CN113667707B - 由葡萄糖生产d-阿洛酮糖的方法 - Google Patents

由葡萄糖生产d-阿洛酮糖的方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及生物工程领域，公开了由葡萄糖生产D‑阿洛酮糖的方法，该方法包括在D‑阿洛酮糖‑3‑差向异构酶活性聚集体和葡萄糖异构酶的存在下，将葡萄糖转化为D‑阿洛酮糖。相比于使用D‑阿洛酮糖‑3‑差向异构酶进行D‑阿洛酮糖的生产，本发明所述的D‑阿洛酮糖‑3‑差向异构酶活性聚集体由于稳定性更好，能够回用，进而能够延长利用葡萄糖生产D‑阿洛酮糖的时间或增加生产批次，且还利于酶的分离，降低分离成本，也利于后续D‑阿洛酮糖的纯化，利于工业化生产。

Description

由葡萄糖生产D-阿洛酮糖的方法
技术领域
本发明涉及生物工程领域，具体涉及一种由葡萄糖生产D-阿洛酮糖的方法。
背景技术
随着城市化进程加快、环境污染日益严重、人们生活方式的改变及人口老龄化，肥胖、糖尿病等慢性代谢性疾病的发病率在我国和全球范围急剧上升。而过多食用糖类造成能量过剩是引起肥胖和糖尿病的一个重要原因。如何保持人们习以为常的甜味程度，同时能降低糖在肠道的吸收，减少能量摄入是目前营养和医学界研究的热点之一，同时也是食品行业亟需解决的重要问题。
D-阿洛酮糖（D-psicose）是D-果糖（D-fructose）C-3的差向异构体，其甜度相当于蔗糖的70%，热量相当于蔗糖0.3％，是一种具有特殊保健功能的新型功能性单糖。D-阿洛酮糖具有与蔗糖相近的口感及容积特性，并与蔗糖一样可与食物中的氨基酸或蛋白质发生美拉德反应，可作为食品中蔗糖理想的替代品。动物实验显示，D-阿洛酮糖具有控制2型糖尿病患者血糖的功效，同时对肥胖等相关疾病也一定的预防作用。动物与人体实验证明，D-阿洛酮糖没有任何不良副作用。2011年8月，美国食品与药物管理局（FDA）确定D-阿洛酮糖为公认安全使用物质（GRAS），并可作为食品或食品添加剂的组成成分。D-阿洛酮糖在膳食、保健、医药等领域拥有广阔的应用前景。
目前生产D-阿洛酮糖的主要方法是酶法转化，以D-果糖为底物，在D-阿洛酮糖-3-差向异构酶的催化下生成D-阿洛酮糖。D-阿洛酮糖-3-差向异构酶的特点在于具有反应平衡常数，一般在28-33%之间。D-果糖是以葡萄糖为底物，在葡萄糖异构酶的催化下转化而来。葡萄糖异构酶也具有反应平衡常数，一般在42-45%之间。D-阿洛酮糖-3-差向异构酶和葡萄糖异构酶的最适反应温度一般都在50-60℃之间，并且都具有金属离子依赖性。因此，可以在葡萄糖异构酶和D-阿洛酮糖-3-差向异构酶存在的情况下，以葡萄糖为底物转化生成D-阿洛酮糖，而如何优化葡萄糖生产D-阿洛酮糖的方法也将是研究的重点和方向。
发明内容
本发明的目的是为了提供一种由葡萄糖生产D-阿洛酮糖的方法，该方法中使用的D-阿洛酮糖-3-差向异构酶活性聚集体相比于D-阿洛酮糖-3-差向异构酶而言，稳定性更好，能够回用，进而能够延长利用葡萄糖生产D-阿洛酮糖的时间或增加生产批次，且更易分离，工艺简单，利于工业化生产。
为了实现上述目的，本发明提供一种由葡萄糖生产D-阿洛酮糖的方法，该方法包括在D-阿洛酮糖-3-差向异构酶活性聚集体和葡萄糖异构酶的存在下，将葡萄糖转化为D-阿洛酮糖。
优选地，所述D-阿洛酮糖-3-差向异构酶活性聚集体由基因工程菌表达，其中，所述基因工程菌含有编码所述D-阿洛酮糖-3-差向异构酶的基因、编码自聚集短肽的基因和编码连接肽的基因。
优选地，所述基因工程菌中，编码所述D-阿洛酮糖-3-差向异构酶的基因具有SEQID NO.1所示的核苷酸序列；自聚集短肽为ELK16；连接肽为PT-linker。
优选地，所述基因工程菌为大肠杆菌或者枯草芽孢杆菌，更优选为枯草芽孢杆菌。
相比于使用D-阿洛酮糖-3-差向异构酶进行D-阿洛酮糖的生产，本发明所述的D-阿洛酮糖-3-差向异构酶活性聚集体由于稳定性更好，能够回用，进而能够延长利用葡萄糖生产D-阿洛酮糖的时间或增加生产批次，且利于酶的分离，降低分离成本，也利于后续D-阿洛酮糖的纯化，利于工业化生产。在两种酶同时存在的情况下，也即一步法生产D-阿洛酮糖时，还能减少中间产物D-果糖的纯化步骤，对于减少D-阿洛酮糖的生产成本具有重要的意义。
在本发明的优选的基因工程菌生产的D-阿洛酮糖差向异构酶活性聚集体的情况下，能够进一步提高D-阿洛酮糖的产量。
附图说明
图1是本发明实施例1转化后的混合液的HPLC检测图（从左至右依次是葡萄糖、D-果糖和D-阿洛酮糖）。
具体实施方式
在本文中所披露的范围的端点和任何值都不限于该精确的范围或值，这些范围或值应当理解为包含接近这些范围或值的值。对于数值范围来说，各个范围的端点值之间、各个范围的端点值和单独的点值之间，以及单独的点值之间可以彼此组合而得到一个或多个新的数值范围，这些数值范围应被视为在本文中具体公开。
本发明提供一种由葡萄糖生产D-阿洛酮糖的方法，该方法包括在D-阿洛酮糖-3-差向异构酶活性聚集体和葡萄糖异构酶的存在下，将葡萄糖转化为D-阿洛酮糖。
在本发明中，D-阿洛酮糖-3-差向异构酶活性聚集体和葡萄糖异构酶可以单独存在，也可以先加葡萄糖异构酶后加D-阿洛酮糖-3-差向异构酶活性聚集体，两者也可以同时存在。也即，先使用葡萄糖异构酶将葡萄糖转化为D-果糖，经过可选的分离或纯化后，使用D-阿洛酮糖-3-差向异构酶活性聚集体将果糖转化为D-阿洛酮糖；也可以同步进行葡萄糖转化生产果糖和果糖生成葡萄糖的过程。
在两者同时加入时，相比于其他两种方式工艺更简单，成本更低，且D-阿洛酮糖的收率更高。
优选地，所述D-阿洛酮糖-3-差向异构酶活性聚集体包含D-阿洛酮糖-3-差向异构酶和自聚集短肽。
优选地，所述D-阿洛酮糖-3-差向异构酶活性聚集体中D-阿洛酮糖-3-差向异构酶和自聚集短肽中间还插入有连接肽。
在本发明中，所述D-阿洛酮糖-3-差向异构酶的种类可以不受特别的限制，只要具有D-阿洛酮糖-3-差向异构酶活性即可。
所述D-阿洛酮糖-3-差向异构酶的来源菌株可以不受特别的限制，只要该菌株能够产生D-阿洛酮糖-3-差向异构酶即可；优选地，所述D-阿洛酮糖-3-差向异构酶来源于嗜热嗜酸菌（Mesoaciditogalauensis）、瘤胃球菌（Ruminococcus sp.，比如可以为Ruminococcus sp. CAG55）、解纤维梭菌（Clostridium cellulolyticum，比如可以为Clostridium cellulolyticumH10）、疾卡氏菌（Catonellamorbi，比如可以为其模式种）和布劳特氏菌（Blautiaschinkii）中的至少一种。
在本发明中，优选地，所述D-阿洛酮糖-3-差向异构酶来源于瘤胃球菌，更优选来源于Ruminococcussp. CAG55。
应当理解的是，所述D-阿洛酮糖-3-差向异构酶可以是上述来源菌株直接可获得的，也可以是基于上述菌株的D-阿洛酮糖-3-差向异构酶突变得到的。所述D-阿洛酮糖-3-差向异构酶的氨基酸序列可以从GenBank中获得，也可以根据获得的序列经过优化后获得（比如，可以是相应的氨基酸序列经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸残基且仍具有D-阿洛酮糖-3-差向异构酶活性的氨基酸序列；或者是与相应的氨基酸序列具有80%以上同源性，且具有D-阿洛酮糖-3-差向异构酶活性的氨基酸序列；或者是在其氨基末端和/或羧基末端连接有标签的氨基酸序列；或者是在其氨基末端连接有信号序列的氨基酸序列）。
在本发明的一种优选的实施方式中，所述D-阿洛酮糖-3-差向异构酶为（a）-（e）中任意一项所述的酶：
（a）具有SEQ ID NO.2所示氨基酸序列的酶；
（b）SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸残基且仍具有D-阿洛酮糖-3-差向异构酶活性的氨基酸序列所示的酶；
（c）与SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列具有80%以上同源性，且具有D-阿洛酮糖-3-差向异构酶活性的氨基酸序列所示的酶；
（d）在（a）、（b）或（c）所述氨基酸序列的氨基末端和/或羧基末端连接有标签的氨基酸序列所示的酶；
（e）在（a）、（b）或（c）所述氨基酸序列的氨基末端连接有信号序列的氨基酸序列所示的酶。
SEQ ID NO.2
MNKIGVHFGYFNRDWNTDFIKRIEQVKKIGLDILEVAPAPLLALTKFQRDEIAAAAKANDIELTFSVGLSANQDLASEDEEIRKNGIKFTTDTFQIMSEMGGKTYSGVDIAAWNKTFMEGITDKSATWERSISAVKEIMKVAEDKGITFAVEVVNRYESSLVNTAEEAVKYVDEVGSPNCKILLDTYHMNIEEDSFAGAIKLVGNRLGHFHVGESNRRPPCENGKMPWNEITNALKEIDYQGAIVMEPFIKMGGEVGRDIKVWRDISEGASESEMEQLLADAAMMLRKKMQR
在本发明的一种优选的实施方式中，所述D-阿洛酮糖-3-差向异构酶为具有SEQID NO.2所示氨基酸序列的酶。
组成蛋白质的20种氨基酸残基，按照侧链极性可以分成四类：1、非极性的氨基酸：丙氨酸（Ala）、缬氨酸（Val）、亮氨酸（Leu）、异亮氨酸（Ile）、甲硫氨酸（Met）、苯丙氨酸（Phe）、色氨酸（Trp）和脯氨酸（Pro）；2、极性不带电荷的氨基酸：甘氨酸（Gly）、丝氨酸（Ser）、苏氨酸（Thr）、半胱氨酸（Cys）、天冬氨酸（Asn）、谷氨酰胺（Gln）和酪氨酸（Tyr）；3、带正电荷的氨基酸：精氨酸（Arg）、赖氨酸（Lys）和组氨酸（His）；4、带负电荷的氨基酸：天冬氨酸（Asp）和谷氨酸（Glu）（参见“生物化学”（第二版）上册，沈同、王镜岩，第82-83页，高等教育出版社，1990年12月）。
蛋白质中如果发生同属一个类别的氨基酸残基取代，例如由Arg取代Lys或由Leu取代Ile，所述残基在蛋白质结构域中所起的作用（比如提供正电荷或形成疏水囊袋结构的作用）没有改变，因此对蛋白质的立体结构并不会产生影响，因此仍然可以实现蛋白的功能。所述同属一个类别的氨基酸残基取代可以发生在上述D-阿洛酮糖-3-差向异构酶的任意一个氨基酸残基位置上。
除上所述的氨基酸残基取代，本发明提供的D-阿洛酮糖-3-差向异构酶还包括相比于SEQ ID NO.2所示氨基酸序列的氨基酸残基任意位置发生一个或多个氨基酸残基缺失或添加或兼而有之的蛋白。
本发明中的D-阿洛酮糖-3-差向异构酶氨基酸序列可以是相比于SEQ ID NO.2所示氨基酸序列在如下位点突变获得的序列：第23位、第67位、第74位、第112位、第164位、第177位、第180位、第182位、第183位、第190位、第194位、第195位、第213位、第215位、第218位、第221位、第239位、第253位和第263位中的至少一位；优选具有如下突变：L183M、N190T、V67I、T164E、G253C、W263S、G213S、A112F、C180V/I182V/L183M、D74E、S215C、G213S/L183M、G213S/S215C、C221G、R218M、I23L/G213S、I23L、D194C、D239C、S177C和S195C中的至少一种。
在本发明中，所述酶还可以是与SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列具有80%以上同源性，且具有D-阿洛酮糖-3-差向异构酶活性的氨基酸序列所示的酶。优选地，所述D-阿洛酮糖-3-差向异构酶为与SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列具有85%以上，更优选90%以上，进一步优选95%以上，再进一步优选98%以上，最优选99%以上同源性，且具有D-阿洛酮糖-3-差向异构酶活性的氨基酸序列所示的酶。
为了方便纯化，还可以采用本领域常见的标签对（a）、（b）或（c）进行添加修饰，举例来说，可以通过在（a）的氨基末端和/或羧基末端连接有标签的氨基酸序列（如Poly-Arg、Poly-His、FLAG、Strep-tagⅡ和c-myc中的至少一种）而获得。所述标签不会影响本发明的D-阿洛酮糖-3-差向异构酶的活性，在实际应用过程中，可以根据需求选择是否添加标签。
在本发明中，所述D-阿洛酮糖-3-差向异构酶的氨基末端还可以连接信号序列。所述信号序列可以来自地衣芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌，但不限于此。
在本发明中，仍具有酶活力是指在相同的测定条件下，由（a）衍生的酶仍具有酶活力，其酶活力与（a）的酶活力之间的百分比（相对活性）不低于60%，优选不低于70%（或80%，或90%，或95%，或96%，或97%，或98%，或99%，或100%）。
上述D-阿洛酮糖-3-差向异构酶可以通过人工合成得到，也可以先合成其编码基因，再通过生物表达获得。
在本发明中，编码所述D-阿洛酮糖-3-差向异构酶的基因可以是上述来源菌株中的相应基因，也可以是基于相应基因优化得到的能够编码D-阿洛酮糖-3-差向异构酶的核苷酸序列。所述D-阿洛酮糖-3-差向异构酶基因，并不严格要求恰好为D-阿洛酮糖-3-差向异构酶编码基因的开放阅读框，只要该序列插入表达载体可正常转录翻译出D-阿洛酮糖-3-差向异构酶编码氨基酸序列即可，优选为D-阿洛酮糖-3-差向异构酶编码基因的开放阅读框。
本领域公知，组成蛋白质的20种不同的氨基酸中，除Met（ATG）或Trp（TGG）分别为单一密码子编码外，其他18种氨基酸分别由2-6个密码子编码（Sambrook等，分子克隆，冷泉港实验室出版社，纽约，美国，第二版，1989，见950页附录D）。即由于遗传密码子的简并性，决定一个氨基酸的密码子大多不止一个，三联体密码子中第三个核苷酸的置换，往往不会改变氨基酸的组成，因此编码相同蛋白的基因的核苷酸序列可以不同。本领域人员根据公知的密码子表，从本发明公开的氨基酸序列，以及由所述氨基酸序列得到的D-阿洛酮糖-3-差向异构酶活性不变的氨基酸序列，完全可以推导出能够编码它们的基因的核苷酸序列，通过生物学方法（如PCR方法、突变方法）或化学合成方法得到所述核苷酸序列，因此该部分核苷酸序列都应该包括在本发明范围内。相反，利用本文公开的DNA序列，也可以通过本领域公知的方法，例如Sambrook等的方法（分子克隆，冷泉港实验室出版社，纽约，美国，第二版，1989）进行，通过修改本发明提供的核酸序列，得到与本发明所述D-阿洛酮糖-3-差向异构酶活性一致的氨基酸序列。
优选地，编码所述D-阿洛酮糖-3-差向异构酶的基因具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列或SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列经过取代、缺失或添加一个或几个核苷酸残基且仍能够表达具有D-阿洛酮糖-3-差向异构酶活性的酶的核苷酸序列。
SEQ ID NO.1
TTAACGCTGCATCTTTTTTCTCAACATCATTGCAGCATCTGCAAGAAGTTGTTCCATTTCACTTTCAGAAGCTCCTTCACTAATATCGCGCCATACTTTTATATCACGTCCTACTTCTCCACCCATTTTAATAAATGGTTCCATAACTATTGCCCCTTGATAATCGATTTCTTTTAATGCGTTTGTAATTTCATTCCACGGCATTTTCCCATTTTCACATGGTGGTCTTCTATTACTCTCTCCCACATGAAAATGACCAAGGCGATTACCAACTAATTTAATTGCTCCTGCAAAACTGTCCTCCTCAATATTCATATGATATGTGTCCAGAAGAATCTTGCAGTTCGGACTTCCAACTTCATCTACATACTTTACTGCTTCTTCTGCTGTATTAACAAGAGATGACTCATAACGATTTACAACTTCAACTGCAAAAGTAATTCCCTTATCTTCTGCAACTTTCATAATCTCTTTCACTGCTGAAATACTTCTCTCCCAGGTAGCACTTTTATCTGTAATACCTTCCATAAATGTCTTATTCCACGCTGCAATATCCACTCCCGAATAAGTTTTTCCGCCCATTTCAGACATAATTTGGAAAGTATCCGTTGTAAATTTAATTCCATTTTTTCGAATCTCTTCATCTTCTGATGCTAAATCTTGATTCGCAGATAAACCAACTGAAAAAGTCAATTCAATATCATTCGCCTTTGCGGCAGCTGCAATCTCATCTCTCTGAAATTTTGTCAGTGCAAGAAGAGGGGCCGGAGCTACCTCTAGAATATCTAATCCTATTTTCTTTACCTGCTCAATCCGTTTGATAAAATCCGTATTCCAATCTCTGTTGAAATATCCAAAGTGAACTCCTATCTTGTTCAA
在本发明的一种优选的实施方式中，编码所述D-阿洛酮糖-3-差向异构酶的基因具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。
如上所述，相应地，核苷酸序列的5'端和/或3'端还可以连接有标签的编码序列。
本发明提供的核苷酸序列通常可以用聚合酶链式反应（PCR）扩增法、重组法、或人工合成的方法获得。例如，本领域技术人员根据本发明所提供的核苷酸序列，可以很容易得到模板和引物，利用PCR进行扩增获得有关序列。
一旦获得了有关核苷酸序列，就可以用重组法大批量的获得有关氨基酸序列。通常将所得核苷酸序列克隆入载体，再转入基因工程菌中，然后通过常规的方法从增殖后的宿主细胞分离得到有关核苷酸序列。
此外，还可用公知的人工化学合成的方法来合成有关核苷酸序列。
在本发明中，所述自聚集短肽可以是本领域现有的自聚集短肽，包括但不限于口蹄疫病毒衣壳蛋白VP1（foot-and-mouth disease virus capsid protein VP1）、人β-淀粉样蛋白Aβ42（Human β-amyloid peptide Aβ42）、麦芽糖结合蛋白MalE（Maltose-bindingprotein）、麦芽糖结合蛋白突变体MalE31、纤维素结合域（Cellulose-binding domain，CBDclos）、类弹性蛋白多肽（Elastin-like polypeptide，ELP）、ELK16、L6KD和18A；优选地，所述自聚集短肽为ELK16（LELELKLKLELELKLK，记为SEQ ID NO.3）。
优选地，所述D-阿洛酮糖-3-差向异构酶活性聚集体中D-阿洛酮糖-3-差向异构酶和自聚集短肽中间还插入有连接肽。
所述连接肽可以是本领域现有的连接肽，优选地，所述连接肽选自PT-linker（PTPPTTPTPPTTPTPTP，记为SEQ ID NO.4）、(GGGGS)3、(Gly)6、(Gly)8和(EAAAK)n中的至少一种；其中，n＝1-3。
所述的连接肽与自聚集短肽的拼接顺序可以是连接肽-自聚集短肽或者自聚集短肽-连接肽，相应的自聚集短肽与D-阿洛酮糖-3-差向异构酶融合表达，自聚集短肽可位于D-阿洛酮糖-3-差向异构酶的C端或者N端。
在本发明中的一种优选的实施方式中，所述D-阿洛酮糖-3-差向异构酶活性聚集体由基因工程菌表达，其中，所述基因工程菌含有编码所述D-阿洛酮糖-3-差向异构酶的基因、编码自聚集短肽的基因和编码连接肽的基因。
在本发明中的一种优选的实施方式中，所述基因工程菌中，编码所述D-阿洛酮糖-3-差向异构酶的基因具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列；自聚集短肽为ELK16；连接肽为PT-linker。
优选地，所述基因工程菌为大肠杆菌或者枯草芽孢杆菌，更优选为枯草芽孢杆菌。
本领域技术人员可以根据本领域常规的技术手段制备所述基因工程菌，并进一步制备得到D-阿洛酮糖-3-差向异构酶活性聚集体。比如，一种D-阿洛酮糖-3-差向异构酶活性聚集体的制备方法，该方法包括：
（1）将连接肽的编码基因、自聚集短肽的编码基因和D-阿洛酮糖-3-差向异构酶的编码基因进行拼接，构建表达载体；
（2）将步骤（1）得到的表达载体转化到受体菌中，得到基因工程菌；
（3）对步骤（2）得到的基因工程菌进行诱导表达，得到D-阿洛酮糖-3-差向异构酶活性聚集体；
其中，连接肽的编码基因位于自聚集短肽的编码基因和D-阿洛酮糖-3-差向异构酶的编码基因之间。
在本发明中，可以在本领域已知的各种载体中完成拼接，构建表达载体，如市售的各种质粒、粘粒、噬菌体及反转录病毒等。所述载体优选为可在受体菌中过量表达的诱导型载体，其具有诱导目的蛋白在受体菌体内自聚集为活性聚集体的能力。
当所述受体菌为大肠杆菌时，载体优选为pET30a、pET28a、pET24a、pET21a、pET22b、pET32a、pET14a、pBAD和pCold I中的至少一种。
当所述受体菌为枯草芽孢杆菌时，载体优选为pMA5、pHY300PLK、pAXO1、pHTHisQ和pHTHisR中的至少一种。
表达载体构建可采用能够在载体多克隆位点具有切割位点的各种核酸内切酶进行酶切获得线性载体，与采用相同核酸内切酶切割的基因片段连接，获得表达载体。
连接肽的编码基因、自聚集短肽的编码基因和D-阿洛酮糖-3-差向异构酶的编码基因的拼接顺序可以不受特别的限制，优选地，先将连接肽的编码基因、自聚集短肽的编码基因拼接，然后与D-阿洛酮糖-3-差向异构酶的编码基因拼接。
可以通过本领域常规的方法将所述重组载体转化、转导或者转染到受体菌中，如热激法、氯化钙法和电转化法等。
所述受体菌可以为原核细胞或真核细胞，优选地，所述受体菌选自大肠杆菌和/或枯草芽孢杆菌。
当所述受体菌为大肠杆菌时，优选地，所述受体菌选自E.coliDH5α、E.coliBL21、E.coli BL21(DE3)、E.coli BL21(DE3)/plysS、E.coli Rosetta、E.coli Rosetta(DE3)、E.coli JM109、E.coli JM110和E.coli TOP10中的至少一种。
当所述受体菌为枯草芽孢杆菌时，优选地，所述受体菌为枯草芽孢杆菌BS1012、BS168、WB600N和WB800N中的至少一种。
其中，所述诱导表达的条件可以为常规的条件，例如，当所述宿主细胞为大肠杆菌时，所述诱导表达的条件可以为：使用LB液体培养基，在35-37℃、150-250 rpm下培养至OD600nm为0.4-0.8，之后加入异丙基-β-d-硫代半乳糖苷（IPTG）至终浓度为0.4-0.6 mmol/L，并在16-30℃的条件下进行诱导表达。
当所述宿主细胞为枯草芽孢杆菌时，所述诱导表达的条件可以为：使用LB液体培养基，在35-37℃、150-250rpm下培养至OD600nm为0.4-0.8，之后转入到KB培养基中，并在28-32℃、150-250rpm的条件下进行诱导表达。
可以采用本领域技术人员公知的方法进行获得D-阿洛酮糖-3-差向异构酶活性聚集体，例如，用缓冲液悬浮并超声破碎细胞，再经过纯化即可得到所述D-阿洛酮糖-3-差向异构酶活性聚集体。
细胞破碎方法包括但不限于超声破碎法、溶菌酶破碎法、高压匀浆破碎法、及其上述方法的组合，优选超声破碎法。
所述纯化的方法可以是本领域常规的方法，比如可以为离心和/或过滤的方式，得到的沉淀物即为D-阿洛酮糖-3-差向异构酶活性聚集体。
在本发明的一种优选的实施方式中，D-阿洛酮糖-3-差向异构酶活性聚集体的制备方法包括以下步骤：
将连接肽的编码基因与自聚集短肽的编码基因拼接，得到连接肽-自聚集短肽核苷酸片段；
将D-阿洛酮糖-3-差向异构酶基因与连接肽片段进行拼接，得到D-阿洛酮糖-3-差向异构酶-连接肽核苷酸片段；
用含有表达载体和酶切位点的D-阿洛酮糖-3-差向异构酶基因正向引物以及含有表达载体和酶切位点的自聚集肽反向引物，以D-阿洛酮糖-3-差向异构酶-连接肽片段和连接肽-自聚集短肽片段为模板，通过overlap PCR方式将D-阿洛酮糖-3-差向异构酶基因与连接肽-自聚集肽核苷酸片段进行拼接，得到D-阿洛酮糖-3-差向异构酶-连接肽-自聚集肽核苷酸片段；
通过同源重组方式将D-阿洛酮糖-3-差向异构酶-连接肽-自聚集肽核苷酸片段与表达载体进行拼接，并转化入受体菌，获得D-阿洛酮糖-3-差向异构酶-连接肽-自聚集肽表达载体；
将D-阿洛酮糖-3-差向异构酶-连接肽-自聚集肽表达载体转化至大肠杆菌表达菌株，获得能够表达D-阿洛酮糖-3-差向异构酶-自聚集肽融合蛋白的工程菌；
对上述工程菌进行诱导表达，对细胞进行破碎处理，离心和/或过滤获得沉淀，即为D-阿洛酮糖-3-差向异构酶活性聚集体。
在本发明中，所述葡萄糖异构酶的来源可以没有特别的限制，只要能够将葡萄糖转化为D-果糖即可。
所述葡萄糖异构酶的用量可以在较宽的范围内选择，优选地，所述D-阿洛酮糖-3-差向异构酶活性聚集体与葡萄糖异构酶的用量使得反应体系中D-阿洛酮糖-3-差向异构酶与葡萄糖异构酶的酶活力之比为0.5-2:1；优选为1-1.5:1。
在本发明中，D-阿洛酮糖-3-差向异构酶的酶活力是指1分钟内生成1微摩尔D-阿洛酮糖所需的酶量为一个D-阿洛酮糖-3-差向异构酶的活力单位（U）；葡萄糖异构酶的酶活力是指1分钟内生成1微摩尔果糖所需的酶量为一个葡萄糖异构酶的活力单位（U）。
所述葡萄糖异构酶的形式没有特别的限制，优选地，所述葡萄糖异构酶为固定化的葡萄糖异构酶或葡萄糖异构酶活性聚集体。
固定化的葡萄糖异构酶可以通过商购获得，比如购自诺维信的固定化的葡萄糖异构酶。
所述葡萄糖异构酶活性聚集体的制备方法可以参见上方D-阿洛酮糖-3-差向异构酶活性聚集体的制备方法。
优选地，所述葡萄糖以葡萄糖溶液的形式存在。
优选地，所述葡萄糖溶液的浓度为10-80重量%，优选为30-50重量%。
在本发明中，若是使用的酶是金属依赖型的酶，该方法优选还包括在金属离子的存在下进行转化。本领域技术人员可以根据具体的酶选择适合的金属离子。在本发明优选的一种实施方式中，所述金属离子为Co2+。
优选地，反应体系中，Co2+的浓度为0.01-0.5mM，更优选为0.05-0.2mM。
优选地，所述转化的条件包括：温度为40-60℃，优选为50-55℃；pH为7-8.5。
优选地，所述转化在反应釜或者柱体系中进行。本领域技术人员可以根据需要选择合适的反应釜和柱体系，在此不再赘述。
比如，当所述转化在反应釜中进行时，该方法包括：
（1）将D-阿洛酮糖-3-差向异构酶活性聚集体与葡萄糖异构酶固定化酶置于反应釜中，其中，所述D-阿洛酮糖-3-差向异构酶活性聚集体与葡萄糖异构酶的用量使得反应体系中D-阿洛酮糖-3-差向异构酶与葡萄糖异构酶的酶活力之比为0.5-2:1；
（2）根据反应体系的体积，向反应釜中加入终浓度为10-80重量%的葡萄糖和终浓度为0.01mM-0.5mM的氯化钴溶液，然后加水至反应体积，搅拌至葡萄糖完全溶解后，在40-60℃下反应1-24h，然后过滤得到含有D-阿洛酮糖、果糖、葡萄糖的混合液。
比如，当所述转化在柱体系中进行时，该方法包括：
（1）将D-阿洛酮糖-3-差向异构酶活性聚集体与葡萄糖异构酶固定化酶混合均匀后装入柱中，其中，所述D-阿洛酮糖-3-差向异构酶活性聚集体与葡萄糖异构酶的用量使得反应体系中D-阿洛酮糖-3-差向异构酶与葡萄糖异构酶的酶活力之比为0.5-2:1；
（2）配制浓度为10-80重量%的葡萄糖溶液，并加入氯化钴，使得Co2+的终浓度为0.01-0.5mM，混合均匀后缓慢通过步骤（1）中填充好的柱子，在40℃-60℃下进行反应，得到含有D-阿洛酮糖、果糖、葡萄糖的混合液。
优选地，该方法还包括对转化后的产物进行分离、浓缩以及结晶或干燥，得到D-阿洛酮糖产品。
所述分离比如可以在模拟移动床中分离，其他操作（包括浓缩以及结晶或干燥）也可以按照本领域常规的方式进行，在此不再赘述。
以下将通过实施例对本发明进行详细描述。
所采用的D-阿洛酮糖-3-差向异构酶的基因和蛋白序列分别见SEQ ID NO.1和SEQID NO.2。
所采用的葡萄糖异构酶固定化酶购自诺维信（中国）生物技术有限公司。
葡萄糖、果糖、D-阿洛酮糖的HPLC检测方法和条件：色谱柱：Waters Sugar-PakTMI，6.5*300mm Column，流动性：纯水，RID检测器：55℃，柱温箱温度：80℃，进样量：20μL，流速：0.4mL/min，检测时间30min。
葡萄糖转化率定义：葡萄糖减少量/葡萄糖初始量。
实施例中所述模拟移动床、色谱分离、浓缩、结晶或干燥均为本领域的常规技术手段。
基因工程菌的构建方法参见202110987156.3。
下述实施例中有未注明具体条件的实验方法，则是按照常规的分子克隆手册所述的条件进行操作。
制备例1
本制备例用于说明基因工程菌为大肠杆菌时D-阿洛酮糖-3-差向异构酶活性聚集体的制备。
将含有D-阿洛酮糖-3-差向异构酶活性聚集体的重组大肠杆菌接种在含有50μg/mL卡那霉素抗性的LB液体培养基中，培养至OD600nm达到0.4-0.6，加入终浓度为0.5mM IPTG，在25℃、200rpm条件下诱导18小时。离心收集菌体，用pH=8.0的Tris-HCl（50mM）缓冲液重悬，采用高压均质或超声破碎法进行菌体破碎，破碎后10000rpm离心10min，所得样品即为D-阿洛酮糖-3-差向异构酶活性聚集体。
制备例2
本制备例用于说明基因工程菌为枯草芽孢杆菌时D-阿洛酮糖-3-差向异构酶活性聚集体的制备。
将含有D-阿洛酮糖-3-差向异构酶活性聚集体的重组枯草芽孢杆菌用LB培养基在37℃下过夜活化，然后按1：100比例将活化菌液转化至新鲜的LB培养基中，37℃培养，待OD600nm达到0.5，将菌液转接至KB培养基中，30℃发酵24h，收集菌体，用pH=8.0的Tris-HCl（50mM）缓冲液重悬，采用高压均质或超声破碎法进行菌体破碎，破碎后10000rpm离心10min，所得样品即为D-阿洛酮糖-3-差向异构酶活性聚集体。
实施例1
本实施例用于说明在反应釜中将葡萄糖转化生产D-阿洛酮糖的方法。
（1）将制备例1制备的D-阿洛酮糖-3-差向异构酶活性聚集体与葡萄糖异构酶固定化酶（购自诺维信）按照D-阿洛酮糖-3-差向异构酶与葡萄糖异构酶的酶活力之比为1.3:1的比例称取，加于1L反应釜中；
（2）称取500g葡萄糖，加于反应釜中；
（3）称取2.379g六水氯化钴，加入反应釜中，然后向反应釜中加入水至1L，搅拌至葡萄糖完全溶解后，在50℃进行反应24h，期间每隔1h取样，HPLC检测D-阿洛酮糖、果糖、葡萄糖的浓度，至浓度不再变化停止反应，过滤反应液，得到含有D-阿洛酮糖、果糖、葡萄糖的混合液；
（4）收集步骤（3）制得的混合液，经模拟移动床分离得到D-阿洛酮糖溶液和果糖、葡萄糖的混合液；反应3h后，HPLC法检测混合液中的各组分含量，如图1所示，从左至右依次是葡萄糖（11.876min）、果糖（14.491min）和D-阿洛酮糖（20.868min）。
（5）将步骤（4）制得的D-阿洛酮糖溶液经浓缩、结晶或干燥，制得D-阿洛酮糖。
经检测，D-阿洛酮糖的生成量为60.39g/L，D-阿洛酮糖比例为16.78%，葡萄糖转化为D-阿洛酮糖的转化率为15.66%。
将步骤（3）中分离出来的D-阿洛酮糖-3-差向异构酶活性聚集体与葡萄糖异构酶固定化酶再次进行葡萄糖转化生产D-阿洛酮糖，经检测，葡萄糖转化为D-阿洛酮糖的转化率为9.96%。
在使用D-阿洛酮糖-3-差向异构酶（SEQ ID NO.1所示基因编码的由大肠杆菌表达的酶）和葡萄糖异构酶固定化酶按照同样方法进行D-阿洛酮糖生产时，其转化率相差不大，但是分离工序更复杂，需要依次进行固液分离、糖液和酶液的分离以及D-阿洛酮糖的分离；且酶液（D-阿洛酮糖-3-差向异构酶）无法回用，成本更高。
实施例2
本实施例用于说明在柱体系中将葡萄糖转化生产D-阿洛酮糖的方法。
（1）将制备例1制备的D-阿洛酮糖-3-差向异构酶活性聚集体与葡萄糖异构酶固定化酶（购自诺维信）按照D-阿洛酮糖-3-差向异构酶与葡萄糖异构酶的酶活力之比为1.3:1的比例称取，混合均匀后装入100mL柱中；
（2）配制浓度为50重量%的葡萄糖，加入0.238g六水氯化钴，溶解并混合均匀后缓慢通过步骤（1）中填充好的柱子，在50℃下进行循环反应，期间每隔1h取样，HPLC检测D-阿洛酮糖、果糖、葡萄糖的浓度，至浓度不再变化停止循环反应，得到含有D-阿洛酮糖、果糖、葡萄糖的混合液；
（3）收集步骤（2）制得的混合液，经模拟移动床分离得到D-阿洛酮糖溶液和果糖、葡萄糖的混合液；
（4）将步骤（3）制得的D-阿洛酮糖溶液经浓缩、结晶或干燥，制得D-阿洛酮糖。
经检测，反应6h后，D-阿洛酮糖的生成量为63.12g/L，D-阿洛酮糖比例为16.94%，葡萄糖转化为D-阿洛酮糖的转化率为16.36%。
实施例3
本实施例用于说明在反应釜中将葡萄糖转化生产D-阿洛酮糖的方法。
按照实施例1所述的方法进行操作，不同的是，D-阿洛酮糖-3-差向异构酶活性聚集体为制备例2制备得到的。
经检测，D-阿洛酮糖的生成量为61.47g/L，D-阿洛酮糖比例为16.80%，葡萄糖转化为D-阿洛酮糖的转化率为15.89%。
以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于此。在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，包括各个技术特征以任何其它的合适方式进行组合，这些简单变型和组合同样应当视为本发明所公开的内容，均属于本发明的保护范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 中粮营养健康研究院有限公司
吉林中粮生化有限公司
<120> 由葡萄糖生产D-阿洛酮糖的方法
<130> 71388
<160> 4
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 879
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> The sequence is artifically synthesized.
<400> 1
ttaacgctgc atcttttttc tcaacatcat tgcagcatct gcaagaagtt gttccatttc 60
actttcagaa gctccttcac taatatcgcg ccatactttt atatcacgtc ctacttctcc 120
acccatttta ataaatggtt ccataactat tgccccttga taatcgattt cttttaatgc 180
gtttgtaatt tcattccacg gcattttccc attttcacat ggtggtcttc tattactctc 240
tcccacatga aaatgaccaa ggcgattacc aactaattta attgctcctg caaaactgtc 300
ctcctcaata ttcatatgat atgtgtccag aagaatcttg cagttcggac ttccaacttc 360
atctacatac tttactgctt cttctgctgt attaacaaga gatgactcat aacgatttac 420
aacttcaact gcaaaagtaa ttcccttatc ttctgcaact ttcataatct ctttcactgc 480
tgaaatactt ctctcccagg tagcactttt atctgtaata ccttccataa atgtcttatt 540
ccacgctgca atatccactc ccgaataagt ttttccgccc atttcagaca taatttggaa 600
agtatccgtt gtaaatttaa ttccattttt tcgaatctct tcatcttctg atgctaaatc 660
ttgattcgca gataaaccaa ctgaaaaagt caattcaata tcattcgcct ttgcggcagc 720
tgcaatctca tctctctgaa attttgtcag tgcaagaaga ggggccggag ctacctctag 780
aatatctaat cctattttct ttacctgctc aatccgtttg ataaaatccg tattccaatc 840
tctgttgaaa tatccaaagt gaactcctat cttgttcaa 879
<210> 2
<211> 292
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> The sequence is artifically synthesized.
<400> 2
Met Asn Lys Ile Gly Val His Phe Gly Tyr Phe Asn Arg Asp Trp Asn
1 5 10 15
Thr Asp Phe Ile Lys Arg Ile Glu Gln Val Lys Lys Ile Gly Leu Asp
20 25 30
Ile Leu Glu Val Ala Pro Ala Pro Leu Leu Ala Leu Thr Lys Phe Gln
35 40 45
Arg Asp Glu Ile Ala Ala Ala Ala Lys Ala Asn Asp Ile Glu Leu Thr
50 55 60
Phe Ser Val Gly Leu Ser Ala Asn Gln Asp Leu Ala Ser Glu Asp Glu
65 70 75 80
Glu Ile Arg Lys Asn Gly Ile Lys Phe Thr Thr Asp Thr Phe Gln Ile
85 90 95
Met Ser Glu Met Gly Gly Lys Thr Tyr Ser Gly Val Asp Ile Ala Ala
100 105 110
Trp Asn Lys Thr Phe Met Glu Gly Ile Thr Asp Lys Ser Ala Thr Trp
115 120 125
Glu Arg Ser Ile Ser Ala Val Lys Glu Ile Met Lys Val Ala Glu Asp
130 135 140
Lys Gly Ile Thr Phe Ala Val Glu Val Val Asn Arg Tyr Glu Ser Ser
145 150 155 160
Leu Val Asn Thr Ala Glu Glu Ala Val Lys Tyr Val Asp Glu Val Gly
165 170 175
Ser Pro Asn Cys Lys Ile Leu Leu Asp Thr Tyr His Met Asn Ile Glu
180 185 190
Glu Asp Ser Phe Ala Gly Ala Ile Lys Leu Val Gly Asn Arg Leu Gly
195 200 205
His Phe His Val Gly Glu Ser Asn Arg Arg Pro Pro Cys Glu Asn Gly
210 215 220
Lys Met Pro Trp Asn Glu Ile Thr Asn Ala Leu Lys Glu Ile Asp Tyr
225 230 235 240
Gln Gly Ala Ile Val Met Glu Pro Phe Ile Lys Met Gly Gly Glu Val
245 250 255
Gly Arg Asp Ile Lys Val Trp Arg Asp Ile Ser Glu Gly Ala Ser Glu
260 265 270
Ser Glu Met Glu Gln Leu Leu Ala Asp Ala Ala Met Met Leu Arg Lys
275 280 285
Lys Met Gln Arg
290
<210> 3
<211> 16
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> The sequence is artifically synthesized.
<400> 3
Leu Glu Leu Glu Leu Lys Leu Lys Leu Glu Leu Glu Leu Lys Leu Lys
1 5 10 15
<210> 4
<211> 17
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> The sequence is artifically synthesized.
<400> 4
Pro Thr Pro Pro Thr Thr Pro Thr Pro Pro Thr Thr Pro Thr Pro Thr
1 5 10 15
Pro

Claims (6)

1.一种由葡萄糖生产D-阿洛酮糖的方法，其特征在于，该方法包括在D-阿洛酮糖-3-差向异构酶活性聚集体和葡萄糖异构酶的存在下，将葡萄糖转化为D-阿洛酮糖；
其中，所述D-阿洛酮糖-3-差向异构酶活性聚集体由基因工程菌表达，其中，所述基因工程菌含有编码所述D-阿洛酮糖-3-差向异构酶的基因、编码自聚集短肽的基因和编码连接肽的基因；
所述基因工程菌中，编码所述D-阿洛酮糖-3-差向异构酶的基因的核苷酸序列为SEQID NO.1所示的核苷酸序列；自聚集短肽为ELK16；连接肽为PT-linker。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述D-阿洛酮糖-3-差向异构酶活性聚集体与葡萄糖异构酶的用量使得反应体系中D-阿洛酮糖-3-差向异构酶与葡萄糖异构酶的酶活力之比为0.5-2:1。
3.根据权利要求1所述的方法，其中，所述葡萄糖以葡萄糖溶液的形式存在，所述葡萄糖溶液的浓度为10-80重量%。
4.根据权利要求1所述的方法，其中，该方法还包括在金属离子的存在下进行转化，所述金属离子为Co2+；
其中，反应体系中，Co2+的浓度为0.01-0.5mM。
5.根据权利要求1所述的方法，其中，所述转化的条件包括：温度为40-60℃，pH为7-8.5。
6.根据权利要求1-5中任意一项所述的方法，其中，该方法还包括对转化后的产物进行分离、浓缩以及结晶或干燥，得到D-阿洛酮糖产品。
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