CN112501153A - 一种固定化纤维二糖差向异构酶及其应用于乳果糖制备的方法 - Google Patents

一种固定化纤维二糖差向异构酶及其应用于乳果糖制备的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种固定化纤维二糖差向异构酶及其应用于乳果糖制备的方法，本发明采用新型的金属‑有机物杂化方法对纤维二糖差向异构酶进行固定化，赋予固定化酶以独特的纳米化结构特性，不仅提高了酶活表现率，同时也增强了固定化酶对底物的亲和选择性。此外，利用钴离子对含有组氨酸标签的目标酶蛋白的亲和选择性，可使用粗酶液以替代昂贵的纯化酶，极大程度上降低了固定化酶的成本。总体而言，本发明制备的固定化纤维二糖差向异构酶实用性强，是对酶法制备乳果糖的一种有益替代。

Description

一种固定化纤维二糖差向异构酶及其应用于乳果糖制备的 方法
技术领域
本发明属于食品生物技术领域，具体涉及一种固定化纤维二糖差向异构酶及其应用于乳果糖制备的方法。
背景技术
乳果糖（C12H22O11，4-O-β-D-吡喃半乳糖基-D-果糖）是一种功能性低聚糖。具有具有热量低、安全性高、稳定性好、应用面广等优点。乳果糖不能被人体代谢分解，是一种“双歧杆菌增殖因子”。作为功能因子在健康食品（保健品、食品添加剂、动物饲料、以及婴幼儿奶粉等）领域，以及医药领域，尤其是用于治疗便秘和肝性脑病等方面有着重要的应用。目前世界上100多个国家将乳果糖纳入药典，并被列入“世界卫生组织基本药物标准清单”（World Health Organization Model List of Essential Medicines），是人体系统所必须的重要药物之一。
乳果糖的制备分为化学法和酶法，化学法是目前常用的工业乳果糖制备手段，但是存在副产物多、转化率低、安全性有待提高等问题。酶法制备乳果糖是目前研究热点，尤其是以纤维二糖差向异构酶（CEs, EC 5.1.3.11）为代表的新型乳果糖制备用酶，能够催化单一底物乳糖高效制备乳果糖，是目前最为高效，也是最有可能实现大规模产业化应用的乳果糖制备用酶。但是使用游离酶，存在难以回收、难以分离且热稳定性较差等问题，会显著增加酶法制备乳果糖的成本，因此制备一款固定化纤维二糖差向异构酶具有极强的实际应用价值。但是传统酶的固定化方法，包括交联、包埋、微胶囊等，均会对酶活造成很大的损失，并且固定化后，因为载体的存在，会明显降低酶蛋白对底物的亲和性甚至特异性，同时载体往往占据固定化酶整体的90%以上，一方面不可避免地造成单位酶活较低，另一方面，也对反应容器有着较高的要求，往往会限制固定化酶在实际体系中的应用。
因此找到一种适宜的固定化方法，避免对酶蛋白的活力以及底物特异性和亲和性造成损害，对于乳果糖的酶法工业化制备，具有重要的应用价值。
发明内容
为解决现有技术存在的缺陷，本发明提供一种纤维二糖差向异构酶的固定化并应用于乳果糖制备的方法。
针对游离酶在实际应用体系中存在的难以回收、难以与产物分离、以及高昂的酶制剂生产成本等不足，本发明采用固定化纤维二糖差向异构酶并应用于酶法制备乳果糖。此外，传统固定化方法同样存在诸如酶活损失、亲和性降低、单位酶活低等缺陷，本发明采用金属离子-酶蛋白杂化（metal-organic hybridization）的方式合成具有纳米化结构（nanoflower-like structure）的固定化纤维二糖差向异构酶，不仅提高了酶活表现率，同时得益于其独特的纳米化结构，对底物亲和选择性也实现了增强。更重要的是，钴离子（Co2 +）对含有组氨酸标签（His-tagged）的酶蛋白具有特异的亲和选择性，因此无需使用昂贵的纯化酶，在一定程度上进一步降低了固定化酶制剂的生成成本。
通过查阅文献，这是首次对纤维二糖差向异构酶进行的金属离子-酶蛋白杂化固定化，以该固定化酶为生物催化剂用于催化乳糖异构化乳果糖也是首次报道。
为了解决上述技术问题，本发明提供了如下的技术方案：
本发明提供一种固定化纤维二糖差向异构酶，所述固定化的纤维二糖差向异构酶通过固定化操作而获得，且呈纳米化结构。
作为本发明的一种优选技术方案，所述固定化操作包括以下步骤：
S1、将纤维二糖差向异构酶溶解到pH 6.0-8.0 的磷酸盐缓冲液中，调节酶蛋白浓度为0.05-5 mg/mL；
S2、向步骤S1获得的混合液中加入氯化钴溶液，使得最终混合体系中钴离子浓度为0.1-20 mM；
S3、将步骤S2获得的含有钴离子的混合液在4-30℃下放置2-48 h，获得沉淀-上清液体系；
S4、对步骤S3获得的沉淀-上清液体系进行固液分离，收集获得的沉淀，该沉淀洗涤后即为制备得到的固定化纤维二糖差向异构酶。
作为本发明的一种优选技术方案，所述纤维二糖差向异构酶为纯化的酶或者是含有纤维二糖差向异构酶的粗酶溶液，依靠Co2+对含有组氨酸标签的目标纤维二糖差向异构酶的特异亲和性，可实现对粗酶液的选择性固定化。
作为本发明的一种优选技术方案，对步骤S3中混合液采用静置或者缓慢搅拌的方式。
作为本发明的一种优选技术方案，步骤S4中收集的沉淀洗涤后真空冷冻干燥成粉末样品用于后续的酶催化反应，或洗涤后以湿基模式用于后续的酶催化反应。
作为本发明的一种优选技术方案，步骤S4中固液分离采用离心分离，或采用过滤分离。
作为本发明的一种优选技术方案，本发明还提供一种固定化纤维二糖差向异构酶应用于乳果糖制备的方法，其特征在于，包以下步骤：
Q1、纤维二糖差向异构酶的固定化，制备成固定化纤维二糖差向异构酶；
Q2、以固定化纤维二糖差向异构酶为生物催化剂，以单一乳糖为底物，催化乳糖异构化制备乳果糖。
作为本发明的一种优选技术方案，所述乳糖包括但不限于目前市售的乳糖粉、一水合乳糖、以及乳清粉等，反应体系中，乳糖含量为50-800 g/L。
作为本发明的一种优选技术方案，催化反应为批次反应模式或连续柱色谱反应模式。
本发明相较于现有技术，具有以下有益效果：
（1）本发明采用酶法制备乳果糖，与目前工业化的化学催化法相比，具有反应条件温和 [反应温度30-80℃，pH为中性至微酸性环境（pH 6.0-8.0）]，不会产生高碱性废水，无需酸化中和操作，不会对环境造成污染，同时对设备耗损小。此外，副反应小，产品色泽澄清透明，几乎不产生色素等有害副产物，无需后续脱色脱盐等复杂操作，安全性更高。
（2）与游离酶相比，固定化纤维二糖差向异构酶的热稳定性更高，操作稳定性更强，更易于回收利用，使得生产过程中纤维二糖差向异构酶的成本显著下降。并且，固定化纤维二糖差向异构酶更好分离，有效简化了反应产物的提纯。
（3）采用金属离子-有机物杂化方法制备的固定化纤维二糖差向异构酶，具有独特的纳米化结构特征，有效增强底物与酶蛋白的亲和选择性，且采用该方法，对酶活有激活促进作用，最终固定化酶的酶活表现率是游离酶的1.7倍。
（4）选用的钴离子对含有组氨酸标签的目标纤维二糖差向异构酶具有特异的亲和选择性，无需以纯酶为有机物来源，可用粗酶液为酶源，极大程度上降低了纯酶制备的成本，从而显著降低固定化酶制剂的制备成本。
附图说明
图1是本发明制备得到的固定化纤维二糖差向异构酶的电镜图。
图2是本发明使用固定化纤维二糖差向异构酶催化乳糖制备乳果糖最终反应产物的HPLC图谱。
具体实施方式
以下结合附图对本发明的优选实施例进行说明，应当理解，此处所描述的优选实施例仅用于说明和解释本发明，并不用于限定本发明。
目标糖类（乳果糖、乳糖等）检测方法：
利用HPLC测定目标糖类分布和含量的具体操作过程如下：取样后离心（8000~12000 rpm，15~20 min），上清液经0.22 μm微孔滤膜过滤，滤液上样后进行HPLC检测分析。
利用HPLC测定目标糖类纯度的具体检测条件如下：
色谱仪：Waters 2695高效液相色谱仪；
色谱柱：HILICpak VG-50 4E；
流动相：75%乙腈：20%甲醇：5%水溶液（v/v/v）；
流动相流速：1 mL/min；温度：40℃；
检测器：Water 2414示差折光检测器；
进样量：10 μL。
下面是对本发明进行具体描述。
实施例1：固定化纤维二糖差向异构酶
以来源于Caldicellulosiruptor saccharolyticus的纤维二糖差向异构酶为酶源，将含有纤维二糖差向异构酶的粗酶液（含有其他杂蛋白）加入到pH 7.5的磷酸钠缓冲液中，混合体系中纤维二糖差向异构酶的蛋白浓度为0.25 mg/mL，随后加入氯化钴溶液，最终体系中钴离子浓度为2.0 mM，将上述混合溶液在25℃下静置12 h，然后离心收集沉淀，沉淀经pH 7.5的磷酸纳缓冲液洗涤三遍后，真空冷冻干燥后备用。图1是所制备的固定化纤维二糖差向异构酶，可以很明显低看出呈现纳米化结构，酶学性质分析表明，所制备的固定化纤维二糖差向异构酶其酶活表现率为游离酶的1.7倍，酶蛋白固定化效率约为70%，明显优于传统固定化工艺。
实施例2：固定化纤维二糖差向异构酶催化乳糖制备乳果糖
向pH 7.5的磷酸盐缓冲液中加入400 g乳糖，搅拌溶解（可采用加热辅助溶解），配制成1 L的最终乳糖浓度为400 g/L的反应底物溶液，向底物溶液中加入1 g固定化纤维二糖差向异构酶为催化剂，在60℃下，搅拌反应4 h，取1 mL反应液，在沸水浴中灭酶5 min，稀释至适当的倍数，然后使用高效液相检测反应液体系中各类糖的组成和含量。所得到的HPLC图谱如图2所示，经分析可知，最终乳果糖含量为217.12 g/L，此外还生成了另一种功能性二糖，即依匹乳糖，其含量为58.96 g/L，乳果糖和依匹乳糖的总转化率达到75%，单以乳果糖计算，其转化率达到54.28%，且固定化纤维二糖差向异构酶后续可以连续循环使用，在酶法制备乳果糖领域具有显著的应用前景。
本发明首先采用“金属离子-有机物杂化”对纤维二糖差向异构酶进行固定化，所制备的固定化纤维二糖差向异构酶具有独特的纳米化结构，其酶活表现率是游离酶的1.7倍，并且对底物乳糖的选择亲和性更强。采用制备的固定化纤维二糖差向异构酶为生物催化剂，在温和的条件下催化单一底物乳糖异构化制备乳果糖，最终乳果糖的得率可达55%，含量为217 g/L，除此以外，还获得约60 g/L的依匹乳糖，乳果糖和依匹乳糖的总转化率达到75%以上，满足工业化乳果糖制备的要求。
最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (8)

1.一种固定化纤维二糖差向异构酶，其特征在于，所述固定化纤维二糖差向异构酶通过固定化操作而获得，且呈纳米化结构。
2.根据权利要求1所述的固定化纤维二糖差向异构酶，其特征在于，所述固定化操作包括以下步骤：
S1、将纤维二糖差向异构酶溶解到pH 6.0-8.0 的磷酸盐缓冲液中，调节酶蛋白浓度为0.05-5 mg/mL；
S2、向步骤S1获得的混合液中加入氯化钴溶液，使得最终混合体系中钴离子浓度为0.1-20 mM；
S3、将步骤S2获得的含有钴离子的混合液在4-30℃下放置2-48 h，获得沉淀-上清液体系；
S4、对步骤S3获得的沉淀-上清液体系进行固液分离，收集获得的沉淀，该沉淀洗涤后即为制备得到的固定化纤维二糖差向异构酶。
3.根据权利要求1所述的固定化纤维二糖差向异构酶，其特征在于，所述纤维二糖差向异构酶为纯化的酶或者是含有纤维二糖差向异构酶的粗酶溶液。
4.根据权利要求1所述的固定化纤维二糖差向异构酶，其特征在于，对步骤S3中混合液采用静置或者缓慢搅拌的方式。
5.根据权利要求1所述的固定化纤维二糖差向异构酶，其特征在于，步骤S4中收集的沉淀洗涤后真空冷冻干燥成粉末样品用于后续的酶催化反应，或洗涤后以湿基模式用于后续的酶催化反应。
6.根据权利要求1所述的固定化纤维二糖差向异构酶，其特征在于，步骤S4中固液分离采用离心分离，或采用过滤分离。
7.一种如权利要求1-6任一所述的固定化纤维二糖差向异构酶应用于乳果糖制备的方法，其特征在于，包以下步骤：
Q1、纤维二糖差向异构酶的固定化，制备成固定化纤维二糖差向异构酶；
Q2、以固定化纤维二糖差向异构酶为生物催化剂，以单一乳糖为底物，催化乳糖异构化制备乳果糖。
8.根据权利要求7所述的固定化纤维二糖差向异构酶应用于乳果糖制备的方法，其特征在于，催化反应为批次反应模式或连续柱色谱反应模式。
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