CN109913438A - 一种制备固定化的d-阿洛酮糖-3-差向异构酶的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种制备固定化的D‑阿洛酮糖‑3‑差向异构酶的方法。该方法利用钴盐作为载体以共沉降法自组装制备得到固定化的D‑阿洛酮糖‑3‑差向异构酶。本发明的固定化DPEase制备方法具有操作简单、固定化效率高、固定化后的酶不易脱落以及可重复使用等特点。本发明还涉及由上述方法制备的固定化DPEase以及利用该固定化DPEase制备D‑阿洛酮糖的方法。通过本发明的方法制备的固定化DPEase较游离酶的酶活有显著提高，可用于包括制备D‑阿洛酮糖在内的食品加工行业，具有很大的工业应用前景。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及制备固定化的D-阿洛酮糖-3-差向异构酶的方法以及所制备的固定化DPEase及其应用。
背景技术
稀少糖是指在自然界存在但含量极少的一类单糖及其衍生物，所述稀少糖包括D-阿洛酮糖。D-阿洛酮糖由于其甜度为蔗糖的70％，而热量值只有蔗糖的1％；并且可以用于修饰药物或活性物质，从而优化所述药物或活性物质的功能，在食品和医疗领域有很大的潜在价值。
D-阿洛酮糖在自然界中主要存在于小麦、鼠刺植物、加工过的甘蔗和甜菜糖蜜中，其不能被人消化，是一种低能量且降血糖的食糖替代品。
D-阿洛酮糖是D-果糖的差向异构体，D-果糖在加热条件下可以生成少量的D-阿洛酮糖，为了提高产率，目前常用的方法为生物转化法。
生物转化法中，一种方法是采用氧化还原酶将蒜糖醇氧化为D-阿洛酮糖，但由于其底物蒜糖醇价格昂贵，不具有广泛应用潜力。
另一种是采用异构酶，例如D-阿洛酮糖-3-差向异构酶(D-psicose3-epimerase，缩写为DPEase)将D-果糖异构化为D-阿洛酮糖，此反应成本低，原料来源广，且转化过程中无任何副产物，非常适合工业化生产D-阿洛酮糖。通常，可利用载体来对D-阿洛酮糖-3-差向异构酶进行固定化，以通过为酶提供稳定的环境，来提高酶的活性。例如，中国专利文献CN102869783A公开了一种阿洛酮糖-差向异构酶的固定化以及使用所述阿洛酮糖-差向异构酶制备D-阿洛酮糖的方法，该方法使用海藻酸钠作为载体来进行阿洛酮糖-差向异构酶的固定化，以对酶进行促活化。然而，使用海藻酸钠作为载体对D-阿洛酮糖-3-差向异构酶进行固定化的缺点在于，海藻酸钠强度低、易碎，不适合工业化应用过程。
中国专利文献CN105849260A报道了一种编码阿洛酮糖差向异构酶的多核苷酸和使用其生产阿洛酮糖的方法，并公开了金属离子(例如钴离子)的存在能够促进阿洛酮糖的产量提高。虽然经研究，D-阿洛酮糖-3-差向异构酶在适量添加钴离子后，酶的活力可以提升到1.6倍，但对将含有钴离子的钴盐作为载体用于D-阿洛酮糖-3-差向异构酶的固定化及其相关方法，尚缺乏深入研究。
发明内容
因此，本发明的目的是提供简单有效的制备固定化的D-阿洛酮糖-3-差向异构酶(也称为“固定化DPEase”)的方法、所制备的固定化的D-阿洛酮糖-3-差向异构酶及其应用，从而解决了现有技术中存在的上述问题。
本发明人研究发现，通过利用钴盐与磷酸缓冲液中的磷酸盐形成的骨架(即磷酸钴)作为载体制备的固定化的D-阿洛酮糖-3-差向异构酶，既能提高酶的重复使用性和稳定性，又能大幅度提高酶的活性。因此，本发明提供了一种利用金属钴离子通过共沉淀法制备固定化的D-阿洛酮糖-3-差向异构酶的方法，与游离DPEase和通过使用海藻酸钠作为载体得到的固定化DPEase相比，通过本发明的方法制得的固定化的D-阿洛酮糖-3-差向异构酶的稳定性和酶活更高，应用性更好，适合工业生产用。
本发明的第一方面在于提供一种制备固定化的D-阿洛酮糖-3-差向异构酶的方法，所述方法包括：
(1)将D-阿洛酮糖-3-差向异构酶溶于磷酸缓冲液中，制备得到含D-阿洛酮糖-3-差向异构酶的溶液；
(2)将步骤(1)制备的所述溶液缓慢滴加到钴盐缓冲液中，静置、离心得到沉淀；以及
(3)将所述沉淀用去离子水冲洗并干燥，得到固定化的D-阿洛酮糖-3-差向异构酶。
本发明的第二方面在于提供一种由本发明的第一方面所述的方法制备的固定化的D-阿洛酮糖-3-差向异构酶。
本发明的第三方面在于提供一种利用本发明第二方面所述的固定化的D-阿洛酮糖-3-差向异构酶制备D-阿洛酮糖的方法，其中，所述方法包括：
(1)将D-果糖、CoCl2和所述固定化的D-阿洛酮糖-3-差向异构酶加入缓冲液中，得到反应混合物；以及
(2)使所述反应混合物在30～70℃、优选55℃下反应5～30min、优选10～20min，然后终止反应，获得D-阿洛酮糖。
本发明的技术方案至少实现了以下优点或益处，但其它优点和益处也在本发明涵盖的范围内：
①本发明的固定化的D-阿洛酮糖-3-差向异构酶(固定化DPEase)的制备利用磷酸钴作为载体，采用简单的沉淀法，得到的固定化的磷酸钴-D-阿洛酮糖-3-差向异构酶；与其它的固定化技术相比，本发明的方法简便易操作、固定化效率高、固定化后的酶不易从载体上脱落且可重复使用；
②本发明的酶固定化方法利用价格低廉磷酸缓冲液和钴盐，使得固定化成本大大降低，能够满足工业化生产的应用；
③由于钴离子能够激活D-阿洛酮糖-3-差向异构酶，使固定化DPEase较游离DPEase酶活有显著提高，具体地，本发明的酶固定化方法制备的固定化的D-阿洛酮糖-3-差向异构酶可以用于催化D-果糖异构反应，用于制备D-阿洛酮糖，本发明的固定化DPEase的比活(36±0.5U/mg)是游离DPEase(5±0.2U/mg)的7.2倍；
④本发明的固定化DPEase的半衰期(2h)约是游离DPEase(20min)的6倍；
⑤本发明的固定化DPEase在重复使用6次后，能够保留约90％的初始酶活。
附图说明
图1为示例性的钴离子固定化的D-阿洛酮糖-3-差向异构酶的纳米颗粒的形态及大小的示意图：其中，图1A、图1B和图1C为使用扫描电镜观测的，不同放大倍数下的本发明的固定化DPEase纳米颗粒扫描电镜图片；图1D为本发明的固定化DPEase纳米颗粒的EDAX能谱分析。
图2为示例性的使用液相色谱检测的D-果糖和D-阿洛酮糖的保留时间的HPLC图，其中，D-果糖的保留时间约为15.017min；D-阿洛酮糖的保留时间约为21.995min。
图3为示出在不同的pH条件下，本发明的固定化DPEase纳米颗粒与游离DPEase的相对活性的图表。
图4为示出在不同的pH条件下，本发明的固定化DPEase纳米颗粒与游离DPEase的稳定性(残余活性)的图表。
图5为示出在不同的温度条件下，本发明的固定化DPEase纳米颗粒与游离DPEase的相对活性的图表。
图6为示出本发明的固定化DPEase纳米颗粒与游离DPEase的相对活性随时间变化的图表。
图7为示出在经过1～6次反应循环后，本发明的固定化DPEase的相对活性的图表。
具体实施方式
为更好地理解本发明，下面结合实施方式对本发明进行进一步阐述，但这些实施方式不应理解为对本发明的任何限制。
在本发明中，所述“D-阿洛酮糖-3-差向异构酶”是指具有使D-果糖转化为D-阿洛酮糖的转化活性的酶。
在本发明中，所述“固定化DPEase纳米花”是指在电子显微镜下观察呈花朵型的固定化DPEase纳米颗粒。其中，所述“固定化DPEase纳米花”、“固定化DPEase纳米颗粒”和“纳米花固定化DPEase”可互换使用。
在本发明中，所述“固定化的D-阿洛酮糖-3-差向异构酶”和所述“固定化DPEase”可互换使用。
在本发明中，除非另有说明，所述室温是指环境温度为20～30℃。
在一个实施方式中，本发明涉及一种制备固定化的D-阿洛酮糖-3-差向异构酶的方法，所述方法包括：
(1)将D-阿洛酮糖-3-差向异构酶溶于磷酸缓冲液中，制备得到含D-阿洛酮糖-3-差向异构酶的溶液；
(2)将步骤(1)制备的所述溶液缓慢滴加到钴盐缓冲液中，静置、离心得到沉淀；以及
(3)将所述沉淀用去离子水冲洗并干燥，得到固定化的D-阿洛酮糖-3-差向异构酶。
在优选的实施方式中，在所述步骤(1)中，所述D-阿洛酮糖-3-差向异构酶可来源于能够表达D-阿洛酮糖-3-差向异构酶的天然菌株或基因工程菌株。例如，D-阿洛酮糖-3-差向异构酶可来源于瘤胃菌(Ruminococcus sp.)、菊苣假单胞杆菌ST-24(Pseudomonascichorii)、枯草芽孢杆菌(B.subtilis)、梭状芽孢杆菌(Clostridiumbolteae)，或它们的基因工程菌株，或大肠杆菌、毕赤酵母、酿酒酵母等细菌或者真菌基因工程重组菌株。
在本发明中，在所述步骤(1)中，所述D-阿洛酮糖-3-差向异构酶是指D-阿洛酮糖-3-差向异构酶含量在0.05wt％以上、优选0.1wt％以上、更优选0.2wt％以上、进一步优选2wt％以上的D-阿洛酮糖-3-差向异构酶制剂。在本发明中，对所述D-阿洛酮糖-3-差向异构酶制剂的性状不作特别地限定，只要其能够提供D-阿洛酮糖-3-差向异构酶即可，仅作为示例，所述D-阿洛酮糖-3-差向异构酶制剂可以为冻干粉末状，其中的D-阿洛酮糖-3-差向异构酶含量为2wt％。
在优选的实施方式中，在所述步骤(1)中，所述磷酸缓冲液的pH值为7.2～7.4。在本发明中，对所述磷酸缓冲液的成分不作特别地限定，只要其pH值在上述范围内即可。
在优选的实施方式中，在所述步骤(1)中，所述磷酸缓冲液包含氯化钠、氯化钾、磷酸氢二钠、磷酸二氢钾。
在进一步优选的实施方式中，在所述步骤(1)中，在所述磷酸缓冲液中，所述氯化钠的浓度为0.06～0.2mmol/mL、氯化钾的浓度为0.002～0.02mmol/mL、磷酸氢二钠的浓度为0.001～0.005mmol/mL、磷酸二氢钾的浓度为0.0007～0.002mmol/mL。
在优选的实施方式中，在所述步骤(1)中，对于20mg的D-阿洛酮糖-3-差向异构酶，使用100～1000mL、优选100～500mL的磷酸缓冲液进行溶解。可使用不会使酶失活的方式来促进D-阿洛酮糖-3-差向异构酶的溶解，包括但不限于搅拌等。
在优选的实施方式中，在所述步骤(2)中，所述钴盐可以为选自以下中的一种或多种的含水或无水钴盐：硫酸钴、氯化钴、硝酸钴、和/或乙酸钴，优选地所述钴盐为七水合硫酸钴。
在优选的实施方式中，在所述步骤(2)中，所述钴盐缓冲液为钴离子浓度为0.4～2mM、优选0.1～0.5mM的磷酸盐缓冲液。
在优选的实施方式中，在所述步骤(2)中，所述静置在20℃～30℃下进行24～72h、优选24～48h。
在优选的实施方式中，在所述步骤(2)中，所述离心以3000～8000rpm、优选3000～5000rpm，进行0.5～5min、优选1～5min。
在优选的实施方式中，在所述步骤(3)中，将所述沉淀用去离子水冲洗3～5次。通过用去离子水反复冲洗能够去掉沉淀上残留的金属离子和未固定化的酶。
在优选的实施方式中，在所述步骤(3)中，所述干燥在20～30℃的温度下进行24～48h。
在所述步骤(3)中，所述固定化的D-阿洛酮糖-3-差向异构酶为纳米颗粒。在优选的实施方式中，所述固定化的D-阿洛酮糖-3-差向异构酶为粒径为3.0～10.0μm、优选3.0～5.0μm的纳米颗粒。进一步优选地，所述固定化的D-阿洛酮糖-3-差向异构酶中D-阿洛酮糖-3-差向异构酶的含量为8～12wt％、优选10～12wt％、进一步优选10～11.7wt％。
在另一个实施方式中，本发明涉及一种由本发明上述方法制备的固定化的D-阿洛酮糖-3-差向异构酶。在本发明中，所述“固定化的D-阿洛酮糖-3-差向异构酶”是指在磷酸缓冲溶液和钴盐的存在下，将D-阿洛酮糖-3-差向异构酶固定在作为载体的磷酸钴骨架上得到的酶产品，即磷酸钴-D-阿洛酮糖-3-差向异构酶。
在又一个实施方式中，本发明涉及一种利用本发明所述的固定化的D-阿洛酮糖-3-差向异构酶制备D-阿洛酮糖的方法，其中，所述方法包括：
(1)将D-果糖、CoCl2和所述固定化的D-阿洛酮糖-3-差向异构酶加入Tris-HCl缓冲液中，得到反应混合物；以及
(2)使所述反应混合物在30～70℃、优选50～70℃、进一步优选55～60℃下反应5～30min、优选10min，然后终止反应，获得D-阿洛酮糖。
在优选的实施方式中，在所述步骤(1)中，所述缓冲液的浓度为20～100mM(例如20～50mM)、pH为7.0～9.5、优选7.5～8.5、进一步优选8.0～8.5。
在优选的实施方式中，在所述步骤(1)中，所述反应混合物中D-果糖的浓度为10～50mg/mL、优选20～50mg/mL；CoCl2的浓度为0.05～0.20mM、优选0.10～0.12mM。
在优选的实施方式中，在所述步骤(1)中，相对于10～50mg的D-果糖，加入0.01～0.25mg、优选0.17～0.25mg、进一步优选0.17～0.2mg的所述固定化的D-阿洛酮糖-3-差向异构酶。
在优选的实施方式中，在所述步骤(1)中，所述D-果糖和CoCl2分别处于D-果糖水溶液和CoCl2水溶液的形式，优选地，所述D-果糖水溶液的浓度为100～500mg/mL、优选200～500mg/mL，所述CoCl2水溶液的浓度为5～20mM、优选10～12mM。
在进一步优选的实施方式中，在所述步骤(1)中，所述CoCl2水溶液、D-果糖水溶液和所述缓冲液的体积比为1:(5～20):(80～100)(例如，1:10:89)，优选地，所述反应混合物的体积为1mL。
在优选的实施方式中，在所述步骤(2)中，所述反应在水浴中进行。
在优选的实施方式中，在所述步骤(2)中，通过将所述反应混合物置于沸水中5～10min、例如10min终止反应。
实施例
下面通过具体实施例对本发明进行说明，但本发明并不局限于此。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法；下述实施例中所用的试剂、材料等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
D-阿洛酮糖-3-差向异构酶的制备
下述实施例和对比例中所使用的D-阿洛酮糖-3-差向异构酶根据J.Agric.FoodChem.2011，59，7785-7792中公开的方法制备。在下述实施例1-实施例3中，所述D-阿洛酮糖-3-差向异构酶为D-阿洛酮糖-3-差向异构酶含量在2wt％的冻干粉末状的D-阿洛酮糖-3-差向异构酶制剂。
实施例1
磷酸缓冲液的制备：按100mL液体来计，称取0.8g氯化钠、0.02g氯化钾、0.144g十二水合磷酸氢二钠、0.024g磷酸二氢钾，加水定容至100mL，制备得到磷酸缓冲液，所述磷酸缓冲液的pH为7.4。
硫酸钴缓冲液的制备：称取0.007g七水合硫酸钴，加入到50mL上述磷酸缓冲液中，制备得到硫酸钴缓冲液。
固定化的D-阿洛酮糖-3-差向异构酶(固定化DPEase)的制备
(1)称取0.1g的D-阿洛酮糖-3-差向异构酶冻干粉制剂(有效酶量为2mg)，加入到50mL上述磷酸缓冲液中溶解，制备得到含D-阿洛酮糖-3-差向异构酶的溶液；
(2)将步骤(1)制备的所述溶液缓慢滴加到上述硫酸钴缓冲液中，所得混合体系在25℃下静置48h后，以5000rpm离心1min，得到沉淀；以及
(3)将步骤(2)所得沉淀用去离子水冲洗5次去掉残留的金属离子和游离酶，25℃下干燥24h，所得粉末即为固定化的D-阿洛酮糖-3-差向异构酶纳米颗粒(含有10wt％的DPEase)，该纳米颗粒的粒径为3.0μm。
固定化DPEase的活性验证
配置Tris-HCl缓冲液，其中按100mL液体来计：称取Tris 0.6g，加入盐酸调节pH至8.0，加水定容至100mL，配置得到50mM的Tris-HCl缓冲液。
(1)1mL反应体系：称取50mg D-果糖溶于100μL水中，得到D-果糖水溶液；秤取CoCl2 12μg溶于10μL水中，得到CoCl2水溶液；将D-果糖水溶液、CoCl2水溶液和0.2mg固定化的D-阿洛酮糖-3-差向异构酶纳米颗粒(有效酶量为20μg)依次加入890μL Tris-HCl缓冲液中，得到1mL反应混合物(即1mL反应体系)；以及
(2)将反应混合物置于55℃下的水浴中反应10min，然后置于沸水中10min终止反应，获得产物D-阿洛酮糖。
使用液相色谱检测产物，其中色谱柱：Waters Sugar-Pak I Column,10μm,6.5mm×300mm；检测器：RID检测器；柱温：80℃；检测器温度：55℃。D-果糖和D-阿洛酮糖的保留时间如图2所示，其中，D-果糖的保留时间约为15.017min；D-阿洛酮糖的保留时间约为21.995min。
实施例2
磷酸缓冲液的制备：称取0.32g氯化钠、0.008g氯化钾、0.0567g十二水合磷酸氢二钠、0.0096g磷酸二氢钾，加水定容至100mL，制备得到磷酸缓冲液，所述磷酸缓冲液pH为7.2。
固定化DPEase的制备
除了制备固定化DPEase的步骤(1)中所使用的磷酸缓冲液的pH为7.2之外，使用与实施例1相同的方法，制备得到固定化的D-阿洛酮糖-3-差向异构酶纳米颗粒(含有8wt％的DPEase)，该纳米颗粒的粒径为3.0μm。
固定化DPEase的活性验证
除了步骤(1)中加入0.25mg固定化的D-阿洛酮糖-3-差向异构酶纳米颗粒之外，使用与实施例1相同的方法，制备得到产物D-阿洛酮糖。使用与实施例1相同的方法对产物进行检测。
实施例3
固定化DPEase的制备
除了制备固定化DPEase的步骤(3)中将所得沉淀用去离子水冲洗3次之外，使用与实施例1相同的方法，制备得到固定化的D-阿洛酮糖-3-差向异构酶纳米颗粒(含有11.7wt％的DPEase)，该纳米颗粒的粒径为3.0μm。
固定化DPEase的活性验证
除了步骤(1)中加入0.17mg固定化的D-阿洛酮糖-3-差向异构酶纳米颗粒之外，使用与实施例1相同的方法，制备得到产物D-阿洛酮糖。使用与实施例1相同的方法对产物进行检测。
对比例1：本发明的固定化DPEase与现有的游离DPEase的酶学性质的对比
本对比例对本发明实施例3制备的固定化DPEase与现有的游离DPEase(即未进行固定的游离的D-阿洛酮糖-3-差向异构酶)的酶学性质进行了对比，所述酶学性质包括酶活、最适pH值、pH稳定性、热稳定性等。
酶活的对比
酶活的测定方法：
(1)1mL反应体系：将100μL浓度为500mg/mL的D-果糖水溶液、10μL浓度为10mM的CoCl2水溶液、0.17mg的固定化DPEase或有效酶量为20μg的游离DPEase依次加入890μLTris-HCl缓冲液(pH为8.0)中，得到1mL反应混合物；以及
(2)将反应混合物置于55℃下的水浴中反应20min，然后置于沸水中10min终止反应，通过HPLC检测产物阿洛酮糖的生成量。
定义60℃条件下每分钟生成1.0μmol D-阿洛酮糖所需的D-阿洛酮糖-3-差向异构酶的量为1U，游离DPEase和本发明的固定化DPEase(纳米花)的酶活如下表1所示：
表1游离DPEase(游离酶)和本发明的固定化DPEase(纳米花)的酶活
最适pH的对比
最适pH测定：在pH为5.5-10.0的范围内，具体地在pH为6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0和9.5下，对本发明的固定化DPEase与游离DPEase的最适pH进行了测定。
配制50mM磷酸二氢钠-氢氧化钠缓冲液，pH范围分别调节至6.0、6.5、7.0；配制50mM Tris-HCl缓冲液，pH范围分别调节至7.5、8.0、8.5、9.0和9.5。除了缓冲液pH不同之外，使用与酶活的对比中相同的活性反应体系和检测方法来检测酶活。游离DPEase在pH8.0条件下酶活为5.0U，纳米花固定化DPEase在pH 8.5条件下酶活为36.2U，将这两个条件下的酶活分别作为100％酶活，进行不同pH条件下的活性比较。结果如图3所示，游离DPEase的最适pH为8.0，固定化DPEase的最适pH为8.5，并且在pH7.5到9.5范围内，活性可以保持90％以上。
pH稳定性的对比
pH稳定性测定：在pH为5.5-10.0的范围内，具体地在pH为6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0和9.5下，对本发明的固定化DPEase与游离DPEase的pH稳定性进行了测定。
配制50mM磷酸二氢钠-氢氧化钠缓冲液，pH范围分别调节至6.0、6.5、7.0；配制50mM Tris-HCl缓冲液，pH范围分别调节至7.5、8.0、8.5、9.0和9.5。将游离DPEase和固定化DPEase分别在不同pH的缓冲液中孵育2h，测定孵育前后的酶活变化。除了所使用的酶分别为孵育前后的游离DPEase和固定化DPEase、且缓冲液pH不同之外，使用与酶活的对比中相同的活性反应体系和检测方法检测酶活。孵育前游离DPEase在pH 8.0条件下酶活为5.0U，纳米花固定化DPEase在pH 8.5条件下酶活为36.2U，将这两个条件下的酶活分别作为100％酶活，进行不同pH条件下，孵育前后的酶活比较。结果如图4所示，纳米花固定化DPEase比游离DPEase的pH稳定性强，在pH7.5到9.5范围内，固定化DPEase活性可以保持90％以上。
最适温度的对比
最适温度测定：在45℃-70℃的范围内，具体地在45℃、50℃、55℃、60℃、65℃和70℃下，对本发明的固定化DPEase与游离DPEase的最适温度进行了测定。
游离DPEase在pH 8.0条件下测定最适温度，纳米花固定化DPEase在pH 8.5条件下测定最适温度。除了反应温度和缓冲液pH不同之外，使用与酶活的对比中相同的活性反应体系和检测方法测定酶活。游离DPEase在pH 8.0条件下酶活为5.0U，纳米花固定化DPEase在pH 8.5条件下酶活为36.2U，将这两个条件下的酶活分别作为100％酶活，进行不同温度条件下的活性比较。结果如图5所示，游离DPEase和固定化DPEase的最适温度均为60℃。在50℃到70℃范围内，固定化DPEase活性可以保持90％以上。
热稳定性的对比
热稳定性测定：游离DPEase在pH 8.0条件下测定热稳定性，纳米花固定化DPEase在pH 8.5条件下测定热稳定性。除了反应温度和/或缓冲液pH不同之外，使用与酶活的对比中相同的活性反应体系和检测方法进行酶活测定。60℃条件下，游离DPEase在pH 8.0条件下酶活为5.0U，纳米花固定化DPEase在pH 8.5条件下酶活为36.2U，将这两个条件下的酶活分别作为100％酶活，进行同温度下不同时间的活性比较。55℃条件下，游离DPEase在pH8.0条件下酶活为4.6U，纳米花固定化DPEase在pH 8.5条件下酶活为35.4U，将这两个条件下的酶活分别作为100％酶活，进行同温度下不同时间的活性比较。结果如图6所示，游离DPEase的半衰期只有20min，而固定化DPEase的半衰期为2h。固定化DPEase的热稳定性明显高于游离DPEase。
效果例1：本发明的固定化DPEase的重复使用活性的测定
(1)1mL反应体系：将100μL浓度为500mg/mL的D-果糖水溶液、10μL浓度为10mMCoCl2水溶液和0.17mg实施例3制备的固定化DPEase(含有20μg DPEase，即酶含量为11.7wt％)依次加入890μL Tris-HCl缓冲液(pH＝8.5，50mM)中，得到1mL反应混合物(即1mL反应体系)；
(2)将反应混合物置于60℃下的水浴中反应10min，然后置于沸水中10min终止反应，获得产物D-阿洛酮糖。
每个反应循环后，固定化DPEase离心收集，并重复试验，共计6个循环。结果如图7所示，6次循环后，经上述酶活的测定方法测定，本发明的固定化DPEase的活性仍然可以保持90％以上。
Claims (10)
1.一种制备固定化的D-阿洛酮糖-3-差向异构酶的方法，所述方法包括：
(1)将D-阿洛酮糖-3-差向异构酶溶于磷酸缓冲液中，制备得到含D-阿洛酮糖-3-差向异构酶的溶液；
(2)将步骤(1)制备的所述溶液缓慢滴加到钴盐缓冲液中，静置、离心得到沉淀；以及
(3)将所述沉淀用去离子水冲洗并干燥，得到固定化的D-阿洛酮糖-3-差向异构酶。
2.如权利要求1所述的方法，其中，在所述步骤(1)中，所述磷酸缓冲液的pH值为7.2～7.4；
优选地，所述磷酸缓冲液包含氯化钠、氯化钾、磷酸氢二钠、和/或磷酸二氢钾；
优选地，所述磷酸缓冲液中，所述氯化钠的浓度为0.06～0.2mmol/mL、氯化钾的浓度为0.002～0.02mmol/mL、磷酸氢二钠的浓度为0.001～0.005mmol/mL、磷酸二氢钾的浓度为0.0007～0.002mmol/mL；
优选地，对于20mg的所述D-阿洛酮糖-3-差向异构酶，使用100～1000mL、优选100～500mL的所述磷酸缓冲液进行溶解。
3.如权利要求1或2所述的方法，其中，在所述步骤(2)中，所述钴盐为选自以下中的一种或多种的含水或无水钴盐：硫酸钴、氯化钴、硝酸钴、和/或乙酸钴；
优选地，所述钴盐为七水合硫酸钴；
优选地，所述钴盐缓冲液为钴离子浓度为0.4～2mM、优选0.1～0.5mM的磷酸盐缓冲液。
4.如权利要求1-3中任一项所述的方法，其中，在所述步骤(2)中，所述静置在20℃～30℃下进行24～72h、优选24～48h；
优选地，所述离心以3000～8000rpm、优选3000～5000rpm，进行0.5～5min、优选1～5min。
5.如权利要求1-4中任一项所述的方法，其中，在所述步骤(3)中，将所述沉淀用去离子水冲洗3～5次；
优选地，所述干燥在20℃～30℃的温度下进行24～48h；
优选地，所述固定化的D-阿洛酮糖-3-差向异构酶为粒径为3.0～10.0μm、优选3.0～5.0μm的纳米颗粒；
优选地，所述固定化的D-阿洛酮糖-3-差向异构酶中D-阿洛酮糖-3-差向异构酶的含量为8～12wt％、优选10～12wt％、进一步优选10～11.7wt％。
6.一种由权利要求1-5中任一项所述的方法制备的固定化的D-阿洛酮糖-3-差向异构酶。
7.一种利用权利要求6所述的固定化的D-阿洛酮糖-3-差向异构酶制备D-阿洛酮糖的方法，其中，所述方法包括：
(1)将D-果糖、CoCl2和所述固定化的D-阿洛酮糖-3-差向异构酶加入Tris-HCl缓冲液中，得到反应混合物；以及
(2)使所述反应混合物在30～70℃、优选50～70℃、进一步优选55～60℃下反应5～30min、优选10～20min，然后终止反应，获得D-阿洛酮糖。
8.如权利要求7所述的方法，其中，在所述步骤(1)中，所述缓冲液的浓度为20～100mM、优选20～50mM；
优选地，所述缓冲液的pH为7.0～9.5、优选7.5～8.5、进一步优选8.0～8.5。
9.如权利要求7或8所述的方法，其中，所述反应混合物中D-果糖的浓度为10～50mg/mL、优选20～50mg/mL；CoCl2的浓度为0.05～0.20mM、优选0.10～0.12mM；
优选地，相对于10～50mg的D-果糖，加入0.01～0.25mg、优选0.17～0.25mg、进一步优选0.17～0.2mg的所述固定化的D-阿洛酮糖-3-差向异构酶；
优选地，在所述步骤(1)中，所述D-果糖和CoCl2分别处于D-果糖水溶液和CoCl2水溶液的形式；
优选地，所述D-果糖水溶液的浓度为100～500mg/mL、优选200～500mg/mL；所述CoCl2水溶液的浓度为5～20mM、优选10～12mM；
优选地，所述CoCl2水溶液、D-果糖水溶液和所述缓冲液的体积比为1:(5～20):(80～100)，优选1:10:89。
10.如权利要求7-9中任一项所述的方法，其中，在所述步骤(2)中，所述反应在水浴中进行；
优选地，通过将所述反应混合物置于沸水中5～10min、例如10min终止反应。
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Cited By (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN110438113A (zh) * | 2019-07-23 | 2019-11-12 | 吉林中粮生化有限公司 | D-阿洛酮糖3-差向异构酶的固定化方法 |
| CN111019928A (zh) * | 2019-12-11 | 2020-04-17 | 吉林中粮生化有限公司 | D-阿洛酮糖3-差向异构酶的编码基因、载体、重组细胞以及它们的应用 |
| CN112501153A (zh) * | 2020-12-21 | 2021-03-16 | 苏州福赛思生物科技有限公司 | 一种固定化纤维二糖差向异构酶及其应用于乳果糖制备的方法 |
| CN113801240A (zh) * | 2021-08-26 | 2021-12-17 | 华南理工大学 | 一种d-阿洛酮糖-3-差向异构酶活性聚集体及其制备方法与应用 |
| CN113980880A (zh) * | 2021-09-24 | 2022-01-28 | 吉林中粮生化有限公司 | 基因工程菌及其应用和以葡萄糖为原料生产阿洛酮糖的方法 |
| CN115074350A (zh) * | 2022-08-12 | 2022-09-20 | 保龄宝生物股份有限公司 | 一种降低d-阿洛酮糖-3-差向异构酶酶液酶活力损失的方法 |
| WO2023171643A1 (ja) * | 2022-03-07 | 2023-09-14 | 国立大学法人香川大学 | 乾燥に耐えうる酵素である固定化酵素の乾燥体、その製造方法および保存方法 |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN106520746A (zh) * | 2016-12-02 | 2017-03-22 | 山东百龙创园生物科技股份有限公司 | 一种高纯度d‑阿洛酮糖的制备方法 |
| CN107699557A (zh) * | 2017-11-10 | 2018-02-16 | 山东百龙创园生物科技股份有限公司 | 一种高纯度d‑阿洛酮糖的制备方法 |
| CN107955825A (zh) * | 2017-11-10 | 2018-04-24 | 山东百龙创园生物科技股份有限公司 | 一种以d-阿洛酮糖为主要成分的甜味剂组合物的制备方法 |
-
2018
- 2018-12-27 CN CN201811609654.9A patent/CN109913438A/zh active Pending
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN106520746A (zh) * | 2016-12-02 | 2017-03-22 | 山东百龙创园生物科技股份有限公司 | 一种高纯度d‑阿洛酮糖的制备方法 |
| WO2018099479A1 (zh) * | 2016-12-02 | 2018-06-07 | 山东百龙创园生物科技股份有限公司 | 一种高纯度d-阿洛酮糖的制备方法 |
| CN107699557A (zh) * | 2017-11-10 | 2018-02-16 | 山东百龙创园生物科技股份有限公司 | 一种高纯度d‑阿洛酮糖的制备方法 |
| CN107955825A (zh) * | 2017-11-10 | 2018-04-24 | 山东百龙创园生物科技股份有限公司 | 一种以d-阿洛酮糖为主要成分的甜味剂组合物的制备方法 |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| LU ZHENG等: "Preparation of a Flower-Like Immobilized D-Psicose 3-Epimerase with Enhanced Catalytic Performance", 《CATALYSTS》 * |
Cited By (11)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN110438113A (zh) * | 2019-07-23 | 2019-11-12 | 吉林中粮生化有限公司 | D-阿洛酮糖3-差向异构酶的固定化方法 |
| CN111019928A (zh) * | 2019-12-11 | 2020-04-17 | 吉林中粮生化有限公司 | D-阿洛酮糖3-差向异构酶的编码基因、载体、重组细胞以及它们的应用 |
| CN111019928B (zh) * | 2019-12-11 | 2022-08-16 | 吉林中粮生化有限公司 | D-阿洛酮糖3-差向异构酶的编码基因、载体、重组细胞以及它们的应用 |
| CN112501153A (zh) * | 2020-12-21 | 2021-03-16 | 苏州福赛思生物科技有限公司 | 一种固定化纤维二糖差向异构酶及其应用于乳果糖制备的方法 |
| CN113801240A (zh) * | 2021-08-26 | 2021-12-17 | 华南理工大学 | 一种d-阿洛酮糖-3-差向异构酶活性聚集体及其制备方法与应用 |
| CN113801240B (zh) * | 2021-08-26 | 2022-05-03 | 华南理工大学 | 一种d-阿洛酮糖-3-差向异构酶活性聚集体及其制备方法与应用 |
| CN113980880A (zh) * | 2021-09-24 | 2022-01-28 | 吉林中粮生化有限公司 | 基因工程菌及其应用和以葡萄糖为原料生产阿洛酮糖的方法 |
| CN113980880B (zh) * | 2021-09-24 | 2024-04-05 | 吉林中粮生化有限公司 | 基因工程菌及其应用和以葡萄糖为原料生产阿洛酮糖的方法 |
| WO2023171643A1 (ja) * | 2022-03-07 | 2023-09-14 | 国立大学法人香川大学 | 乾燥に耐えうる酵素である固定化酵素の乾燥体、その製造方法および保存方法 |
| CN115074350A (zh) * | 2022-08-12 | 2022-09-20 | 保龄宝生物股份有限公司 | 一种降低d-阿洛酮糖-3-差向异构酶酶液酶活力损失的方法 |
| CN115074350B (zh) * | 2022-08-12 | 2022-12-13 | 保龄宝生物股份有限公司 | 一种降低d-阿洛酮糖-3-差向异构酶酶液酶活力损失的方法 |
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