CN111019928B

CN111019928B - D-阿洛酮糖3-差向异构酶的编码基因、载体、重组细胞以及它们的应用

Info

Publication number: CN111019928B
Application number: CN201911265952.5A
Authority: CN
Inventors: 李义; 沈雪梅; 张媛; 王靖; 陈宇豪; 陈博; 佟毅; 王小艳; 安泰; 丁子元; 范春艳
Original assignee: Cofco Nutrition and Health Research Institute Co Ltd; Cofco Jilin Bio Chemical Technology Co Ltd
Current assignee: Cofco Nutrition and Health Research Institute Co Ltd; Cofco Jilin Bio Chemical Technology Co Ltd
Priority date: 2019-12-11
Filing date: 2019-12-11
Publication date: 2022-08-16
Anticipated expiration: 2039-12-11
Also published as: CN111019928A

Abstract

本发明涉及基因工程领域，公开了D‑阿洛酮糖3‑差向异构酶的编码基因、载体、重组细胞以及它们的应用。该编码基因为SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列，或者由如SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列和连接在其上的编码标签序列的核苷酸序列组成。D‑阿洛酮糖3‑差向异构酶的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。本发明提供了一种新型的D‑阿洛酮糖3‑差向异构酶，其半衰期长，具有较高的热稳定性，并且具有较高的转化率。此外，本发明提供的编码D‑阿洛酮糖3‑差向异构酶的基因为经过优化的编码序列，可高效表达D‑阿洛酮糖3‑差向异构酶，得到的D‑阿洛酮糖3‑差向异构酶重组细胞具有极高的生物安全性，可直接用于工业化生产。

Description

D-阿洛酮糖3-差向异构酶的编码基因、载体、重组细胞以及它们的应用

技术领域

本发明涉及基因工程领域，具体地，涉及一种D-阿洛酮糖3-差向异构酶的编码基因，含有所述编码基因的重组载体，含有所述重组载体的宿主细胞，所述编码基因、或者所述重组载体、或者所述重组细胞在生产D-阿洛酮糖3-差向异构酶中的应用，一种生产D-阿洛酮糖3-差向异构酶的方法，如SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列在作为D-阿洛酮糖3-差向异构酶中的应用，以及所述编码基因、或者所述重组载体、或者所述重组细胞、或者如SEQID NO：1所示的氨基酸序列在生产D-阿洛酮糖中的应用。

背景技术

随着城市化进程加快、环境污染日益严重、人们生活方式的改变及人口老龄化，肥胖、糖尿病等慢性代谢性疾病的发病率在我国和全球范围急剧上升。而过多食用糖类造成能量过剩是引起肥胖和糖尿病的一个重要原因。如何保持人们习以为常的甜味程度，同时能降低糖在肠道的吸收，减少能量摄入是目前营养和医学界研究的热点之一，同时也是食品行业亟需解决的重要问题。

D-阿洛酮糖(D-psicose，DPE)是D-果糖(D-fructose)C-3的差向异构体，其甜度相当于蔗糖的70％，热量相当于蔗糖0.3％(Matsuo,Suzuki et al.2002)，是一种具有特殊保健功能的新型功能性单糖。D-阿洛酮糖具有与蔗糖相近的口感及容积特性，并与蔗糖一样可与食物中的氨基酸或蛋白质发生美拉德反应(Baek,Kwon et al.2008)，可作为食品中蔗糖理想的替代品。动物实验显示，D-阿洛酮糖具有控制2型糖尿病患者血糖的功效，同时对肥胖等相关疾病也一定的预防作用(Hossain,Yamaguchi et al.2015)。动物与人体实验证明，D-阿洛酮糖没有任何不良副作用。2011年8月，美国食品与药物管理局(FDA)确定D-阿洛酮糖为公认安全使用物质(GRAS)，并可作为食品或食品添加剂的组成成分。D-阿洛酮糖在膳食、保健、医药等领域拥有广阔的应用前景。

D-阿洛酮糖极其少量地存在于自然界中，如存在于甘蔗、甜菜糖蜜、小麦和鼠刺属植物，而化学法合成D-阿洛酮糖面临产物纯化步骤复杂、化学污染严重和副产物杂多等问题，目前尚未取得突破性进展。生物转化方法最早由日本香川大学Izumori团队发现(Izumori,Yamakita et al.1990)，其具有反应单一、纯化步骤简单等优点，逐渐成为生产D-阿洛酮糖的主要方法。D-阿洛酮糖3-差向异构酶作为D-阿洛酮糖生物转化的重要催化剂，可催化D-果糖与D-阿洛酮糖之间的相互转化。

近年来，发现越来越多的细菌具有D-阿洛酮糖3-差向异构酶活性。解纤维梭菌和根癌农杆菌的dpe基因的重组大肠杆菌具有较高的D-果糖和D-阿洛酮糖转化率，约33％，但后者在最适反应条件下(50℃)半衰期仅为63.5min，也即，在最适反应条件下热稳定性低的问题，从而导致不利于工业化大规模生产D-阿洛酮糖的成本控制。

因此，需要开发高温稳定性优良，同时保持较高转化率的D-阿洛酮糖3-差向异构酶，以满足工业化生产的需求。

发明内容

为了克服现有技术存在的如上不足，首先，本发明的第一个目的在于提供一种D-阿洛酮糖3-差向异构酶(CatDPE)的编码基因，该编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，或者该编码基因由如SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列和连接在其上的编码标签序列的核苷酸序列组成。

本发明的第二个目的在于提供一种重组载体，所述重组载体含有如上所述的编码基因。

本发明的第三个目的在于提供一种宿主细胞，所述宿主细胞含有如上所述的重组载体。

本发明的第四个目的在于提供如上所述的编码基因、或者如上所述的重组载体、或者如上所述的重组细胞在生产D-阿洛酮糖3-差向异构酶中的应用。

本发明的第五个目的在于提供一种生产D-阿洛酮糖3-差向异构酶的方法。

本发明的第六个目的在于提供如SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列在作为D-阿洛酮糖3-差向异构酶中的应用。

本发明的第七个目的在于提供如上所述的编码基因、或者如上所述的重组载体、或者如上所述的重组细胞、或者如SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列在生产D-阿洛酮糖中的应用。

本发明取得了如下的有益技术效果：

1、本发明提供了一种新型的D-阿洛酮糖3-差向异构酶(CatDPE)，其氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示，如SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列在作为D-阿洛酮糖3-差向异构酶时，半衰期长，具有较高的热稳定性，并且具有较高的转化率。

2、本发明提供的编码D-阿洛酮糖3-差向异构酶的基因为经过优化的编码序列，可高效表达D-阿洛酮糖3-差向异构酶，并且得到的D-阿洛酮糖3-差向异构酶重组细胞具有极高的生物安全性，可直接用于工业化生产。

本发明的其它特征和优点将在随后的具体实施方式部分予以详细说明。

附图说明

附图是用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与下面的具体实施方式一起用于解释本发明，但并不构成对本发明的限制。在附图中：

图1为实施例1纯化后的CatDPE的电泳图。

图2为CatDPE反应体系反应后的高效液相色谱图。

图3为金属离子对CatDPE活性的影响。

图4为pH对CatDPE活性的影响。

图5为温度对CatDPE活性的影响。

图6为CatDPE的热稳定性。

具体实施方式

以下对本发明的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明。

在本文中所披露的范围的端点和任何值都不限于该精确的范围或值，这些范围或值应当理解为包含接近这些范围或值的值。对于数值范围来说，各个范围的端点值之间、各个范围的端点值和单独的点值之间，以及单独的点值之间可以彼此组合而得到一个或多个新的数值范围，这些数值范围应被视为在本文中具体公开。

第一方面，本发明提供了一种D-阿洛酮糖3-差向异构酶的编码基因，该编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，或者该编码基因由如SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列和连接在其上的编码标签序列的核苷酸序列组成。

SEQ ID NO：1：

ATGCAGTATGGCATTTATTACGCATATTGGGAACATGAATGGAATGGCGATTATCATTATTATATCGATAAGGTTGCGAAGCTGGGATATGATATTCTGGAAATTGCGGCAGGCCCGCTTCCGGAATATTCAGCAGCAGAACTGAAAGCGCTTAAAGAACATGCGAAAGAAAAAAATATCAAGCTGACAGTTGGATATGGACCGCTTAGAGAAAATAATATTGCAAGCAGCGATCCGCAAGTGAGAAAACATGCAATTGGATTTTATACAGAGCTTTTTAAGCGCATGGAACAAATTGGAGCGACACTGATTGGAGGAGCGCTGTATTCATGTTGGCCGATTGATTATTCAGGAAGCGTTGATAAAAAGGGCGATTGGGAAAGAGGCATTGAAGGCGTGGCGAAACTTGGAAGAATTGCGTCAGAATGCGGCATTGAAGTGCTTGGCCTTGAATGTCTGAATAGATTTGAAAATCACGTGCTGAATACAGCAAAAGAAGGAGTGGAATTTGTTAAATCAGTGAGACAACTTGAACCGAAAGCAAGCAATGTGAGCGTTATGCTGGATACATTTCACATGAATATTGAAGAAGAGTCAATCGGAGCAGCAATTAGAATGGCGGGAGAACTGCTGGGCCATTTTCATACAGGCGAATGCAATAGAATGGTTCCGGGCAAAGGCAGAATGCCGTGGAGAGAAATTGGAGAAGCACTTAGAGAAATTCATTATGATAAGGCGGTTGTGATGGAACCGTTTGTTATGCAGGGCGGAACAGTGGGACAAAATATTAAAGTGTGGAGAGATATTGTGCCGGATGCAAGCGAAGAAGCACTGGATAGAGATGCAAAAGAAGCGCTTGCATTTGAAAGATATATGCTGGGCCATCATCATCATCACCATTAA

本发明提供的所述编码基因序列是经过密码子优化后的，可在宿主细胞中进行高效表达，且由此得到的D-阿洛酮糖3-差向异构酶具有极高的生物安全性，可直接用于工业化生产。

根据本发明，为了方便纯化，本发明采用本领域常见的标签对SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列进行添加修饰，所述修饰可以发生在SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列的3’端，也可以发生在SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列的5’端。根据本发明一种优选的实施方式，在SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列的3’端连接编码标签序列的核苷酸序列。

所述标签可以为本领域常规使用的各种有利于编码蛋白纯化的标签，如表1所示的Poly-Arg、Poly-His、FLAG、Strep-tagⅡ和c-myc中的至少一种，优选为六聚组氨酸标签(Poly-His)。所述标签不会影响表达蛋白的活性，在实际应用过程中，可以根据需求选择是否添加标签。

表1

其中，所述标签序列的编码核苷酸序列可以为本领域常规使用的核苷酸序列，本发明对此并没有特别的限制。

本发明提供的核苷酸序列通常可以用聚合酶链式反应(PCR)扩增法、重组法、或人工合成的方法获得。例如，本领域技术人员根据本发明所提供的核苷酸序列，可以很容易得到模板和引物，利用PCR进行扩增获得有关序列。

一旦获得了有关核苷酸序列，就可以用重组法大批量的获得有关氨基酸序列。通常将所得核苷酸序列克隆入载体，再转入宿主细胞中，然后通过常规的方法从增殖后的宿主细胞分离得到有关核苷酸序列。

第二方面，本发明提供了一种重组载体，所述重组载体含有如上所述的编码基因。

根据本发明，重组载体中使用的“载体”可选用本领域已知的各种载体，如市售的各种质粒、粘粒、噬菌体及反转录病毒等，本发明优选适用于大肠杆菌的pET系列质粒，例如，pET-30a(+)载体(通用生物系统(安徽)有限公司)，以及适用于枯草芽孢杆菌的pHThis载体(CN104263711A)。重组载体构建可采用能够在载体多克隆位点具有切割位点的各种核酸内切酶进行酶切获得线性质粒，与采用相同核酸内切酶切割的基因片段连接，获得重组质粒。

第三方面，本发明提供了一种宿主细胞，所述宿主细胞含有如上所述的重组载体。

可以通过本领域常规的方法将所述重组载体转化、转导或者转染到宿主细胞(菌株)中，如氯化钙法化学转化、高压电击转化。所述宿主细胞可以为原核细胞或真核细胞，优选为大肠杆菌(Escherichia coli)或枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)，更优选地，所述宿主细胞为大肠杆菌Transetta(DE3)细胞或枯草芽孢杆菌1012细胞。

第四方面，本发明提供了如上所述的编码基因、或者如上所述的重组载体、或者如上所述的重组细胞在生产D-阿洛酮糖3-差向异构酶中的应用。

第五方面，本发明提供了一种生产D-阿洛酮糖3-差向异构酶的方法，该方法包括以下步骤：

(1)培养如上所述的宿主细胞，诱导所述D-阿洛酮糖3-差向异构酶的编码基因进行表达；

(2)分离提纯所表达的D-阿洛酮糖3-差向异构酶。

根据本发明一种具体的实施方式，将所述目的基因片段克隆至表达载体中，构建重组载体；然后将重组载体转化至宿主细胞中，培养所述宿主细胞，诱导编码所述D-阿洛酮糖3-差向异构酶的基因的表达；最后分离提纯所表达的所述D-阿洛酮糖3-差向异构酶。

其中，重组载体的构建以及重组载体转化宿主细胞的方法已经在如上进行了详细的介绍，此处不再重复赘述。

其中，所述培养条件可以为常规的培养条件，例如，当所述宿主细胞为大肠杆菌时，所述培养条件可以为：使用LB液体培养基，在35-37℃、150-250rpm下培养至OD₆₀₀为0.6-0.8，之后加入异丙基-β-d-硫代半乳糖苷(IPTG)至终浓度为0.4-0.6mmol/L，并在14-20℃的条件下进行诱导表达。

当所述宿主细胞为枯草芽孢杆菌时，所述培养条件可以为：使用YT液体培养基，在35-37℃、150-250rpm下培养至对数期，之后加入异丙基-β-d-硫代半乳糖苷(IPTG)至终浓度为0.8-1.2mmol/L，并在35-37℃、150-250rpm的条件下进行诱导表达。

由于本发明提供的宿主细胞中含有编码重组蛋白的基因，其可以高效地表达所述重组蛋白。培养后经过分离提纯，即可得到高纯度的D-阿洛酮糖3-差向异构酶。可以采用本领域技术人员公知的方法进行分离提纯，例如，用缓冲液悬浮并超声破碎细胞，再经过纯化即可得到含有所述D-阿洛酮糖3-差向异构酶。

第六方面，本发明提供了如SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列在作为D-阿洛酮糖3-差向异构酶中的应用。

SEQ ID NO：2：

MQYGIYYAYWEHEWNGDYHYYIDKVAKLGYDILEIAAGPLPEYSAAELKALKEHAKEKNIKLTVGYGPLRENNIASSDPQVRKHAIGFYTELFKRMEQIGATLIGGALYSCWPIDYSGSVDKKGDWERGIEGVAKLGRIASECGIEVLGLECLNRFENHVLNTAKEGVEFVKSVRQLEPKASNVSVMLDTFHMNIEEESIGAAIRMAGELLGHFHTGECNRMVPGKGRMPWREIGEALREIHYDKAVVMEPFVMQGGTVGQNIKVWRDIVPDASEEALDRDAKEALAFERYMLG

该新型D-阿洛酮糖3-差向异构酶来来自于卡氏菌属的模式种疾卡氏菌(Catonella morbi)，基因注释为糖磷酸异构酶，实验验证显示，可将D-果糖转化为D-阿洛酮糖。在作为D-阿洛酮糖3-差向异构酶时，表现出较高的转化效率和热稳定性以及半衰期。

第七方面，本发明提供了如上所述的编码基因、或者如上所述的重组载体、或者如上所述的重组细胞、或者如SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列在生产D-阿洛酮糖中的应用。

根据本发明，用于生产D-阿洛酮糖的底物为果糖。

本发明的发明人在研究中发现，并非常规的金属离子均可提高所述D-阿洛酮糖3-差向异构酶的活性，一些金属离子不但不能提高其活性，相反还会抑制其活性，例如，铜、锌和钙等离子，而根据本发明一种优选的实施方式，所述金属离子为钴、锰、铁和镁中的至少一种。

优选的，所述D-阿洛酮糖3-差向异构酶的作用条件包括：pH为6-9，例如，6、6.5、7、7.5、8、8.5、9，温度为45-65℃，例如，45℃、50℃、55℃、60℃、65℃，在该温度范围内，相对活性可达80％以上。

以下将通过实施例对本发明进行详细描述。

在以下实施例中，所有基因操作均可根据Molecular Cloning(Cold SpringHarbor Laboratory Press(1989))的教导进行。

如无特别说明，全部试剂来自于Fisher Scientific。

培养基和缓冲液请参见《分子克隆实验指南》下册(第三版，科学出版社，2002年)附录2的培养基部分。

实施例1

本实施例用于说明D-阿洛酮糖-3-差向异构酶(CatDPE)的表达

(1)重组质粒的构建

由通用生物系统(安徽)有限公司合成SEQ ID NO.1所示的编码序列，并在其5’端添加BamH I酶切位点，同时在终止密码子前添加组氨酸标签，在3’端添加Pst I和Not I酶切位点。通过BamH I和Not I(New England Biolabs，NEB)双酶切并用T4 DNA连接酶(Takara)连接，将该序列连接至pET-30a(+)载体(通用生物系统(安徽)有限公司)。将连接产物分别转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞(北京全式金生物技术有限公司)中，在带有50μg/mL卡那霉素的LB固体平板上培养筛选阳性克隆，对于单菌落进行菌落PCR验证，并对菌落PCR显示阳性的克隆进行测序验证，对验证表明序列正确的阳性克隆进行扩大培养。

利用商业化试剂盒对扩大培养的细胞进行质粒提取，得到重组质粒DPE-pET-30a(+)。

(2)表达菌株的构建

将重组质粒DPE-pET-30a(+)转化至表达载体大肠杆菌Transetta(DE3)感受态细胞(北京全式金生物技术有限公司)，在带有50μg/mL卡那霉素的LB平板上挑取克隆并进行菌落PCR验证，得到CatDPE表达菌株。

(3)目标蛋白的表达

将该CatDPE表达菌株接种于5mL含卡那霉素的LB液体培养基，37℃，200rpm过夜培养。再以1v/v％的接种量接入500mL的LB液体培养基中，37℃，200rpm继续培养至OD600＝0.6-0.8时(约2-3小时)，加入终浓度为0.5mmol/L的IPTG。随后置于16℃、150rpm条件下过夜培养。

(4)目标蛋白的纯化

离心收集菌体，用Tris-HCl缓冲液(pH 8.0)洗涤三次，而后用40mL该缓冲液重悬菌体。在4℃下使用高压匀浆破碎菌体(压力为600-800mPa，破碎4-6个循环)。在4℃下10000g离心10min，收集上清液，即CatDPE粗分离蛋白产品。使用AKTA purifier 100蛋白层析仪，将流速保持1.0mL/min，用0.2M硫酸镍溶液洗柱子，使柱子结合上镍离子；用Tris-HCl缓冲液(pH 8.0)预平衡Ni柱(GE，HisTrap FF，1mL)，平衡至少2个柱体积；上样时，将流速降至0.5mL/min上样；分别用含有20mM咪唑的Tris-HCl缓冲液(pH 8.0)和50mM咪唑的Tris-HCl缓冲液(pH 8.0)洗去结合力弱的杂蛋白，然后用含有250mM咪唑的Tris-HCl缓冲液(pH8.0)冲洗柱子，洗脱下来的是结合力强的目的蛋白，即为纯化的CatDPE，表达量为2mg/L，4℃保存。电泳图如图1所示。

实施例2

本实施例用于说明D-阿洛酮糖-3-差向异构酶(CatDPE)在枯草芽孢杆菌体内的表达

(1)重组质粒的构建

由通用生物系统(安徽)有限公司合成SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列，并在其5’端添加BamH I酶切位点，同时在3’端添加Pst I酶切位点。通过BamH I和Pst I(NewEngland Biolabs，NEB)对所合成的片段进行双酶切，并用T4 DNA连接酶(Takara)将双酶切后的片段分别连接至同样通过BamH I和Pst I进行双酶切的pHThis载体(CN104263711A)。将连接产物转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞(北京全式金生物技术有限公司)中，在带有50μg/mL氨苄青霉素抗性的LB固体平板上进行培养并筛选阳性克隆。挑取单菌落进行菌落PCR验证，并对菌落PCR显示阳性的克隆进行测序验证，对验证表明序列正确的阳性克隆进行扩大培养。

利用商业化试剂盒对扩大培养的细胞进行质粒提取，得到重组质粒DPE-pHThis。

(2)表达菌株的构建

在HS固体培养基上(如表1所示)活化枯草芽孢杆菌1012(MoBiTec公司，Germany)，接至3mL HS液体培养基，37℃、250rpm培养过夜；将过夜培养菌液按1:100接至新鲜配制的HS培养基中，使初始OD₆₀₀约为0.05，37℃、250rpm培养5-5.5小时；取250μL菌液(1:20)接至5mL新鲜配制的LS培养基中，培养2h；培养结束，取1mL菌液至1.5mL无菌EP管中，加入10μL0.1M EGTA，室温温浴5min；加入适量如上得到的重组质粒DPE-pHThis，37℃、180rpm培养2h；菌液13,400g离心30秒，去掉800μL，轻轻重悬，将剩余200μL全部涂布氯霉素抗性的LB固体平板，37℃培养箱培养过夜。挑取单菌落进行菌落PCR验证，将菌落PCR显示阳性的克隆作为D-阿洛酮糖3-差向异构酶表达菌株。

表1

(3)目标蛋白的表达

将该DPE表达菌株接种于5mL 2*YT液体培养基中，37℃、220rpm培养过夜；按1％比例转接摇瓶(含30mL 2*YT液体培养基)，37℃、220rpm培养2小时左右至对数中期，加IPTG至终浓度1mM，37℃、180rpm继续培养16小时。

(4)目标蛋白的纯化

诱导培养完成后收集菌液，4℃、5000g条件下离心10min，分别收集上清和菌体沉淀；沉淀使用Tris-HCl缓冲液(pH 7.5)悬浮，然后采用4℃、5000g离心10min，重复两次；菌体采用4mL Tris-HCl缓冲液重悬后，加入溶菌酶至1mg/mL，37℃条件下放置5min；使用超声波细胞破碎仪进行细胞破碎，条件为功率20％，超声10min，超声3s，间隔2s；收集处理后细胞破碎液进行功能验证。

测试例1

本测试例用于测定重组CatDPE的酶活

1、标准反应体系如下(1mL)：200μL实施例1制备的纯化酶CatDPE(终浓度为0.02mg/mL)；100μL D-果糖溶液(终浓度为50mg/mL)；10μL Co²⁺(终浓度为0.1mM CoCl₂)；690μL Tris-HCl缓冲液(pH 8.0)。反应条件为：55℃水浴中反应20min，而后沸水浴中处理5min以灭活酶的活性。

2.反应体系用0.22μm的微孔滤膜过滤，滤液用于高效液相分析。高效液相色谱条件如下：安捷伦1260HPLC和G1362ARID检测器；分析柱：Waters Sugar-Pak I,6.5×300mmcolumn；流动相：水；流速：0.4mL/min；柱温：80℃；检测器：RID，检测器温度55℃；上样量为20μL。

3.以Sigma公司的D-果糖和D-阿洛酮糖纯品为标准品，配置为10mg/mL溶液并通过高效液相色谱检测分析。其中，果糖的出峰时间为14.5min，阿洛酮糖的出峰时间为20.9min。

图2示出CatDPE与D-果糖反应后的高效液相色谱图。可以看出，本发明的重组CatDPE可以催化D-果糖和D-阿洛酮糖之间的差向异构反应。

测试例2

本测试例用于说明重组CatDPE的酶学性质

1.金属离子依赖性测定：反应体系按照底物果糖终浓度为50mg/mL，金属离子(分别为钴、铜、锌、铁、锰、钙、镁)终浓度为1mM，酶终浓度0.02mg/mL配置，其余按照测试例1中的反应条件进行。如图3所示，CatDPE的活性主要依赖于Co²⁺，其次是Mn²⁺。

2.pH对酶活性的影响：以50mg/mL果糖为底物，Co²⁺终浓度为0.1mM，分别使用如下缓冲液：pH6-7(pH6、pH6.5、pH7)的50mM磷酸二氢钠-氢氧化钠缓冲液；pH7.5-9(pH7、pH7.5、pH8、pH8.5、pH9)的50mM Tris-HCl缓冲液；其余按照测试例1中的反应条件进行。以pH 6.5下酶活为100％，计算各pH下酶的相对活性，如图4所示。结果显示，CatDPE的pH范围比较宽泛，在pH6.0-9.0的范围内，活性都比较高；最适pH为6.5。

3.温度对酶活性的影响：按照测试例1中的标准反应配置反应体系，分别于35、40、45、50、55、60、65、70℃条件下反应时间20min；随后沸水中处理5min灭活，以55℃下酶活为100％，计算各温度下酶的相对活性。结果显示(图5)，CatDPE在温度为60-70℃的条件下活性最高。

4.热稳定性

测定酶在55℃孵育0-6h后的活性。按照测试例1中的标准反应配置反应体系，在添加1mM Co离子的条件下，分别在酶在55℃下孵育0、0.5h、1h、2h、3h、4h、5h、6h后取样，在55℃条件下反应20min；随后沸水中处理5min灭活，以孵育0h的酶活为100％，计算各孵育时间下酶的相对活性。结果显示(图6)，CatDPE在Co离子存在的条件下，在55℃下具有较好的热稳定性，半衰期约为5.5h。

测试例3

本测试例用于说明1L反应体系下CatDPE生成D-阿洛酮糖反应验证

按照测试例1中的标准反应(pH 8.0、55℃)，1L反应体系中加入实施例2制备的CatDPE粗酶液100mL，反应20min，而后沸水浴中处理5min以灭活酶的活性。取样进行HPLC检测，转化率达33.9％。

以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。

另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。

此外，本发明的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本发明的思想，其同样应当视为本发明所公开的内容。

SEQUENCE LISTING

<110> 吉林中粮生化有限公司

中粮营养健康研究院有限公司

<120> D-阿洛酮糖3-差向异构酶的编码基因、载体、重组细胞以及它们的应用

<130> I59625COF

<160> 8

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 903

<212> DNA

<213> D-阿洛酮糖3-差向异构酶的编码基因

<400> 1

atgcagtatg gcatttatta cgcatattgg gaacatgaat ggaatggcga ttatcattat 60

tatatcgata aggttgcgaa gctgggatat gatattctgg aaattgcggc aggcccgctt 120

ccggaatatt cagcagcaga actgaaagcg cttaaagaac atgcgaaaga aaaaaatatc 180

aagctgacag ttggatatgg accgcttaga gaaaataata ttgcaagcag cgatccgcaa 240

gtgagaaaac atgcaattgg attttataca gagcttttta agcgcatgga acaaattgga 300

gcgacactga ttggaggagc gctgtattca tgttggccga ttgattattc aggaagcgtt 360

gataaaaagg gcgattggga aagaggcatt gaaggcgtgg cgaaacttgg aagaattgcg 420

tcagaatgcg gcattgaagt gcttggcctt gaatgtctga atagatttga aaatcacgtg 480

ctgaatacag caaaagaagg agtggaattt gttaaatcag tgagacaact tgaaccgaaa 540

gcaagcaatg tgagcgttat gctggataca tttcacatga atattgaaga agagtcaatc 600

ggagcagcaa ttagaatggc gggagaactg ctgggccatt ttcatacagg cgaatgcaat 660

agaatggttc cgggcaaagg cagaatgccg tggagagaaa ttggagaagc acttagagaa 720

attcattatg ataaggcggt tgtgatggaa ccgtttgtta tgcagggcgg aacagtggga 780

caaaatatta aagtgtggag agatattgtg ccggatgcaa gcgaagaagc actggataga 840

gatgcaaaag aagcgcttgc atttgaaaga tatatgctgg gccatcatca tcatcaccat 900

taa 903

<210> 2

<211> 294

<212> PRT

<213> D-阿洛酮糖3-差向异构酶

<400> 2

Met Gln Tyr Gly Ile Tyr Tyr Ala Tyr Trp Glu His Glu Trp Asn Gly

1 5 10 15

Asp Tyr His Tyr Tyr Ile Asp Lys Val Ala Lys Leu Gly Tyr Asp Ile

20 25 30

Leu Glu Ile Ala Ala Gly Pro Leu Pro Glu Tyr Ser Ala Ala Glu Leu

35 40 45

Lys Ala Leu Lys Glu His Ala Lys Glu Lys Asn Ile Lys Leu Thr Val

50 55 60

Gly Tyr Gly Pro Leu Arg Glu Asn Asn Ile Ala Ser Ser Asp Pro Gln

65 70 75 80

Val Arg Lys His Ala Ile Gly Phe Tyr Thr Glu Leu Phe Lys Arg Met

85 90 95

Glu Gln Ile Gly Ala Thr Leu Ile Gly Gly Ala Leu Tyr Ser Cys Trp

100 105 110

Pro Ile Asp Tyr Ser Gly Ser Val Asp Lys Lys Gly Asp Trp Glu Arg

115 120 125

Gly Ile Glu Gly Val Ala Lys Leu Gly Arg Ile Ala Ser Glu Cys Gly

130 135 140

Ile Glu Val Leu Gly Leu Glu Cys Leu Asn Arg Phe Glu Asn His Val

145 150 155 160

Leu Asn Thr Ala Lys Glu Gly Val Glu Phe Val Lys Ser Val Arg Gln

165 170 175

Leu Glu Pro Lys Ala Ser Asn Val Ser Val Met Leu Asp Thr Phe His

180 185 190

Met Asn Ile Glu Glu Glu Ser Ile Gly Ala Ala Ile Arg Met Ala Gly

195 200 205

Glu Leu Leu Gly His Phe His Thr Gly Glu Cys Asn Arg Met Val Pro

210 215 220

Gly Lys Gly Arg Met Pro Trp Arg Glu Ile Gly Glu Ala Leu Arg Glu

225 230 235 240

Ile His Tyr Asp Lys Ala Val Val Met Glu Pro Phe Val Met Gln Gly

245 250 255

Gly Thr Val Gly Gln Asn Ile Lys Val Trp Arg Asp Ile Val Pro Asp

260 265 270

Ala Ser Glu Glu Ala Leu Asp Arg Asp Ala Lys Glu Ala Leu Ala Phe

275 280 285

Glu Arg Tyr Met Leu Gly

290

<210> 3

<211> 5

<212> PRT

<213> Poly-Arg

<400> 3

Arg Arg Arg Arg Arg

1 5

<210> 4

<211> 6

<212> PRT

<213> Poly-His

<400> 4

His His His His His His

1 5

<210> 5

<211> 8

<212> PRT

<213> FLAG

<400> 5

Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys

1 5

<210> 6

<211> 8

<212> PRT

<213> Strep-tagⅡ

<400> 6

Trp Ser His Pro Gln Phe Glu Lys

1 5

<210> 7

<211> 10

<212> PRT

<213> c-myc

<400> 7

Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu

1 5 10

<210> 8

<211> 243

<212> PRT

<213> GST

<400> 8

Met Ser Pro Ile Leu Gly Tyr Trp Lys Ile Lys Gly Leu Val Gln Pro

1 5 10 15

Thr Arg Leu Leu Leu Glu Tyr Leu Glu Glu Lys Tyr Glu Glu His Leu

20 25 30

Tyr Glu Arg Asp Glu Gly Asp Lys Trp Arg Asn Lys Lys Phe Glu Leu

35 40 45

Gly Leu Glu Phe Pro Asn Leu Pro Tyr Tyr Ile Asp Gly Asp Val Lys

50 55 60

Leu Thr Gln Ser Met Ala Ile Ile Arg Tyr Ile Ala Asp Lys His Asn

65 70 75 80

Met Leu Gly Gly Cys Pro Lys Glu Arg Ala Glu Ile Ser Met Leu Glu

85 90 95

Gly Ala Val Leu Asp Ile Arg Tyr Gly Val Ser Arg Ile Ala Tyr Ser

100 105 110

Lys Asp Phe Glu Thr Leu Lys Val Asp Phe Leu Ser Lys Leu Pro Glu

115 120 125

Met Leu Lys Met Phe Glu Asp Arg Leu Cys His Lys Thr Tyr Leu Asn

130 135 140

Gly Asp His Val Thr His Pro Asp Phe Met Leu Tyr Asp Ala Leu Asp

145 150 155 160

Val Val Leu Tyr Met Asp Pro Met Cys Leu Asp Ala Phe Pro Lys Leu

165 170 175

Val Cys Phe Lys Lys Arg Ile Glu Ala Ile Pro Gln Ile Asp Lys Tyr

180 185 190

Leu Lys Ser Ser Lys Tyr Ile Ala Trp Pro Leu Gln Gly Trp Gln Ala

195 200 205

Thr Phe Gly Gly Gly Asp His Pro Pro Lys Ser Asp Leu Glu Val Leu

210 215 220

Phe Gln Gly Pro Leu Gly Ser Pro Gly Ile Pro Gly Ser Thr Arg Ala

225 230 235 240

Ala Ala Ser

Claims

1.一种宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞含有重组载体，所述重组载体含有编码D-阿洛酮糖-3-差向异构酶的基因，该编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；

所述宿主细胞为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis) 1012细胞。

2.一种生产D-阿洛酮糖3-差向异构酶的方法，该方法包括以下步骤：

(1)培养权利要求1所述的宿主细胞，诱导所述D-阿洛酮糖3-差向异构酶的编码基因进行表达；

(2)分离提纯所表达的D-阿洛酮糖- 3-差向异构酶。

3.权利要求1所述的宿主细胞在生产D-阿洛酮糖中的应用。

4.根据权利要求3所述的应用，其中，D-阿洛酮糖的生产在金属离子的存在下进行。

5.根据权利要求4所述的应用，其中，所述金属离子为钴、锰、铁和镁中的至少一种。

6.根据权利要求5所述的应用，其中，所述D-阿洛酮糖的生产条件包括：pH为6-9，温度为45-65℃。