CN109337886B - 伏马毒素降解酶FumDXA及其基因和应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于农业生物技术领域，具体涉及伏马毒素降解酶FumDXA及其基因和应用。本发明提供了一种来源于Xenophilus azovorans的伏马毒素降解酶蛋白FumDXA，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，且本发明提供编码上述伏马毒素降解酶的编码基因。本发明的伏马毒素降解酶FumDXA具有降解伏马毒素B1的活性，可以应用于农业、饲料和食品等工业，减少伏马毒素对动物及人类健康的危害。

Description

伏马毒素降解酶FumDXA及其基因和应用

技术领域

本发明属于农业生物技术领域，具体涉及伏马毒素降解酶FumDXA及其基因和应用。

背景技术

伏马毒素(Fumonisin，FB)是镰刀菌属(Fusarium spp.)在特定的条件下产生的一些水溶性的次级代谢产物。伏马毒素是由多氢醇和丙三羧酸组成双酯类化合物，结构中的主要活性官能团是伯胺、三羧酸、羟基和脂肪族骨架，这些与它们的毒性效应密切相关。研究表明，伏马毒素可引起大鼠肾肿瘤和肝癌、马脑白质软化症(ELEM)，猪肺水肿(PPE)等，且与人类食管癌的发病密切相关。到目前为止，发现了28种伏马毒素的类似物，将其分为四类，即FA、FB、FC和FP，在B系列中，最常发现的是伏马菌素B1(FB1)、B2(FB2)和B3(FB3)，其中FB1量在自然界中的量大约占70％-80％左右，其毒性最强，污染最广泛。应用物理、化学的方法能将伏马毒素去除，但是，化学方法局限性比较大，虽然能降低FB1的含量，但会引入新的化学物质，增加安全隐患，此外欧盟也禁止使用化学方法消除真菌毒素。物理方法可去除一定量的FB1，但要求条件高，且易改变食品品质和风味。生物降解法降解FB1反应温和，专一性强，特异性高，应用前景非常广阔。

真菌毒素的污染在全球范围内都在日益加剧，其造成宝贵的粮食资源的浪费，且对人具有致癌性。因此，研发降解真菌毒素的酶制剂，可以很好的遏制被污染的粮食作物中的毒素的产生，挽回经济损失。

发明内容

为了能够利用生物降解法降解伏马毒素，本发明提供一种伏马毒素降解酶FumDXA及其基因和应用。

本发明的目的在于提供一种伏马毒素降解酶FumDXA。

本发明的再一目的在于提供一种伏马毒素降解酶FumDXA的基因。

本发明的再一目的在于提供一种含有伏马毒素降解酶FumDXA基因的重组表达载体。

本发明的再一目的在于提供一种含有伏马毒素降解酶FumDXA基因的重组菌株。

本发明的再一目的在于提供制备上述伏马毒素降解酶FumDXA的方法。

本发明的再一目的在于提供上述伏马毒素降解酶FumDXA的应用。

根据本发明具体实施方式的伏马毒素降解酶FumDXA，其氨基酸序列如SEQ IDNO.1所示：

MRQPDAPLVETPLGMLSGVVARPGVAAFLGIPYAAPPVGALRWRAPQPAAPWAGVRDAAAFGPDGPQLPNPRLRAGRQDEDCLYLNVWAPQGAAPGSCPVVVWVHGGGFAGGSGSDARSDGARVAAHGVVVVSFNYRSGLLGFLAHPALSRESPQGTSGNWGLLDQMAALRWVRTYIAAFGGDARRITAFGVSAGSASLSLMLASPLAGGLFEQAILQSPGAGRPLASLAQAEQAGRALGDDIEALRALPAHELLQRTPLLAPKVRGLTTPRVLRPICDGWLLPEDERPVFQSGRLHAMPLIVGSNADEGTQLTRPWPVDTLQAYEAQIEANFAGAQEQARALYPAATDAEARPAVAQMFADTQFNYGTRLLARSMAAREPRTWRYLFTRRAPDAADGPHHGEEVGYVFGNLDQVPGAGDQDRRLSDAMMQAWIGFAREGDPNAGRPGAEWPRYDPAADNHLEFGDRVAAGARWRTAQLDFLERYHGGLPARA

其中，该酶基因编码493个氨基酸和一个终止密码子，没有信号肽，因此，成熟的伏马毒素降解酶FumDXA的理论分子量为53kDa。

本发明提供了编码上述伏马毒素降解酶FumDXA的基因，该基因的基因组序列如SEQ ID NO.2所示：

Atgcggcagccggacgcccctctcgtcgagacgccgctgggcatgctgagcggcgtcgtggcgcggcccggcgtggccgccttcctgggcatcccctatgcggcgccgccggtgggcgcgctgcgctggcgcgcgccgcagccggcggcgccgtgggccggcgtgcgcgacgcggccgccttcggccccgacggcccgcagctgccgaacccgcgcctgcgcgccgggcggcaggacgaggactgcctctacctcaacgtctgggcgccgcagggcgccgcgccgggaagctgcccggtggtggtgtgggtccacggcggcggcttcgcgggcggcagcggctcggacgcgcgcagcgacggcgcgcgggtggccgcccacggcgtggtggtggtgagcttcaactaccgctcggggctgctcggctttctcgcccatccggcgctcagccgcgagagcccgcagggaacctccggcaactgggggctgctcgaccagatggcggcgctgcgctgggtgcgcacctacatcgcggccttcggcggcgacgcacggcgcatcacggccttcggcgtctcggcgggctcggcctcgctgtcgctgatgctggcctcgccgctggcgggcgggctgttcgagcaggccatcctgcaaagccccggcgcgggccggccgctggcctcgctcgcccaggccgagcaggccggccgcgcgcttggcgacgacatcgaggcgctgcgcgccctgccggcgcacgagctgctgcagcgcaccccgctgctcgcgccgaaggtccggggcctcacgacgccgcgggtgctccggcccatctgcgacggctggctgctgcccgaggacgagcgcccggtcttccagtccgggcgcctgcatgcgatgccattgatcgtcggcagcaacgcggacgagggcacgcagctcacccgcccctggcccgtcgacaccctgcaggcctacgaggcgcagatcgaggccaacttcgccggcgcgcaggagcaggcgcgtgcgctgtacccggcggcgacggatgccgaggcccggcccgcggtcgcgcagatgttcgccgacacccagttcaactacggcacgcgcctgctggcgcgctcgatggccgcgcgcgagccgcgcacctggcgctacctgttcacccggcgcgcgcccgacgccgcggacgggccgcaccacggcgaggaggtgggctacgtgttcggcaacctggaccaggtgccgggcgccggcgaccaggaccgccggttgagcgacgcgatgatgcaggcctggatcggcttcgcacgcgagggggacccgaatgccggccggcccggcgccgaatggccccgctacgacccggctgccgacaaccacctggagttcggcgaccgcgtggccgcgggcgcgcgctggcgcacggcgcaactggacttcctcgagcgttatcacggcgggctgccggcgcgcgcctga

本发明通过PCR的方法分离克隆了降解酶FumDXA基因，DNA全序列分析结果表明，降解酶FumDXA结构基因全长1482bp。

将伏马毒素降解酶FumDXA基因序列及氨基酸序列在GenBank中进行BLAST比对，该序列与来源于鞘氨醇盒菌MTA144氨基酸序列一致性为46％，说明本发明的伏马毒素降解酶FumDXA是一种新的FB1降解酶。

本发明还提供了包含上述伏马毒素降解酶FumDXA的重组载体，将优选重组载体命名为pET28a-FumDXA。将本发明的降解酶FumDXA基因插入到表达载体合适的限制性酶切位点之间，使其核苷酸序列可操作的与表达调控序列相连接。作为本发明的一个最优选的实施方案，优选为将本发明的解毒酶基因插入到质粒pET28a上的EcoR I和Xhol限制性酶切位点之间，使该核苷酸序列位于T7启动子的下游并受其调控，得到重组大肠表达质粒pET28a-FumDXA。

本发明还提供了包含上述伏马毒素降解酶FumDXA的重组菌株，优选所述菌株为大肠杆菌。

本发明还提供了一种制备伏马毒素降解酶FumDXA的方法，包括以下步骤：

(1)用包含编码伏马毒素降解酶FumDXA的基因的重组载体转化宿主细胞，得到重组菌株；

(2)培养重组菌株，诱导伏马毒素降解酶FumDXA表达；

(3)分离纯化获得的伏马毒素降解酶FumDXA。

其中，优选所述宿主细胞为大肠细胞、啤酒酵母细胞或多型逊酵母细胞，优选为大肠杆菌BL21(DE3)。

本发明还提供上述伏马毒素降解酶FumDXA的应用，尤其是在降解伏马毒素B1的应用。

本发明的伏马毒素降解酶FumDXA的最适温度30℃，最适pH为9.0，在Ph7-10范围内仍保持60％以上的活性。在最适温度和最适pH下，本发明的伏马毒素降解酶FumDXA对FB1的降解率为100％。

应用本发明的方法可以获得性质优良的伏马毒素B1伏马毒素降解酶，该酶可以应用于农业、饲料和食品等工业，减少伏马毒素B1对动物及人类健康的危害。

附图说明

图1为伏马毒素降解酶FumDXA的SDS-PAGE纯化图，其中，M：蛋白marker；1:伏马毒素降解酶FumDXA；

图2显示伏马毒素降解酶FumDXA的最适温度情况；

图3显示伏马毒素降解酶FumDXA的最适pH情况。

具体实施方式

试验材料和试剂

1、菌株及载体：大肠杆菌表达载体pET28a(+)及菌株BL21(DE3)。

2、培养基：

大肠杆菌培养基LB(1％蛋白胨、0.5％酵母提取物、1％NaCl，pH7.0)。

实施例1克隆伏马毒素降解酶FumDXA

利用人工化学合成的方法获得来源于Xenophilus azovoran的伏马毒素降解酶FumDXA的基因片段，并在5’端引入内切酶位点EcoR I、在3’端引入内切酶位点Xho I。

实施例2重组伏马毒素降解酶FumDXA的制备

将表达载体pET28a进行双酶切(EcoR I+Xho I)，同时将编码伏马毒素解毒酶的基因FumDXA双酶切(EcoR I+Xho I)，切出编码解毒酶的基因片段与表达载体pET28a连接，获得含有降解酶FumDXA的重组质粒pET28a-FumDXA转化至大肠杆菌BL21(DE3)，获得重组大肠杆菌菌株BL21(DE3)/FumDXA。

取含有重组质粒的BL21(DE3)菌株，接种于100mL LB培养液中，37℃220rpm振荡培养2-3h后，OD₆₀₀为0.6-0.8时，加入终浓度为1mM IPTG，25℃诱导20h，诱导结束，4℃离心收集菌体。通过超声破碎，收集上清，镍柱纯化后，SDS-PAGE结果表明，重组解毒酶在大肠杆菌中得到了表达。如图1所示，泳道1为纯化后的结果。

实施例3伏马毒素降解酶FumDXA的性质测定

高效液相色谱检测伏马毒素降解酶的酶活，具体方法如下：

(1)FB1标准储备液：称1mg标品，用10ml乙腈和水(1：1)溶解，配制成浓度为100ug/mL的标准液，-20℃保存。

(2)样品的制备：取纯化好的伏马毒素降解酶酶液900ul，加入100ul的FB1标准储备液，使FB1的终浓度为10ug/ml，37℃，220rpm，避光培养20min。

(3)样品衍生化：取待测样品100ul，加入400ul 50％乙腈水，500ul OPA衍生液，混匀30s，衍生2min内进样，过滤膜待测。通过与FB1的标品的峰图对比，来确定伏马毒素降解酶FumDXA的酶活性。

1.测定伏马毒素降解酶的最适温度

以FB1为底物，取100μL底物并加入900μL的酶液，终浓度为10μg/ml，在柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液(pH7.0)缓冲液体系及不同温度下，反应20min，然后沸水煮10min，让酶失活。冷却至室温后过膜，待高效液相色谱检测。

如图2所示，伏马毒素降解酶FumDXA的最适温度为30℃。

2.测定伏马毒素降解酶FumDXA的最适pH

将纯化的重组伏马毒素降解酶FumDXA在不同的pH缓冲液下进行酶促反应，以测定其最适pH，所选用的缓冲溶液的缓冲梯度为100mM柠檬酸-磷酸氢二钠(pH3.0–8.0)，100mM的Tris-HCl(pH8.0-9.0)，100mM甘氨酸-NaOH(pH 9.0–12.0)。伏马毒素降解酶FumDXA在上述不同的缓冲液中与底物FB1(终浓度为1μg/ml)在37℃反应30min，沸水煮10min，高效液相色谱检测。

结果如图3所示，伏马毒素降解酶FumDXA的最适pH为9.0。

同时，本发明还对伏马毒素降解酶FumDXA的温度稳定性和pH稳定性进行测定，结果表明伏马毒素降解酶FumDSB具有较好的温度稳定性和pH稳定性。

序列表

<110> 天津科技大学

<120> 伏马毒素降解酶FumDXA及其基因和应用

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 493

<212> PRT

<213> 草酸杆菌(Xenophilus azovoran)

<400> 1

Met Arg Gln Pro Asp Ala Pro Leu Val Glu Thr Pro Leu Gly Met Leu

1 5 10 15

Ser Gly Val Val Ala Arg Pro Gly Val Ala Ala Phe Leu Gly Ile Pro

20 25 30

Tyr Ala Ala Pro Pro Val Gly Ala Leu Arg Trp Arg Ala Pro Gln Pro

35 40 45

Ala Ala Pro Trp Ala Gly Val Arg Asp Ala Ala Ala Phe Gly Pro Asp

50 55 60

Gly Pro Gln Leu Pro Asn Pro Arg Leu Arg Ala Gly Arg Gln Asp Glu

65 70 75 80

Asp Cys Leu Tyr Leu Asn Val Trp Ala Pro Gln Gly Ala Ala Pro Gly

85 90 95

Ser Cys Pro Val Val Val Trp Val His Gly Gly Gly Phe Ala Gly Gly

100 105 110

Ser Gly Ser Asp Ala Arg Ser Asp Gly Ala Arg Val Ala Ala His Gly

115 120 125

Val Val Val Val Ser Phe Asn Tyr Arg Ser Gly Leu Leu Gly Phe Leu

130 135 140

Ala His Pro Ala Leu Ser Arg Glu Ser Pro Gln Gly Thr Ser Gly Asn

145 150 155 160

Trp Gly Leu Leu Asp Gln Met Ala Ala Leu Arg Trp Val Arg Thr Tyr

165 170 175

Ile Ala Ala Phe Gly Gly Asp Ala Arg Arg Ile Thr Ala Phe Gly Val

180 185 190

Ser Ala Gly Ser Ala Ser Leu Ser Leu Met Leu Ala Ser Pro Leu Ala

195 200 205

Gly Gly Leu Phe Glu Gln Ala Ile Leu Gln Ser Pro Gly Ala Gly Arg

210 215 220

Pro Leu Ala Ser Leu Ala Gln Ala Glu Gln Ala Gly Arg Ala Leu Gly

225 230 235 240

Asp Asp Ile Glu Ala Leu Arg Ala Leu Pro Ala His Glu Leu Leu Gln

245 250 255

Arg Thr Pro Leu Leu Ala Pro Lys Val Arg Gly Leu Thr Thr Pro Arg

260 265 270

Val Leu Arg Pro Ile Cys Asp Gly Trp Leu Leu Pro Glu Asp Glu Arg

275 280 285

Pro Val Phe Gln Ser Gly Arg Leu His Ala Met Pro Leu Ile Val Gly

290 295 300

Ser Asn Ala Asp Glu Gly Thr Gln Leu Thr Arg Pro Trp Pro Val Asp

305 310 315 320

Thr Leu Gln Ala Tyr Glu Ala Gln Ile Glu Ala Asn Phe Ala Gly Ala

325 330 335

Gln Glu Gln Ala Arg Ala Leu Tyr Pro Ala Ala Thr Asp Ala Glu Ala

340 345 350

Arg Pro Ala Val Ala Gln Met Phe Ala Asp Thr Gln Phe Asn Tyr Gly

355 360 365

Thr Arg Leu Leu Ala Arg Ser Met Ala Ala Arg Glu Pro Arg Thr Trp

370 375 380

Arg Tyr Leu Phe Thr Arg Arg Ala Pro Asp Ala Ala Asp Gly Pro His

385 390 395 400

His Gly Glu Glu Val Gly Tyr Val Phe Gly Asn Leu Asp Gln Val Pro

405 410 415

Gly Ala Gly Asp Gln Asp Arg Arg Leu Ser Asp Ala Met Met Gln Ala

420 425 430

Trp Ile Gly Phe Ala Arg Glu Gly Asp Pro Asn Ala Gly Arg Pro Gly

435 440 445

Ala Glu Trp Pro Arg Tyr Asp Pro Ala Ala Asp Asn His Leu Glu Phe

450 455 460

Gly Asp Arg Val Ala Ala Gly Ala Arg Trp Arg Thr Ala Gln Leu Asp

465 470 475 480

Phe Leu Glu Arg Tyr His Gly Gly Leu Pro Ala Arg Ala

485 490

<210> 2

<211> 1482

<212> DNA

<213> 草酸杆菌(Xenophilus azovoran)

<400> 2

atgcggcagc cggacgcccc tctcgtcgag acgccgctgg gcatgctgag cggcgtcgtg 60

gcgcggcccg gcgtggccgc cttcctgggc atcccctatg cggcgccgcc ggtgggcgcg 120

ctgcgctggc gcgcgccgca gccggcggcg ccgtgggccg gcgtgcgcga cgcggccgcc 180

ttcggccccg acggcccgca gctgccgaac ccgcgcctgc gcgccgggcg gcaggacgag 240

gactgcctct acctcaacgt ctgggcgccg cagggcgccg cgccgggaag ctgcccggtg 300

gtggtgtggg tccacggcgg cggcttcgcg ggcggcagcg gctcggacgc gcgcagcgac 360

ggcgcgcggg tggccgccca cggcgtggtg gtggtgagct tcaactaccg ctcggggctg 420

ctcggctttc tcgcccatcc ggcgctcagc cgcgagagcc cgcagggaac ctccggcaac 480

tgggggctgc tcgaccagat ggcggcgctg cgctgggtgc gcacctacat cgcggccttc 540

ggcggcgacg cacggcgcat cacggccttc ggcgtctcgg cgggctcggc ctcgctgtcg 600

ctgatgctgg cctcgccgct ggcgggcggg ctgttcgagc aggccatcct gcaaagcccc 660

ggcgcgggcc ggccgctggc ctcgctcgcc caggccgagc aggccggccg cgcgcttggc 720

gacgacatcg aggcgctgcg cgccctgccg gcgcacgagc tgctgcagcg caccccgctg 780

ctcgcgccga aggtccgggg cctcacgacg ccgcgggtgc tccggcccat ctgcgacggc 840

tggctgctgc ccgaggacga gcgcccggtc ttccagtccg ggcgcctgca tgcgatgcca 900

ttgatcgtcg gcagcaacgc ggacgagggc acgcagctca cccgcccctg gcccgtcgac 960

accctgcagg cctacgaggc gcagatcgag gccaacttcg ccggcgcgca ggagcaggcg 1020

cgtgcgctgt acccggcggc gacggatgcc gaggcccggc ccgcggtcgc gcagatgttc 1080

gccgacaccc agttcaacta cggcacgcgc ctgctggcgc gctcgatggc cgcgcgcgag 1140

ccgcgcacct ggcgctacct gttcacccgg cgcgcgcccg acgccgcgga cgggccgcac 1200

cacggcgagg aggtgggcta cgtgttcggc aacctggacc aggtgccggg cgccggcgac 1260

caggaccgcc ggttgagcga cgcgatgatg caggcctgga tcggcttcgc acgcgagggg 1320

gacccgaatg ccggccggcc cggcgccgaa tggccccgct acgacccggc tgccgacaac 1380

cacctggagt tcggcgaccg cgtggccgcg ggcgcgcgct ggcgcacggc gcaactggac 1440

ttcctcgagc gttatcacgg cgggctgccg gcgcgcgcct ga 1482

Claims (1)

1.伏马毒素降解酶FumDXA在降解伏马毒素FB1方面的应用，其特征在于，所述伏马毒素降解酶FumDXA的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

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