTA的酶液与丙酮酸的混合液中加入100μL的HFB1溶液，使得HFB1的终浓度为10μg/mL。将反应液置于37℃条件下，反应12h，将未添加纯化后的转氨酶UPTA的溶液作为对照。反应完成后沸水煮10min，让酶失活。冷却至室温后过膜，待高效液相色谱检测。

结果展示在图2中，其中图2a表示的是缓冲液与HFB1的混合溶液，图2b表示的是酶液与HFB1的反应液。可以看出HFB1在12.646min的时候会出现最高峰，而加入了纯化后的重组转氨酶UPTA的溶液中未检测到HFB1。因此，可以得出转氨酶UPTA具有将HFB1完全降解的能力，能够在12h内将10μg/mL HFB1降解完全。

尽管为说明目的公开了本发明的实施例，但是本领域的技术人员可以理解：在不脱离本发明及所附权利要求的精神和范围内，各种替换、变化和修改都是可能的，因此，本发明的范围不局限于实施例所公开的内容。

序列表

<110> 天津科技大学

<120> 一种转氨酶PHTA、制备方法和应用

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 423

<212> PRT

<213> 转氨酶PHTA的氨基酸序列(Unknown)

<400> 1

Met Ala Trp Thr Asn Lys Arg Ala Leu Glu Leu Arg Asp Arg Ala Glu

1 5 10 15

Gln Val Ile Pro Gly Gly Met Tyr Gly His Glu Ala Thr Thr Leu Met

20 25 30

Pro Ala Glu Phe Pro Gln Phe Phe Ser Arg Gly Lys Gly Ala Arg Leu

35 40 45

Trp Asp Ala Asp Asp Asn Glu Tyr Val Asp Phe Leu Cys Ala Trp Gly

50 55 60

Pro Asn Leu Leu Gly Tyr Gly Phe Glu Pro Val Glu Ala Ala Ala Ala

65 70 75 80

Ala Gln Gln Ala Arg Gly Asp Thr Leu Thr Gly Pro Ser Glu Val Met

85 90 95

Ile Asp Leu Ala Glu Ala Phe Thr Gly Met Val Ser His Ala Asp Trp

100 105 110

Ala Met Phe Cys Lys Asn Gly Thr Asp Ala Thr Ser Met Ala Met Val

115 120 125

Thr Ala Arg Ala His Thr Gly Arg Lys Thr Ile Leu Val Ala Arg Gly

130 135 140

Ala Tyr His Gly Ala Ala Pro Trp Cys Thr Pro Arg Thr Ala Gly Ile

145 150 155 160

Leu Pro Glu Asp Arg Ala His Val Val His Tyr Asp Tyr Asn Asp Ala

165 170 175

Asp Ser Leu Ala Asp Ala Phe Lys Ala His Glu Gly Asp Val Ala Gly

180 185 190

Val Phe Ala Thr Pro Phe Arg His Glu Val Leu Ala Asp Gln His Asp

195 200 205

Ala Leu Leu Glu Tyr Ala Leu Ala Ala Arg Ala Leu Cys Asp Gln Thr

210 215 220

Gly Ala Leu Leu Ile Val Asp Glu Val Arg Ala Gly Phe Arg Leu Ala

225 230 235 240

Arg Asp Ser Ser Trp Ser Thr Leu Gly Val Lys Pro Asp Leu Ser Thr

245 250 255

Trp Gly Lys Cys Phe Ala Asn Gly Tyr Pro Ile Ser Ala Leu Leu Gly

260 265 270

Ala Asn Val Ala Arg Glu Ala Ala Lys Gln Ile Phe Val Thr Gly Ser

275 280 285

Phe Trp Phe Ser Ala Thr Pro Met Ala Ala Ala Val Glu Thr Leu Arg

290 295 300

Gln Ile Arg Glu Thr Asp Tyr Leu Glu Arg Leu Ile Gly Ala Gly Arg

305 310 315 320

Arg Phe Arg Glu Gly Leu Gln Gln Gln Ala Ala Ser His Gly Phe Gly

325 330 335

Leu Arg Gln Thr Gly Pro Val Gln Met Pro Gln Ile Leu Phe Glu Asp

340 345 350

Asp Pro Asp Phe Arg Ile Gly Tyr Gly Trp Val Ser Glu Cys Leu Lys

355 360 365

Arg Gly Val Tyr Leu Ser Pro Tyr His Asn Met Phe Leu Ser Ser Ala

370 375 380

His Ser Glu Ala Asp Ile Ala Gln Thr Leu Ala Ala Thr Asp Glu Ala

385 390 395 400

Phe Glu Ala Leu Lys Thr Arg Val Gly Arg Leu Glu Pro His Pro Ala

405 410 415

Leu Ile Ala Leu Met Ala Gly

420

<210> 2

<211> 1269

<212> DNA/RNA

<213> 转氨酶UPTA基因(Unknown)

<400> 2

atggcttgga ctaacaagag agccttggag ttgagagaca gagctgagca agttatccca 60

ggtggtatgt acggtcacga ggctactact ttgatgccag ctgagttccc acagttcttc 120

tcaagaggta agggtgctag attgtgggat gctgacgaca acgaatacgt tgacttcttg 180

tgtgcttggg gtccaaactt gcttggttac ggtttcgaac cagttgaagc tgctgctgcc 240

gctcaacaag ctagaggtga tactttgact ggtccatccg aggtcatgat tgatttggct 300

gaggctttca ccggtatggt ttctcatgct gattgggcca tgttctgcaa gaacggtact 360

gacgctactt ctatggctat ggttactgct agagcccaca ctggtagaaa gactatcttg 420

gttgccagag gtgcttacca cggtgctgca ccttggtgta ctccaagaac tgctggtatt 480

ttgcctgagg acagagccca tgttgttcac tacgattaca acgacgctga ctctttggct 540

gatgccttta aggctcacga aggtgatgtt gctggtgttt tcgctactcc attcagacac 600

gaagttttgg ctgaccaaca cgacgctttg ttggaatacg ctttggctgc aagagctttg 660

tgtgaccaaa ctggtgcctt gctgatcgtt gacgaagtta gagctggttt cagattggct 720

agagactctt cctggtccac cttgggtgtt aagccagatt tgtctacctg gggtaagtgt 780

ttcgctaacg gttacccaat ttccgccttg ttgggtgcta acgttgctag agaagctgcc 840

aagcagattt tcgttactgg ttccttctgg ttctccgcca ctccaatggc agctgctgtt 900

gaaactttga gacagatcag agagactgac tacttggaga gattgatcgg tgccggtaga 960

agattcagag agggtctgca acaacaagct gcttctcacg gtttcggttt gagacaaact 1020

ggtccagttc agatgccaca gattttgttc gaagatgacc ccgacttcag aatcggttac 1080

ggatgggttt ctgagtgctt gaagagaggt gtttacttgt ccccatacca caacatgttc 1140

ttgtcctctg ctcactccga agctgacatt gctcaaacat tggctgctac tgacgaggct 1200

ttcgaggctc ttaagactag agttggtaga ttggagccac atccagcttt gatcgctttg 1260

atggctggt 1269

Claims

1.转氨酶UPTA用于制备降解伏马毒素FB1的制剂的应用，其特征在于，所述转氨酶UPTA的氨基酸序列为SEQ ID NO .1。