CN113226506A - 寡糖的分离 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及在与二乙烯基苯交联的溴官能化的聚苯乙烯(BPS‑DVB)固定介质上用层析使两种亲水性中性寡糖彼此分离的方法。

Description

寡糖的分离
技术领域
本发明涉及用于将通过发酵或酶促法生产的两种亲水性中性寡糖，优选至少两种中性人乳寡糖(HMO)彼此分离的方法。具体地，至少两种中性寡糖中的一种具有比另一种更高的分子量，并且它们在疏水性固定相上示出分区。
背景技术
近年来，已经做出越来越多的努力来生产工业上复杂的碳水化合物，诸如分泌的寡糖。这是由于这类化合物在活生物体中的许多生物过程中的作用。分泌的寡糖，诸如人乳寡糖(HMO)，已成为营养和治疗应用中特别重要的商业目标。人乳寡糖由于其在人的成长中的重要作用而在过去几年中成为极大的关注。迄今为止，已经确定140多种HMO的结构，并且显著更多的HMO可能存在于人乳中(Urashima等人：乳寡糖(Milk oligosaccharides)，NovaBiomedical Books,2011；Chen Adv.Carbohydr.Chem.Biochem.72,113(2015))。
人们一直在寻找低成本的方法来生产尽可能多的HMO的工业数量，使得全世界的研究人员和公司可研究、开发和利用它们在婴儿、儿童和成人的营养和治疗配方中的用途。目前，HMO已通过酶促，或大部分通过使用转化的单细胞生物(尤其是大肠杆菌(E.coli.))发酵生产的。然而，这些方法提供伴有另一种寡糖/HMO副产物的目的HMO。通常，2'-FL主要伴有DFL和/或3-FL(参见例如EP-A-2896628、WO 2015/032412、WO 2015/106943)，LNnT发酵液包含乳-N-三糖II(GlcNAcβ1-3Galβ1-4Glc)和高级寡糖如pLNnH(Galβ1-4GlcNAcβ1-3Galβ1-4GlcNAcβ1-3Galβ1-4Glc)(参见例如WO 01/04341，Priem等人，Glycobiology 12,235(2002)、Gebus等人Carbohydr.Res.361,83(2012)、WO 2017/182965)，并且LNT被乳-N-三糖II和高级寡糖如pLNH II(Galβ1-3GlcNAcβ1-3Galβ1-3GlcNAcβ1-3Galβ1-4Glc)(参见例如WO 2015/049331、WO 2017/182965)污染。
WO 2017/182965提出如何将通过发酵制备的寡糖混合物与发酵液的非碳水化合物组分(诸如生物质、酸、碱、有机和无机盐、蛋白质、蛋白质片段、DNA、内毒素、生物胺、着色体等)分离的方法，该方法包括超滤、纳滤和应用离子交换树脂，其包括直接用以H+形式的强阳离子交换树脂处理，然后用以游离碱形式的弱阴离子交换树脂处理。然而，此方法没有将寡糖组分彼此显著分离。
EP-A-2896628描述一种从发酵液中纯化2'-FL的方法，该方法包括以下步骤：超滤、强阳离子交换树脂处理(H+形式)、中和、强阴离子交换树脂处理(Cl-形式)、中和、纳滤/渗滤、活性炭处理、电渗析、强阳离子交换树脂处理(Na+形式)、强阴离子交换树脂处理(Cl-形式)、活性炭处理和电渗析，强调不采用层析。尽管该方法提供纯度为94％-94.5％(通过HPLC)的2'-FL，但是该申请没有提及存在于最终产品中的约5％的主要碳水化合物污染物(诸如3-FL、DFL和乳糖)的量是否通过此方法减少。
将结构接近的寡糖彼此分离是非常困难的任务，因为它们的特性非常相似。凝胶过滤当然是一种选择(参见例如Priem等人《糖生物学》12,235(2002))，然而它被认为是实验室方法而不是工业上有用的方法。
WO 2015/049331公开一种从发酵液中纯化LNT的方法，该方法包括以下操作步骤：提供澄清的无粒子溶液、电渗析/纳滤、第一模拟移动床(SMB)强阳离子交换树脂层析、电渗析、超滤。使用某些SMB参数，在萃余液中分馏LNT和较大的中性寡糖，而较小的碳水化合物(乳糖、单糖)富集在提取物级分中。为了进一步从高级寡糖中纯化LNT，用不同的参数进行第二SMB层析，导致LNT富集在提取物级分中。
然而，仍然需要适用于工业放大，用于将LNT、LNnT和其它中性HMO与发酵方法中经常制备的伴随的碳水化合物副产物分离和纯化的替代、更有效、稳健和/或具有成本效益的规程。
发明内容
根据本发明，提供一种在水性介质中将第一亲水性中性寡糖与第二亲水性中性寡糖分离的方法，该方法包括通过使用疏水性固定相的层析处理水性介质，所述疏水性固定相为与二乙烯基苯交联的聚苯乙烯(PS-DVB)，并且在芳香环上用溴官能化。当水性介质与溴官能化的PS-DVB(BPS-DVB)疏水性固定层析介质接触时，寡糖中的一种比另一种更多地被固定固相保留，从而可获得各自的寡糖的富集或分离的级分。
在一个实施方式中，在一种亲水性中性寡糖中的单糖单元的数量高于在另一种亲水性中性寡糖中的单糖单元的数量。
在其它实施方式中，亲水性中性寡糖中的一种的组成比另一种的组成多至少两个单糖单元。
在其它实施方式中，亲水性中性寡糖中的一种包含至少一个N-乙酰葡萄糖氨基(GlcNAc)部分或N-乙酰半乳糖氨基(GalNAc)部分，而另一种不包含。
在其它实施方式中，亲水性中性寡糖中的一种比另一种包含更多的GlcNAc部分或GalNAc部分。
在一个实施方式中，亲水性中性寡糖中的至少一种为人乳寡糖或其前体。
在一个实施方式中，第一和第二亲水性中性寡糖是人乳寡糖或其前体。
在一个实施方式中，第一和第二亲水性中性寡糖是人乳寡糖，其中一种的组成比另一种的组成多至少两个单糖单元。
在一个实施方式中，第一和第二亲水性中性寡糖为人乳寡糖，其中一种为四糖，另一种为六糖。
在一个实施方式中，亲水性中性寡糖中的至少一种为含有GlcNAc部分的人乳寡糖。
在一个实施方式中，第一和第二亲水性中性寡糖为人乳寡糖，并且两者均包含GlcNAc部分。
在一个实施方式中，第一和第二亲水性中性寡糖为人乳寡糖，两者均包含GlcNAc部分，并且其中的一种的组成比另一种的组成多至少两个单糖单元。
在一个实施方式中，第一和第二亲水性中性寡糖为人乳寡糖，并且其中的一种比另一种包含更多的GlcNAc部分。
在一个实施方式中，第一和第二亲水性中性寡糖为人乳寡糖，两者均包含GlcNAc部分，并且其中的一种比另一个包含更多的GlcNAc部分。
在一个实施方式中，第一和第二亲水性中性寡糖为人乳寡糖，其中的一种的组成比另一种的组成多至少两个单糖单元，并且高级寡糖(即具有更多单糖单元的寡糖)比低级寡糖包含更多的GlcNAc部分。
在一个实施方式中，第一和第二亲水性中性寡糖为人乳寡糖，其中的一种为包含两个，优选恰好两个GlcNAc部分的六糖，并且另一种为包含一个，优选恰好一个GlcNAc部分的四糖。
在一个实施方式中，人乳寡糖或其前体通过在水性培养介质中发酵，尤其通过大肠杆菌发酵在细胞内产生，并且然后分泌到水性培养介质中。
在一个实施方式中，在通过BPS-DVB层析处理包含人乳寡糖或其前体的水性介质之前，进行以下步骤中的一个或两个：
a)将水性介质澄清以去除来自发酵过程的颗粒和污染物，并且有利地还去除细胞组分以及任何不溶解的代谢物和碎片；和
b)从水性介质去除基本上所有蛋白质，有利地在步骤a)中将水性介质澄清之后。
在一个实施方式中，第一和第二寡糖包含LNnT和pLNnH。
在一个实施方式中，第一和第二寡糖包含LNT和pLNH II。
具体实施方式
通常，高疏水性固定层析介质(反相层析，RPC)的应用不适合分离高极性寡糖(参见例如WO 2017/221208)。本发明人惊奇地发现，只要固体层析相由与二乙烯基苯交联并且被芳香环上的溴官能化的聚苯乙烯(BPS-DVB)构成，那么RPC可适用于所述任务。
根据本发明，提供了一种用于将第一亲水性中性寡糖与第二亲水性中性寡糖至少部分分离的方法，该寡糖优选地通过发酵或在离体酶促过程中产生，该方法包括使包含第一和第二寡糖的水溶液在与二乙烯基苯交联的溴官能化的聚苯乙烯(BPS-DVB)固定介质上进行层析。
优选地，BPS-DVB树脂的溴化水平为约25-61w/w％，例如25-35w/w％。
上述层析分离过程作为间歇过程和在多柱装置中，从研发实验室到中试工厂再到工业规模都被证明是稳健的。固相和相关的层析运行可以使用例如醇水溶液应用梯度的方式进行，但是也可在完全没有有机溶剂(纯水)的情况下运行。该方法在高温(例如高至60℃)下运行良好，这从降低微生物生长的风险和提高生产率的角度提供益处。此外，固相可使用例如醋酸水溶液完全再生，并且因此非常适合与食品有关的加工。
在本发明中，术语“反相层析”或RPC优选地意指使用疏水性固定(即，填充)或悬浮相和极性(即，水性)流动相(包含要分离的组分)的任何层析方法。
术语“亲水性中性寡糖”优选地意指含有至少两个单糖单元的糖聚合物，即二、三、四或更高级寡糖。寡糖可具有含有通过糖苷间键(interglycosidic linkage)相互连接的单糖单元的直链或支链结构。优选地，寡糖由两个至八个，更优选地两个至六个单糖部分组成。显然，构成寡糖的单糖单元是中性单糖，并且不能是酸性单糖，诸如醛糖酸、酮-醛糖酸(如唾液酸)、醛糖二酸、糖醛酸或碱性单糖部分(如带有游离氨基的单糖部分)。中性单糖单元的羟基没有被保护，因此由单糖构成的寡糖也没有被保护。中性单糖单元可选自任何含有5-9个，优选地5-6个碳原子的由以下组成的单糖：醛糖(例如D-葡萄糖、D-半乳糖、D-甘露糖、D-核糖、D-阿拉伯糖、L-阿拉伯糖、D-木糖等)、酮糖(例如D-果糖、D-山梨糖、D-塔格糖等)、脱氧糖(例如L-鼠李糖、L-岩藻糖等)和N-乙酰化脱氧氨基糖(例如N-乙酰葡糖胺、N-乙酰甘露糖胺，N-乙酰半乳糖胺等)。
术语“与二乙烯基苯交联的溴官能化的聚苯乙烯”、“与二乙烯基苯交联并被溴官能化的聚苯乙烯”或“BPS-DVB”是指苯乙烯和二乙烯基苯的改性共聚物，其中至少一部分苯乙烯单体用溴苯乙烯(其中的溴在芳香环上)替换，或用溴化剂将聚苯乙烯-二乙烯基苯共聚物溴化。
术语“C1-C4醇”是指具有1至4个碳原子的烷基醇，诸如甲醇、乙醇、丙醇或丁醇。优选的C1-C4醇为异丙醇。
术语“水性介质[来自发酵或酶促过程]”优选地意指由用于产生至少一种亲水性中性寡糖的酶促或发酵过程产生的水性悬浮液。
术语“澄清的水性介质”优选地意指已被处理以去除可干扰后续纯化步骤的来自过程的悬浮的颗粒和污染物，特别是来自发酵过程的细胞、细胞组分、不溶解的代谢物和碎片的水性介质，例如酶促过程或发酵液的水性介质。这类澄清处理可以常规方式通过离心、絮凝、任选有超声处理的絮凝、重力过滤、微滤、超滤、泡沫分离或真空过滤(例如，通过可包括CeliteTM助滤器的陶瓷过滤器)进行。
术语“无蛋白质的水性介质”优选地是指被处理以去除可干扰后续纯化步骤的基本上所有蛋白质，优选地以及多肽、氨基酸、RNA、DNA和其片段以及内毒素和糖脂类的水性介质，例如酶促过程或发酵液的水性介质。蛋白质、氨基酸、RNA和DNA的这类去除可以常规方式通过离子交换层析、亲和层析、超滤、纳滤或尺寸排阻层析完成。
术语“高级寡糖”意指其聚合度高于另一种寡糖，即其比另一种寡糖包含更多的单糖单元。
术语“低级寡糖”意指其聚合度低于另一种寡糖，即其比另一种寡糖包含更少的单糖单元。
所要求保护的分离方法可以常规方式进行。包含第一和第二亲水性中性寡糖的水溶液用作层析中的流动相。可将有机溶剂，优选地C1-C4醇添加到水溶液。水溶液的pH优选地在3至8之间，更优选地在4至7之间。必要时，可以常规方式通过添加酸、碱或缓冲剂的水溶液将pH调节至所需值。通过使用常规层析柱或实验室或工业规模的容器可容易地进行分离，其中BPS-DVB树脂可填充或悬浮(例如，呈珠状)。优选地，分离方法在柱中进行。
分离程度取决于许多参数，诸如洗脱液的性质、流动/洗脱速率、收集的级分的体积、相对于树脂质量或树脂床体积的第一和第二寡糖的质量等。这些参数可用常规技能进行优化。术语“分离”意指第一和第二寡糖彼此完全分离，即，它们以不含有彼此的纯形式从级分中收集和分离。另外，术语“分离”意指部分分离，其中寡糖中的至少一种可以纯形式从至少一种级分获得，或第一和第二寡糖在级分中的比率与在进料溶液中不同，从而富集寡糖中的一种。
在借助于如上文公开的BPS-DVB层析将第一亲水性中性寡糖与第二亲水性中性寡糖分离进行后，然后可以常规方式(例如通过蒸发、结晶、冷冻干燥或喷雾干燥)从收集其的水性级分中分离纯化或富集的第一和/或第二寡糖。
优选地，在BPS-DVB固定介质上的层析包括：
-将包含第一和第二亲水性中性寡糖的水溶液加载到BPS-DVB介质上，
-用水(任选地含有C1-C4醇)洗脱，并且然后
-收集包含或富集有寡糖中的一种的级分。
在层析之后，可通过用含有与水混溶的有机溶剂的水洗脱来再生BPS-DVB介质并且再循环利用。
还优选地，包含第一和第二亲水性中性寡糖的水溶液为预处理的其中产生/包含第一和第二寡糖的发酵液或水性反应介质。
此方法的一个方面涉及将第一亲水性中性寡糖和第二亲水性中性寡糖至少部分地彼此分离，所述寡糖在水性培养介质中通过发酵，优选通过大肠杆菌发酵在细胞内产生，并且然后分泌、运输或带入水性培养介质中。在BPS-DVB层析之前，该方法可涉及以下预处理步骤：
a)将水性培养介质澄清以从其去除来自发酵过程的颗粒和污染物，优选地还有细胞、细胞组分和任何不溶解的代谢物和碎片，以提供澄清的水性介质，和/或
b)从水性介质，优选地从步骤a)的澄清的水性介质中去除基本上所有的蛋白质，以提供无蛋白质的水性介质，和/或
c)从水性培养介质，从步骤a)的澄清的水性介质或从步骤b)的无蛋白质的水性介质去除盐和带电荷组分。
因此，将来自步骤a)的澄清的水性介质，来自步骤b)的无蛋白质的水性介质或在步骤c)中获得的水性介质加载到BPS-DVB树脂上。
方法的另一个方面涉及将第一和第二亲水中性寡糖至少部分地彼此分离，寡糖中的至少一种在水性介质中离体酶促产生。除产生的目的寡糖外，离体酶促反应混合物通常含有蛋白质、蛋白质片段、无机盐、未反应的碳水化合物受体(通常为乳糖)或供体、类糖副产物、碳水化合物离去基团(通常为单糖或二糖)等。在BPS-DVB层析之前，该方法可涉及以下预处理步骤：超滤(UF)、纳滤(NF)和任选的活性炭(AC)处理。UF包括将高分子量的悬浮固体(通常为蛋白质或蛋白质片段)与通过渗透液中超滤膜的水性介质的可溶组分分离。此UF渗透液(UFP)为含有产生的伴有其它碳水化合物产物的寡糖的水溶液。NF步骤可在UF步骤或AC处理的任选的步骤之后；此步骤可有利地用于浓缩包含产生的伴有其它碳水化合物产物的寡糖的先前处理的水性介质和/或去除离子，主要是单价离子和分子量低于寡糖产物的分子量的有机材料，诸如单糖。就这一点而言，产生的伴有其它寡糖的寡糖积聚在NF保留物(NFR)中。NF可与水的渗滤结合以更有效地去除可渗透分子，例如直到渗透液的电导率示出无盐或盐的存在量非常低。可选的AC步骤可在UF步骤、NF步骤或BPS-DVB树脂之后。如果需要，AC处理有助于去除或至少减少着色剂和/或水溶性污染物(诸如盐)的量。
在所要求保护的分离方法的一个实施方式中，通过以下步骤处理水性介质，该水性介质可直接来自酶促或优选发酵过程，特别是大肠杆菌或酵母的发酵过程，并且其含有第一和第二亲水性中性寡糖：
1)将水性介质澄清以去除来自发酵过程的颗粒和污染物，特别是细胞、细胞组分、不溶解的代谢物和碎片；然后
2)从步骤1)中获得的水溶液去除可干扰后续纯化步骤的基本上所有蛋白质以及肽、氨基酸、RNA和DNA以及任何内毒素和糖脂类；并且然后
3)通过在BPS-DVB上的层析，从步骤2)中获得的水溶液分离第一和第二寡糖。
在步骤1)中，以常规方式，例如通过离心或过滤，将含有第一和第二寡糖的水性介质澄清。优选地，首先将水性介质絮凝，并且然后离心或过滤以除去任何残余的不溶解的颗粒和污染物，以及细胞和细胞组分以及不溶解的代谢物和碎片。
在步骤2)中，以常规方式，例如通过超滤、纳滤、切向流高效过滤、切向流超滤、亲和层析、离子交换层析、疏水相互作用层析、凝胶过滤、尺寸排阻层析、活性炭处理从水性介质去除蛋白质和相关杂质。如果需要，活性炭处理有助于去除或至少减少着色剂和/或水溶性污染物(诸如盐)的量。离子交换层析有效去除带电荷组分，诸如盐、发色体、蛋白质、氨基酸、脂质和DNA。
在通过在上述BPS-DVB上的层析将第一亲水性中性寡糖与第二亲水性中性寡糖分离的方法中，包括任何优选和/或公开的实施方式，第一和第二寡糖在至少一个结构特征上彼此不同，例如至少一个单糖单元不同，单糖单元的数量不同，或糖苷间键中的至少一个的方向不同(无论其为α或β)。在一个实施方式中，寡糖中的一种的组成比另一种的组成多一个单糖单元。在其它实施方式中，寡糖中的一种的组成比另一种的组成多两个或至少两个单糖单元，例如，寡糖中的一种为三糖，而另一种为五糖，或寡糖中的一种为四糖，而另一种为六糖。在其它实施方式中，寡糖中的一种包含至少一个GlcNAc单元或GalNAc单元，优选地GlcNAc单元，而另一种不包含。在其它实施方式中，寡糖中的一种比另一种包含更多的GlcNAc单元或GalNAc单元，优选地GlcNAc单元。
优选地，寡糖中的一种包含另一种寡糖的结构，即寡糖中的一种为另一种的糖基化衍生物。更优选地，糖基化包括附接至少两个单糖单元。甚至更优选地，第一和第二寡糖共享的结构为乳糖或其糖基化衍生物。
还优选地，第一和第二亲水性中性寡糖在还原端包含乳糖(Galβ1-4Glc)部分。更优选地，第一和第二亲水性中性寡糖的特征在于下式1
Figure BDA0003118801870000091
R1为岩藻糖基或H，
R2为岩藻糖基或H，
R3选自H、N-乙酰基-葡萄糖氨基、N-乙酰基-乳糖氨基和乳-N-二糖基(lacto-N-biosyl)，其中N-乙酰基-乳糖氨基或乳-N-二糖基可携带包含一个或多个N-乙酰基-葡萄糖氨基、N-乙酰基-乳糖氨基和/或乳-N-二糖基的糖基残基；N-乙酰基-乳糖氨基和乳-N-二糖基中的任一种可被一个或多个岩藻糖基残基取代，
R4选自H、N-乙酰基-葡萄糖氨基和N-乙酰基-乳糖氨基，其中N-乙酰基-乳糖氨基可任选地被包含一个或多个N-乙酰基-葡萄糖氨基、N-乙酰基-乳糖氨基和/或一个或多个乳-N-二糖基的糖基残基取代；N-乙酰基-乳糖氨基和乳-N-二糖基中的任一种可被一个或多个岩藻糖基残基取代；甚至更优选地，式1的特征可在于式1a、1b或1c
Figure BDA0003118801870000101
其中R1和R2如上文所定义，
R3a为N-乙酰基-葡萄糖氨基，或任选地被包含N-乙酰基-葡萄糖氨基、N-乙酰基-乳糖氨基和/或乳-N-二糖基的糖基残基取代的N-乙酰基-乳糖氨基；N-乙酰基-乳糖氨基和乳-N-二糖基中的任一种可被一个或多个岩藻糖基残基取代，
R4a为H，或N-乙酰基-葡萄糖氨基，或任选地被N-乙酰基-葡萄糖氨基或乳-N-二糖基取代的N-乙酰基-乳糖氨基；N-乙酰基-乳糖氨基和乳-N-二糖基中的任一种可被一个或多个岩藻糖基残基取代，
R3b为N-乙酰基-葡萄糖氨基，或任选地被包含N-乙酰基-葡萄糖氨基、N-乙酰基-乳糖氨基和/或乳-N-二糖基的糖基残基取代的乳-N-二糖基；N-乙酰基-乳糖氨基和乳-N-二糖基中的任一种可被一个或多个岩藻糖基残基取代，
R4b为H，或N-乙酰基-葡萄糖氨基，或任选被一个或两个N-乙酰基-葡萄糖氨基、N-乙酰基-乳糖氨基和/或一个乳-N-二糖基取代的N-乙酰基-乳糖氨基；N-乙酰基-乳糖氨基和乳-N-二糖基中的任一种可被一个或多个岩藻糖基残基取代；
再更优选地，式1a和1b的特征在于：
-R3a的糖基残基中的N-乙酰基-乳糖氨基用1-3个糖苷间键附接到另一个N-乙酰基-乳糖氨基，
-R3a的糖基残基中的乳-N-二糖基用1-3个糖苷间键附接到N-乙酰基-乳糖氨基，
-R4a的糖基残基中的乳-N-二糖基用1-3个糖苷间键附接到N-乙酰基-乳糖氨基，
-R4b的糖基残基中的N-乙酰基-乳糖氨基用1-3或1-6个糖苷间键附接到另一个N-乙酰基-乳糖氨基，
-R4b的糖基残基中的乳-N-二糖基用1-3个糖苷间键附接到N-乙酰基-乳糖氨基。
还更优选地，根据式1a、1b和1c的化合物为人乳寡糖，特别地，式1a的优选化合物为乳-N-新四糖、对乳-N-六糖、对乳-N-新六糖、乳-N-新六糖、对乳-N-八糖或乳-N-新八糖，它们都可任选地被一个或多个岩藻糖基残基取代；并且式1b的优选化合物为乳-N-四糖、乳-N-六糖、乳-N-八糖、异乳-N-八糖、乳-N-十糖或乳-N-新十糖，它们都可任选地被一个或多个岩藻糖基残基取代。特别地，式1a或1b的化合物特征在于附接到N-乙酰基-乳糖氨基和/或乳-N-二糖基的岩藻糖基残基
-用1-2个糖苷间键连接到乳-N-二糖基的半乳糖和/或
-用1-4个糖苷间键连接到乳-N-二糖基的N-乙酰基-葡萄糖氨基和/或
-用1-3个糖苷间键连接到N-乙酰基-乳糖氨基的N-乙酰基-葡萄糖氨基。
根据最优选的方面，子式1a、1b和1c的化合物选自：乳糖、2'-岩藻糖基乳糖、3-岩藻糖基乳糖、2',3-二岩藻糖基乳糖、乳-N-四糖、乳-N-新四糖、LNFP I、LNFP II、LNFP III、LNFP V、LNFP VI、LNDFH I、LNDFH II、LNDFH III、pLNnH、单岩藻糖基化的pLNnH、pLNH II、单岩藻糖基化的pLNH II和乳-N-三糖II。
在一个实施方式中，第一和第二亲水性中性寡糖中的一种在其结构中不包含GlcNAc单元或GalNAc单元，而另一种包含。
在一个实施方式中，第一和第二亲水性中性寡糖均在其结构中包含GlcNAc单元或GalNAc单元，优选GlcNAc单元。
在一个实施方式中，第一和第二亲水性中性寡糖中的一种在其结构中比另一种包含更多的GlcNAc单元或GalNAc单元，优选GlcNAc单元。根据优选的实施方式，第一和第二寡糖的特征在于式1a，更优选地R1为H，R3a为任选地被N-乙酰基-乳糖氨基和/或乳-N-二糖基取代的N-乙酰基-乳糖氨基；N-乙酰基-乳糖氨基和乳-N-二糖基中的任一种可被一个或多个岩藻糖基残基取代，并且R4a为H。甚至更优选地，寡糖中的一种为四糖，例如LNnT，并且另一种为五糖或六糖，例如pLNnH。根据另一个优选的实施方式，第一和第二寡糖的特征在于式1b，更优选地，R1是H，R3b为任选地被包含N-乙酰基-葡萄糖氨基、N-乙酰基-乳糖氨基和/或乳-N-二糖基的糖基残基取代的乳-N-二糖基；N-乙酰基-乳糖氨基和乳-N-二糖基中的任一种可被一个或多个岩藻糖基残基取代，并且R4b为H。甚至更优选地，寡糖中的一种为四糖，例如LNT，并且另一种为五糖或六糖，例如pLNH II。
实施例
概述：使用前，将PS-DVB或BPS-DVB树脂在30％的醋酸溶液中混合2小时，并由此脱气。然后将它们填充到玻璃柱中，并用水洗涤，直到电导率达到小于500μS/cm。
实施例1
分别用Purosorb PAD428 BPS-DVB树脂和Sepabeads SP825L PS-DVB(非溴化)树脂填充两个玻璃柱(1:40cm，d：26mm)。将LNnT(500mg)和pLNnH(115mg，比率为4.35:1)的混合物溶解在10ml水中的溶液在每种树脂上进行层析，其中流速为约2.5ml/min。收集级分(约20ml)，并通过HPLC分析。
结果：
对于Purosorb PAD428溴化的PS-DVB树脂，合并级分3-10(96ml，约0.5-1.67床体积)，其含有比率为8.7:1的LNnT:pLNnH(回收77％的LNnT)。
对于Sepabeads SP825L PS-DVB树脂，合并级分2-8(104ml，约0.3-1.17床体积)，其含有比率为4.7:1的LNnT:pLNnH(回收98％的LNnT)。
BPS-DVB树脂通过使LNnT的比率增加一倍来富集LNnT，而未溴化的PS-DVB树脂示出几乎没有分离。
实施例2
用Purosorb PAD428 BPS-DVB树脂填充玻璃柱(1:40cm，d：26mm)。将LNnT(1.2g)和pLNnH(0.25g，比率为4.8:1)的混合物溶解在20ml水中的溶液进行层析，其中流速为约4ml/min。收集级分(约30ml)，并通过HPLC分析。
合并级分2-10(240ml，约0.5-2.6床体积)，其含有比率为7.65:1的LNnT:pLNnH(回收90％的LNnT)。
实施例3
用Sepabeads SP207 BPS-DVB树脂填充玻璃柱(1:40cm，d：26mm)。将LNnT(1.5g)、pLNnH(100mg)和F-pLNnH(Galβ1-4[Fucα1-3]GlcNAcβ1-3Galβ1-4GlcNAcβ1-3Galβ1-4Glc，参见WO 2016/063261，50mg；比率为30:2:1)的混合物溶解在30ml水中的溶液进行层析，其中流速为约6ml/min。收集级分(约30ml)，并通过HPLC分析。
合并级分3-14(400ml)，其含有比率为129:2.6:1的LNnT:pLNnH:Galβ1-4[Fucα1-3]GlcNAcβ1-3Galβ1-4GlcNAcβ1-3Galβ1-4G lc。
实施例4
LNnT通过使用LacZ-、LacY+表型的基因修饰大肠杆菌细胞发酵制得，其中所述细胞包含编码能够将UDP-GlcNAc的GlcNAc转移到内在化乳糖的β-l,3-N-乙酰基-葡萄糖氨基转移酶的重组基因，编码能够将UDP-Gal的半乳糖基残基转移到N-乙酰基-葡萄糖氨基化的乳糖的β-l,4-半乳糖基转移酶的重组基因，以及编码UDP-GlcNAc和UDP-Gal生物合成途径的基因。通过在外源添加的乳糖和合适的碳源存在下培养所述细胞来进行发酵，从而产生LNnT，其在发酵液中伴有乳-N-三糖II、pLNnH和乳糖。通过UF、用渗滤的NF、用活性炭的脱色和离子交换处理(阳离子和阴离子)对发酵液进行标准的细胞去除操作。所获得的溶液含有LNnT(30g/l)、乳糖、乳-N-三糖II和pLNnH(相对于FNnT为10.6％)。将溶液加载到填充有Sepabeads SP207 BPS-DVB树脂的柱上(每100ml床体积约1.6g LNnT)，并用含有0.02％异丙醇的水洗脱。收集约1.1-2.1床体积的级分。HPLC分析示出，回收82％的LNnT，并且相对于LNnT，pLNnH的量减少到0.3％。
实施例5
LNT通过使用LacZ-、LacY+表型的基因修饰大肠杆菌细胞发酵制得，其中所述细胞包含编码能够将UDP-GlcNAc的GlcNAc转移到内在化乳糖的β-l,3-N-乙酰基-葡萄糖氨基转移酶的重组基因，编码能够将UDP-Gal的半乳糖基残基转移到N-乙酰基-葡萄糖氨基化的乳糖的β-l,3-半乳糖基转移酶的重组基因，以及编码UDP-GlcNAc和UDP-Gal生物合成途径的基因。通过在外源添加的乳糖和合适的碳源存在下培养所述细胞来进行发酵，从而产生LNT，其在发酵液中伴有乳-N-三糖II、pLNH II和乳糖。通过UF、用渗滤的NF、用活性炭的脱色和离子交换处理(阳离子和阴离子)对发酵液进行标准的细胞去除操作。所获得的溶液含有LNT(20.7g/kg，通过HPLC的纯度：76.1％)、乳糖、乳-N-三糖II和pLNH II(相对于LNT为3.23％)。将溶液冷冻干燥。将冻干粉末样品(3.40g)溶解在45ml水中，并将溶液加载到填充有Sepabeads SP207 BPS-DVB树脂(柱直径：1.6cm，床体积：170ml)的柱上，并用水(1.5床体积)洗脱，然后用20％甲醇洗脱。级分体积为170ml。合并级分11-26，并冷冻干燥，得到2.85g固体。HPLC分析示出，LNT的纯度提高到81.3％，而pLNH II的量相对于LNT降低到0.25％。

Claims (22)

1.一种用于将第一亲水性中性寡糖与第二亲水性中性寡糖分离的方法，其包括使包含第一和第二寡糖的水溶液在与二乙烯基苯交联的溴官能化的聚苯乙烯(BPS-DVB)固定介质上进行层析。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述BPS-DVB介质的溴化水平为每干重约25-61w/w％。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述第一和第二寡糖通过在水性培养介质中发酵，优选通过大肠杆菌(E.coli)发酵而在细胞内产生并且然后分泌、运输或带入到所述水性培养介质中。
4.根据权利要求3所述的方法，其中在所述BPS-DVB介质上的层析之前进行以下步骤中的至少一个：
a)将所述水性培养介质澄清以从其去除来自发酵过程的颗粒和污染物，优选细胞、细胞组分和任何不溶解的代谢物和碎片，以提供澄清的水性介质，
b)从水性介质，优选从步骤a)的所述澄清的水性介质中去除基本上所有的蛋白质，以提供无蛋白质的水性介质，
c)从所述水性培养介质、从步骤a)的所述澄清的水性介质、或从步骤b)的所述无蛋白质的水性介质去除盐和带电荷组分。
5.根据权利要求4所述的方法，其中步骤a)、b)和/或c)包括超滤、纳滤、离子交换处理和任选的活性炭处理。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其中在所述寡糖中的一种中的单糖单元的数量高于在另一种寡糖中的单糖单元的数量。
7.根据权利要求6所述的方法，其中所述寡糖中的一种的组成比另一种寡糖的组成多至少两个单糖单元。
8.根据权利要求6或7所述的方法，其中所述寡糖中的至少一种包含GlcNAc部分或GalNAc部分。
9.根据权利要求8所述的方法，其中两种寡糖均包含GlcNAc部分或GalNAc部分。
10.根据权利要求9所述的方法，其中所述寡糖中的一种比另一种寡糖包含更多的GlcNAc部分或GalNAc部分。
11.根据权利要求10所述的方法，其中高级寡糖比低级寡糖包含更多的GlcNAc部分或GalNAc部分。
12.根据权利要求6至11中任一项所述的方法，其中所述寡糖中的一种为四糖，另一种寡糖为六糖或七糖。
13.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其中所述第一和第二寡糖为人乳寡糖(HMO)。
14.根据权利要求13所述的方法，其中在所述HMO中的一种中的单糖单元的数量高于在另一种HMO中的单糖单元的数量。
15.根据权利要求14所述的方法，其中所述HMO中的一种的组成比另一种HMO的组成多至少两个单糖单元。
16.根据权利要求13至15中任一项所述的方法，其中所述HMO中的至少一种包含GlcNAc部分。
17.根据权利要求16所述的方法，其中两种HMO均包含GlcNAc部分。
18.根据权利要求17所述的方法，其中所述HMO中的一种比另一种HMO包含更多的GlcNAc部分。
19.根据权利要求18所述的方法，其中高级HMO比低级HMO包含更多的GlcNAc部分。
20.根据权利要求13至19中任一项所述的方法，其中所述HMO中的一种为四糖，另一种HMO为六糖或七糖。
21.根据权利要求12或20所述的方法，其中所述四糖为LNnT，所述六糖为pLNnH。
22.根据权利要求12或20所述的方法，其中所述四糖为LNT，所述六糖为pLNH II。
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