CN109306347A - 一种新型d-阿洛酮糖3-差向异构酶及其应用 - Google Patents

一种新型d-阿洛酮糖3-差向异构酶及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于基因工程技术领域，具体而言，涉及一种新型D‑阿洛酮糖3‑差向异构酶、编码其的DNA、含有该DNA的表达载体和转化子以及该酶在生产D‑阿洛酮糖中的应用。所述D‑阿洛酮糖3‑差向异构酶来源于深海温泉的嗜热嗜酸菌Mesoaciditoga lauensis，其在将D‑果糖转化为D‑阿洛酮糖时表现出较高的转化率和热稳定性。

Description

一种新型D-阿洛酮糖3-差向异构酶及其应用
技术领域
本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种来源于Mesoaciditoga lauensis的D-阿洛酮糖3-差向异构酶及其应用。
背景技术
随着城市化进程加快、环境污染日益严重、人们生活方式的改变及人口老龄化，肥胖、糖尿病等慢性代谢性疾病的发病率在我国和全球范围急剧上升。而过多食用糖类造成能量过剩是引起肥胖和糖尿病的一个重要原因。如何保持人们习以为常的甜味程度，同时能降低糖在肠道的吸收，减少能量摄入是目前营养和医学界研究的热点之一，同时也是食品行业亟需解决的重要问题。
D-阿洛酮糖(D-psicose)是D-果糖(D-fructose)C-3的差向异构体,其甜度相当于蔗糖的70％，热量相当于蔗糖0.3％(Matsuo,Suzuki et al.2002)，是一种具有特殊保健功能的新型功能性单糖。D-阿洛酮糖具有与蔗糖相近的口感及容积特性，并与蔗糖一样可与食物中的氨基酸或蛋白质发生美拉德反应(Baek,Kwon et al.2008)，可作为食品中蔗糖理想的替代品。动物实验显示，D-阿洛酮糖具有控制2型糖尿病患者血糖的功效，同时对肥胖等相关疾病也一定的预防作用(Hossain,Yamaguchi et al.2015)。动物与人体实验证明，D-阿洛酮糖没有任何不良副作用。2011年8月，美国食品与药物管理局(FDA)确定D-阿洛酮糖为公认安全使用物质(GRAS)，并可作为食品或食品添加剂的组成成分。D-阿洛酮糖在膳食、保健、医药等领域拥有广阔的应用前景。
D-阿洛酮糖极其少量地存在于自然界中，如存在于甘蔗、甜菜糖蜜、小麦和鼠刺属植物，而化学法合成D-阿洛酮糖面临产物纯化步骤复杂、化学污染严重和副产物杂多等问题，目前尚未取得突破性进展。生物转化方法最早由日本香川大学Izumori团队发现(Izumori,Yamakita et al.1990)，其具有反应单一、纯化步骤简单等优点，逐渐成为生产D-阿洛酮糖的主要方法。酮糖3-差向异构酶作为D-阿洛酮糖生物转化的重要催化剂，可催化D-果糖与D-阿洛酮糖之间的相互转化。近年来，发现越来越多的细菌具有酮糖3-差向异构酶活性，例如根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)(Kim，2006)、解纤维梭菌(Clostridium cellulolyticum)H10(Mu，2011)和Treponema primitia ZAS-1(Zhang，2016)等。其中，含有解纤维梭菌和根癌农杆菌的dpe基因的重组大肠杆菌具有较高的D-果糖和D-阿洛酮糖转化率，约33％，但后者在最适反应条件下(50℃)半衰期仅为63.5min。
此外，目前的差向异构酶存在在最适反应条件下热稳定性低的问题，不利于工业化大规模生产D-阿洛酮糖的成本控制。因此，需要开发高温稳定性优良酮糖3-差相异构酶，以满足工业化生产的需求。
发明内容
在第一方面，本发明提供了一种新型D-阿洛酮糖3-差向异构酶，该D-阿洛酮糖3-差向异构酶具有如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列。
SEQ ID NO：1
MNFGVYLYLWEDRILEEEKALKIFKTIAELGYDGIEIPLNNPNLIDPFLARKLAKEFELNITTSVALPQNINFMSDDESERDKAKEFLTNCVDLCNTMGSAVLGGVLYAPWGRTDVDKSEKKIGFLVEGLREISKYAEERGINLYLEPVNRFETNVLNTVKEGIDLIEKINSNNVSLLLDTFHMNIEEKDLSTAITEAGNLVGHFHTCENDRGIPGTGHIPWKDIVQSLKKINYDGFLVFEAFSVKKEEILNSANIWRSQELIPNPDKAAYESISFFKSIIY。
该新型D-阿洛酮糖3-差向异构酶来自于深海温泉的嗜热嗜酸菌Mesoaciditogalauensis，可将D-果糖转化为D-阿洛酮糖，表现相对高的转化率且具有较高的热稳定性。同时，其对生产条件要求较低，有利于降低生产成本，减少能耗。
在第二方面，本发明提供了编码第一方面所述的D-阿洛酮糖3-差向异构酶的DNA，其序列如SEQ ID NO.2所示。
SEQ ID NO：2
ATGAATTTTGGTGTCTATTTGTACTTGTGGGAAGATAGAATTTTGGAAGAAGAAAAGGCTTTGAAAATTTTTAAGACTATTGCTGAATTAGGTTATGATGGTATTGAAATTCCTTTAAATAATCCTAATTTGATTGATCCATTCTTGGCTAGAAAGTTGGCTAAAGAATTTGAATTGAATATTACTACTTCTGTTGCTTTACCTCAAAATATTAATTTTATGTCTGATGATGAATCTGAGAGAGACAAGGCTAAGGAATTTTTGACTAATTGTGTTGATTTGTGTAACACAATGGGTTCTGCTGTTTTGGGTGGTGTCTTGTACGCTCCATGGGGTAGAACTGACGTTGACAAGTCAGAGAAGAAAATTGGTTTTTTGGTCGAAGGTTTAAGAGAAATTTCTAAATACGCTGAAGAAAGAGGTATTAATTTGTACTTGGAACCAGTTAATAGATTTGAAACTAATGTTTTAAACACTGTTAAAGAAGGTATTGATTTGATTGAAAAGATTAATTCTAATAATGTTTCTTTGTTATTGGATACTTTTCACATGAATATTGAAGAAAAGGATTTGTCTACAGCTATTACTGAGGCTGGTAACTTGGTCGGACACTTCCACACTTGCGAAAACGACAGGGGTATTCCAGGTACTGGTCACATTCCATGGAAGGATATTGTTCAATCTTTGAAGAAAATTAATTATGATGGTTTCTTGGTTTTCGAGGCTTTTTCAGTTAAGAAAGAAGAAATTTTAAATTCTGCTAATATTTGGAGATCTCAAGAATTGATACCAAATCCAGATAAAGCTGCTTACGAATCTATTTCATTTTTTAAATCTATTATTTAT。
该序列为经过优化的编码序列，能够在大肠杆菌中高表达，有利于在大规模生产中降低成本。
在第三方面，本发明提供了包含第二方面所述的编码D-阿洛酮糖3-差向异构酶的DNA的表达载体。
在第四方面，本发明提供了导入第三方面所述的表达载体的转化子。
在第五方面，本发明提供了第四方面所述的转化子在工业发酵生产本发明的改进的D-阿洛酮糖3-差向异构酶中的用途。
在第六方面，本发明提供了第四方面所述的转化子在生产D-阿洛酮糖中的用途。
附图说明
图1为根据实施例1，工程菌株大肠杆菌Transetta(DE3)表达MesDPE的蛋白质电泳图谱。上样样品分别为破碎细胞液、透过液、20mM咪唑洗脱液、50mM咪唑洗脱液、250mM咪唑洗脱液以及蛋白质分子质量标准。箭头所示的条带为D-阿洛酮糖3-差向异构酶蛋白。
图2为根据实施例2，D-果糖标准品的高效液相色谱图。其中，D-果糖溶液浓度为10mg/mL。
图3为根据实施例2，D-阿洛酮糖标准品的高效液相色谱图。其中，D-阿洛酮糖溶液浓度为10mg/mL。
图4为根据实施例2，MesDPE反应体系反应后的高效液相色谱图。
图5为根据实施例3，金属离子对MesDPE活性的影响。
图6为根据实施例3，pH对MesDPE活性的影响。
图7为根据实施例3，温度对MesDPE活性的影响。
图8为根据实施例3，MesDPE的热稳定性。
具体实施方式
借助于下述实施例可更好地理解本发明，这些实施例仅用于举例说明本发明，不应被解释为对本发明的限制。
实施例
在以下实施例中，所有基因操作均可根据Molecular Cloning(Cold SpringHarbor Laboratory Press(1989))的教导进行。
如无特别说明，全部试剂来自于Fisher Scientific。
培养基和缓冲液请参见《分子克隆实验指南》下册(第三版，科学出版社，2002年)附录2的培养基部分。
实施例1D-阿洛酮糖3-差向异构酶(MesDPE)的表达
在数据库中对潜在的热稳定的糖异构酶进行搜索，并经再次筛选，找到一种来自于Mesoaciditoga lauensis的糖磷酸异构酶，其蛋白序列如SEQ ID NO：1所示，推测其具有酮糖3-差向异构酶活性。为在大肠杆菌中高效表达，通过实验对其编码序列进行优化并筛选，得到如SEQ ID NO.2所示的编码序列。
包含SEQ ID NO.2的大肠杆菌表达菌株的构建如下：
由苏州金唯智生物科技有限公司合成SEQ ID NO.2所示的编码序列，并在其5’端添加BamH I酶切位点，同时在终止密码子前添加组氨酸标签，在3’端添加Pst I和Not I酶切位点。通过BamH I和Not I(New England Biolabs，NEB)双酶切并用T4DNA连接酶(Takara)连接，分别将该序列连接至pET 30a(+)、pTac28和pTST载体(本实验室保存)。将连接产物分别转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞(北京全式金生物技术有限公司)中，在带有相应抗性的LB固体平板上培养筛选阳性克隆，对于单菌落进行菌落PCR验证。对于pET 30a(+)、pTac28背景的质粒，使用添加50μg/mL卡那霉素的LB平板。对于pTST载体，使用添加100μg/mL卡那霉素的LB平板。对于阳性克隆进行测序验证。
将阳性克隆转化至表达载体大肠杆菌Transetta(DE3)感受态细胞(北京全式金生物技术有限公司)，在抗性LB平板上挑取克隆并进行菌落PCR验证，得到MesDPE表达菌株。
将该MesDPE表达菌株接种于5mL含相应抗生素的LB培养基，37℃，200rpm过夜培养。以1v/v％的接种量接入500mL的LB培养基中，37℃，200rpm继续培养2-3h后，待培养物OD600＝0.6-0.8时，加入终浓度为0.5mmol/L的IPTG。随后置于16℃、150rpm条件下过夜培养。
离心收集菌体，用Tris-HCl缓冲液(pH 8.0)洗涤三次，而后用40mL该缓冲液重悬菌体。在4℃下使用高压匀浆破碎菌体(压力为600～800mPa，破碎4-6个循环)。在4℃下10000g离心10min，收集上清液，即MesDPE粗分离蛋白产品。使用AKTA purifier 100蛋白层析仪，将流速保持1.0mL/min，用0.2M硫酸镍溶液洗柱子，使柱子结合上镍离子；用Tris-HCl缓冲液(pH 8.0)预平衡Ni柱(GE，HisTrap FF，1mL)，平衡至少2个柱体积；上样时，将流速降至0.5mL/min上样；分别用含有20mM咪唑的Tris-HCl缓冲液(pH 8.0)和50mM咪唑的Tris-HCl缓冲液(pH 8.0)洗去结合力弱的杂蛋白，然后用含有250mM咪唑的Tris-HCl缓冲液(pH8.0)冲洗柱子，洗脱下来的是结合力强的目的蛋白，即为纯化的MesDPE，4℃保存。对细胞破碎液、上样液(透过)、20mM咪唑洗脱液、50mM咪唑洗脱液、250mM咪唑洗脱液进行SDS Page，结果如图1所示，箭头标出纯化的MesDPE。
实施例2重组MesDPE的酶活测定
1、标准反应体系如下(1mL)：143μL纯化酶MesDPE(终浓度为0.02mg/mL)；100μL D-果糖溶液(终浓度为50mg/mL)；10μL Co2+(终浓度为0.1mM CoCl2)；690μL Tris-HCl缓冲液(pH 8.0)。反应条件为：55℃水浴中反应20min，而后沸水浴中处理5min以灭活酶的活性。
2.反应体系用0.45μm的微孔滤膜过滤，滤液用于高效液相分析。高效液相色谱条件如下：安捷伦1260HPLC和G1362A RID检测器；分析柱：Waters Sugar-Pak I,6.5×300mmcolumn；流动相：水；流速：0.4mL/min；柱温：80℃；检测器：RID，检测器温度55℃；上样量为20μL。
3.以Sigma公司的D-果糖和D-阿洛酮糖纯品为标准品，配置为10mg/mL溶液并进行色谱分析。D-果糖的保留时间为14.885min(图2)，D-阿洛酮糖的保留时间为21.413min(图3)。
4.以相同的方法对经步骤1反应后溶液中的D-果糖和D-阿洛酮糖进行测定，并与标准样品比较。图4示出MesDPE与D-果糖反应后的高效液相色谱图。可以看出，本发明的重组MesDPE可以催化D-果糖和D-阿洛酮糖之间的差向异构反应。
实施例3重组MesDPE酶学性质的鉴定
1.金属离子依赖性测定：反应体系按照底物果糖终浓度为50mg/mL，金属离子终浓度为1mM，酶终浓度0.02mg/mL配置；按照实施例2中的反应条件进行。如图5所示，MesDPE的活性主要依赖于Co2+，其次是Mn2+。
2.pH对酶活性的影响：按照实施例2中的标准反应，以50mg/mL果糖为底物，Co2+终浓度为0.1mM，分别使用如下缓冲液：pH5-7的50mM磷酸二氢钠-氢氧化钠缓冲液；pH7.5-9.5的50mM Tris-HCl缓冲液；按照实施例2中的反应条件进行。结果显示(图6)，MesDPE在pH为6.0时，活性最高；随着pH值升高，活性降低。以pH 6.0下酶活为100％，计算各pH下酶的相对活性。
3.温度对酶活性的影响：按照实施例2中的标准反应配置反应体系，分别于40、45、50、55、60、65、70℃条件下反应时间20min；随后沸水中处理5min灭活。结果显示(图7)，MesDPE在温度为60-70℃的条件下活性最高。以65℃下酶活为100％，计算各温度下酶的相对活性。
4.热稳定性测定：将MesDPE分别于55℃和65℃条件下保温后，每隔1.5h后进行反应。按照实施例2中的标准反应配置反应体系，反应时间20min；随后沸水中处理5min灭活。结果显示(图8)，MesDPE在最适温度65℃条件下保温4.5h后仍保持100％活性，保温6h后活性仍大于80％；在较低温度条件下(55℃)，6h后仍表现较高的热稳定性，并未出现活性衰减现象。以活性最高的酶活为100％，计算各时间点酶的相对活性。
实施例4 1L反应体系下MesDPE生成D-阿洛酮糖反应验证
按照实施例2中的标准反应，在最适反应条件下(pH 6.0，温度65℃)，1L反应体系中加入MesDPE粗酶液100mL，反应20min，而后沸水浴中处理5min以灭活酶的活性。取样进行HPLC检测，转化率达14.3％。
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Claims (8)

1.一种D-阿洛酮糖3-差向异构酶，所述D-阿洛酮糖3-差向异构酶具有如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列。
2.编码权利要求1所述的D-阿洛酮糖3-差向异构酶的DNA，所述DNA的序列如SEQ IDNO.2所示。
3.如权利要求2所述的编码D-阿洛酮糖3-差向异构酶的DNA，其特征在于，所述DNA进一步在其3’端连接有编码六聚组氨酸标签的DNA序列。
4.包含权利要求2或3中任一项所述的编码D-阿洛酮糖3-差向异构酶的DNA的表达载体。
5.导入权利要求4所述的表达载体的转化子。
6.如权利要求5所述的转化子，所述转化子为大肠杆菌转化子。
7.权利要求5或6所述的转化子在发酵生产D-阿洛酮糖3-差向异构酶中的用途。
8.权利要求5或6所述的转化子在生产D-阿洛酮糖中的用途。
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