CN108531527A - 一种d-阿洛酮糖-3-差向异构酶的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种D‑阿洛酮糖‑3‑差向异构酶的应用，具体地，本发明提供了一种D‑阿洛酮糖‑3‑差向异构酶，它具有高酶活性和高热稳定性，能够高效催化产生阿洛酮糖。

Description

一种D-阿洛酮糖-3-差向异构酶的应用
技术领域
本发明涉及酶的基因工程技术领域，具体地，本发明涉及一种D-阿洛酮糖-3-差向异构酶的应用。
背景技术
D-阿洛酮糖是近年发现的一种具有特殊保健功能的新型功能性稀少糖，它的甜度相当于果糖的70％，能量只有蔗糖的0.3％，具有低能量、改善肠道菌群、降低血糖、抗龋齿等生理功能。2011年FDA认可甜味剂D-阿洛酮糖可以作为食品添加剂使用，自此D-阿洛酮糖得到了迅速发展,市场上出现了多种含D-阿洛酮糖的产品,像糖尿病患者就应选择此类低热量安全性高的甜味剂,此类甜味剂可以使患者在维持健康膳食的前提下同样享受甜蜜滋味。
在自然界中，D-阿洛酮糖的含量极少。D-阿洛酮糖的生产方法有化学法和生物法。其中，化学合成法存在工艺复杂、副产物多、分离纯化困难、食品安全性等问题。
当前有两种异构化酶可以实现将D-果糖异构化为D-阿洛酮糖：D-阿洛酮糖-3-差向异构酶(D-psicose-3-epimerase，缩写为DPE)和D-塔格糖-3-差向异构酶(D-tagatose-3-epimerase，缩写为DTE)。对于这两种异构酶，已经发现的有Rhodobacter sphaeroidesSK01来源的DTE酶，Clostridium cellulolyticum H10来源、Ruminococcus sp.来源和Clostridium scindens来源的DPEase酶。然而，这些酶有很多问题，比如，得到的阿洛酮糖的产量低，转化效率低，活性低等。
因此，本领域迫切需要开发一种具有高酶活性，高热稳定性，并且能够高效催化D-果糖和D-阿洛酮糖之间转化的D-阿洛酮糖-3-差向异构酶。
发明内容
本发明的目的在于提供一种具有高酶活性，高热稳定性，并且能够高效催化D-果糖和D-阿洛酮糖之间转化的D-阿洛酮糖-3-差向异构酶。
本发明第一方面提供了一种生产阿洛酮糖的方法，包括步骤：
(a)在D-阿洛酮糖-3-差向异构酶存在下，对底物进行酶促反应，从而形成产物阿洛酮糖，其中所述D-阿洛酮糖-3-差向异构酶为类芽孢杆菌(Paenibacillussenegalensis)的D-阿洛酮糖-3-差向异构酶，并且所述的底物包括果糖；和
(b)任选地，分离阿洛酮糖。
在另一优选例中，所述的D-阿洛酮糖-3-差向异构酶选自下组：
(i)氨基酸序列如SEQ ID NO.:1所示的多肽；
(ii)将SEQ ID NO.:1所示氨基酸序列的多肽经过一个或多个氨基酸残基(较佳地，1-50个，更佳地，1-30个，更佳地，1-10个，最佳地，1-6个)的取代、缺失或添加而形成的、或是添加信号肽序列后形成的、并具有催化产生阿洛酮糖活性的衍生多肽；
(iii)序列中含有(i)或(ii)中所述按氨基酸序列的衍生多肽；
(iv)氨基酸序列与SEQ ID NO.:1所示氨基酸序列的同源性≥70％(较佳地≥80％，更佳地≥90％)，并具有催化产生阿洛酮糖活性的衍生多肽。
在另一优选例中，所述的D-阿洛酮糖-3-差向异构酶具有选自下组的一个或多个特性：
(p1)适合的pH：5-10，较佳地，6-9，更佳地，8-9；
(p2)适合的温度：20～80℃，较佳地，50-80℃，更佳地，60-70℃；
(p3)催化活性：在pH7.0和60℃为最佳反应条件下，催化活性为100％；
(p4)在pH7.0和60－70℃下，转化反应2h，转化率为5-30％，较佳地，25-30％；
(p5)在最适pH±0.5下，在80℃下的催化活性A80与在60℃下的催化活性A60之比(A80/A60)≥50％(如50-80％)，较佳地≥60％(如60-65％)；
(p6)在最适pH±0.5下，在50℃下的催化活性A50与在60℃下的催化活性A60之比(A50/A60)≥50％(如50-80％)，较佳地≥60％(如60-65％)；
(p7)在最适pH±0.5下，在45℃下的催化活性A45与在60℃下的催化活性A60之比(A45/A60)≥50％(如50-80％)，较佳地≥60％(如60-65％)；
(p8)在T1温度下，在pH5.5下的催化活性ApH5.5与在pH7下的催化活性ApH7之比(ApH5.5/ApH7)≥60％(如60-90％)，较佳地≥65％(如65-80％)；
(p9)在T1温度下，在pH8下的催化活性ApH8与在pH7下的催化活性ApH7之比(ApH8/ApH7)≥60％(如60-90％)，较佳地≥65％(如65-80％)；
(p10)在T1温度下，在pH9.5下的催化活性ApH9.5与在pH7下的催化活性ApH7之比(ApH9.5/ApH7)≥60％(如60-90％)，较佳地≥65％(如65-80％)；
(p11)在T1温度下，在pH10下的催化活性ApH10与在pH7下的催化活性ApH7之比(ApH10/ApH7)≥60％(如60-90％)，较佳地≥65％(如65-80％)；
其中T1为40-70℃中任意温度，较佳地T1为50、60、65℃。
在另一优选例中，在步骤(a)中，在一反应体系中进行反应。
在另一优选例中，所述的反应体系含有：(A)D-阿洛酮糖-3-差向异构酶；(B)反应底物，所述反应底物包括果糖；和(C)缓冲体系。
在另一优选例中，在所述反应体系中，所述底物的浓度(w/w)为1-80％，较佳地，3-70％，更佳地，8-65％，按反应体系的总重量计算。
在另一优选例中，在所述反应体系中，所述差向异构酶的浓度(w/w)为1～20％，较佳地，2-10％，更佳地，3-7％，最佳地，5％。
在另一优选例中，所述差向异构酶与底物果糖之比为10-80U:1g，较佳地，30-70U:1g，更佳地，40-60U:1g，最佳地，50U:1g。
在另一优选例中，反应体系的pH为5.5-9.5，较佳地，6-9，更佳地，8-9。
在另一优选例中，反应体系的pH为6.0-9.5，较佳地，6-8，更佳地，6.5-7.5。
在另一优选例中，反应体系的温度为40-90℃，较佳地，50-80℃，更佳地，60-70℃。
在另一优选例中，反应体系的温度为30-70℃，较佳地，35-60℃，更佳地，35-50℃。
在另一优选例中，步骤(a)中，反应温度为70-90℃，较佳地，70-80℃，或80-85℃。
在另一优选例中，在步骤(a)所述阿洛酮糖的转化率为5-30％，较佳地，25-30％。
在另一优选例中，所述反应时间为1－5小时。
在另一优选例中，所述的D-阿洛酮糖-3-差向异构酶包括游离态的酶、固定化酶。
在另一优选例中，在步骤(a)中，所述的D-阿洛酮糖-3-差向异构酶是原位产生的。
在另一优选例中，在步骤(a)中，在发酵体系中进行反应，所述发酵体系中含有产生所述D-阿洛酮糖-3-差向异构酶的生产菌。
在另一优选例中，所述的生产菌包括重组的工程菌。
在另一优选例中，所述的工程菌包括大肠杆菌、酵母、或杆菌。
在另一优选例中，所述的生产菌包括类芽孢杆菌(Paenibacillussenegalensis)。
本发明第二方面提供了一种催化反应体系，所述的反应体系包含(A)D-阿洛酮糖-3-差向异构酶；(B)反应底物，所述反应底物包括果糖；和(C)缓冲体系。
在另一优选例中，在所述反应体系中，所述底物的浓度(w/w)为1-80％，较佳地，3-70％，更佳地，8-65％，按反应体系的总重量计算。
在另一优选例中，在所述反应体系中，所述差向异构酶的浓度(w/w)为1～20％，较佳地，2-10％，更佳地，3-7％，最佳地，5％。
在另一优选例中，所述差向异构酶与底物果糖之比为10-80U:1g，较佳地，30-70U:1g，更佳地，40-60U:1g，最佳地，50U:1g。
在另一优选例中，反应体系的pH为5.5-9.5，较佳地，6-9，更佳地，8-9。
在另一优选例中，反应体系的pH为6.0-9.5，较佳地，6-8，更佳地，6.5-7.5。
在另一优选例中，反应体系的温度为40-90℃，较佳地，50-80℃，更佳地，60-70℃。
在另一优选例中，反应体系的温度为30-70℃，较佳地，35-60℃，更佳地，35-50℃。
本发明第三方面提供了一种D-阿洛酮糖-3-差向异构酶的用途，所述的所述D-阿洛酮糖-3-差向异构酶为类芽孢杆菌(Paenibacillus senegalensis)的D-阿洛酮糖-3-差向异构酶，并且所述D-阿洛酮糖-3-差向异构酶用于在工业上催化生产阿洛酮糖，或用作工业上催化生产阿洛酮糖的催化剂。
在另一优选例中，所述的D-阿洛酮糖-3-差向异构酶的分子量为32.7kD道尔顿。
在另一优选例中，所述D-阿洛酮糖-3-差向异构酶的蛋白序列如SEQ ID NO.:1所示。
应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
附图说明
图1A显示了D-果糖标准物的高效液相色谱图；
图1B显示了D-阿洛酮糖标准物的高效液相色谱图；
图1C显示了PsDPE粗酶液与D-阿洛酮糖60℃反应后的高效液相色谱图；
图2A显示了重组PsDPE的最适温度；
图2B显示了重组PsDPE的最适pH；
图2C显示了果糖浓度对重组PsDPE活性的影响；
图2D显示了温度对重组PsDPE稳定性的影响(40℃，50℃，60℃)。
具体实施方式
本发明人经过广泛而深入的研究，通过大量筛选，首次意外的发现一种新型的D-阿洛酮糖-3-差向异构酶，它来自类芽孢杆菌(Paenibacillus senegalensis)，具有高酶活性和高热稳定性，并且在极端pH下也具有很高的酶活性，并可高效催化产生阿洛酮糖。在此基础上，本发明人完成了本发明。
D-阿洛酮糖-3-差向异构酶
如本文所用，术语“本发明的蛋白”、“本发明的多肽”、“D-阿洛酮糖-3-差向异构酶”、“本发明的酶”可互换使用，均指可高效催化产生阿洛酮糖的酶。在本发明中，所述D-阿洛酮糖-3-差向异构酶为SEQ ID NO.:1所示的蛋白或其衍生蛋白，所述D-阿洛酮糖-3-差向异构酶来自类芽孢杆菌(Paenibacillus senegalensis)。
本文所用的术语“分离的”是指物质从其原始环境中分离出来(如果是天然的物质，原始环境即是天然环境)。如活体细胞内的天然状态下的多聚核苷酸和多肽是没有分离纯化的，但同样的多聚核苷酸或多肽如从天然状态中同存在的其他物质中分开，则为分离纯化的。因此，本文所用的术语“分离的D-阿洛酮糖-3-差向异构酶”是指所述蛋白基本上不含天然与其相关的其它蛋白、脂类、糖类或其它物质。本领域的技术人员能用标准的蛋白质纯化技术纯化本发明的D-阿洛酮糖-3-差向异构酶。基本上纯的蛋白在非还原聚丙烯酰胺凝胶上能产生单一的条带。然而，鉴于本发明的教导以及现有技术，本领域技术人员还应明白“D-阿洛酮糖-3-差向异构酶”还应包括所述蛋白的变异形式，所述变异形式具有与“本发明的D-阿洛酮糖-3-差向异构酶”相同或相似的功能，但其氨基酸序列与SEQ ID NO:1所示氨基酸序列有少量差异。这些变异形式包括(但不限于)：一个或多个(通常为1-50个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个，还更佳如1-8个、1-6个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一个或多个(通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为6个以内)氨基酸。例如，本领域技术人员熟知，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。该术语还包括D-阿洛酮糖-3-差向异构酶蛋白的活性片段和活性衍生物。
多肽的变异形式包括：同源序列、保守性变异体、等位变异体、天然突变体、诱导突变体、在高或低的严格性条件下能与“本发明的黄D-阿洛酮糖-3-差向异构酶”的编码DNA杂交的DNA所编码的蛋白。本发明还包括其他多肽，如包含“本发明的D-阿洛酮糖-3-差向异构酶”或其片段的融合蛋白。除了几乎全长的多肽外，本发明还应包括“本发明的D-阿洛酮糖-3-差向异构酶”的活性片段。通常，该片段具有“本发明的D-阿洛酮糖-3-差向异构酶”的氨基酸序列的至少约10个连续氨基酸，通常至少约30个连续氨基酸，较佳地至少约50个连续氨基酸，更佳地至少约80个连续氨基酸，最佳地至少约100个连续氨基酸。
本发明还提供“D-阿洛酮糖-3-差向异构酶”的类似物。这些类似物与天然“本发明的D-阿洛酮糖-3-差向异构酶”的差别可以是氨基酸序列上的差异，也可以是不影响序列的修饰形式上的差异，或者兼而有之。这些多肽包括天然或诱导的遗传变异体。诱导变异体可以通过各种技术得到，如通过辐射或暴露于诱变剂而产生随机诱变，还可通过定点诱变法或其他已知分子生物学的技术。类似物还包括具有不同于天然L-氨基酸的残基(如D-氨基酸)的类似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、γ-氨基酸)的类似物。应理解，本发明的蛋白并不限于上述例举的代表性蛋白。
修饰(通常不改变一级结构)形式包括：体内或体外的多肽的化学衍生形式如乙酰化或羧基化。修饰还包括糖基化。修饰形式还包括具有磷酸化氨基酸残基(如磷酸酪氨酸，磷酸丝氨酸，磷酸苏氨酸)的序列。还包括被修饰从而提高了其抗蛋白水解性能或优化了溶解性能的蛋白。
在本发明中，“D-阿洛酮糖-3-差向异构酶”的保守性变异多肽指与SEQ IDNO:1所示氨基酸序列相比，有至多20个，较佳地至多10个，更佳地至多5个，最佳地至多3个氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所替换而形成多肽，但所述保守性变异多肽依然具有与氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示蛋白相同或相似的活性，即，催化产生阿洛酮糖的活性。
因此，鉴于本发明的教导和现有技术，本领域技术人员可根据，例如下表所示进行氨基酸替换而产生保守性变异的突变体。
初始残基 代表性的取代残基 优选的取代残基
Ala(A) Val；Leu；Ile Val
Arg(R) Lys；Gln；Asn Lys
Asn(N) Gln；His；Lys；Arg Gln
Asp(D) Glu Glu
Cys(C) Ser Ser
Gln(Q) Asn Asn
Glu(E) Asp Asp
Gly(G) Pro；Ala Ala
His(H) Asn；Gln；Lys；Arg Arg
Ile(I) Leu；Val；Met；Ala；Phe Leu
Leu(L) Ile；Val；Met；Ala；Phe Ile
Lys(K) Arg；Gln；Asn Arg
Met(M) Leu；Phe；Ile Leu
Phe(F) Leu；Val；Ile；Ala；Tyr Leu
Pro(P) Ala Ala
Ser(S) Thr Thr
Thr(T) Ser Ser
Trp(W) Tyr；Phe Tyr
Tyr(Y) Trp；Phe；Thr；Ser Phe
Val(V) Ile；Leu；Met；Phe；Ala Leu
因此，本文所用的“含有”，“具有”或“包括”包括了“包含”、“主要由……构成”、“基本上由……构成”、和“由……构成”；“主要由……构成”、“基本上由……构成”和“由……构成”属于“含有”、“具有”或“包括”的下位概念。
本发明的蛋白可以是重组蛋白、天然蛋白、合成蛋白，优选重组蛋白。本发明的蛋白可以是天然纯化的产物，或是化学合成的产物，或使用重组技术从原核或真核宿主(例如，细菌、酵母、高等植物、昆虫和哺乳动物细胞)中产生。根据重组生产方案所用的宿主，本发明的蛋白可以是糖基化的，或可以是非糖基化的。本发明的蛋白还可包括或不包括起始的甲硫氨酸残基。
本领域技术人员明白，本发明的“D-阿洛酮糖-3-差向异构酶”还包括“D-阿洛酮糖-3-差向异构酶”的片段、衍生物和类似物。如本文所用，术语“片段”、“衍生物”和“类似物”是指基本上保持本发明的“D-阿洛酮糖-3-差向异构酶”相同的生物学功能或活性的多肽。本发明的多肽片段、衍生物或类似物可以是(i)有一个或多个保守或非保守性氨基酸残基(优选保守性氨基酸残基)被取代的多肽，而这样的取代的氨基酸残基可以是也可以不是由遗传密码编码的，或(ii)在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的多肽，或(i ii)成熟多肽与另一个化合物(比如延长多肽半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合所形成的多肽，或(iv)附加的氨基酸序列融合到此多肽序列而形成的多肽(如前导序列或分泌序列或用来纯化此多肽的序列或蛋白原序列，或融合蛋白)。根据本文的定义这些片段、衍生物和类似物属于本领域熟练技术人员公知的范围。
鉴于本领域现有技术和本发明的教导，本领域技术人员不难获得本发明D-阿洛酮糖-3-差向异构酶的活性片段。因此，任何一种“D-阿洛酮糖-3-差向异构酶”的生物活性片段都可以应用于本发明。在本文中，“D-阿洛酮糖-3-差向异构酶”的生物活性片段是指“D-阿洛酮糖-3-差向异构酶”的片段，但其仍然能保持全长“D-阿洛酮糖-3-差向异构酶”的全部或部分功能。通常情况下，所述的生物活性片段至少保持全长“D-阿洛酮糖-3-差向异构酶”的50％的活性。在更优选的条件下，所述活性片段能够保持全长“D-阿洛酮糖-3-差向异构酶”的60％、70％、80％、90％、95％、99％、或100％的活性。
基于本发明的教导和现有技术，本领域技术人员还可以明白，可以将本发明的D-阿洛酮糖-3-差向异构酶制成固定化酶等其它利用形式。
本发明还提供了编码本发明“D-阿洛酮糖-3-差向异构酶”或其保守性变异多肽的多核苷酸序列。
本发明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因组DNA或人工合成的DNA。DNA可以是单链的或是双链的。DNA可以是编码链或非编码链。编码成熟多肽的编码区序列可以与SEQ ID NO.:2所示的编码区序列相同或者是简并的变异体。如本文所用，“简并的变异体”在本发明中是指编码具有SEQ ID NO.:1所示的蛋白质，但与SEQ IDNO.:2所示的编码区序列有差别的核酸序列。
编码SEQ ID NO.:1所示的成熟多肽的多核苷酸包括：只编码成熟多肽的编码序列；成熟多肽的编码序列和各种附加编码序列；成熟多肽的编码序列(和任选的附加编码序列)以及非编码序列。
术语“编码多肽的多核苷酸”可以是包括编码所述多肽的多核苷酸，也可以是还包括附加编码和/或非编码序列的多核苷酸。
本发明还涉及上述多核苷酸的变异体，其编码与本发明有相同的氨基酸序列的多肽或多肽的片段、类似物和衍生物。此多核苷酸的变异体可以是天然发生的等位变异体或非天然发生的变异体。这些核苷酸变异体包括取代变异体、缺失变异体和插入变异体。如本领域所知的，等位变异体是一个多核苷酸的替换形式，它可能是一个或多个核苷酸的取代、缺失或插入，但不会从实质上改变其编码的多肽的功能。
本发明还涉及与上述的序列杂交且两个序列之间具有至少50％，较佳地至少70％，更佳地至少80％相同性的多核苷酸。本发明特别涉及在严格条件下与本发明所述多核苷酸可杂交的多核苷酸。在本发明中，“严格条件”是指:(1)在较低离子强度和较高温度下的杂交和洗脱，如0.2×SSC，0.1％SDS，60℃；或(2)杂交时加有变性剂，如50％(v/v)甲酰胺，0.1％小牛血清/0.1％Ficoll，42℃等；或(3)仅在两条序列之间的相同性至少在90％以上，更好是95％以上时才发生杂交。并且，可杂交的多核苷酸编码的多肽与SEQ ID NO:1所示的成熟多肽有相同的生物学功能和活性。
本发明还涉及与上述的序列杂交的核酸片段。如本文所用，“核酸片段”的长度至少含15个核苷酸，较好是至少30个核苷酸，更好是至少50个核苷酸，最好是至少100个核苷酸以上。核酸片段可用于核酸的扩增技术(如PCR)以确定和/或分离编码“D-阿洛酮糖-3-差向异构酶”的多聚核苷酸。
本发明的“D-阿洛酮糖-3-差向异构酶”核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据本发明所公开的有关核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA库作为模板，扩增而得有关序列。
一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。此外，还可用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短时。通常，通过先合成多个小片段，然后再进行连接可获得序列很长的片段。
目前，已经可以完全通过化学合成来得到编码本发明蛋白(或其片段，或其衍生物)的DNA序列。然后可将该DNA序列引入本领域中已知的各种现有的DNA分子(或如载体)和细胞中。此外，还可通过化学合成将突变引入本发明蛋白序列中。
在优选的实施方式中，所述“D-阿洛酮糖-3-差向异构酶”是：(a)具有SEQ ID NO.:1所示氨基酸序列的蛋白；或(b)由SEQ ID NO.:1所示氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的且具有“黄酮-6-羟化酶”功能的由(a)衍生的蛋白；或(c)由SEQ ID NO.:1所示氨基酸序列经过一个或数个，优选1-50个，更优选1-30个，还要优选1-10个，最优选1-6个氨基酸残基的缺失或添加而形成的且具有(a)所述蛋白功能的衍生蛋白；或(d)在SEQ ID NO.:1所示氨基酸序列的C末端和/或N末端添加或缺失一个或数个，优选1-50个，更优选1-30个，还要优选1-10个，最优选1-6个氨基酸残基而形成的且具有(a)所述蛋白功能的衍生蛋白。
相应地，所述“D-阿洛酮糖-3-差向异构酶”的编码基因是：
(a)氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示的蛋白的编码核苷酸序列；或
(b)由SEQ ID NO.:1示氨基酸序列经过一个或数个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的且具有氨基酸序列如SEQ ID NO.:1所示蛋白功能的衍生蛋白的编码核苷酸序列；或
(c)由SEQ ID NO.:1所示氨基酸序列经过一个或数个，优选1-50个，更优选1-30个，还要优选1-10个，最优选1-6个氨基酸残基的缺失或添加而形成的且具有(a)所述蛋白功能的衍生蛋白的编码序列；或
(d)在SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的C末端和/或N末端添加或缺失一个或数个，优选1-50个，更优选1-30个，还要优选1-10个，最优选1-6个氨基酸残基而形成的且具有(a)所述蛋白功能的衍生蛋白的编码序列。
在进一步优选的实施方式中，所述“D-阿洛酮糖-3-差向异构酶”的编码基因是：(i)具有SEQ ID NO.:2所示序列的多核苷酸；或(ii)具有与SEQ ID NO.:2所示序列互补的多核苷酸。
表达载体
本发明也涉及包含本发明编码序列的表达载体，以及用本发明的表达载体或“D-阿洛酮糖-3-差向异构酶”编码序列经基因工程产生的宿主细胞，以及经重组技术产生本发明所述多肽的方法。
通过常规的重组DNA技术(Science，1984；224：1431)，可利用本发明的多聚核苷酸序列来表达或生产重组的“D-阿洛酮糖-3-差向异构酶”。一般来说有以下步骤：
1.用本发明的编码“D-阿洛酮糖-3-差向异构酶”的多核苷酸(或其变异体)，或用含有该多核苷酸的重组表达载体转化或转导合适的宿主细胞；
2.在合适的培养基中培养的宿主细胞；
3.从培养基或细胞中分离、纯化蛋白质。
本发明中，“D-阿洛酮糖-3-差向异构酶”的编码多核苷酸序列可插入重组表达载体或基因组。术语“重组表达载体”指本领域熟知的细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒或其他载体。总之，只要能在宿主体内复制和稳定，任何质粒和载体都可以用。表达载体的一个重要特征是通常含有复制起点、启动子、标记基因和翻译控制元件。
本领域的技术人员可采用熟知的方法能用于构建含“D-阿洛酮糖-3-差向异构酶”编码DNA序列和合适的转录/翻译控制信号的表达载体，包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等。所述的DNA序列可有效连接到表达载体中的适当启动子上，以指导mRNA合成。表达载体还包括翻译起始用的核糖体结合位点和转录终止子。
此外，表达载体优选包含一个或多个选择性标记基因，以提供用于选择转化的宿主细胞的表型性状，如真核细胞培养用的二氢叶酸还原酶、新霉素抗性以及绿色荧光蛋白(GFP)，或用于大肠杆菌的卡那霉素或氨苄青霉素抗性。
包含上述的适当DNA序列以及适当启动子或者控制序列的载体，可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达蛋白质。
本文所述的宿主细胞包括包含表达载体或基因组上整合了本发明“D-阿洛酮糖-3-差向异构酶”编码序列的宿主细胞。本发明的宿主细胞或菌株能够高效表达具有催化产生阿洛酮糖活性的D-阿洛酮糖-3-差向异构酶，本发明的宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞。在具体的实施方式中，所述菌株包括但不限于：酿酒酵母或大肠杆菌。在优选的实施方式中，所述菌株为大肠杆菌。
用重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主为原核生物如大肠杆菌时，能吸收DNA的感受态细胞可在指数生长期后收获，用CaCl2法处理，所用的步骤在本领域众所周知。另一种方法是使用MgCl2。如果需要，转化也可用电穿孔的方法进行。当宿主是真核生物，可选用如下的DNA转染方法：磷酸钙共沉淀法，常规机械方法如显微注射、电穿孔、脂质体包装等。当宿主是酿酒酵母，可选用醋酸锂转化的方法
获得的转化子可以用常规方法培养，表达本发明的基因所编码的多肽。根据所用的宿主细胞，培养中所用的培养基可选自各种常规培养基。在适于宿主细胞生长的条件下进行培养。当宿主细胞生长到适当的细胞密度后，用合适的方法(如温度转换或化学诱导)诱导选择的启动子，将细胞再培养一段时间。
在上面的方法中的重组多肽可在细胞内、或在细胞膜上表达、或分泌到细胞外。如果需要，可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化重组的蛋白。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于：常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(HPLC)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。
鉴于本发明的教导和现有技术，本领域普通技术人员会理解，本发明的D-阿洛酮糖-3-差向异构酶及其编码序列、表达载体、宿主细胞可用于催化产生阿洛酮糖。
阿洛酮糖的制备方法
本发明还提供了一种阿洛酮糖的制备方法。
在一优选实施方式中，可通过发酵包含本发明表达载体或其基因组上整合由本发明所述蛋白的编码序列的宿主细胞，使之产生阿洛酮糖。
在一优选实施方式中，所述产生阿洛酮糖的方法是在果糖为底物的条件下进行的。
在一优选实施方式中，所述方法包括如下步骤：
(a)在D-阿洛酮糖-3-差向异构酶存在下，对底物进行酶促反应，从而形成产物阿洛酮糖，其中所述D-阿洛酮糖-3-差向异构酶为类芽孢杆菌(Paenibacillussenegalensis)的D-阿洛酮糖-3-差向异构酶，并且所述的底物包括果糖；和
(b)任选地分离阿洛酮糖。
本发明的主要优点包括：
(1)本发明经过大量筛选，首次筛选出一种来自于类芽孢杆菌(Paenibacillussenegalensis)的D-阿洛酮糖-3-差向异构酶，它可高效催化果糖产生阿洛酮糖。
(2)本发明首次提供一种来自于类芽孢杆菌(Paenibacillus senegalensis)的D-阿洛酮糖-3-差向异构酶，它具有高催化活性，高热稳定性，高转化效率(可达29.6％)。
(3)本发明的D-阿洛酮糖-3-差向异构酶可以将廉价的D-果糖转化为D-阿洛酮糖，并且有很好的热稳定性和催化效率，这对通过基因重组和表达技术的大规模工业化生产十分有利，有很强的竞争力。
(4)与目前已经发现的其他DPE相比，本发明的D-阿洛酮糖-3-差向异构酶(DPE)的最适反应温度较高，且热稳定性明显高于其他DPE。
(5)本发明提供的新型D-阿洛酮糖-3-差向异构酶(PsDPE)的稳定性更强，这大大提高了该酶的重复利用率和使用周期，另外该酶促反应利用较廉价的D-果糖作为底物，成本较低，可以实现D-阿洛酮糖的生物转化法生产，具有较大优势。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring HarborLaboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数是重量百分比和重量份数。
如果没有特别说明，实施例中所用的材料均为市售产品。
实施例1从类芽孢杆菌Paenibacillus senegalensis中分离DPE的核苷酸序列
根据已有DPE序列进行Blast比对，发现来源于Paenibacillus senegalensis中某一未知蛋白的氨基酸序列与其他几种DPE基因的相似性较大。据此推测该基因具有将D-果糖转化为D-阿洛酮糖的能力，是潜在的DPE基因。DNA序列经优化后由常州基宇生物科技有限公司进行全基因合成，5’和3’端分别带有NdeI和BamHI酶切位点。所述DPE基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.:2所示。
实施例2类芽孢杆菌DPE大肠杆菌重组表达系统的构建
将全基因合成的片段和表达载体pET 29a(购自Novagen)分别用NdeI和BamHI限制性内切酶(New England Biolabs,NEB)双酶切后进行连接反应，连接反应体系(10μl)：T4DNA连接酶(Takara)1μl；10×T4Buffer 1μl；基因片段与载体8μl(摩尔比5﹕1)，16℃过夜反应。
然后，将10μl连接反应液加到100μl的E.coli DH5α感受态细胞(购于天根生化科技(北京)有限公司)中，置于冰上30分钟，42℃热激90s，迅速放在冰上冷却2min，接着加入无菌的800μl的LB液体培养基(配方为1％Tryptone(OXOID)，0.5％Yeast Extract(OXOID)，1％NaCl，购自国药集团化学试剂有限公司)。37℃，160rpm培养1h。然后培养液3000rpm离心2min，吸掉700μl的上清，用移液枪轻轻吹打重悬菌体。然后涂布到含有50μg/ml硫酸卡那霉素(Kan)的LB固体平板上，培养12-16h。挑取单菌落打入10μl ddH2O，进行菌落PCR验证，筛选出阳性克隆单菌落。菌落PCR反应体系(25μl)：单菌落悬液1μl；r-Taq聚合酶(5U/μl，Takara)0.2μl；dNTP Mixture(2.5mM each，Takara)2μl；10×PCR Buffer 2.5μl；引物T7(20μM)(TAA TAC GAC TCA CTA TAG GG)和T7ter(20μM)(TGC TAG TTA TTG CTC AGC GG)各0.5μl；ddH2O 18.3μl。PCR条件：94℃预变性5min；94℃变性30s；58℃退火1min；72℃延伸1min；循环28次；72℃10min。琼脂糖凝胶电泳验证阳性克隆的单菌落接种到5ml的LB液体培养基中，培养12h，取1ml送测序同时留样保存在15％甘油的EP管中。
最后，把重组质粒PsDPE-pET29a转化到BL21(DE3)感受态细胞(购于天根生化科技(北京)有限公司)，由此制备得到PsDPE的表达菌株。
实施例3生产DPE酶的工程菌的诱导表达
挑取上例中在含卡那霉素(终浓度为50μg/ml)的LB培养基平板上出现的阳性转化子，接种于3ml含卡那霉素(终浓度为50μg/ml)的LB培养基(配方为1％Tryptone(OXOID)，0.5％Yeast Extract(OXOID)，1％NaCl，购自国药集团化学试剂有限公司)，37℃，200rpm过夜培养，以1％的接种量接入50ml以上LB培养基中，37℃，200rpm继续培养4-5h；待培养物OD600＝0.6-0.8左右时，加入IPTG，使其终浓度为0.1mmol/L，20℃，150rpm过夜培养。6000rpm离心收集菌体，用去离子水洗涤三次，用2ml无菌水重悬菌体，超声破碎，12000rpm离心收集上清液，即为粗酶液。
实施例4重组PsDPE的酶活测定
标准反应条件如下：取0.25μl的DPE粗酶液与0.5ml 50％的D-果糖溶液(购自山东西王糖业有限公司)于60℃反应10min，然后100℃处理10min灭活酶的活性。用0.45μm的微孔滤膜(购自上海乐枫生物科技有限公司)过滤，滤液做高效液相分析。高效液相色谱按如下条件进行：岛津SHIMADZU LC-20A HPLC with RID detector；分析柱：Waters Sugar-PakI,6.5×300mm column；流动相：水；流速：0.6ml/min；柱温：80℃；检测器：RID，检测器温度60℃。以Sigma公司生产的D-果糖和D-阿洛酮糖纯品为标准品，将上述样品进行分析，上样量为20μl。色谱分析结果显示D-果糖和D-阿洛酮糖标准物(图1A、1B)、DPE与D-果糖(图1C)60℃反应1h后的高效液相色谱图。通过与D-果糖和D-阿洛酮糖标准品的保留时间进行比较鉴别出各个峰。图1A中保留时间为9.389min对应的峰为D-果糖，图1B中保留时间为12.233min对应的峰为D-阿洛酮糖。由此可见，本发明中分离得到的来源于Paenibacillussenegalensis的DPE酶(SEQ ID NO.:1)和D-阿洛酮糖之间的差向异构反应，反应达到平衡时D-果糖和D-阿洛酮糖的浓度比例约为7:3(图1C)。
实施例5重组PsDPE酶学性质的鉴定
最适温度的测定：按照上例中的标准反应，以50％果糖为底物，分别于25、35、40、45、50、55、60、65、70、80℃下反应10min，然后100℃处理10min灭活。以60℃下酶活为100％，计算各温度下的相对酶活。
最适pH的测定：按照上例中的标准反应，以50％果糖为底物，分别于pH 5.0、6.0、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、10.0下反应10min，然后100℃处理10min灭活。以pH7.0下酶活为100％，计算各pH下的相对酶活。
温度对酶稳定性的影响：按照上例中的标准反应，首先将DPE分别于40、50、60℃下保温30、60、90、120、150min，然后以50％果糖为底物，60℃下反应10min，100℃处理10min灭活。以不经热处理的酶活为100％，计算各温度下保温不同时间时的相对酶活。
结果如图2所示。结果显示，Paenibacillus senegalensis的DPE的最适反应温度为60℃(图2A)，最适pH6.0-8.0(图2B)，并且在果糖浓度10％～50％均保持30％左右转化率(图2C)。此外，该酶热稳定性较好，于60℃下保温150min相对酶活仍然在50％以上(图2D，◆40℃，■50℃，▲60℃)。
实施例6 1L反应体系下PsDPE酶转化果糖生成D-阿洛酮糖反应验证
反应体系：
果糖500g(购自山东西王糖业有限公司)
纯化水500g
氯化钴1mM(购自国药集团化学试剂有限公司)
将上述样品混匀后预热至60℃进行反应，加入PsDPE粗酶液机械搅拌开始进行反应，反应过程中取样然后100℃处理10min灭活酶的活性。用0.45μm的微孔滤膜过滤，滤液做高效液相分析。结果显示，反应2h转化率达到29.6％，停止反应。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
序列表
<110> 上海立足生物科技有限公司
<120> 一种D-阿洛酮糖-3-差向异构酶的应用
<130> P2016-1216
<160> 2
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 879
<212> DNA
<213> 类芽孢杆菌(Paenibacillus senegalensis)
<400> 1
atgaaattcg gcacctattt tgcctattgg gaacagagct gggataccga ttatctgaaa 60
tacgttaaaa aagtggccga tctgggtttt gatgttctgg aagttggtgc agcaggtatt 120
gttaatatga gtgatgatgc actgagcgca ctgaaaagcg aagcagaaaa ttatgcaatt 180
accctgaccg caggcattgg tctgccgaaa cagtttgatg ttagcagcga aaatgaaagc 240
gttcgtcagg atggtattgc ctttatgaaa aaaatcctgg atgcactgca taaagccggt 300
attaaagcaa ttggtggcac catttatagc tattggcctg ttgattatag cgcaccgatt 360
aacaaaccgg cagttcgtaa acagagcatc aaaagcatgc aagaactggc agattatgca 420
gcccagtatg atattaccct gctggttgaa agcctgaatc gttttgaaca gtttctggtg 480
aatgatgcca aagaagcagt ggattacgtt aaagcagtga ataaaccgaa cgtgaaagtt 540
atgctggata gctttcacat gaacatcgaa gaggattatc tgggtgatgc aattcgttat 600
accggtgatt acctgggcca ttttcatatt ggtgaatgca atcgtaaagt tccgggtaaa 660
ggtcacatgc cgtggtcaga aattggtcag gcactgcgtg atattcagta tgatggttgt 720
gttgttatgg aaccgtttgt tcgtccgggt ggcattgttg gtagcgatat taaagtttgg 780
cgtgatctga gcgataatgc agatgaagca aaactggatg ccgatatcaa agaaagcctg 840
gaatttgtga aacagacctt tctgaaaagc accccgtaa 879
<210> 2
<211> 292
<212> PRT
<213> 类芽孢杆菌(Paenibacillus senegalensis)
<400> 2
Met Lys Phe Gly Thr Tyr Phe Ala Tyr Trp Glu Gln Ser Trp Asp Thr
1 5 10 15
Asp Tyr Leu Lys Tyr Val Lys Lys Val Ala Asp Leu Gly Phe Asp Val
20 25 30
Leu Glu Val Gly Ala Ala Gly Ile Val Asn Met Ser Asp Asp Ala Leu
35 40 45
Ser Ala Leu Lys Ser Glu Ala Glu Asn Tyr Ala Ile Thr Leu Thr Ala
50 55 60
Gly Ile Gly Leu Pro Lys Gln Phe Asp Val Ser Ser Glu Asn Glu Ser
65 70 75 80
Val Arg Gln Asp Gly Ile Ala Phe Met Lys Lys Ile Leu Asp Ala Leu
85 90 95
His Lys Ala Gly Ile Lys Ala Ile Gly Gly Thr Ile Tyr Ser Tyr Trp
100 105 110
Pro Val Asp Tyr Ser Ala Pro Ile Asn Lys Pro Ala Val Arg Lys Gln
115 120 125
Ser Ile Lys Ser Met Gln Glu Leu Ala Asp Tyr Ala Ala Gln Tyr Asp
130 135 140
Ile Thr Leu Leu Val Glu Ser Leu Asn Arg Phe Glu Gln Phe Leu Val
145 150 155 160
Asn Asp Ala Lys Glu Ala Val Asp Tyr Val Lys Ala Val Asn Lys Pro
165 170 175
Asn Val Lys Val Met Leu Asp Ser Phe His Met Asn Ile Glu Glu Asp
180 185 190
Tyr Leu Gly Asp Ala Ile Arg Tyr Thr Gly Asp Tyr Leu Gly His Phe
195 200 205
His Ile Gly Glu Cys Asn Arg Lys Val Pro Gly Lys Gly His Met Pro
210 215 220
Trp Ser Glu Ile Gly Gln Ala Leu Arg Asp Ile Gln Tyr Asp Gly Cys
225 230 235 240
Val Val Met Glu Pro Phe Val Arg Pro Gly Gly Ile Val Gly Ser Asp
245 250 255
Ile Lys Val Trp Arg Asp Leu Ser Asp Asn Ala Asp Glu Ala Lys Leu
260 265 270
Asp Ala Asp Ile Lys Glu Ser Leu Glu Phe Val Lys Gln Thr Phe Leu
275 280 285
Lys Ser Thr Pro
290

Claims (10)

1.一种生产阿洛酮糖的方法，其特征在于，包括步骤：
(a)在D-阿洛酮糖-3-差向异构酶存在下，对底物进行酶促反应，从而形成产物阿洛酮糖，其中所述D-阿洛酮糖-3-差向异构酶为类芽孢杆菌(Paenibacillus senegalensis)的D-阿洛酮糖-3-差向异构酶，并且所述的底物包括果糖；和
(b)任选地，分离阿洛酮糖。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的D-阿洛酮糖-3-差向异构酶选自下组：
(i)氨基酸序列如SEQ ID NO.:1所示的多肽；
(ii)将SEQ ID NO.:1所示氨基酸序列的多肽经过一个或多个氨基酸残基(较佳地，1-50个，更佳地，1-30个，更佳地，1-10个，最佳地，1-6个)的取代、缺失或添加而形成的、或是添加信号肽序列后形成的、并具有催化产生阿洛酮糖活性的衍生多肽；
(iii)序列中含有(i)或(ii)中所述按氨基酸序列的衍生多肽；
(iv)氨基酸序列与SEQ ID NO.:1所示氨基酸序列的同源性≥70％(较佳地≥80％，更佳地≥90％)，并具有催化产生阿洛酮糖活性的衍生多肽。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的D-阿洛酮糖-3-差向异构酶具有选自下组的一个或多个特性：
(p1)适合的pH：5-10，较佳地，6-9，更佳地，8-9；
(p2)适合的温度：20～80℃，较佳地，50-80℃，更佳地，60-70℃；
(p3)催化活性：在pH7.0和60℃为最佳反应条件下，催化活性为100％；
(p4)在pH7.0和60－70℃下，转化反应2h，转化率为5-30％，较佳地，25-30％；
(p5)在最适pH±0.5下，在80℃下的催化活性A80与在60℃下的催化活性A60之比(A80/A60)≥50％(如50-80％)，较佳地≥60％(如60-65％)；
(p6)在最适pH±0.5下，在50℃下的催化活性A50与在60℃下的催化活性A60之比(A50/A60)≥50％(如50-80％)，较佳地≥60％(如60-65％)；
(p7)在最适pH±0.5下，在45℃下的催化活性A45与在60℃下的催化活性A60之比(A45/A60)≥50％(如50-80％)，较佳地≥60％(如60-65％)；
(p8)在T1温度下，在pH5.5下的催化活性ApH5.5与在pH7下的催化活性ApH7之比(ApH5.5/ApH7)≥60％(如60-90％)，较佳地≥65％(如65-80％)；
(p9)在T1温度下，在pH8下的催化活性ApH8与在pH7下的催化活性ApH7之比(ApH8/ApH7)≥60％(如60-90％)，较佳地≥65％(如65-80％)；
(p10)在T1温度下，在pH9.5下的催化活性ApH9.5与在pH7下的催化活性ApH7之比(ApH9.5/ApH7)≥60％(如60-90％)，较佳地≥65％(如65-80％)；
(p11)在T1温度下，在pH10下的催化活性ApH10与在pH7下的催化活性ApH7之比(ApH10/ApH7)≥60％(如60-90％)，较佳地≥65％(如65-80％)；
其中T1为40-70℃中任意温度，较佳地T1为50、60、65℃。
4.一种催化反应体系，其特征在于，所述的反应体系包含(A)D-阿洛酮糖-3-差向异构酶；(B)反应底物，所述反应底物包括果糖；和(C)缓冲体系。
5.如权利要求4所述的催化反应体系，其特征在于，在所述反应体系中，所述底物的浓度(w/w)为1-80％，较佳地，3-70％，更佳地，8-65％，按反应体系的总重量计算。
6.如权利要求4所述的催化反应体系，其特征在于，在所述反应体系中，所述差向异构酶的浓度(w/w)为1-20％，较佳地，2-10％，更佳地，3-7％，按反应体系的总重量计算。
7.如权利要求4所述的催化反应体系，其特征在于，所述差向异构酶与底物果糖之比为10-80U:1g，较佳地，30-70U:1g，更佳地，40-60U:1g。
8.如权利要求4所述的催化反应体系，其特征在于，所述反应体系的pH为5.5-9.5，较佳地，6-9，更佳地，8-9。
9.如权利要求4所述的催化反应体系，其特征在于，所述反应体系的温度为40-90℃，较佳地，50-80℃，更佳地，60-70℃。
10.一种D-阿洛酮糖-3-差向异构酶的用途，其特征在于，所述的所述D-阿洛酮糖-3-差向异构酶为类芽孢杆菌(Paenibacillus senegalensis)的D-阿洛酮糖-3-差向异构酶，并且所述D-阿洛酮糖-3-差向异构酶用于在工业上催化生产阿洛酮糖，或用作工业上催化生产阿洛酮糖的催化剂。
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