CN112239755A

CN112239755A - 伏马毒素降解酶FumDSS及其基因和应用

Info

Publication number: CN112239755A
Application number: CN202011000873.4A
Authority: CN
Inventors: 李中媛; 张同存; 金善政; 罗学刚; 宋亚囝
Original assignee: Tianjin University of Science and Technology
Current assignee: Tianjin University of Science and Technology
Priority date: 2020-09-22
Filing date: 2020-09-22
Publication date: 2021-01-19

Abstract

本发明涉及一种羧酸酯酶FumDSS，具体涉及到了伏马毒素降解酶FumDSS的氨基酸序列为SEQ ID NO.1。本发明的伏马毒素降解酶FumDSS对FB1的降解率为100％；本发明伏马毒素降解酶FumDSS性质优良，还提供了编码上述伏马毒素降解酶的编码基因。该酶可以应用于农业、饲料和食品等工业，并且可以减少伏马毒素FB1对动物及人类健康的危害。

Description

伏马毒素降解酶FumDSS及其基因和应用

技术领域

本发明属于农业生物技术领域，具体涉及到一种伏马毒素降解酶FumDSS及其基因和应用。

背景技术

伏马毒素(Fumonisin，FB)是天然存在的毒素，主要由镰刀菌(Fusarium spp.)和增殖镰刀菌产生。它是一类结构相关的代谢物，已知存在若干不同类型(FA、FB、FC、FP)的伏马菌素，目前已鉴定出28种伏马毒素类似物，其FB1、FB2和FB3是食物中发现的主要形式(玉米和玉米制品中含有大量的伏马毒素)，其中伏马毒素B1(FB1)是最普遍、毒性最强的伏马毒素。占伏马毒素的80％，且毒性最强。它会引起马的白质脑软化，对猪脑和垂体发生神经化学变化而引起不良生理反应，也会影响家禽的肝脏和免疫系统，诱发癌症。此外，FB1对大多数哺乳动物都有肝肾毒性、生殖毒性。还具有一定的植物毒性和昆虫毒性。

目前，去除食品和饲料中伏马毒素污染的缓解策略分为物理、化学和生物原理。物理方法，包括干法和湿磨法，浸泡、加热以及吸附剂的使用。然而，这些策略或因为使用仪器昂贵，或因为物理法化学法不能专一的选择底物，造成营养物质的流失，因此存在局限性。氨化和碱化是最常见的化学脱毒方法，但由于其潜在的毒性和对原料的口感与营养品质存在负面影响，其应用也受到限制。生物脱毒技术可以在不影响食品和饲料质量的前提下降低霉菌毒素毒性，被认为是一种很有前途的脱毒策略，生物酶专一性强，转化效率高，转化后的产物无毒无污染。酶制剂在存贮方面相比于微生物制剂而言具有更高的稳定性，随着真菌毒素在全世界都有着严重的污染，造成了大量粮食资源的浪费，又是2B类致癌物，为了有效控制消除食品和饲料中的伏马毒素污染，我们需要开发安全、高效和低成本的伏马毒素脱毒技术，寻找高效伏马毒素脱毒酶。

通过检索，尚未发现与本发明专利申请相关的专利公开文献。

发明内容

本发明目的在于克服现有技术的不足之处，提供一种伏马毒素降解酶FumDSS及其制备方法和应用，该伏马毒素降解酶FumDSS能够降解伏马毒素中的丙三羧酸(TCA)以解除其毒性。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：

一种伏马毒素降解酶FumDSS，所述伏马毒素降解酶FumDSS的氨基酸序列为SEQ IDNO.1。

如上所述的伏马毒素降解酶FumDSS的制备方法，步骤如下：

⑴用包含编码所述伏马毒素降解酶FumDSS的基因的重组载体转化宿主细胞，得到重组菌株；

⑵培养重组菌株，诱导伏马毒素降解酶FumDSS表达；

⑶分离纯化获得的伏马毒素降解酶FumDSS。

而且，所述步骤⑴中宿主细胞为大肠细胞、毕赤酵母细胞或多型逊酵母细胞。

如上所述的伏马毒素降解酶FumDSS在降解伏马毒素方面中的应用。

一种编码如上所述的伏马毒素降解酶FumDSS的伏马毒素降解酶FumDSS基因。

而且，所述基因的核苷酸序列为SEQ ID NO.2。

包含如上所述的伏马毒素降解酶FumDSS基因的重组载体。

包含如上所述的伏马毒素降解酶FumDSS基因的重组载体pET28a(+)-FumDSS。

包含如上所述的伏马毒素降解酶FumDSS基因的重组菌株。

而且，所述重组菌株为大肠杆菌。

本发明取得的优点和积极效果为：

1、本发明伏马毒素降解酶FumDSS对FB1的降解率为100％；本发明伏马毒素降解酶FumDSS性质优良，该酶可以应用于农业、饲料和食品等工业，减少伏马毒素FB1对动物及人类健康的危害。

2、本发明伏马毒素降解酶FumDSS可以降解催化伏马毒素FB1的丙三羧酸，降解伏马毒素的活性。由于丙三羧酸是使得伏马毒素具有毒性作用的关键官能团之一，因此去除丙三羧酸是解除伏马毒素毒性的关键点。本发明的伏马毒素降解酶FumDSS具有降解伏马毒素FB1的活性，可以应用于农业、饲料和食品等工业，减少伏马毒素对动物及人类健康的危害。

附图说明

图1为本发明中伏马毒素降解酶FumDSS的SDS-PAGE纯化图；其中，M：蛋白marker；1:伏马毒素降解酶FumDSS；

图2为本发明中显示伏马毒素降解酶FumDSS的降解效果示意图；

具体实施方式

下面详细叙述本发明的实施例，需要说明的是，本实施例是叙述性的，不是限定性的，不能以此限定本发明的保护范围。

本发明中所使用的原料，如无特殊说明，均为常规的市售产品；本发明中所使用的方法，如无特殊说明，均为本领域的常规方法。

如上所述的伏马毒素降解酶FumDSS的制备方法，步骤如下：

⑵培养重组菌株，诱导伏马毒素降解酶FumDSS表达；

⑶分离纯化获得的伏马毒素降解酶FumDSS。

较优地，所述步骤⑴中宿主细胞为大肠细胞、啤酒酵母细胞或多型逊酵母细胞，优选为大肠杆菌BL21(DE3)。

较优地，所述基因的核苷酸序列为SEQ ID NO.2。

包含如上所述的伏马毒素降解酶FumDSS基因的重组载体。

包含如上所述的伏马毒素降解酶FumDSS基因的重组菌株。

较优地，所述重组菌株为大肠杆菌。

具体地，所述伏马毒素降解酶FumDSS，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示：

SEQ ID NO.1：

MPIVSTTAGKVRGVRLENGLLAFRGIPYAAPPVGPLRWRPPAPVAPWADVKEAQDFGADAVQVSGVRQSRAPEMSEDCLYLNVWAPEEARAGGWPVIVWCGGGGFTTGGGAFVTEDLARLAARGAILVSYNYRLGIFGFLAHRALSAESPDGSSGNYGLMDHVAALEWVRANIAAFGGDPGRITYMAESSGAAAGLLMLAMEREQPLFDRAVLLSPGSISPLLSLEEAEASSAALDMTAEQMRSLTAEQLLDQAKSLAAAPSNLSVARPMRPIVDGHLVTSDSAYAEGRFAAVPVIIGTNEDEGRFFTRRMAISSLADHLDYLSDSFGAHAERAQLLYPAETEAEVAGAVAAAYGDISINFPVERLARAFAGRQPRTFRLVYTYRHGDTQQPPTHSEESETFLDTRPHVTPADAAMADLVGRYLIAFAENGEPSAEGLPDWPAYDADAAPFQRLDLPLSQGTRWRSEHMTFLSEVFD

其中，该酶基因编码477个氨基酸，没有信号肽，因此，成熟的伏马毒素降解酶FumDSS的理论分子量为55.22kDa。

本发明提供了编码上述伏马毒素降解酶FumDSS。该基因的基因组序列如SEQ IDNO.2所示：

SEQ ID NO.2：

ATGCCGATTGTCAGCACCACCGCGGGAAAGGTGCGGGGCGTTCGCCTCGAGAATGGCTTGCTGGCATTTCGCGGTATTCCTTATGCGGCGCCGCCGGTCGGACCGCTGCGCTGGCGGCCCCCTGCGCCCGTCGCGCCATGGGCCGACGTCAAAGAGGCGCAGGACTTCGGGGCCGACGCGGTGCAGGTGTCCGGCGTGAGGCAGTCCCGCGCGCCTGAGATGTCGGAAGATTGCCTGTACCTTAATGTCTGGGCCCCCGAAGAAGCGCGTGCGGGCGGCTGGCCGGTGATCGTCTGGTGCGGCGGCGGCGGCTTCACGACCGGCGGCGGCGCCTTCGTGACGGAAGATCTTGCCAGGCTCGCCGCGCGCGGTGCCATCCTCGTCTCCTATAATTACCGGCTCGGCATCTTCGGCTTTCTCGCGCATCGCGCGCTGAGCGCCGAATCTCCCGACGGGAGCTCAGGCAACTACGGCCTGATGGACCATGTCGCGGCCCTCGAGTGGGTGCGCGCCAATATCGCGGCCTTTGGAGGCGACCCCGGCCGGATCACCTATATGGCGGAATCGTCGGGCGCCGCGGCGGGACTGCTGATGCTCGCCATGGAACGTGAGCAGCCGCTGTTCGATCGTGCGGTCCTGCTATCGCCGGGGTCGATCTCTCCGCTGCTGTCGCTCGAAGAGGCCGAAGCATCGAGCGCGGCGCTCGACATGACGGCCGAGCAGATGCGCAGCCTCACCGCCGAACAATTGCTCGATCAGGCGAAATCGCTCGCGGCCGCCCCTTCCAATCTTTCGGTGGCCCGGCCGATGCGACCGATCGTCGACGGCCATCTGGTGACAAGCGACAGCGCTTACGCCGAAGGCCGCTTTGCCGCGGTCCCGGTCATCATCGGGACCAACGAGGACGAAGGCCGCTTCTTCACTCGCCGGATGGCGATTTCGTCGCTGGCGGATCATCTGGACTATCTCTCGGACAGTTTCGGCGCCCACGCCGAACGGGCGCAACTGCTCTATCCTGCAGAAACCGAGGCGGAGGTGGCCGGTGCCGTTGCCGCCGCCTATGGCGACATATCGATCAATTTTCCGGTCGAGCGGCTCGCGCGCGCATTTGCCGGTCGCCAGCCGCGAACCTTTCGGTTGGTCTACACCTACCGCCATGGCGACACCCAGCAGCCGCCGACCCATTCGGAGGAATCCGAGACCTTCCTCGACACGCGGCCCCATGTCACTCCTGCCGATGCGGCGATGGCGGACCTGGTCGGCCGCTATCTCATCGCCTTTGCGGAGAATGGCGAACCGTCCGCCGAAGGCCTCCCAGACTGGCCAGCCTATGACGCTGACGCGGCTCCCTTTCAGCGGCTCGATCTGCCGCTGTCGCAAGGCACGCGGTGGCGTTCGGAGCATATGACCTTCCTGTCGGAGGTCTTCGATTAA

本发明通过PCR的方法分离克隆了伏马毒素降解酶FumDSS，DNA全序列分析结果表明，伏马毒素降解酶FumDSS基因开放阅读框架序列(ORF)全长1434bp。

本发明还提供了包含上述伏马毒素降解酶FumDSS的重组载体，将优选重组载体命名为pET28a(+)-FumDSS。将本发明的伏马毒素降解酶FumDSS基因插入到表达载体合适的限制性酶切位点之间，使其核苷酸序列可操作的与表达调控序列相连接。作为本发明的一个最优选的实施方案，优选为将本发明的解毒酶基因插入到质粒pET28a(+)上的EcoRI和XholI限制性酶切位点之间，使该核苷酸序列位于T7启动子的下游并受其调控，得到重组大肠表达质粒pET28a(+)-FumDSS。

更具体地，相关制备及检测如下：

试验材料和试剂：

1、菌株及载体：大肠杆菌表达载体pET28a(+)及菌株BL21(DE3)为实验室保存。

2、酶类及其它生化试剂：内切酶购自TaKaRa公司，连接酶购自Invitrogen公司。购自Sigma公司，其它都为国产试剂(均可从普通生化试剂公司购买得到)。

3、培养基：

大肠杆菌培养基LB(1％蛋白胨、0.5％酵母提取物、1％NaCl，pH 7.0)。

说明：以下未作具体说明的分子生物学实验方法，均参照《分子克隆实验指南》(第三版)J.萨姆布鲁克一书中所列的具体方法进行，或者按照试剂盒和产品说明书进行。

一、伏马毒素降解酶FumDSS的克隆

利用人工化学合成的方法获得伏马毒素降解酶FumDSS的基因片段，并在核苷酸序列5’端添加内切酶位点EcoRI、在3’端添加位点XholI。

二、重组伏马毒素降解酶FumDSS的制备

将表达载体pET28a(+)进行双酶切(EcoRI+XholI)，同时将编码伏马毒素降解酶FumDSS的基因双酶切(EcoRI+XholI)，切出编码成熟伏马毒素降解酶的基因片段与表达载体pET28a(+)连接，获得含有伏马毒素降解酶基因FumDSS的重组质粒pET28a(+)-FumDSS并转化大肠杆菌BL21(DE3)，获得重组大肠杆菌菌株BL21/FumDSS。

取含有质粒的BL21(DE3)菌株，接种于100mLLB培养液中，37℃、220rpm振荡培养约2-3h后，待OD₆₀₀＝0.6-0.8时，加入1mM IPTG，置于25℃220rpm诱导约20h。4℃离心收集菌体。通过超声破碎，收集上清，经过镍柱纯化，SDS-PAGE结果表明，重组伏马毒素降解酶在大肠杆菌中获得了表达。如图1所示，泳道1为纯化后的FumDSS。

三、重组伏马毒素降解酶的性质测定

高效液相色谱检测伏马毒素降解酶的酶活，具体方法如下：

(1)FB1标准储备液：称1mgFB1标品，用10ml乙腈水(v：v＝1:1)溶解，配制成浓度为100μg/mL的标准液，-20℃保存。

(2)样品的制备：取纯化好的伏马毒素降解酶酶液900μL，加入100μL的FB1标准储备液，使FB1的终浓度为10μg/mL，37℃，避光处理20min。

(3)样品衍生化：取待测样品100μL，加入400μL 50％乙腈水，500μL OPA衍生液，混匀30s，衍生2min内进样，过滤膜待测。通过与FB1的标品的峰图对比，来确定伏马毒素降解酶FumDSS的酶活性。

1、测定伏马毒素降解酶的降解能力

在900μL的伏马毒素降解酶FumDSS的酶液(柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液，pH＝7.0)中加入100μL的FB1溶液，使得FB1的终浓度为10μg/mL。将反应液置于37℃，pH＝7的条件下，反应12h，未添加纯化后的伏马毒素降解酶FumDSS的溶液作为对照。反应完成后沸水煮10min，让酶失活。冷却至室温后过膜，待高效液相色谱检测。

结果展示在图2中，其中图2a表示的是缓冲液与FB1的混合溶液，图2b表示的是酶液与FB1的反应液。可以看出FB1在9.883min的时候会出现最高峰，而加入了纯化后的重组伏马毒素降解酶FumDSS的溶液中未检测到FB1，而生成了降解产物HFB1在11.827出现。因此，可以得出伏马毒素降解酶FumDSS具有将FB1完全降解的能力，能够在12h内将10μg/mLFB1降解完全。

尽管为说明目的公开了本发明的实施例，但是本领域的技术人员可以理解：在不脱离本发明及所附权利要求的精神和范围内，各种替换、变化和修改都是可能的，因此，本发明的范围不局限于实施例所公开的内容。

序列表

<110> 天津科技大学

<120> 伏马毒素降解酶FumDSS及其基因和应用

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 477

<212> PRT

<213> 伏马毒素降解酶FumDSS的氨基酸序列(Unknown)

<400> 1

Met Pro Ile Val Ser Thr Thr Ala Gly Lys Val Arg Gly Val Arg Leu

1 5 10 15

Glu Asn Gly Leu Leu Ala Phe Arg Gly Ile Pro Tyr Ala Ala Pro Pro

20 25 30

Val Gly Pro Leu Arg Trp Arg Pro Pro Ala Pro Val Ala Pro Trp Ala

35 40 45

Asp Val Lys Glu Ala Gln Asp Phe Gly Ala Asp Ala Val Gln Val Ser

50 55 60

Gly Val Arg Gln Ser Arg Ala Pro Glu Met Ser Glu Asp Cys Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Asn Val Trp Ala Pro Glu Glu Ala Arg Ala Gly Gly Trp Pro Val

85 90 95

Ile Val Trp Cys Gly Gly Gly Gly Phe Thr Thr Gly Gly Gly Ala Phe

100 105 110

Val Thr Glu Asp Leu Ala Arg Leu Ala Ala Arg Gly Ala Ile Leu Val

115 120 125

Ser Tyr Asn Tyr Arg Leu Gly Ile Phe Gly Phe Leu Ala His Arg Ala

130 135 140

Leu Ser Ala Glu Ser Pro Asp Gly Ser Ser Gly Asn Tyr Gly Leu Met

145 150 155 160

Asp His Val Ala Ala Leu Glu Trp Val Arg Ala Asn Ile Ala Ala Phe

165 170 175

Gly Gly Asp Pro Gly Arg Ile Thr Tyr Met Ala Glu Ser Ser Gly Ala

180 185 190

Ala Ala Gly Leu Leu Met Leu Ala Met Glu Arg Glu Gln Pro Leu Phe

195 200 205

Asp Arg Ala Val Leu Leu Ser Pro Gly Ser Ile Ser Pro Leu Leu Ser

210 215 220

Leu Glu Glu Ala Glu Ala Ser Ser Ala Ala Leu Asp Met Thr Ala Glu

225 230 235 240

Gln Met Arg Ser Leu Thr Ala Glu Gln Leu Leu Asp Gln Ala Lys Ser

245 250 255

Leu Ala Ala Ala Pro Ser Asn Leu Ser Val Ala Arg Pro Met Arg Pro

260 265 270

Ile Val Asp Gly His Leu Val Thr Ser Asp Ser Ala Tyr Ala Glu Gly

275 280 285

Arg Phe Ala Ala Val Pro Val Ile Ile Gly Thr Asn Glu Asp Glu Gly

290 295 300

Arg Phe Phe Thr Arg Arg Met Ala Ile Ser Ser Leu Ala Asp His Leu

305 310 315 320

Asp Tyr Leu Ser Asp Ser Phe Gly Ala His Ala Glu Arg Ala Gln Leu

325 330 335

Leu Tyr Pro Ala Glu Thr Glu Ala Glu Val Ala Gly Ala Val Ala Ala

340 345 350

Ala Tyr Gly Asp Ile Ser Ile Asn Phe Pro Val Glu Arg Leu Ala Arg

355 360 365

Ala Phe Ala Gly Arg Gln Pro Arg Thr Phe Arg Leu Val Tyr Thr Tyr

370 375 380

Arg His Gly Asp Thr Gln Gln Pro Pro Thr His Ser Glu Glu Ser Glu

385 390 395 400

Thr Phe Leu Asp Thr Arg Pro His Val Thr Pro Ala Asp Ala Ala Met

405 410 415

Ala Asp Leu Val Gly Arg Tyr Leu Ile Ala Phe Ala Glu Asn Gly Glu

420 425 430

Pro Ser Ala Glu Gly Leu Pro Asp Trp Pro Ala Tyr Asp Ala Asp Ala

435 440 445

Ala Pro Phe Gln Arg Leu Asp Leu Pro Leu Ser Gln Gly Thr Arg Trp

450 455 460

Arg Ser Glu His Met Thr Phe Leu Ser Glu Val Phe Asp

465 470 475

<210> 2

<211> 1434

<212> DNA/RNA

<213> 伏马毒素降解酶FumDSS的核苷酸序列(Unknown)

<400> 2

atgccgattg tcagcaccac cgcgggaaag gtgcggggcg ttcgcctcga gaatggcttg 60

ctggcatttc gcggtattcc ttatgcggcg ccgccggtcg gaccgctgcg ctggcggccc 120

cctgcgcccg tcgcgccatg ggccgacgtc aaagaggcgc aggacttcgg ggccgacgcg 180

gtgcaggtgt ccggcgtgag gcagtcccgc gcgcctgaga tgtcggaaga ttgcctgtac 240

cttaatgtct gggcccccga agaagcgcgt gcgggcggct ggccggtgat cgtctggtgc 300

ggcggcggcg gcttcacgac cggcggcggc gccttcgtga cggaagatct tgccaggctc 360

gccgcgcgcg gtgccatcct cgtctcctat aattaccggc tcggcatctt cggctttctc 420

gcgcatcgcg cgctgagcgc cgaatctccc gacgggagct caggcaacta cggcctgatg 480

gaccatgtcg cggccctcga gtgggtgcgc gccaatatcg cggcctttgg aggcgacccc 540

ggccggatca cctatatggc ggaatcgtcg ggcgccgcgg cgggactgct gatgctcgcc 600

atggaacgtg agcagccgct gttcgatcgt gcggtcctgc tatcgccggg gtcgatctct 660

ccgctgctgt cgctcgaaga ggccgaagca tcgagcgcgg cgctcgacat gacggccgag 720

cagatgcgca gcctcaccgc cgaacaattg ctcgatcagg cgaaatcgct cgcggccgcc 780

ccttccaatc tttcggtggc ccggccgatg cgaccgatcg tcgacggcca tctggtgaca 840

agcgacagcg cttacgccga aggccgcttt gccgcggtcc cggtcatcat cgggaccaac 900

gaggacgaag gccgcttctt cactcgccgg atggcgattt cgtcgctggc ggatcatctg 960

gactatctct cggacagttt cggcgcccac gccgaacggg cgcaactgct ctatcctgca 1020

gaaaccgagg cggaggtggc cggtgccgtt gccgccgcct atggcgacat atcgatcaat 1080

tttccggtcg agcggctcgc gcgcgcattt gccggtcgcc agccgcgaac ctttcggttg 1140

gtctacacct accgccatgg cgacacccag cagccgccga cccattcgga ggaatccgag 1200

accttcctcg acacgcggcc ccatgtcact cctgccgatg cggcgatggc ggacctggtc 1260

ggccgctatc tcatcgcctt tgcggagaat ggcgaaccgt ccgccgaagg cctcccagac 1320

tggccagcct atgacgctga cgcggctccc tttcagcggc tcgatctgcc gctgtcgcaa 1380

ggcacgcggt ggcgttcgga gcatatgacc ttcctgtcgg aggtcttcga ttaa 1434

Claims

1.一种伏马毒素降解酶FumDSS，其特征在于：所述伏马毒素降解酶的氨基酸序列为SEQID NO.1。

2.如编码权利要求1所述的伏马毒素降解酶FumDSS的制备方法，其特征在于：步骤如下：

⑵培养重组菌株，诱导伏马毒素降解酶FumDSS表达；

⑶分离纯化获得的伏马毒素降解酶FumDSS。

3.根据权利要求2所述的伏马毒素降解酶FumDSS的制备方法，其特征在于：所述步骤⑴中宿主细胞为大肠细胞、毕赤酵母细胞或多型逊酵母细胞。

4.如权利要求1所述的伏马毒素降解酶FumDSS在降解伏马毒素方面中的应用。

5.一种编码如权利要求1所述的伏马毒素降解酶FumDSS的伏马毒素降解酶FumDSS基因。

6.根据权利要求5所述的伏马毒素降解酶FumDSS基因，其特征在于：所述基因的核苷酸序列为SEQ ID NO.2。

7.包含如权利要求5或6所述的伏马毒素降解酶FumDSS基因的重组载体。

8.包含如权利要求5或6所述的伏马毒素降解酶FumDSS基因的重组载体pET28a(+)-FumDSS。

9.包含如权利要求5或6所述的伏马毒素降解酶FumDSS基因的重组菌株。

10.根据权利要求9所述的重组菌株，其特征在于：所述重组菌株为大肠杆菌。