CN113817695B

CN113817695B - 一种胺氧化酶ndao、制备方法和应用

Info

Publication number: CN113817695B
Application number: CN202111133633.6A
Authority: CN
Inventors: 李中媛; 夏忠强; 张同存
Original assignee: Tianjin University of Science and Technology
Current assignee: Tianjin University of Science and Technology
Priority date: 2021-09-27
Filing date: 2021-09-27
Publication date: 2023-09-01
Anticipated expiration: 2041-09-27
Also published as: CN113817695A

Abstract

本发明涉及一种胺氧化酶NDAO，所述胺氧化酶NDAO的氨基酸序列为SEQ ID NO.1。本发明的胺氧化酶NDAO对HFB1的降解率为100％；本发明胺氧化酶NDAO性质优良，该酶可以应用于农业、饲料和食品等工业，减少伏马毒素FB1对动物及人类健康的危害。

Description

一种胺氧化酶NDAO、制备方法和应用

技术领域

本发明属于农业生物技术领域，尤其是一种胺氧化酶NDAO、制备方法和应用。

背景技术

伏马毒素是一类水溶性的真菌毒素，主要是由镰刀菌属产生的。伏马毒素具有多种的毒性，包括神经毒性，免疫毒性，组织与器官毒性，细胞毒性等，还会对人造成危害。目前，伏马毒素的污染遍布世界，主要污染玉米等谷物，不仅造成经济损失，还会对人于动物的健康造成很大的威胁。随着真菌毒素的研究越来越深入，人们对毒素的危害越来越清楚。近年来，随着全球粮食作物产量的逐渐增加，真菌的污染也越来越严重，人们迫切需要消除伏马毒素的危害，保证食品和动物饲料的安全。

关于伏马毒素的脱毒，国内外学者都对此做了大量的研究试验，方法可分为：物理法、化学法、生物法。虽然已经制定了许多物理和化学解毒策略来消除真菌毒素的污染，但由于成本高、生物安全风险高以及结合能力有限等，并不能满足生产要求，因此，为了确保食品安全，进行生物解毒方法的研究非常必要。其中生物降解是利用从微生物中分离出与伏马毒素解毒酶相关基因进行克隆，利用基因工程技术进行构建基因工程菌，使其表达相关蛋白对毒素进行降解，具有较好的效果。

发明内容

本发明目的在于克服现有技术的不足之处，提供一种胺氧化酶NDAO、制备方法和应用，该胺氧化酶NDAO能够降解伏马毒素中的氨基以解除其毒性。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：

一种胺氧化酶NDAO，所述胺氧化酶NDAO的氨基酸序列为SEQ ID NO.1。

如上所述的胺氧化酶NDAO的制备方法，步骤如下：

(1)采用分子生物学的手段将包含编码所述胺氧化酶NDAO的基因重组至载体继而转化宿主细胞，得到重组菌株；

(2)活化并培养重组菌株，诱导表达胺氧化酶NDAO；

(3)分离纯化胺氧化酶NDAO；

(4)通过蛋白免疫印迹western blot验证蛋白表达正确。

而且，所述步骤(1)中宿主细胞为大肠细胞、啤酒酵母细胞或多型逊酵母细胞。

如上所述的胺氧化酶NDAO在降解伏马毒素方面中的应用。

一种编码如上所述的胺氧化酶NDAO的胺氧化酶NDAO基因。

而且，所述基因的核苷酸序列为SEQ ID NO.2。

包含如上所述的胺氧化酶NDAO基因的重组载体。

包含如上所述的胺氧化酶NDAO基因的重组载体pET28a(+)-NDAO。

包含如上所述的胺氧化酶NDAO基因的重组菌株。

而且，所述重组菌株为大肠杆菌。

本发明取得的优点和积极效果为：

1、本发明胺氧化酶NDAO可以降解催化水解伏马毒素FB1(HFB1)的氨基，消除伏马毒素的活性。由于氨基是使得伏马毒素具有毒性作用的关键官能团之一，因此去除氨基是解除伏马毒素毒性的关键点。本发明的胺氧化酶NDAO具有降解水解伏马毒素HFB1的活性，可以应用于农业、饲料和食品等工业，减少伏马毒素对动物及人类健康的危害。

附图说明

图1为本发明中胺氧化酶NDAO的SDS-PAGE纯化图；其中，M：蛋白marker；1：300mM咪唑洗脱的蛋白；

图2为本发明中胺氧化酶NDAO的westernblot结果图，其中，M：蛋白marker；1:胺氧化酶NDAO；

图3为本发明中显示胺氧化酶NDAO的降解效果示意图，其中图A为标品水解伏马毒素的液相结果图，图B为胺氧化酶NDAO降解水解伏马毒素的液相结果；

具体实施方式

下面详细叙述本发明的实施例，需要说明的是，本实施例是叙述性的，不是限定性的，不能以此限定本发明的保护范围。

本发明中所使用的原料，如无特殊说明，均为常规的市售产品；本发明中所使用的方法，如无特殊说明，均为本领域的常规方法。

如上所述的胺氧化酶NDAO的制备方法，步骤如下：

(2)活化并培养重组菌株，诱导表达胺氧化酶NDAO；

(3)分离纯化胺氧化酶NDAO；

(4)通过蛋白免疫印迹western blot验证蛋白表达正确。

较优地，所述步骤⑴中宿主细胞为大肠细胞、啤酒酵母细胞或多型逊酵母细胞，优选为大肠杆菌BL21(DE3)。

如上所述的胺氧化酶NDAO在降解伏马毒素方面中的应用。

一种编码如上所述的胺氧化酶NDAO的胺氧化酶NDAO基因。

较优地，所述基因的核苷酸序列为SEQ ID NO.2。

包含如上所述的胺氧化酶NDAO基因的重组载体。

包含如上所述的胺氧化酶NDAO基因的重组载体pET28a(+)-NDAO。

包含如上所述的胺氧化酶NDAO基因的重组菌株。

较优地，所述重组菌株为大肠杆菌。

具体地，所述胺氧化酶NDAO，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示：

SEQ ID NO.1：

MPASVESLPAEKQELLTSTNPRQDELEAVTTDVVVVGAGLSGLQAAVKIQAAGISCHVLEANDRVGGKTLTVKSSEDHPGVNDVGAAWINDTNQSEIFQLFQRYGLQAETQRATGYSLRELEDGTTDSFPYGEDKMDDEQAVAMDKIMSTLRRSIEESNLEDPIAGPDATHLDSLAFDEYINEIVLSPITTVFANAISRSLLGVDADEVSALFVVNYFKSGTGIDNMLSDLRDGGQHLRARQGMQSISKGLAGELQPSSLHLSTTVRSIDQLAGQRCEVQSTSGAFFNCRKVIVSVPTPLYSSIQFTPPLPESKRLLSESTALGYYSKMVFVFSKPWWRDAGLSGIFDSDQGPVSFSRDTSIPADDQWSISCFLVGGTGREWSKFPKATRQEKVWNQFRRVFASMVDVVPEPINVIEMEWAKQPHFLGAPSPVMKPGVLSSVGSATLRERFLNVHFVGTETSVVWKGYMDGAVRSGQRGADEVIAGLKEASARSGQ

其中，该酶基因编码496个氨基酸，没有信号肽，因此，成熟的胺氧化酶NDAO的理论分子量为54kDa。

本发明提供了编码上述胺氧化酶NDAO。该基因的基因组序列如SEQ ID NO.2所示：

SEQ ID NO.2：

ATGCCAGCTTCTGTCGAGTCTTTGCCAGCTGAGAAGCAAGAACTTCTTACCTCTAC CAACCCAAGACAAGATGAGCTTGAGGCTGTTACCACCGATGTCGTTGTTGTTGGTGCCGGTTTGTCTGGTTTGCAAGCCGCCGTCAAGATCCAAGCTGCTGGAATCTCTTGCCACGTTTTGGAGGCCAACGATAGAGTTGGTGGTAAGACCTTGACCGTCAAGTCTTCTGAAGACCACCCCGGAGTCAATGACGTCGGTGCCGCTTGGATTAACGACACCAACCAATCTGAAATCTTCCAACTTTTCCAGAGGTACGGTTTGCAAGCTGAGACTCAAAGGGCCACCGGTTACTCTTTGAGAGAGTTGGAGGATGGAACTACCGACAGTTTCCCATACGGAGAGGACAAGATGGACGATGAGCAAGCTGTCGCTATGGACAAAATCATGTCTACTCTTAGAAGGTCTATTGAAGAGAGTAACTTGGAGGACCCAATCGCTGGTCCAGATGCCACCCACTTGGATTCTTTGGCCTTCGACGAGTATATTAATGAGATCGTCCTTAGTCCTATCACCACCGTTTTCGCCAACGCCATCAGTAGAAGTTTGCTTGGTGTTGATGCCGATGAGGTTAGTGCTCTTTTCGTCGTCAACTATTTCAAGTCTGGAACTGGAATTGATAACATGTTGTCTGATTTGAGGGACGGTGGACAGCATCTTAGGGCTAGACAAGGAATGCAGAGTATCAGTAAAGGACTTGCCGGAGAGCTTCAGCCTTCTAGTCTTCACTTGTCTACCACCGTTAGGTCTATCGACCAACTTGCTGGACAAAGGTGCGAGGTTCAGAGTACCAGTGGAGCCTTCTTCAATTGTAGAAAGGTCATCGTCAGTGTCCCAACCCCTCTTTATTCTAGTATCCAGTTCACCCCACCTCTTCCAGAATCTAAGAGGTTGCTTTCTGAGTCTACCGCCTTGGGTTACTACTCTAAAATGGTTTTCGTCTTCTCTAAGCCTTGGTGGAGGGACGCCGGATTGTCTGGAATTTTCGACAGTGACCAAGGACCAGTCTCTTTTTCTAGGGATACCTCTATCCCAGCCGACGATCAGTGGTCTATCTCTTGCTTTCTTGTCGGTGGAACTGGTAGGGAGTGGAGTAAGTTTCCTAAGGCCACTAGACAAGAAAAGGTCTGGAACCAGTTTAGAAGAGTCTTCGCCTCTATGGTTGATGTCGTCCCAGAACCAATCAACGTCATCGAGATGGAGTGGGCTAAGCAACCACACTTCTTGGGAGCCCCATCTCCAGTTATGAAGCCCGGAGTCCTTTCTAGTGTCGGTAGTGCCACCCTTAGGGAGAGATTCTTGAACGTCCACTTCGTCGGAACCGAGACCTCTGTCGTCTGGAAGGGATATATGGACGGTGCCGTTAGGTCTGGTCAAAGGGGAGCTGACGAAGTCATTGCCGGTTTGAAGGAGGCTAGTGCTAGGAGTGGTCAA

本发明通过PCR的方法分离克隆了胺氧化酶NDAO，DNA全序列分析结果表明，胺氧化酶NDAO基因开放阅读框架序列(ORF)全长1416bp。

本发明还提供了包含上述胺氧化酶NDAO的重组载体，将优选重组载体命名为pET28a(+)-NDAO。将本发明的胺氧化酶NDAO基因插入到表达载体合适的限制性酶切位点之间，使其核苷酸序列可操作的与表达调控序列相连接。作为本发明的一个最优选的实施方案，优选为将本发明的解毒酶基因插入到质粒pET28a(+)上的EcoR I和Not I限制性酶切位点之间，使该核苷酸序列位于T7启动子的下游并受其调控，得到重组大肠表达质粒pET28a(+)-NDAO。

更具体地，相关制备及检测如下：

试验材料和试剂：

1、菌株及载体：本发明得到一种新的胺氧化酶NDAO。大肠杆菌表达载体pET28a(+)及菌株BL21(DE3)为实验室保存。

2、酶类及其它生化试剂：内切酶购自TransGen Biotech公司，连接酶购自TransGen Biotech公司。Proteintech His标签抗体购自北京西美杰科科技公司，蛋白marker购自Thermo Scientific公司，色谱级甲醇购自Fisher Chemical公司，其它都为国产试剂(均可从普通生化试剂公司购买得到)。

3、培养基：

大肠杆菌培养基LB(10g/L蛋白胨、5g/L酵母提取物、10g/L氯化钠,pH 7.0)。

说明：以下未作具体说明的分子生物学实验方法，均参照《分子克隆实验指南》(第三版)J.萨姆布鲁克一书中所列的具体方法进行，或者按照试剂盒和产品说明书进行。

一、胺氧化酶NDAO的克隆

利用人工化学合成的方法获得胺氧化酶NDAO的基因片段，并在5’端引入内切酶位点EcoRI、在3’端引入内切酶位点NotI。

二、重组胺氧化酶NDAO的制备

将表达载体pET28a(+)进行双酶切(EcoRI+NotI)，同时将编码胺氧化酶NDAO的基因双酶切(EcoRI+NotI)，切出编码成熟胺氧化酶的基因片段与表达载体pET28a(+)通过T4DNA连接酶进行连接，获得含有胺氧化酶基因NDAO的重组质粒pET28a(+)-NDAO并转化大肠杆菌BL21(DE3)，获得重组大肠杆菌菌株BL21/NDAO。

将重组大肠杆菌菌株BL21/NDAO活化后接种于100mL LB培养液中，37℃、220rpm振荡培养约2.5h后，加入0.2mM IPTG，置于25℃、220rpm进行诱导，约24h后测定胞内和胞外的胺氧化酶活力。在胞内检测到胺氧化酶的活性，经过镍柱纯化，分别收集了80mM、100mM、300mM的咪唑。SDS-PAGE结果表明，重组胺氧化酶得到了表达。在进一步通过western blot进行验证蛋白表达正确。如图1所示，泳道1为纯化后的结果。图2为westernblot验证的结果。

三、重组胺氧化酶的降解性质测定

高效液相色谱检测胺氧化酶的降解性，具体方法如下：

(1)HFB1标准储备液：配制成浓度为100μg/mL的标准液，-20℃保存。

(2)样品的制备：取纯化好的胺氧化酶酶液45μL，加入5μL的HFB1标准储备液，使HFB1的终浓度为10μg/mL，37℃水浴锅中放置10min，然后放入100℃的孵育器中失活10min。(3)样品衍生化：取待测样品50μL，加入200μL乙腈水(V:V＝1:1)，250μL OPA衍生液，混匀30s，衍生2min内进样，过滤膜待测。通过与HFB1的标品的峰图对比，来确定胺氧化酶NDAO的酶活性。

尽管为说明目的公开了本发明的实施例，但是本领域的技术人员可以理解：在不脱离本发明及所附权利要求的精神和范围内，各种替换、变化和修改都是可能的，因此，本发明的范围不局限于实施例所公开的内容。

序列表

<110> 天津科技大学

<120> 一种胺氧化酶NDAO、制备方法和应用

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 496

<212> PRT

<213> 胺氧化酶NDAO的氨基酸序列(Unknown)

<400> 1

Met Pro Ala Ser Val Glu Ser Leu Pro Ala Glu Lys Gln Glu Leu Leu

1 5 10 15

Thr Ser Thr Asn Pro Arg Gln Asp Glu Leu Glu Ala Val Thr Thr Asp

20 25 30

Val Val Val Val Gly Ala Gly Leu Ser Gly Leu Gln Ala Ala Val Lys

35 40 45

Ile Gln Ala Ala Gly Ile Ser Cys His Val Leu Glu Ala Asn Asp Arg

50 55 60

Val Gly Gly Lys Thr Leu Thr Val Lys Ser Ser Glu Asp His Pro Gly

65 70 75 80

Val Asn Asp Val Gly Ala Ala Trp Ile Asn Asp Thr Asn Gln Ser Glu

85 90 95

Ile Phe Gln Leu Phe Gln Arg Tyr Gly Leu Gln Ala Glu Thr Gln Arg

100 105 110

Ala Thr Gly Tyr Ser Leu Arg Glu Leu Glu Asp Gly Thr Thr Asp Ser

115 120 125

Phe Pro Tyr Gly Glu Asp Lys Met Asp Asp Glu Gln Ala Val Ala Met

130 135 140

Asp Lys Ile Met Ser Thr Leu Arg Arg Ser Ile Glu Glu Ser Asn Leu

145 150 155 160

Glu Asp Pro Ile Ala Gly Pro Asp Ala Thr His Leu Asp Ser Leu Ala

165 170 175

Phe Asp Glu Tyr Ile Asn Glu Ile Val Leu Ser Pro Ile Thr Thr Val

180 185 190

Phe Ala Asn Ala Ile Ser Arg Ser Leu Leu Gly Val Asp Ala Asp Glu

195 200 205

Val Ser Ala Leu Phe Val Val Asn Tyr Phe Lys Ser Gly Thr Gly Ile

210 215 220

Asp Asn Met Leu Ser Asp Leu Arg Asp Gly Gly Gln His Leu Arg Ala

225 230 235 240

Arg Gln Gly Met Gln Ser Ile Ser Lys Gly Leu Ala Gly Glu Leu Gln

245 250 255

Pro Ser Ser Leu His Leu Ser Thr Thr Val Arg Ser Ile Asp Gln Leu

260 265 270

Ala Gly Gln Arg Cys Glu Val Gln Ser Thr Ser Gly Ala Phe Phe Asn

275 280 285

Cys Arg Lys Val Ile Val Ser Val Pro Thr Pro Leu Tyr Ser Ser Ile

290 295 300

Gln Phe Thr Pro Pro Leu Pro Glu Ser Lys Arg Leu Leu Ser Glu Ser

305 310 315 320

Thr Ala Leu Gly Tyr Tyr Ser Lys Met Val Phe Val Phe Ser Lys Pro

325 330 335

Trp Trp Arg Asp Ala Gly Leu Ser Gly Ile Phe Asp Ser Asp Gln Gly

340 345 350

Pro Val Ser Phe Ser Arg Asp Thr Ser Ile Pro Ala Asp Asp Gln Trp

355 360 365

Ser Ile Ser Cys Phe Leu Val Gly Gly Thr Gly Arg Glu Trp Ser Lys

370 375 380

Phe Pro Lys Ala Thr Arg Gln Glu Lys Val Trp Asn Gln Phe Arg Arg

385 390 395 400

Val Phe Ala Ser Met Val Asp Val Val Pro Glu Pro Ile Asn Val Ile

405 410 415

Glu Met Glu Trp Ala Lys Gln Pro His Phe Leu Gly Ala Pro Ser Pro

420 425 430

Val Met Lys Pro Gly Val Leu Ser Ser Val Gly Ser Ala Thr Leu Arg

435 440 445

Glu Arg Phe Leu Asn Val His Phe Val Gly Thr Glu Thr Ser Val Val

450 455 460

Trp Lys Gly Tyr Met Asp Gly Ala Val Arg Ser Gly Gln Arg Gly Ala

465 470 475 480

Asp Glu Val Ile Ala Gly Leu Lys Glu Ala Ser Ala Arg Ser Gly Gln

485 490 495

<210> 2

<211> 1488

<212> DNA/RNA

<213> 胺氧化酶NDAO的核苷酸序列(Unknown)

<400> 2

atgccagctt ctgtcgagtc tttgccagct gagaagcaag aacttcttac ctctaccaac 60

ccaagacaag atgagcttga ggctgttacc accgatgtcg ttgttgttgg tgccggtttg 120

tctggtttgc aagccgccgt caagatccaa gctgctggaa tctcttgcca cgttttggag 180

gccaacgata gagttggtgg taagaccttg accgtcaagt cttctgaaga ccaccccgga 240

gtcaatgacg tcggtgccgc ttggattaac gacaccaacc aatctgaaat cttccaactt 300

ttccagaggt acggtttgca agctgagact caaagggcca ccggttactc tttgagagag 360

ttggaggatg gaactaccga cagtttccca tacggagagg acaagatgga cgatgagcaa 420

gctgtcgcta tggacaaaat catgtctact cttagaaggt ctattgaaga gagtaacttg 480

gaggacccaa tcgctggtcc agatgccacc cacttggatt ctttggcctt cgacgagtat 540

attaatgaga tcgtccttag tcctatcacc accgttttcg ccaacgccat cagtagaagt 600

ttgcttggtg ttgatgccga tgaggttagt gctcttttcg tcgtcaacta tttcaagtct 660

ggaactggaa ttgataacat gttgtctgat ttgagggacg gtggacagca tcttagggct 720

agacaaggaa tgcagagtat cagtaaagga cttgccggag agcttcagcc ttctagtctt 780

cacttgtcta ccaccgttag gtctatcgac caacttgctg gacaaaggtg cgaggttcag 840

agtaccagtg gagccttctt caattgtaga aaggtcatcg tcagtgtccc aacccctctt 900

tattctagta tccagttcac cccacctctt ccagaatcta agaggttgct ttctgagtct 960

accgccttgg gttactactc taaaatggtt ttcgtcttct ctaagccttg gtggagggac 1020

gccggattgt ctggaatttt cgacagtgac caaggaccag tctctttttc tagggatacc 1080

tctatcccag ccgacgatca gtggtctatc tcttgctttc ttgtcggtgg aactggtagg 1140

gagtggagta agtttcctaa ggccactaga caagaaaagg tctggaacca gtttagaaga 1200

gtcttcgcct ctatggttga tgtcgtccca gaaccaatca acgtcatcga gatggagtgg 1260

gctaagcaac cacacttctt gggagcccca tctccagtta tgaagcccgg agtcctttct 1320

agtgtcggta gtgccaccct tagggagaga ttcttgaacg tccacttcgt cggaaccgag 1380

acctctgtcg tctggaaggg atatatggac ggtgccgtta ggtctggtca aaggggagct 1440

gacgaagtca ttgccggttt gaaggaggct agtgctagga gtggtcaa 1488

Claims

1.胺氧化酶NDAO在不以治疗为目的的降解伏马毒素B1方面中的应用，所述胺氧化酶NDAO的氨基酸序列为SEQ ID NO.1。