KR20210105385A - 올리고당류의 분리 - Google Patents

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KR20210105385A
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니콜라이 칸진
헤데로스 마르쿠스 존델리우스
피에르 샤샤뉴
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글리콤 에이/에스
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Abstract

본 발명은 디비닐벤젠으로 가교된 브롬 작용화된 폴리스티렌(BPS-DVB) 정지 매질 상에서 크로마토그래피로 2개의 친수성 중성 올리고당류를 서로로부터 분리하는 방법에 관한 것이다.

Description

올리고당류의 분리
본 발명은 발효 또는 효소적 방법에 의해 생산된 2개의 친수성 중성 올리고당류, 바람직하게는 적어도 2개의 중성 인간 모유 올리고당류(HMO)를 서로로부터 분리하는 방법에 관한 것이다. 특히, 적어도 2개의 중성 올리고당류 중 하나는 다른 것에 비해 높은 분자량을 가지며, 이들은 소수성 정지상 상에서 분할을 나타낸다.
최근 수년 간, 산업적으로 복잡한 탄화수물, 예컨대 분비된 올리고당류를 생산하려는 시도가 증가해왔다. 이는 생명체에서의 여러 생물학적 방법에서 이러한 화합물의 역할에 기인하였다. 분비된 올리고당류, 예컨대 인간 모유 올리고당류(HMO)는, 영양 및 치료 적용을 위해 특히 중요한 상업적 표적이 되어왔다. 인간 모유 올리고당류는 지난 몇년 동안 인간 발생에서의 이의 중요한 기능으로 인해 큰 관심을 받게 되었다. 현재까지, 140종을 초과하는 HMO의 구조가 결정되었고, 인간 모유에 상당히 더 많은 종이 존재할 수 있다(Urashima et al.: Milk oligosaccharides, Nova Biomedical Books, 2011; Chen Adv. Carbohydr. Chem. Biochem. 72, 113 (2015)).
HMO의 가능한 최대치의 산업적 양을 제조함으로써, 영유아, 어린이 및 성인을 위한 영양 및 치료 제형물에서의 이의 사용을 연구자 및 세계적 회사에서 연구하고, 개발하고, 탐색할 수 있도록 하기 위한 저비용 방식을 찾아왔다. 현재, HMO는 효소적으로 또는, 대부분, 형질전환된 1-세포 유기체, 특히 대장균을 사용하는 발효에 의해 생산되어왔다. 그러나 이들 방법은 또 다른 올리고당류/HMO 부산물이 동반된 관심 HMO를 제공한다. 전형적으로, 2'-FL에는 대부분 DFL 및/또는 3-FL이 동반되며(예로, EP-A-2896628, WO 2015/032412, WO 2015/106943 참고), LNnT 발효 배양액은 락토-N-트리오스 II(GlcNAcβ1-3Galβ1-4Glc) 및 고급 올리고당류, 예컨대 pLNnH(Galβ1-4GlcNAcβ1-3Galβ1-4GlcNAcβ1-3Galβ1-4Glc)를 포함하고(예로, WO 01/04341, Priem et al. Glycobiology 12, 235 (2002), Gebus et al. Carbohydr. Res. 361, 83 (2012), WO 2017/182965 참고) LNT는 락토-N-트리오스 II 및 고급 올리고당류, 예컨대 pLNH II(Galβ1-3GlcNAcβ1-3Galβ1-3GlcNAcβ1-3Galβ1-4Glc)에 의해 오염된다(예로 WO 2015/049331, WO 2017/182965 참고).
WO 2017/182965는 발효에 의해 제조된 올리고당류 혼합물을 어떻게 배양액의 비-탄수화물 성분(예컨대 바이오매스, 산, 염기, 유기 및 무기 염, 단백질, 단백질 단편, DNA, 내독소, 생물기원 아민, 착색체 등)으로부터 분리하는지에 대한 방법을 제안하며, 이 방법은 초여과, 나노여과, 및 H+-형태의 강한 양이온 교환 수지로의 처리에 바로 이어 자유 염기 형태의 약한 음이온 교환 수지로의 처리를 포함하는 이온 교환 수지의 적용을 포함한다. 그러나, 상기 방법은 올리고당류 성분을 서로 유의미하게 분리하지 않는다.
EP-A-2896628은 하기 단계: 초여과, 강한 양이온 교환 수지 처리(H+-형태), 중화, 강한 음이온 교환 수지 처리(Cl--형태), 중화, 나노여과/투석여과, 활성탄 처리, 전기투석, 강한 양이온 교환 수지 처리(Na+-형태), 강한 음이온 교환 수지 처리(Cl--형태), 활성탄 처리 및 전기투석을 포함하는 발효 배양액으로부터의 2'-FL 정제 방법을 기재하며, 크로마토그래피가 채택되지 않음을 강조한다. 이 방법은 94% 내지 94.5%(HPLC 기준) 순도의 2'-FL을 제공하지만, 최종 산물에서 약 5% 존재하는 주요 탄수화물 오염물질(예컨대 3-FL, DFL 및 락토스)의 양이 방법에 의해 감소되는지에 대해 출원에서 언급하지 않는다.
구조적으로 유사한 올리고당류를 서로 분리하는 것은 이의 매우 유사한 특성으로 인해 어려운 업무이다. 겔 여과가 확실히 하나의 옵션이지만(예로, 문헌[Priem et al. Glycobiology 12, 235 (2002)] 참고), 이는 산업적으로 수익성 있는 방법이라기 보다는 실험실 방법인 것으로 간주된다.
WO 2015/049331은 하기 작동 순서: 깨끗한 무입자 용액을 제공하기 위한, 전기투석/나노여과, 제1 시뮬레이션 이동층(SMB) 강한 양이온 교환 수지 크로마토그래피, 전기투석, 초여과를 포함하는, 발효 배양액으로부터의 LNT 정제 방법을 개시한다. 소정 SMB 파라미터를 사용하여, LNT 및 더 큰 중성 올리고당류는 라피네이트에 분획화되는 반면, 더 작은 탄수화물(락토스, 단당류)은 추출물 분획에 농축된다. 고급 올리고당류로부터 LNT를 추가 정제하기 위해, 제2 SMB 크로마토그래피가 상이한 파라미터로 수행되어 추출물 분획 중 LNT 농축을 유도한다.
그러나, 산업적 스케일-업, 종종 발효 방법에서 제조되는 동반 탄수화물 부산물로부터의 LNT, LNnT 및 다른 중성 HMO의 단리 및 정제에 적합한, 대안적이고, 보다 효율적이고, 강력하고, 및/또는 비용-효과적인 절차가 여전히 요구된다.
본 발명에 따르면, 디비닐벤젠으로 가교되고 방향족 고리 상에서 브롬으로 작용화된 폴리스티렌(PS-DVB)인 소수성 정지상을 사용하여 크로마토그래피에 의해 수성 매질을 처리하는 단계를 포함하는, 수성 매질 중 제2 친수성 중성 올리고당류로부터 제1 친수성 중성 올리고당류를 분리하는 방법이 제공된다. 수성 매질이 브롬 작용화된 PS-DVB(BPS-DVB) 소수성 정지 크로마토그래피 매질과 접촉되는 경우, 올리고당류 중 하나는 다른 것보다 더 정지 고형상에 의해 보유되며, 이에 따라 각각의 올리고당류의 농축되거나 분리된 분획이 수득될 수 있다.
하나의 구현예에서, 친수성 중성 올리고당류 중 하나에서의 단당류 단위의 수는 다른 친수성 중성 올리고당류에서보다 많다.
다른 구현예에서, 친수성 중성 올리고당류 중 하나는 다른 것보다 적어도 2개 더 많은 단당류 단위로 구성된다.
다른 구현예에서, 친수성 중성 올리고당류 중 하나는 적어도 하나의 N-아세틸글루코사미닐(GlcNAc)- 또는 N-아세틸갈락토사미닐(GalNAc)-모이어티를 포함하는 반면 다른 것은 이를 포함하지 않는다.
다른 구현예에서, 친수성 중성 올리고당류 중 하나는 다른 것보다 많은 GlcNAc- 또는 GalNAc-모이어티를 포함한다.
하나의 구현예에서, 적어도 하나의 친수성 중성 올리고당류는 인간 모유 올리고당류 또는 이의 전구체이다.
하나의 구현예에서, 제1 및 제2 친수성 중성 올리고당류는 인간 모유 올리고당류 또는 이의 전구체이다.
하나의 구현예에서, 제1 및 제2 친수성 중성 올리고당류는 인간 모유 올리고당류이며, 이들 중 하나는 다른 것보다 적어도 2개 더 많은 단당류 단위로 구성된다.
하나의 구현예에서, 제1 및 제2 친수성 중성 올리고당류는 인간 모유 올리고당류이며, 이들 중 하나는 사당류이고 다른 하나는 육당류이다.
하나의 구현예에서, 적어도 하나의 친수성 중성 올리고당류는 GlcNAc-모이어티를 함유하는 인간 모유 올리고당류이다.
하나의 구현예에서, 제1 및 제2 친수성 중성 올리고당류는 인간 모유 올리고당류이며 둘 다 GlcNAc-모이어티를 포함한다.
하나의 구현예에서, 제1 및 제2 친수성 중성 올리고당류는 인간 모유 올리고당류이고, 둘 다 GlcNAc-모이어티를 포함하며 이들 중 하나는 다른 것보다 적어도 2개 더 많은 단당류 단위로 구성된다.
하나의 구현예에서, 제1 및 제2 친수성 중성 올리고당류는 인간 모유 올리고당류이며 이들 중 하나는 다른 것보다 많은 GlcNAc-모이어티를 포함한다.
하나의 구현예에서, 제1 및 제2 친수성 중성 올리고당류는 인간 모유 올리고당류이며, 둘 다 GlcNAc-모이어티를 포함하고 이들 중 하나는 다른 것보다 많은 GlcNAc-모이어티를 포함한다.
하나의 구현예에서, 제1 및 제2 친수성 중성 올리고당류는 인간 모유 올리고당류이며, 이들 중 하나는 다른 것보다 적어도 2개 더 많은 단당류 단위로 구성되고 고급 올리고당류(즉 더 많은 단당류 단위를 갖는 것)는 저급 올리고당류보다 많은 GlcNAc-모이어티를 포함한다.
하나의 구현예에서, 제1 및 제2 친수성 중성 올리고당류는 인간 모유 올리고당류이며, 이들 중 하나는 2개의, 바람직하게는 정확히 2개의, GlcNAc-모이어티를 포함하는 육당류이고, 다른 하나는 하나의, 바람직하게는 정확히 하나의, GlcNAc-모이어티를 포함하는 사당류이다.
하나의 구현예에서, 인간 모유 올리고당류 또는 이의 전구체는 수성 배양 매질 중에서 특히 대장균에 의한 발효에 의해 세포내 생산된 후 수성 배양 매질 내로 분비된다.
하나의 구현예에서, BPS-DVB 크로마토그래피에 의해 인간 모유 올리고당류 또는 이의 전구체를 포함하는 수성 매질을 처리하기 전에, 하기 단계 중 하나 또는 둘 다가 수행된다:
a) 수성 매질을 청정화하여 미립자 및 오염물질 그리고 유리하게는 또한 발효 방법으로부터의 세포 성분 및 임의의 불용성 대사물질 및 파편을 제거하는 단계; 및
b) 실질적으로 모든 단백질이, 유리하게는 수성 매질이 단계 a)에서 청정화된 후, 수성 매질로부터 제거되는 단계.
하나의 구현예에서, 제1 및 제2 올리고당류는 LNnT 및 pLNnH를 포함한다.
하나의 구현예에서, 제1 및 제2 올리고당류는 LNT 및 pLNH II를 포함한다.
상세한 설명
전형적으로, 고도 소수성 정지 크로마토그래피 매질(역상 크로마토그래피, RPC)의 적용은 고극성 올리고당류의 분리에 적합하지 않다(예로, WO 2017/221208 참고). 본 발명자들은 놀랍게도 고체 크로마토그래피상이 디비닐벤젠으로 가교되고 방향족 고리 상에서 브롬으로 작용화된 폴리스티렌(BPS-DVB)으로 이루어진 경우, RPC가 상기 과제를 위해 적용 가능할 수 있음을 확인하였다.
본 발명에 따르면, 적어도 부분적으로, 제2 친수성 중성 올리고당류로부터 제1 친수성 중성 올리고당류를 분리하는 방법이 제공되며, 올리고당류는 바람직하게는 발효에 의해 또는 생체외 효소적 방법에서 생산되고, 방법은 디비닐벤젠으로 가교된 브롬 작용화된 폴리스티렌(BPS-DVB) 정지 매질 상에서 제1 및 제2 올리고당류를 포함하는 수용액으로 크로마토그래피를 거치는 단계를 포함한다.
바람직하게는, BPS-DVB 수지의 브롬화 수준은 약 25 w/w% 내지 61 w/w%, 예를 들어 25 w/w% 내지 35 w/w%이다.
상기 크로마토그래피 분리 방법은 회분식 방법으로 그리고 R&D 실험실부터 파일럿 플랜트를 거쳐 산업용 전체-규모에 이르기까지, 다중-칼럼 설정에서 모두 강력한 것으로 입증되었다. 고상 및 연합된 크로마토그래피 수행은 구배가, 예로 수성 알코올을 사용하여 적용되는 방식으로 수행될 수 있지만, 완전히 유기 용매 없이도(순수한 물) 수행될 수 있다. 방법은 감소된 미생물 성장 위험 및 증가된 생산성의 관점에서 이점을 제공하는 고온(예로, 최대 60℃)에서 잘 기능한다. 또한, 고상은, 예로 수성 아세트산을 사용하여 완전 재생될 수 있고, 이에 따라 식품-관련 가공에 매우 적합하다.
본 발명에서, 용어 "역상 크로마토그래피" 또는 RPC는, 바람직하게는 소수성 정지(즉 패킹)상 또는 현탁상 및 분리될 성분을 포함하는 극성(즉 수성) 이동상을 사용하는 임의의 크로마토그래피 방법을 의미한다.
용어 "친수성 중성 올리고당류"는 바람직하게는 적어도 2개의 단당류 단위, 즉 2-올리고당류, 3-올리고당류, 또는 4-올리고당류 이상을 함유하는 당 중합체를 의미한다. 올리고당류는 서로 글리코시드간 결합에 의해 연결되는 단당류 단위를 함유하는 선형 또는 분기형 구조를 가질 수 있다. 바람직하게는, 올리고당류는 2개 내지 8개, 보다 바람직하게는 2개 내지 6개 단당류 모이어티로 구성된다. 명백하게, 올리고당류를 이루는 단당류 단위는 중성 단당류이며 산성 단당류, 예컨대 알돈산, 케토-알돈산(예컨대 시알산), 알다린산, 알두론산 또는 자유 아미노기를 갖는 것과 같은 염기성 단당류 모이어티일 수 없다. 중성 단당류 단위의 하이드록실기는 보호되지 않으며, 결과적으로 단당류로 제조되는 올리고당류도 보호되지 않는다. 중성 단당류 단위는 알도스(예로, D-글루코스, D-갈락토스, D-만노스, D-리보스, D-아라비노스, L-아라비노스, D-자일로스 등), 케토스(예로, D-프룩토스, D-소르보스, D-타가토스 등), 데옥시당(예로, L-람노스, L-푸코스 등) 및 N-아세틸화 데옥시-아미노당(예로, N-아세틸글루코사민, N-아세틸만노스아민, N-아세틸갈락토사민 등)으로 구성되는 임의의 5개 내지 9개, 바람직하게는 5개 내지 6개 탄소 원자 함유 단당류로부터 선택될 수 있다.
용어 "디비닐벤젠으로 가교된 브롬 작용화된 폴리스티렌", "디비닐벤젠으로 가교되고 브롬으로 작용화된 폴리스티렌" 또는 "BPS-DVB"는 적어도 일부 스티렌 단량체가 브로모스티렌에 의해 대체되거나(여기서 브롬은 방향족 고리 상에 있음) 폴리스티렌-디비닐벤젠 공중합체가 브롬화제로 브롬화되는 스티렌 및 디비닐벤젠의 변형된 공중합체를 나타낸다.
용어 "C1-C4 알코올"은 1개 내지 4개 탄소 원자의 알킬 알코올, 예컨대 메탄올, 에탄올, 프로판올 또는 부탄올을 의미한다. 바람직한 C1-C4 알코올은 이소프로판올이다.
용어 "[발효 또는 효소적 방법으로부터의] 수성 매질"은 바람직하게는 적어도 하나의 친수성 중성 올리고당류를 생산하는 효소적 또는 발효 방법으로 생성되는 수성 현탁액을 의미한다.
용어 "청정화된 수성 매질"은 바람직하게는, 예로, 정제의 이후 단계(들)를 방해할 수 있는, 방법으로부터 현탁된 미립자 및 오염물질, 특히 발효 방법으로부터의 세포, 세포 성분, 불용성 대사물질 및 파편을 제거하기 위해 처리된, 효소적 방법 또는 발효 배양액의 수성 매질을 의미한다. 이러한 청정화 처리는 원심분리, 응집, 임의의 초음파 처리를 포함하는 응집, 중력 여과, 마이크로여과, 초여과, 발포체 분리 또는 진공 여과(예로, Celite™ 필터 보조가 포함될 수 있는 세라믹 필터를 통해)에 의해 통상적인 방식으로 수행될 수 있다.
용어 "단백질-비함유 수성 매질"은 바람직하게는, 예로, 정제의 이후 단계(들)를 방해할 수 있는 실질적으로 모든 단백질, 및 바람직하게는 뿐만 아니라 펩타이드, 아미노산, RNA, DNA 및 이의 단편과 더불어 내독소 및 당지질을 제거하기 위해 처리된, 효소적 방법 또는 발효 배양액의 수성 매질을 의미한다. 단백질, 아미노산, RNA 및 DNA의 이러한 제거는 이온 교환 크로마토그래피, 친화도 크로마토그래피, 초여과, 나노여과 또는 크기 배제 크로마토그래피에 의해 통상적 방식으로 달성될 수 있다.
용어 "고급 올리고당류"는 그 중합도가 또 다른 올리고당류에서보다 크다는 것을, 즉 이것이 다른 것보다 많은 단당류 단위를 포함한다는 것을 의미한다.
용어 "저급 올리고당류"는 그 중합도가 또 다른 올리고당류에서보다 작다는 것을, 즉 이것이 다른 것보다 적은 단당류 단위를 포함한다는 것을 의미한다.
청구되는 분리 방법은 통상적 방식으로 수행될 수 있다. 제1 및 제2 친수성 중성 올리고당류를 포함하는 수용액은 크로마토그래피에서 이동상으로 사용된다. 유기 용매, 바람직하게는 C1-C4 알코올이 수용액에 첨가될 수 있다. 수용액의 pH는 바람직하게는 3 내지 8, 보다 바람직하게는 4 내지 7이다. 필요한 경우, pH는 산, 염기 또는 완충제의 수용액의 첨가에 의해 통상적 방식으로 요구되는 값으로 조정될 수 있다. 분리는 실험실 또는 산업적 규모의 통상적인 크로마토그래피 칼럼 또는 용기를 사용함으로써 용이하게 수행될 수 있고, 여기서 BPS-DVB 수지는 패킹되거나 현탁될 수 있다(예로, 비드로). 바람직하게는, 분리 방법은 칼럼에서 수행된다.
분리 정도는 여러 파라미터, 예컨대 용출액의 성질, 유속/용출 속도, 수집되는 분획의 부피, 수지 질량 또는 수지층 부피 대비 제1 및 제2 올리고당류의 질량 등에 의존한다. 이들 파라미터는 일상적 기술로 최적화될 수 있다. 용어 "분리"는 제1 및 제2 올리고당류의 서로로부터의 완전 분리를 의미하며, 즉 이들은 서로를 함유하지 않는 순수한 형태로 수집되고 분획으로부터 단리된다. 또한, 용어 "분리"는 적어도 하나의 올리고당류가 순수한 형태의 적어도 하나의 분획으로부터 수득될 수 있거나 분획(들) 중 제1 및 제2 올리고당류의 비가 공급 용액 중에서와 상이하고, 이에 따라 올리고당류 중 하나가 농축되는 부분적 분리를 의미한다.
이어서 상기 개시된 바와 같이 BPS-DVB 크로마토그래피에 의해 제2 친수성 중성 올리고당류로부터 제1 친수성 중성 올리고당류의 분리를 수행한 후, 정제되거나 농축된 제1 및/또는 제2 올리고당류(들)는 이들이 통상적 방식, 예로, 증발, 결정화, 냉동-건조 또는 분무-건조에 의해 수집되는 수성 분획(들)으로부터 단리될 수 있다.
바람직하게는, BPS-DVB 정지 매질 상의 크로마토그래피는 하기를 포함한다:
- BPS-DVB 매질 상으로의 제1 및 제2 친수성 중성 올리고당류를 포함하는 수용액의 로딩,
- 임의로 C1-C4 알코올을 함유하는 물로의 용출, 이어서
- 올리고당류 중 하나를 포함하거나 이로 농축된 분획의 수집.
크로마토그래피 후, BPS-DVB 매질은 수혼화성 유기 용매를 함유하는 물로의 용출에 의해 재생되고 재순환될 수 있다.
또한 바람직하게는, 제1 및 제2 친수성 중성 올리고당류를 포함하는 수용액은 제1 및 제2 올리고당류가 생산되는/포함되는 사전-처리된 발효 배양액 또는 수성 반응 매질이다.
본 방법의 하나의 양태에는 적어도 부분적으로, 제1 및 제2 친수성 중성 올리고당류의 서로로부터의 분리가 관여되며, 올리고당류는 수성 배양 매질 중에서, 바람직하게는 대장균에 의한, 발효에 의해 세포내 생산된 후, 수성 배양 매질 내로 분비되거나, 수송되거나, 운반된다. 방법에는, BPS-DVB 크로마토그래피 전에, 하기 사전-처리 단계가 관여될 수 있다:
a) 수성 배양 매질을 청정화하여 이로부터 미립자 및 오염물질, 바람직하게는 또한 발효 방법으로부터의 세포, 세포 성분 및 임의의 불용성 대사물질 및 파편을 제거하여 청정화된 수성 매질을 제공하는 단계, 및/또는
b) 수성 매질로부터, 바람직하게는 단계 a)의 청정화된 수성 매질로부터 실질적으로 모든 단백질을 제거하여 단백질-비함유 수성 매질을 제공하는 단계, 및/또는
c) 수성 배양 매질로부터, 단계 a)의 청정화된 수성 매질로부터, 또는 단계 b)의 단백질-비함유 수성 매질로부터 염 및 하전된 성분을 제거하는 단계.
따라서, 단계 a)로부터의 청정화된 수성 매질, 단계 b)로부터의 단백질-비함유 수성 매질 또는 단계 c)에서 수득된 수성 매질이 BPS-DVB 수지 상으로 로딩된다.
방법의 또 다른 양태는 적어도 부분적으로, 제1 및 제2 친수성 중성 올리고당류의 서로로부터의 분리에 관한 것이며, 적어도 하나의 올리고당류는 수성 매질 중 생체외로 효소적으로 생산된다. 생체외 효소적 반응 혼합물은 전형적으로 생산되는 관심 올리고당류 외에, 단백질, 단백질 단편, 무기 염, 미반응 탄수화물 수신체(전형적으로 락토스) 또는 공여체, 당-유사 부산물, 탄수화물 이탈기(전형적으로 단당류 또는 이당류) 등을 함유한다. 방법에는, BPS-DVB 크로마토그래피 전에, 하기 사전-처리 단계: 초여과(UF), 나노여과(NF) 및 임의의 활성탄(AC) 처리가 관여될 수 있다. UF는 투과액 중 초여과막을 통과하는 수성 매질의 가용성 성분으로부터 고분자량 현탁 고체, 전형적으로 단백질 또는 단백질 단편의 분리를 포함한다. 상기 UF 투과액(UFP)은 다른 탄수화물 산물이 동반되는 생산된 올리고당류를 함유하는 수용액이다. NF 단계는 UF 단계 또는 임의의 AC 처리 단계를 뒤따를 수 있다; 상기 단계는 다른 탄수화물 산물이 동반되는 생산된 올리고당류를 포함하는 이전에 처리된 수성 매질을 농축하고/하거나 이온, 주로 1가 이온, 및 올리고당류 산물에서보다 낮은 분자량을 갖는 유기 물질, 예컨대 단당류를 제거하기 위해 유리하게 사용될 수 있다. 이에 관해, 다른 올리고당류가 동반되는 생산된 올리고당류는 NF 체류액 중에 축적된다(NFR). NF는 투과성 분자를 보다 효과적으로 제거하기 위해, 예로 투과액의 전도성이 염의 존재를 전혀 또는 거의 나타내지 않을 때까지, 물로의 투석여과와 조합될 수 있다. 임의의 AC 단계가 UF 단계, NF 단계 또는 BPS-DVB 수지를 뒤따를 수 있다. AC 처리는, 요구되는 경우, 착색제 및/또는 수용성 오염물질, 예컨대 염을 제거하거나 적어도 그 양을 감소시키는 것을 돕는다.
청구되는 분리 방법의 하나의 구현예에서, 효소적 또는 바람직하게는, 특히 대장균 또는 효모의, 발효 방법으로부터 직접 나올 수 있고, 제1 및 제2 친수성 중성 올리고당류를 함유하는 수성 매질은 하기 단계에 의해 처리된다:
1) 수성 매질을 청정화하여 현탁 미립자 및 오염물질, 특히 발효 방법으로부터의 세포, 세포 성분, 불용성 대사물질 및 파편을 제거하는 단계; 이어서
2) 단계 1)에서 수득된 수용액으로부터, 후속 정제 단계를 방해할 수 있는 실질적으로 모든 단백질뿐만 아니라 펩타이드, 아미노산, RNA 및 DNA 그리고 임의의 내독소 및 당지질을 제거하는 단계; 이어서
3) BPS-DVB 상에서 크로마토그래피에 의해 단계 2)에서 수득된 수용액으로부터 제1 및 제2 올리고당류를 분리하는 단계.
단계 1)에서, 제1 및 제2 올리고당류를 함유하는 수성 매질은 통상적 방식으로, 예로, 원심분리 또는 여과에 의해 청정화된다. 바람직하게는 수성 매질은 먼저 응집된 후 원심분리되거나 여과되어 임의의 잔여 불용성 미립자 및 오염물질뿐만 아니라 세포 및 세포 성분 그리고 불용성 대사물질 및 파편을 제거한다.
단계 2)에서, 단백질 및 관련된 불순물은 통상적 방식으로, 예로 초여과, 나노여과, 접선류 고성능 여과, 접선류 초여과, 친화도 크로마토그래피, 이온 교환 크로마토그래피, 소수성 상호작용 크로마토그래피, 겔 여과, 크기 배제 크로마토그래피, 활성탄 처리에 의해 수성 매질로부터 제거된다. 활성탄 처리는, 요망되는 경우, 착색제 및/또는 수용성 오염물질, 예컨대 염을 제거하거나 적어도 그 양을 감소시키는 것을 돕는다. 이온 교환 크로마토그래피는 하전된 성분, 예컨대 염, 색소체, 단백질, 아미노산, 지질 및 DNA를 효율적으로 제거한다.
임의의 바람직한 및/또는 개시된 구현예를 포함하는, 상술된 BPS-DVB 상에서 크로마토그래피에 의해 제2 친수성 중성 올리고당류로부터 제1 친수성 중성 올리고당류를 분리하는 방법에서, 제1 및 제2 올리고당류는 적어도 하나의 구조적 특징에 있어서 서로 상이하며, 예로, 적어도 하나의 단당류 단위가 상이하거나, 단당류 단위의 수가 상이하거나, 적어도 하나의 글리코시드간 결합의 배향이 상이하다(α인지 β인지와 무관함). 하나의 구현예에서, 올리고당류 중 하나는 다른 것보다 하나 더 많은 단당류 단위로 구성된다. 다른 구현예에서, 올리고당류 중 하나는 다른 것보다 2개 또는 적어도 2개 더 많은 단당류 단위로 구성되며, 예를 들어 올리고당류 중 하나는 삼당류이고 다른 하나는 오당류이거나, 올리고당류 중 하나는 사당류이고 다른 하나는 육당류이다. 다른 구현예에서, 올리고당류 중 하나는 적어도 하나의 GlcNAc- 또는 GalNAc-단위, 바람직하게는 GlcNAc-단위를 포함하는 반면, 다른 것은 이를 포함하지 않는다. 다른 구현예에서, 올리고당류 중 하나는 다른 것보다 많은 GlcNAc- 또는 GalNAc-단위, 바람직하게는 GlcNAc-단위를 포함한다.
바람직하게는, 올리고당류 중 하나는 다른 올리고당류의 구조를 포함하며, 즉 올리고당류 중 하나는 다른 것의 글리코실화 유도체이다. 보다 바람직하게는, 글리코실화는 적어도 2개의 단당류 단위가 부착되는 것을 포함한다. 더욱 바람직하게는, 제1 및 제2 올리고당류에 의해 일반적으로 공유되는 구조는 락토스 또는 그 글리코실화 유도체이다.
또한 바람직하게는, 제1 및 제2 친수성 중성 올리고당류는 환원성 말단에 락토스(Galβ1-4Glc) 모이어티를 포함한다. 보다 바람직하게는, 제1 및 친수성 중성 제2 올리고당류는 하기 화학식 1을 특징으로 한다:
[화학식 1]
Figure pct00001
R1은 푸코실 또는 H이며,
R2는 푸코실 또는 H이고,
R3은 H, N-아세틸-글루코사미닐, N-아세틸-락토사미닐 및 락토-N-바이오실 기로부터 선택되고, 여기서 N-아세틸-락토사미닐기 또는 락토-N-바이오실기는 하나 이상의 N-아세틸-글루코사미닐, N-아세틸-락토사미닐 및/또는 락토-N-바이오실기를 포함하는 글리코실 잔기를 운반할 수 있으며; 임의의 N-아세틸-락토사미닐 및 락토-N-바이오실기는 하나 이상의 푸코실 잔기로 치환될 수 있다.
R4는 H, N-아세틸-글루코사미닐 및 N-아세틸-락토사미닐기로부터 선택되고, N-아세틸-락토사미닐기는 하나 이상의 N-아세틸-글루코사미닐, N-아세틸-락토사미닐 및/또는 하나 이상의 락토-N-바이오실기를 포함하는 글리코실 잔기로 임의 치환될 수 있고; 임의의 N-아세틸-락토사미닐 및 락토-N-바이오실기는 하나 이상의 푸코실 잔기로 치환될 수 있으며;
더욱 바람직하게는, 화학식 1은 화학식 1a, 1b 또는 1c를 특징으로 할 수 있다:
[화학식 1a]
Figure pct00002
[화학식 1b]
Figure pct00003
[화학식 1c]
Figure pct00004
식 중, R1 및 R2는 상기와 같이 정의되며,
R3a는 N-아세틸-글루코사미닐기, 또는 N-아세틸-글루코사미닐, N-아세틸-락토사미닐 및/또는 락토-N-바이오실기를 포함하는 글리코실 잔기로 임의 치환된 N-아세틸-락토사미닐기이며; 임의의 N-아세틸-락토사미닐 및 락토-N-바이오실기는 하나 이상의 푸코실 잔기로 치환될 수 있고,
R4a는 H, 또는 N-아세틸-글루코사미닐기, 또는 N-아세틸-글루코사미닐 또는 락토-N-바이오실기로 임의 치환된 N-아세틸-락토사미닐기이고; 임의의 N-아세틸-락토사미닐 및 락토-N-바이오실기는 하나 이상의 푸코실 잔기로 치환될 수 있고,
R3b는 N-아세틸-글루코사미닐기, 또는 N-아세틸-글루코사미닐, N-아세틸-락토사미닐 및/또는 락토-N-바이오실기를 포함하는 글리코실 잔기로 임의 치환된 락토-N-바이오실기이고; 임의의 N-아세틸-락토사미닐 및 락토-N-바이오실기는 하나 이상의 푸코실 잔기로 치환될 수 있고,
R4b는 H, 또는 N-아세틸-글루코사미닐기, 또는 1개 또는 2개의 N-아세틸-글루코사미닐, N-아세틸-락토사미닐 및/또는 1개의 락토-N-바이오실기로 임의 치환된 N-아세틸-락토사미닐기이고; 임의의 N-아세틸-락토사미닐 및 락토-N-바이오실기는 하나 이상의 푸코실 잔기로 치환될 수 있고;
더욱 바람직하게는, 화학식 1a 및 1b는 하기를 특징으로 한다:
- R3a의 글리코실 잔기 내 N-아세틸-락토사미닐기는 1개 내지 3개의 글리코시드간 결합으로 또 다른 N-아세틸-락토사미닐기에 부착되고,
- R3a의 글리코실 잔기 내 락토-N-바이오실기는 1개 내지 3개의 글리코시드간 결합으로 상기 N-아세틸-락토사미닐기에 부착되고,
- R4a의 글리코실 잔기 내 락토-N-바이오실기는 1개 내지 3개의 글리코시드간 결합으로 상기 N-아세틸-락토사미닐기에 부착되고,
- R4b의 글리코실 잔기 내 N-아세틸-락토사미닐기는 1개 내지 3개 또는 1개 내지 6개의 글리코시드간 결합으로 또 다른 N-아세틸-락토사미닐기에 부착되고,
- R4b의 글리코실 잔기 내 락토-N-바이오실기는 1개 내지 3개의 글리코시드간 결합으로 상기 N-아세틸-락토사미닐기에 부착된다.
보다 바람직하게는, 화학식 1a, 1b 및 1c에 따른 화합물은 인간 모유 올리고당류이며, 특히 화학식 1a의 바람직한 화합물은 락토-N-네오테트라오스, 파라-락토-N-헥사오스, 파라-락토-N-네오헥사오스, 락토-N-네오헥사오스, 파라-락토-N-옥타오스 또는 락토-N-네오옥타오스이고, 그 모두는 하나 이상의 푸코실 잔기로 임의 치환될 수 있고; 화학식 1b의 바람직한 화합물은 락토-N-테트라오스, 락토-N-헥사오스, 락토-N-옥타오스, 이소-락토-N-옥타오스, 락토-N-데카오스 또는 락토-N-네오데카오스이고, 그 모두는 하나 이상의 푸코실 잔기로 임의 치환될 수 있다. 특히, 화학식 1a 또는 1b의 화합물은 N-아세틸-락토사미닐 및/또는 락토-N-바이오실기에 부착된 푸코실 잔기가 하기에 연결되는 것을 특징으로 한다:
- 1-2 글리코시드간 결합을 갖는 락토-N-바이오실기의 갈락토스 및/또는
- 1-4 글리코시드간 결합을 갖는 락토-N-바이오실기의 N-아세틸-글루코사민 및/또는
- 1-3 글리코시드간 결합을 갖는 N-아세틸-락토사미닐기의 N-아세틸-글루코사민.
가장 바람직한 양태에 따르면, 하위 화학식 1a, 1b 및 1c의 화합물은 하기: 락토스, 2'-푸코실락토스, 3-푸코실락토스, 2',3-디푸코실락토스, 락토-N-테트라오스, 락토-N-네오테트라오스, LNFP I, LNFP II, LNFP III, LNFP V, LNFP VI, LNDFH I, LNDFH II, LNDFH III, pLNnH, 모노푸코실화 pLNnH, pLNH II, 모노푸코실화 pLNH II 및 락토-N-트리오스 II의 군으로부터 선택된다.
하나의 구현예에서, 제1 및 제2 친수성 중성 올리고당류 중 하나는 그 구조에 GlcNAc 또는 GalNAc 단위를 포함하지 않는 반면, 다른 것은 이를 포함한다.
하나의 구현예에서, 제1 및 제2 친수성 중성 올리고당류는 둘 다 이의 구조에 GlcNAc 또는 GalNAc 단위, 바람직하게는 GlcNAc 단위를 포함한다.
하나의 구현예에서, 제1 및 제2 친수성 중성 올리고당류 중 하나는 그 구조에 다른 것보다 많은 GlcNAc 또는 GalNAc 단위, 바람직하게는 GlcNAc 단위를 포함한다. 바람직한 구현예에 따르면, 제1 및 제2 올리고당류는 화학식 1a를 특징으로 하며, 보다 바람직하게는 R1은 H이고, R3a는 N-아세틸-락토사미닐 및/또는 락토-N-바이오실기로 임의 치환된 N-아세틸-락토사미닐기이고; 임의의 N-아세틸-락토사미닐 및 락토-N-바이오실기는 하나 이상의 푸코실 잔기로 치환될 수 있고, R4a는 H이다. 더욱 바람직하게는, 올리고당류 중 하나는 사당류, 예로, LNnT이며, 다른 하나는 오당류 또는 육당류, 예로, pLNnH이다. 또 다른 바람직한 구현예에 따르면, 제1 및 제2 올리고당류는 화학식 1b를 특징으로 하며, 보다 바람직하게는 R1은 H이고, R3b는 N-아세틸-글루코사미닐, N-아세틸-락토사미닐 및/또는 락토-N-바이오실기를 포함하는 글리코실 잔기로 임의 치환된 락토-N-바이오실기이고; 임의의 N-아세틸-락토사미닐 및 락토-N-바이오실기는 하나 이상의 푸코실 잔기로 치환될 수 있고, R4b는 H이다. 더욱 바람직하게는, 올리고당류 중 하나는 사당류, 예로, LNT이며, 다른 하나는 오당류 또는 육당류, 예로, pLNH II이다.
실시예
일반사항: 사용 전에, PS-DVB 또는 BPS-DVB 수지를 2시간 동안 30% 아세트산 용액 중에 혼합하고 이에 의해 탈기시켰다. 이어서 이들을 유리 칼럼에 충전하고 500 μS/㎝ 미만 전도성에 도달할 때까지 물로 세척하였다.
실시예 1
2개의 유리 칼럼(l: 40 ㎝, d: 26 ㎜)을 Purosorb PAD428 BPS-DVB 수지 및 Sepabeads SP825L PS-DVB(비-브롬화) 수지로 각각 충전하였다. 10 ㎖의 수중 용해된 LNnT(500 ㎎) 및 pLNnH의 혼합물(115 ㎎, 4.35:1의 비) 용액으로 약 2.5 ㎖/분의 유속으로 각각의 수지 상에서 크로마토그래피를 거쳤다. 분획(약 20 ㎖)을 수집하고 HPLC에 의해 분석하였다.
결과:
Purosorb PAD428 브롬화 PS-DVB 수지에 대해, 8.7:1의 비로 LNnT:pLNnH를 함유하는 분획 3 내지 10(96 ㎖, 약 0.5 내지 1.67 층 부피)을 풀링하였다(77%의 LNnT를 회수함).
Sepabeads SP825L PS-DVB 수지에 대해, 4.7:1의 비로 LNnT:pLNnH를 함유하는 분획 2 내지 8(104 ㎖, 약 0.3 내지 1.17 층 부피)을 풀링하였다(98%의 LNnT를 회수함).
그 비를 배가함으로써 BPS-DVB 수지에서는 LNnT가 농축되었으나, 비-브롬화 PS-DVB 수지는 실제로 분리를 나타내지 않았다.
실시예 2
유리 칼럼(l: 40 ㎝, d: 26 ㎜)을 Purosorb PAD428 BPS-DVB 수지로 충전하였다. 20 ㎖의 수중 용해된 LNnT(1.2 g) 및 pLNnH의 혼합물(0.25 g, 4.8:1의 비) 용액으로 약 4 ㎖/분의 유속으로 크로마토그래피를 거쳤다. 분획(약 30 ㎖)을 수집하고 HPLC에 의해 분석하였다.
7.65:1의 비로 LNnT:pLNnH를 함유하는 분획 2 내지 10(240 ㎖, 약 0.5 내지 2.6 층 부피)을 풀링한 반면, 90%의 LNnT를 회수하였다.
실시예 3
유리 칼럼(l: 40 ㎝, d: 26 ㎜)을 Sepabeads SP207 BPS-DVB 수지로 충전하였다. 30 ㎖의 수중 용해된 LNnT(1.5 g), pLNnH(100 ㎎) 및 F-pLNnH의 혼합물(Galβ1-4[Fucα1-3]GlcNAcβ1-3Galβ1-4GlcNAcβ1-3Galβ1-4Glc, WO 2016/063261 참고, 50 ㎎; 30:2:1의 비) 용액으로 약 6 ㎖/분의 유속으로 크로마토그래피를 거쳤다. 분획(약 30 ㎖)을 수집하고 HPLC에 의해 분석하였다.
129:2.6:1의 비로 LNnT:pLNnH:Galβ1-4[Fucα1-3]GlcNAcβ1-3Galβ1-4GlcNAcβ1-3Galβ1-4Glc를 함유하는 분획 3 내지 14(400 ㎖)를 풀링하였다.
실시예 4
LacZ-, LacY+ 표현형의 유전적으로 변형된 대장균 세포를 사용한 발효에 의해 LNnT를 제조하였고, 여기서 상기 세포는 UDP-GlcNAc의 GlcNAc를 내재화된 락토스로 전달할 수 있는 β-1,3-N-아세틸-글루코사미닐 트랜스퍼라제를 인코딩하는 재조합 유전자, UDP-Gal의 갈락토실 잔기를 N-아세틸-글루코사미닐화 락토스로 전달할 수 있는 β-1,4-갈락토실 트랜스퍼라제를 인코딩하는 재조합 유전자, 및 UDP-GlcNAc 및 UDP-Gal에 대한 생합성 경로를 인코딩하는 유전자를 포함한다. 외인성으로 첨가된 락토스 및 적합한 탄소원의 존재 하에 상기 세포를 배양함으로써 발효를 수행하고, 이에 따라 배양 발효액 중 락토-N-트리오스 II, pLNnH 및 락토스가 동반되는 LNnT를 생산하였다. 배양액으로 UF, 투석여과를 포함하는 NF, 및 활성탄으로의 탈색 및 이온 교환 처리(양이온성 및 음이온성 모두)에 의한 표준 세포 제거 공정을 거쳤다. 수득된 용액은 LNnT(30 g/ℓ), 락토스, 락토-N-트리오스 II 및 pLNnH(LNnT 대비 10.6%)를 함유하였다. Sepabeads SP207 BPS-DVB 수지(100 ㎖ 층 부피 당 대략 1.6 g LNnT)가 충전된 칼럼 상으로 용액을 로딩하고 0.02%의 이소프로판올을 함유하는 물로 용출하였다. 약 1.1 내지 2.1 층 부피의 분획을 수집하였다. HPLC 분석은 82%의 LNnT가 회수되었고 pLNnH의 양이 LNnT 대비 0.3%로 감소됨을 나타내었다.
실시예 5
LacZ-, LacY+ 표현형의 유전적으로 변형된 대장균 세포를 사용한 발효에 의해 LNT를 제조하였고, 여기서 상기 세포는 UDP-GlcNAc의 GlcNAc를 내재화된 락토스로 전달할 수 있는 β-1,3-N-아세틸-글루코사미닐 트랜스퍼라제를 인코딩하는 재조합 유전자, UDP-Gal의 갈락토실 잔기를 N-아세틸-글루코사미닐화 락토스로 전달할 수 있는 β-1,3-갈락토실 트랜스퍼라제를 인코딩하는 재조합 유전자, 및 UDP-GlcNAc 및 UDP-Gal에 대한 생합성 경로를 인코딩하는 유전자를 포함한다. 외인성으로 첨가된 락토스 및 적합한 탄소원의 존재 하에 상기 세포를 배양함으로써 발효를 수행하고, 이에 따라 배양 발효액 중 락토-N-트리오스 II, pLNH II 및 락토스가 동반되는 LNT를 생산하였다. 배양액으로 UF, 투석여과를 포함하는 NF, 및 활성탄으로의 탈색 및 이온 교환 처리(양이온성 및 음이온성 모두)에 의한 표준 세포 제거 공정을 거쳤다. 수득된 용액은 LNT(20.7 g/㎏, HPLC에 의한 순도: 76.1%), 락토스, 락토-N-트리오스 II 및 pLNH II(LNT 대비 3.23%)를 함유하였다. 용액을 냉동-건조하였다. 냉동 건조 분말의 샘플(3.40 g)을 45 ㎖의 수중 용해시키고, Sepabeads SP207 BPS-DVB 수지(칼럼 지름: 1.6 ㎝, 층 부피: 170 ㎖)가 충전된 칼럼 상으로 용액을 로딩하고 물(1.5 층 부피)에 이어 20% 메탄올로 용출하였다. 분획 부피는 170 ㎖이었다. 분획 11 내지 26을 풀링하고 냉동-건조하여 2.85 g의 고체를 산출하였다. HPLC 분석은 LNT의 순도가 81.3%로 증가된 반면, pLNH II의 양이 LNT 대비 0.25%로 감소됨을 나타내었다.

Claims (22)

  1. 디비닐벤젠으로 가교된 브롬 작용화된 폴리스티렌(BPS-DVB) 정지 매질 상에서 제1 및 제2 올리고당류를 포함하는 수용액으로 크로마토그래피를 거치는 단계를 포함하는, 제2 친수성 중성 올리고당류로부터 제1 친수성 중성 올리고당류를 분리하는 방법.
  2. 청구항 1에 있어서,
    상기 BPS-DVB 매질의 브롬화 수준이 건조 중량 당 약 25 w/w% 내지 61 w/w%인 방법.
  3. 청구항 1 또는 청구항 2에 있어서,
    상기 제1 및 제2 올리고당류가 수성 배양 매질 중에서 바람직하게는 대장균에 의한 발효에 의해 세포내 생산된 후, 수성 배양 매질 내로 분비되거나, 수송되거나 운반되는 방법.
  4. 청구항 3에 있어서,
    상기 BPS-DVB 매질 상의 크로마토그래피에 적어도 하나의 하기 단계가 선행되는 방법:
    a) 수성 배양 매질을 청정화하여 이로부터 발효 공정 유래의 미립자 및 오염물질, 바람직하게는 세포, 세포 성분 및 임의의 불용성 대사물질 및 파편을 제거하여 청정화된 수성 매질을 제공하는 단계,
    b) 수성 매질로부터, 바람직하게는 단계 a)의 청정화된 수성 매질로부터 실질적으로 모든 단백질을 제거하여 단백질-비함유 수성 매질을 제공하는 단계,
    c) 수성 배양 매질로부터, 단계 a)의 청정화된 수성 매질로부터, 또는 단계 b)의 단백질-비함유 수성 매질로부터 염 및 하전된 성분을 제거하는 단계.
  5. 청구항 4에 있어서,
    단계 a), b) 및/또는 c)가 초여과, 나노여과, 이온 교환 처리 및 선택적 활성탄 처리를 포함하는 방법.
  6. 청구항 1 내지 청구항 5 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 올리고당류 중 하나에서의 단당류 단위의 수가 다른 올리고당류에서의 단당류 단위의 수보다 많은 방법.
  7. 청구항 6에 있어서,
    상기 올리고당류 중 하나는 다른 올리고당류보다 적어도 2개 더 많은 단당류 단위로 구성되는 방법.
  8. 청구항 6 또는 청구항 7에 있어서,
    적어도 하나의 올리고당류는 GlcNAc- 또는 GalNAc-모이어티를 포함하는 방법.
  9. 청구항 8에 있어서,
    두 올리고당류는 모두 GlcNAc- 또는 GalNAc-모이어티를 포함하는 방법.
  10. 청구항 9에 있어서,
    상기 올리고당류 중 하나는 다른 올리고당류보다 많은 GlcNAc- 또는 GalNAc-모이어티를 포함하는 방법.
  11. 청구항 10에 있어서,
    고급 올리고당류는 저급 올리고당류보다 많은 GlcNAc- 또는 GalNAc-모이어티를 포함하는 방법.
  12. 청구항 6 내지 청구항 11 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 올리고당류 중 하나는 사당류이고 다른 올리고당류는 육당류 또는 칠당류인 방법.
  13. 청구항 1 내지 청구항 5 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 제1 및 제2 올리고당류는 인간 모유 올리고당류(HMO)인 방법.
  14. 청구항 13에 있어서,
    상기 HMO 중 하나에서의 단당류 단위의 수는 다른 HMO에서의 단당류 단위의 수보다 많은 방법.
  15. 청구항 14에 있어서,
    상기 HMO 중 하나는 다른 HMO보다 적어도 2개 더 많은 단당류 단위로 구성되는 방법.
  16. 청구항 13 내지 청구항 15 중 어느 한 항에 있어서,
    적어도 하나의 HMO는 GlcNAc-모이어티를 포함하는 방법.
  17. 청구항 16에 있어서,
    두 HMO는 모두 GlcNAc-모이어티를 포함하는 방법.
  18. 청구항 17에 있어서,
    상기 HMO 중 하나는 다른 HMO보다 많은 GlcNAc-모이어티를 포함하는 방법.
  19. 청구항 18에 있어서,
    고급 HMO는 저급 HMO보다 많은 GlcNAc-모이어티를 포함하는 방법.
  20. 청구항 13 내지 청구항 19 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 HMO 중 하나는 사당류이고 다른 HMO는 육당류 또는 칠당류인 방법.
  21. 청구항 12 또는 청구항 20에 있어서,
    상기 사당류는 LNnT이고 상기 육당류는 pLNnH인 방법.
  22. 청구항 12 또는 청구항 20에 있어서,
    상기 사당류는 LNT이고 상기 육당류는 pLNH II인 방법.

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