JP2022513615A - オリゴ糖の分離 - Google Patents
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Abstract
本発明は、２つの親水性の中性オリゴ糖の各々を、臭素化されたポリスチレンのジビニルベンゼン架橋物（BPS-DVB）固定媒体上でのクロマトグラフィーを用いて、互いに分離する方法に関する。
Description
本発明は、発酵又は酵素プロセスによって生産された、２つの親水性の中性オリゴ糖の各々を互いから分離するための方法、好ましくは、少なくとも２つの中性人乳オリゴ糖（HMOs）の各々を互いから分離するための方法に関する。特に、少なくとも２つのオリゴ糖のうちの１つが、他のオリゴ糖よりも高い分子量を有し、それらは、疎水性の固定相上で分配現象を示すものである。
近年、分泌オリゴ糖のような複雑な炭水化物類を工業的に生産する試みが、益々行われるようになった。そのような化合物は、生物体内にある数多くの生物学的プロセスにおいて役目があるため、このような試みが行われている。人乳オリゴ糖（HMOs）のような分泌オリゴ糖は、栄養学的及び治療学的な適用に関して、特に重要な商業ターゲットになっている。人乳オリゴ糖は、人の発育において重要な機能があるゆえに、ここ数年間、大きな関心を集めている。現在までに１４０を超えるHMOsの構造が特定されており、おそらく、さらに相当な数が人乳中に存在する (Urashima et al.: Milk oligosaccharides, Nova Biomedical Books, 2011; Chen Adv. Carbohydr. Chem. Biochem. 72, 113 (2015)) 。
可能な限り数多くのHMOsについて工業的な量のHMOsを作り出すために、低コストの方法が模索された結果、世界中の研究者及び企業が、幼児、子供及び成人用の栄養学的な又は治療学的な処方におけるHMOsの使用について研究、創出、開発することが出来た。現在では、HMOsは酵素によって、又は、大抵の場合、形質転換させた単一細胞、特にＥ．ｃｏｌｉを用いる発酵により製造されている。しかしながら、これらの方法では、目的とするHMOが供給されるのと一緒に他のオリゴ糖／HMO副生物が随伴する。一般的には、2'-FLには大抵の場合、DFL及び／又は3-FLが随伴し（例えば、EP-A-2896628, WO 2015/032412, WO 2015/106943を参照）、LNnT発酵培養液にはラクト－Ｎ－トリオースＩＩ（GlcNAcβ1 -3Galβ1 -4Glc）及びpLNnH（Galβ1 -4GlcNAcβ1 -3 Galβ1 -4GlcNAcβ1 -3 Galβ1 -4Glc）のような、高オリゴ糖が含まれ（例えば、WO 01/04341, Priem et al. Glycobiology 12, 235 (2002), Gebus et al. Carbohydr. Res. 361, 83 (2012), WO 2017/182965を参照）、LNTにはラクト－Ｎ－トリオースＩＩ及びpLNH II（Galβ1-3GlcNAcβ1-3Galβ1-3GlcNAcβ1-3Galβ1-4Glc）のような高オリゴ糖が混入する（例えば、WO 2015/049331, WO 2017/182965を参照）。
WO 2017/182965は、発酵によって作られたオリゴ糖混合物を、（バイオマス、酸、塩基、有機又は無機の塩、蛋白質、蛋白質の断片、DNA、エンドトキシン、生物由来アミン、着色物のような）非炭水化物成分から分離する方法を提案しており、当該方法は、限外ろ過、ナノろ過、及び、Ｈ＋型の強陽イオン交換樹脂で処理した直後に遊離塩基型の弱陰イオン交換樹脂で処理する工程を含むイオン交換樹脂の適用を含む。しかしながら、この方法は、オリゴ糖成分の各々を互いから明確に分離するものではない。
EP-A-2896628は、次の工程を含む、発酵培養液から2'-FLを精製するための方法：限外ろ過、強陽イオン交換樹脂処理（Ｈ＋型）、中和、強陰イオン交換樹脂処理（Ｃｌ－型）、中和、ナノろ過／ダイアフィルトレーション、活性炭処理、電気透析、強陽イオン交換樹脂処理（Ｎａ＋型）、強陰イオン交換樹脂処理（Ｃｌ－型）、活性炭処理、及び、電気透析、を記述しており、クロマトグラフィーを適用しないことを強調している。当該方法は、９４－９４．５％の純度（HPLCによる）をもつ2'-FLを供給するものではあるが、この出願には、最終生成物中に約５％存在する（3-FL、DFL及びラクトースのような）主要な炭水化物混入物の量が、当該方法によって低減されるのか否かについて記載されていない。
構造が近いオリゴ糖の各々を互いから分離することは、それらの特性がきわめて類似しているため困難な課題である。ゲルろ過は確かに一つの選択肢であるが（例えば、Priem et al., Glycobiology 12, 235 (2002)を参照。）、工業的に有利な方法とはいえず、実験室規模の方法だと考えられる。
構造が近いオリゴ糖の各々を互いから分離することは、それらの特性がきわめて類似しているため困難な課題である。ゲルろ過は確かに一つの選択肢であるが（例えば、Priem et al., Glycobiology 12, 235 (2002)を参照。）、工業的に有利な方法とはいえず、実験室規模の方法だと考えられる。
WO 2015/049331は、次の操作手順を含む、発酵培養液からLNTを精製するための方法：透明粒子不含有溶液とする手順、電気透析／ナノろ過、第１のシミュレーションされた移動床（SMB）を用いた強陽イオン交換樹脂クロマトグラフィー、電気透析、限外ろ過、を記述している。ある一定のSMBパラメータを用いることにより、ラフィネ―ト中でLNT及びLNTよりも大きな中性オリゴ糖が分画されるのに対して、LNTよりも小さい炭水化物（ラクトース、単糖）は、抽出分画中に濃縮される。LNTを高オリゴ糖からさらに精製するために、第２のSMBクロマトグラフィーを異なるパラメータを用いて実施することにより、抽出分画中にLNTが濃縮する。
しかしながら、発酵プロセスにおいてしばしば生成し随伴している炭水化物副生物からLNT、LNnT及びその他の中性HMOsを分離及び精製するために、代替性があり、より効率的で、ロバスト性があり、及び／又は費用効果が高く、工業的スケールアップに適している手順が、依然として必要とされている。
発明の概要
本発明によれば、水性媒体中で第２の親水性の中性オリゴ糖から第１の親水性の中性オリゴ糖を分離するための方法が提供され、当該方法は、ジビニルベンゼンにより架橋されたポリスチレン（PS-DVB）からなり、その芳香環が臭素化された疎水性固定相を用いるクロマトグラフィーにより水性媒体を処理する工程を含む。水性媒体が臭素化PS-DVB（BPS-DVB）疎水性固定クロマトグラフィー媒体に接触すると、オリゴ糖のうちの一方が固体状の固定相によって、他方のオリゴ糖よりも多量に保持され、それぞれのオリゴ糖が濃縮又は分離された分画を得ることが出来る。
本発明によれば、水性媒体中で第２の親水性の中性オリゴ糖から第１の親水性の中性オリゴ糖を分離するための方法が提供され、当該方法は、ジビニルベンゼンにより架橋されたポリスチレン（PS-DVB）からなり、その芳香環が臭素化された疎水性固定相を用いるクロマトグラフィーにより水性媒体を処理する工程を含む。水性媒体が臭素化PS-DVB（BPS-DVB）疎水性固定クロマトグラフィー媒体に接触すると、オリゴ糖のうちの一方が固体状の固定相によって、他方のオリゴ糖よりも多量に保持され、それぞれのオリゴ糖が濃縮又は分離された分画を得ることが出来る。
一実施形態において、親水性の中性オリゴ糖のうちの一方に含まれる単糖単位の数は、他方の親水性の中性オリゴ糖に含まれる単糖単位の数よりも高い。
他の実施形態において、親水性の中性オリゴ糖のうちの一方は、他方のオリゴ糖よりも少なくとも２つ多い単糖単位からなる。
他の実施形態において、親水性の中性オリゴ糖のうちの一方は、少なくとも一つのＮ－アセチルグルコサミニル（GlcNAc-）又はＮ－アセチルガラクトサミニル（GalNAc-）残基を含むが、他方のオリゴ糖は含まない。
他の実施形態において、親水性の中性オリゴ糖のうちの一方は、GlcNAc-又はGalNAc-残基を、他方のオリゴ糖よりも多く含む。
他の実施形態において、親水性の中性オリゴ糖のうちの一方は、他方のオリゴ糖よりも少なくとも２つ多い単糖単位からなる。
他の実施形態において、親水性の中性オリゴ糖のうちの一方は、少なくとも一つのＮ－アセチルグルコサミニル（GlcNAc-）又はＮ－アセチルガラクトサミニル（GalNAc-）残基を含むが、他方のオリゴ糖は含まない。
他の実施形態において、親水性の中性オリゴ糖のうちの一方は、GlcNAc-又はGalNAc-残基を、他方のオリゴ糖よりも多く含む。
一実施形態において、親水性の中性オリゴ糖の少なくとも一方は、人乳オリゴ糖又はその前駆体である。
一実施形態において、第１及び第２の親水性の中性オリゴ糖は、人乳オリゴ糖又はその前駆体である。
一実施形態において、第１及び第２の親水性の中性オリゴ糖は人乳オリゴ糖であり、それらのうち一方は、他方のオリゴ糖よりも少なくとも２つ多い単糖単位からなる。
一実施形態において、第１及び第２の親水性の中性オリゴ糖は人乳オリゴ糖であり、それらのうち一方は４糖であり、他方のオリゴ糖は６糖である。
一実施形態において、第１及び第２の親水性の中性オリゴ糖は、人乳オリゴ糖又はその前駆体である。
一実施形態において、第１及び第２の親水性の中性オリゴ糖は人乳オリゴ糖であり、それらのうち一方は、他方のオリゴ糖よりも少なくとも２つ多い単糖単位からなる。
一実施形態において、第１及び第２の親水性の中性オリゴ糖は人乳オリゴ糖であり、それらのうち一方は４糖であり、他方のオリゴ糖は６糖である。
一実施形態において、親水性の中性オリゴ糖の少なくとも一方は、GlcNAc-残基を含む人乳オリゴ糖である。
一実施形態において、第１及び第２の親水性の中性オリゴ糖は人乳オリゴ糖であり、その両方がGlcNAc-残基を含む。
一実施形態において、第１及び第２の親水性の中性オリゴ糖は人乳オリゴ糖であり、その両方がGlcNAc-残基を含み、それらのうち一方は他方のオリゴ糖よりも少なくとも２つ多い単糖単位からなる。
一実施形態において、第１及び第２の親水性の中性オリゴ糖は人乳オリゴ糖であり、それらのうち一方はGlcNAc-残基を、他方のオリゴ糖よりも多く含む。
一実施形態において、第１及び第２の親水性の中性オリゴ糖は人乳オリゴ糖であり、その両方がGlcNAc-残基を含み、それらのうち一方はGlcNAc-残基を、他方のオリゴ糖よりも多く含む。
一実施形態において、第１及び第２の親水性の中性オリゴ糖は人乳オリゴ糖であり、その両方がGlcNAc-残基を含む。
一実施形態において、第１及び第２の親水性の中性オリゴ糖は人乳オリゴ糖であり、その両方がGlcNAc-残基を含み、それらのうち一方は他方のオリゴ糖よりも少なくとも２つ多い単糖単位からなる。
一実施形態において、第１及び第２の親水性の中性オリゴ糖は人乳オリゴ糖であり、それらのうち一方はGlcNAc-残基を、他方のオリゴ糖よりも多く含む。
一実施形態において、第１及び第２の親水性の中性オリゴ糖は人乳オリゴ糖であり、その両方がGlcNAc-残基を含み、それらのうち一方はGlcNAc-残基を、他方のオリゴ糖よりも多く含む。
一実施形態において、第１及び第２の親水性の中性オリゴ糖は人乳オリゴ糖であり、それらのうち一方は他方のオリゴ糖よりも少なくとも２つ多い単糖単位からなり、当該高オリゴ糖（すなわち、より多くの単糖単位を有するもの）はGlcNAc-残基を、低オリゴ糖よりも多く含む。
一実施形態において、第１及び第２の親水性の中性オリゴ糖は人乳オリゴ糖であり、それらのうち一方はGlcNAc-残基を２つ、好ましくは厳密に２つ含む６糖であり、他方のオリゴ糖はGlcNAc-残基を１つ、好ましくは厳密に１つ含む４糖である。
一実施形態において、第１及び第２の親水性の中性オリゴ糖は人乳オリゴ糖であり、それらのうち一方はGlcNAc-残基を２つ、好ましくは厳密に２つ含む６糖であり、他方のオリゴ糖はGlcNAc-残基を１つ、好ましくは厳密に１つ含む４糖である。
一実施形態において、人乳オリゴ糖又はその前駆体は、水性培地中での発酵によって、特にＥ．ｃｏｌｉによって、細胞内で生産され、当該水性培地中へ分泌される。
一実施形態において、人乳オリゴ糖又はその前駆体を含む水性媒体を、前記BPS-DVBクロマトグラフィーにより処理する前に、下記工程のうちの１つ又は両方を行う：
ａ）前記水性媒体を清澄化して、粒子及び異物を除去し、好適には細胞構成物及び発酵過程から生じた不溶性代謝物並び不溶性残骸も除去する、
ｂ）前記水性媒体から、好適には工程ａ）で水性媒体を清澄化した後に、実質的に全ての蛋白質を除去する。
一実施形態において、人乳オリゴ糖又はその前駆体を含む水性媒体を、前記BPS-DVBクロマトグラフィーにより処理する前に、下記工程のうちの１つ又は両方を行う：
ａ）前記水性媒体を清澄化して、粒子及び異物を除去し、好適には細胞構成物及び発酵過程から生じた不溶性代謝物並び不溶性残骸も除去する、
ｂ）前記水性媒体から、好適には工程ａ）で水性媒体を清澄化した後に、実質的に全ての蛋白質を除去する。
一実施形態において、第１及び第２のオリゴ糖はLNnT及びpLNnHを含む。
一実施形態において、第１及び第２のオリゴ糖はLNT及びpLNH IIを含む。
一実施形態において、第１及び第２のオリゴ糖はLNT及びpLNH IIを含む。
詳細な説明
一般的には、高い極性をもつオリゴ糖を分離するために、高疎水性固定クロマトグラフィー媒体（逆相クロマトグラフィー、RPC）を利用することは適していない（WO 2017/221208を参照）。本発明者らは驚くべきことに、もしも固体状のクロマトグラフィー相が、ジビニルベンゼンにより架橋されたポリスチレンであってその芳香環が臭素化されたもの（BPS-DVB）で構成される場合には、RPCがこの課題に利用可能であるかもしれないことを発見した。
一般的には、高い極性をもつオリゴ糖を分離するために、高疎水性固定クロマトグラフィー媒体（逆相クロマトグラフィー、RPC）を利用することは適していない（WO 2017/221208を参照）。本発明者らは驚くべきことに、もしも固体状のクロマトグラフィー相が、ジビニルベンゼンにより架橋されたポリスチレンであってその芳香環が臭素化されたもの（BPS-DVB）で構成される場合には、RPCがこの課題に利用可能であるかもしれないことを発見した。
本発明によれば、第１の親水性の中性オリゴ糖の少なくとも一部を第２の親水性の中性オリゴ糖から分離するための方法が提供される。当該方法において、オリゴ糖は好ましくは発酵又は生体外の酵素プロセスにより生産されたものである。当該方法は、第１及び第２のオリゴ糖を含む水溶液に対し、臭素化されたポリスチレンのジビニルベンゼン架橋物（BPS-DVB）固定媒体上でクロマトグラフィーを行う工程を含む。
好ましくは、前記BPS-DVB樹脂のブロム化レベルは約２５－６１ｗ／ｗ％であり、例えば２５－３５ｗ／ｗ％である。
好ましくは、前記BPS-DVB樹脂のブロム化レベルは約２５－６１ｗ／ｗ％であり、例えば２５－３５ｗ／ｗ％である。
上記のクロマトグラフィー手法に基づく分離プロセスは、研究開発の実験室からパイロットプラントを経て工業的フルスケールに至るまでに亘り、バッチプロセス及び多段カラム構成の両方におけるロバスト性が立証された。固体相及び当該固体相と組み合わせたクロマトグラフィーの運転は、例えば水溶性アルコールを用いるグラジュエントを適用した方式により行うことが出来るが、有機溶剤を用いずに（純水で）運転を完了させることもできる。そのプロセスは、高温（例えば、上限が６０℃）において効果的に機能し、微生物の成長リスクを低減する点、及び、生産性を増大させる点で有益となる。また、固体相は、例えば、酢酸水溶液を用いて完全に再生するので、食品関連の加工に適している。
本発明において、用語「逆相クロマトグラフィー」又はRPCとは、好ましくは、疎水性の固定された（すなわち充填された）又は懸濁された相と、分離すべき成分を含む極性（すなわち水溶性）の移動相とを用いるクロマトグラフィーのいかなる方法をも意味する。
用語「親水性の中性オリゴ糖」とは、好ましくは、少なくとも２つの単糖単位を含む糖ポリマー、すなわち、ジ－、トリ－、テトラ－又はより高単糖単位を含むオリゴ糖を意味する。オリゴ糖は、内部グリコシド結合により互いに連結しあった単糖単位を含有する線状又は分岐状の構造を有し得る。オリゴ糖は、好ましくは２つから８つ、より好ましくは２つから６つの単糖単位残基により構成される。当該オリゴ糖を作り上げる単糖単位は、明白に中性の単糖であり、それらはアルドン酸、（シアル酸のような）ケト－アルドン酸、アルダル酸、アルドウロン酸のような酸性の単糖ではあり得ず、遊離アミノ基を有するもののような塩基性の単糖残基でもない。中性単糖単位の水酸基は保護されていないため、単糖によって作り上げられたオリゴ糖も、非保護である。中性の単糖単位は、アルドース類（例えばＤ－グルコース、Ｄ－ガラクトース、Ｄ－マンノース、Ｄ－リボース、Ｄ－アラビノース、Ｌ－アラビノース、Ｄ－キシロースなど）、ケトース類（例えばＤ－フルクトース、Ｄ－ソルボース、Ｄ－タガトースなど）、デオキシ糖類（Ｌ－ラムノース、Ｌ－フコースなど）及びＮ－アセチル化デオキシ－アミノ糖（例えばＮ－アセチルグルコサミン、Ｎ－アセチルマンノサミン、Ｎ－アセチルガラクトサミンなど）から構成される、５個－９個の、好ましくは５個－６個の炭素原子を含む単糖から選択することが出来る。
用語「親水性の中性オリゴ糖」とは、好ましくは、少なくとも２つの単糖単位を含む糖ポリマー、すなわち、ジ－、トリ－、テトラ－又はより高単糖単位を含むオリゴ糖を意味する。オリゴ糖は、内部グリコシド結合により互いに連結しあった単糖単位を含有する線状又は分岐状の構造を有し得る。オリゴ糖は、好ましくは２つから８つ、より好ましくは２つから６つの単糖単位残基により構成される。当該オリゴ糖を作り上げる単糖単位は、明白に中性の単糖であり、それらはアルドン酸、（シアル酸のような）ケト－アルドン酸、アルダル酸、アルドウロン酸のような酸性の単糖ではあり得ず、遊離アミノ基を有するもののような塩基性の単糖残基でもない。中性単糖単位の水酸基は保護されていないため、単糖によって作り上げられたオリゴ糖も、非保護である。中性の単糖単位は、アルドース類（例えばＤ－グルコース、Ｄ－ガラクトース、Ｄ－マンノース、Ｄ－リボース、Ｄ－アラビノース、Ｌ－アラビノース、Ｄ－キシロースなど）、ケトース類（例えばＤ－フルクトース、Ｄ－ソルボース、Ｄ－タガトースなど）、デオキシ糖類（Ｌ－ラムノース、Ｌ－フコースなど）及びＮ－アセチル化デオキシ－アミノ糖（例えばＮ－アセチルグルコサミン、Ｎ－アセチルマンノサミン、Ｎ－アセチルガラクトサミンなど）から構成される、５個－９個の、好ましくは５個－６個の炭素原子を含む単糖から選択することが出来る。
用語「臭素化されたポリスチレンのジビニルベンゼン架橋物」、「ジビニルベンゼンで架橋され、かつ、臭素化されたポリスチレン」又は、「BPS-DVB」とは、スチレンとジビニルベンゼンとの修飾された共重合体であって、スチレンモノマーの少なくとも一部が臭素化スチレンで置き換えられている（ここで、臭素は芳香環上に存在する）か、又は、ポリスチレン－ジビニルベンゼン共重合体が臭素化剤によって臭素化されているものを指す。
用語「Ｃ１－Ｃ４アルコール」とは、メタノール、エタノール、プロパノール又はブタノールのような、１個から４個の炭素原子を含むアルキルアルコールを意味する。好ましいＣ１－Ｃ４アルコールは、イソプロパノールである。
用語「Ｃ１－Ｃ４アルコール」とは、メタノール、エタノール、プロパノール又はブタノールのような、１個から４個の炭素原子を含むアルキルアルコールを意味する。好ましいＣ１－Ｃ４アルコールは、イソプロパノールである。
用語「水性媒体［発酵又は酵素プロセスから得られる］」とは、好ましくは、少なくとも１つの親水性の中性オリゴ糖を生産するための酵素的な又は発酵のプロセスから生じた水性懸濁物を意味する。
用語「清澄化した水性媒体」とは、好ましくは、プロセスから生じ懸濁している粒子又は混入物を除去するための処理、特に、後続する精製工程を妨げ得る細胞、細胞構成物、発酵プロセスから生じた不溶性の代謝物及び残骸を除去するための処理が行われた水性媒体、例えば、酵素プロセスの水性媒体又は発酵培養液を意味する。そのような清澄化処理は、遠心分離、凝集、任意の超音波処理を用いる凝集、重力ろ過、マイクロろ過、限外ろ過、発泡分離、又は、真空ろ過（例えば、Celite（登録商標）filter aid を包含し得るセラミックフィルターを通過させる）などによる従来の手法で行うことが出来る。
用語「蛋白質フリー水性媒体」とは、好ましくは、実質的に全てのタンパク質を除去するための処理、好ましくは、蛋白質と共に、ペプチド、アミノ酸、RNA、DNA並びにそれらの断片、及び、後続する精製工程を妨げ得るエンドトキシン並びに糖脂質を除去するための処理が行われた水性媒体、例えば、酵素プロセスの水性媒体又は発酵培養液を意味する。そのような蛋白質、アミノ酸、RNA及びDNAの除去は、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィー、限外ろ過、ナノろ過、又は、サイズ排除クロマトグラフィーなどによる従来の手法で成し遂げることが出来る。
用語「清澄化した水性媒体」とは、好ましくは、プロセスから生じ懸濁している粒子又は混入物を除去するための処理、特に、後続する精製工程を妨げ得る細胞、細胞構成物、発酵プロセスから生じた不溶性の代謝物及び残骸を除去するための処理が行われた水性媒体、例えば、酵素プロセスの水性媒体又は発酵培養液を意味する。そのような清澄化処理は、遠心分離、凝集、任意の超音波処理を用いる凝集、重力ろ過、マイクロろ過、限外ろ過、発泡分離、又は、真空ろ過（例えば、Celite（登録商標）filter aid を包含し得るセラミックフィルターを通過させる）などによる従来の手法で行うことが出来る。
用語「蛋白質フリー水性媒体」とは、好ましくは、実質的に全てのタンパク質を除去するための処理、好ましくは、蛋白質と共に、ペプチド、アミノ酸、RNA、DNA並びにそれらの断片、及び、後続する精製工程を妨げ得るエンドトキシン並びに糖脂質を除去するための処理が行われた水性媒体、例えば、酵素プロセスの水性媒体又は発酵培養液を意味する。そのような蛋白質、アミノ酸、RNA及びDNAの除去は、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィー、限外ろ過、ナノろ過、又は、サイズ排除クロマトグラフィーなどによる従来の手法で成し遂げることが出来る。
用語「高オリゴ糖」とは、その重合の程度が、他のオリゴ糖よりも高いこと、すなわち、他のオリゴ糖よりも多くの単糖単位を含むことを意味している。
用語「低オリゴ糖」とは、その重合の程度が、他のオリゴ糖よりも低いこと、すなわち、他のオリゴ糖よりも少ない単糖単位を含むことを意味している。
用語「低オリゴ糖」とは、その重合の程度が、他のオリゴ糖よりも低いこと、すなわち、他のオリゴ糖よりも少ない単糖単位を含むことを意味している。
クレームされた分離方法は、従来の手法で行うことが出来る。第１及び第２の親水性の中性オリゴ糖を含む水溶液が、クロマトグラフィーの移動相として用いられる。有機溶媒、好ましくはＣ１－Ｃ４アルコールが水溶液に添加されてもよい。水溶液のｐＨは、好ましくは３～８の間、より好ましくは４～７の間である。必要な場合には、酸、塩基又は緩衝剤の水溶液を添加することによる従来の手法で、ｐＨを所望の値に調整することが出来る。
分離は、実験室スケール又は工業的スケールの、従来のクロマトグラフィーのカラム又は容器を用いて容易に行うことができ、当該カラム又は容器内には、BPS-DVB樹脂が充填されていても又は懸濁されていても（例えばビーズとして）、いずれであってもよい。好ましくは、分離方法はカラム内で実施される。
分離は、実験室スケール又は工業的スケールの、従来のクロマトグラフィーのカラム又は容器を用いて容易に行うことができ、当該カラム又は容器内には、BPS-DVB樹脂が充填されていても又は懸濁されていても（例えばビーズとして）、いずれであってもよい。好ましくは、分離方法はカラム内で実施される。
分離の程度は、溶出液の性質、流通／溶出速度、捕集した分画の容積、樹脂質量又は樹脂床容積に対する第１及び第２のオリゴ糖の質量など、多数のパラメータに依存する。これらのパラメータは、慣例的なスキルを用いて最適化することが出来る。
用語「分離」とは、第１及び第２のオリゴ糖の各々を互いから完全に分離すること、すなわち、それらを、互いに他を含有しない純粋な形態で、分画から捕集及び分離することを意味する。さらに当該用語「分離」は、当該オリゴ糖の少なくとも一方を、純粋な形態で、少なくとも一つの分画から得ることが出来るか、又は、分画中に存在する第１及び第２のオリゴ糖の割合が供給液とは異なっており、それによって当該オリゴ糖のうちの一方が濃縮されるという、部分的な分離をも意味する。
用語「分離」とは、第１及び第２のオリゴ糖の各々を互いから完全に分離すること、すなわち、それらを、互いに他を含有しない純粋な形態で、分画から捕集及び分離することを意味する。さらに当該用語「分離」は、当該オリゴ糖の少なくとも一方を、純粋な形態で、少なくとも一つの分画から得ることが出来るか、又は、分画中に存在する第１及び第２のオリゴ糖の割合が供給液とは異なっており、それによって当該オリゴ糖のうちの一方が濃縮されるという、部分的な分離をも意味する。
上記したBPS-DVBクロマトグラフィーを用いて第２の親水性の中性オリゴ糖からの第１の親水性の中性オリゴ糖の分離を行った後、精製又は濃縮された第１の及び／又は第２のオリゴ糖は、水溶性分画から分離することが出来る。この分離において、それ（又はそれら）は、例えば蒸発、結晶化、凍結乾燥又は噴霧乾燥などによる従来の手法で捕集される。
好ましくは、BPS-DVB固定媒体上でのクロマトグラフィーは、次の工程を含む：
－ 第１及び第２の親水性の中性オリゴ糖を含む水溶液を、BPS-DVB媒体上に装填する、
－ 任意にＣ１－Ｃ４アルコールを含有する水を用いて溶出する、そして、
－ 当該オリゴ糖のうちの一方を含む又は当該オリゴ糖のうちの一方が濃縮された分画を捕集する。
クロマトグラフィーの後、BPS-DVB媒体を水－混和性の有機溶剤を含有する水を用いて溶出することにより再生し、再使用することが出来る。
また好ましくは、第１及び第２の親水性の中性オリゴ糖を含む水溶液は、第１及び第２のオリゴ糖が生産された／含まれている発酵培養液又は水性反応媒体に前処理を行ったものである。
－ 第１及び第２の親水性の中性オリゴ糖を含む水溶液を、BPS-DVB媒体上に装填する、
－ 任意にＣ１－Ｃ４アルコールを含有する水を用いて溶出する、そして、
－ 当該オリゴ糖のうちの一方を含む又は当該オリゴ糖のうちの一方が濃縮された分画を捕集する。
クロマトグラフィーの後、BPS-DVB媒体を水－混和性の有機溶剤を含有する水を用いて溶出することにより再生し、再使用することが出来る。
また好ましくは、第１及び第２の親水性の中性オリゴ糖を含む水溶液は、第１及び第２のオリゴ糖が生産された／含まれている発酵培養液又は水性反応媒体に前処理を行ったものである。
本方法の一態様は、第１及び第２の親水性の中性オリゴ糖の各々を互いから、少なくとも部分的に分離する工程を含んでおり、当該方法においてオリゴ糖は、水性培地中での発酵によって、好ましくはＥ．ｃｏｌｉによって細胞内で生産され、当該水性培地中へ分泌され、移送され、又は、取り込まれたものである。当該方法は、BPS-DVBクロマトグラフィーの前に、次の前処理工程を含んでいてもよい：
ａ）前記水性培地を清澄化して、当該水性培地から、粒子及び異物、また好ましくは細胞、細胞構成物、及び、発酵過程から生じた不溶性代謝物並びに不溶性残骸を除去し、清澄化した水性媒体を得る工程、及び／又は、
ｂ）前記水性培地、好ましくは、前記工程ａ）の清澄化した水性媒体から、実質的に全ての蛋白質を除去して、蛋白質フリー水性媒体を得る工程、及び／又は、
ｃ）前記水性培地、前記工程ａ）の清澄化した水性媒体、又は、前記工程ｂ）の蛋白質フリー水性媒体から、塩及び帯電した成分を除去する工程。
したがって、前記工程ａ）由来の清澄化した水性媒体、前記工程ｂ）由来の蛋白質フリー水性媒体、又は、前記工程ｃ）で得られた水性媒体が、BPS-DVB樹脂上に装填される。
ａ）前記水性培地を清澄化して、当該水性培地から、粒子及び異物、また好ましくは細胞、細胞構成物、及び、発酵過程から生じた不溶性代謝物並びに不溶性残骸を除去し、清澄化した水性媒体を得る工程、及び／又は、
ｂ）前記水性培地、好ましくは、前記工程ａ）の清澄化した水性媒体から、実質的に全ての蛋白質を除去して、蛋白質フリー水性媒体を得る工程、及び／又は、
ｃ）前記水性培地、前記工程ａ）の清澄化した水性媒体、又は、前記工程ｂ）の蛋白質フリー水性媒体から、塩及び帯電した成分を除去する工程。
したがって、前記工程ａ）由来の清澄化した水性媒体、前記工程ｂ）由来の蛋白質フリー水性媒体、又は、前記工程ｃ）で得られた水性媒体が、BPS-DVB樹脂上に装填される。
当該方法の他の態様は、第１及び第２の親水性の中性オリゴ糖の各々を互いから、少なくとも部分的に分離する工程を含んでおり、当該方法においてオリゴ糖のうち少なくとも一方は、水性媒体中での生体外の酵素プロセスにより生産されたものである。生体外酵素反応の混合物は、一般的に生産された目的物であるオリゴ糖のほか、蛋白質、蛋白質断片、無機塩、未反応の炭水化物アクセプター（一般的にはラクトース）又はドナー、糖様副生物、炭水化物残基（一般的には単糖又は二糖）などを含有している。
当該方法は、BPS-DVBクロマトグラフィーの前に、次の前処理工程を含んでいてもよい：限外ろ過（UF）、ナノろ過（NF）及び任意の活性炭（AC）処理。UFは、高分子量の懸濁固形物、一般的には蛋白質又は蛋白質断片を、水性媒体の可溶成分から分離する工程を含み、水性媒体は浸透物となって限外ろ過膜を通過する。この限外ろ過浸透物（UFP）は、生産されたオリゴ糖及び当該オリゴ糖に随伴する他の炭水化物生成物を含有する水溶液である。NF工程は、UF工程又は任意工程のAC処理に後続してもよい；この工程は、生産されたオリゴ糖及び当該オリゴ糖に随伴する他の炭水化物生成物を含有している前処理された水性媒体を濃縮するため、及び／又は、イオン、主に１価イオン、及び、単糖のように、オリゴ糖生成物よりも低い分子量を有する有機材料を除去するために、好適に用いられ得る。この点に関し、生産されたオリゴ糖及び当該オリゴ糖に随伴する他のオリゴ糖は、NF保持物（NFR）中に蓄積される。NFは、浸透物分子をより効果的に除去するために、例えば、浸透物の導電率が塩の非存在又は極めて少量の存在を示すまで除去するために、水を用いるダイアフィルトレーションと組み合わせることが出来る。任意のAC工程は、UF工程、NF工程又はBPS-DVB樹脂クロマトグラフィーに後続してもよい。AC処理は、必要に応じ、色材及び／又は塩のような水溶性混入物を除去又は少なくともその量を低減するために役立つ。
当該方法は、BPS-DVBクロマトグラフィーの前に、次の前処理工程を含んでいてもよい：限外ろ過（UF）、ナノろ過（NF）及び任意の活性炭（AC）処理。UFは、高分子量の懸濁固形物、一般的には蛋白質又は蛋白質断片を、水性媒体の可溶成分から分離する工程を含み、水性媒体は浸透物となって限外ろ過膜を通過する。この限外ろ過浸透物（UFP）は、生産されたオリゴ糖及び当該オリゴ糖に随伴する他の炭水化物生成物を含有する水溶液である。NF工程は、UF工程又は任意工程のAC処理に後続してもよい；この工程は、生産されたオリゴ糖及び当該オリゴ糖に随伴する他の炭水化物生成物を含有している前処理された水性媒体を濃縮するため、及び／又は、イオン、主に１価イオン、及び、単糖のように、オリゴ糖生成物よりも低い分子量を有する有機材料を除去するために、好適に用いられ得る。この点に関し、生産されたオリゴ糖及び当該オリゴ糖に随伴する他のオリゴ糖は、NF保持物（NFR）中に蓄積される。NFは、浸透物分子をより効果的に除去するために、例えば、浸透物の導電率が塩の非存在又は極めて少量の存在を示すまで除去するために、水を用いるダイアフィルトレーションと組み合わせることが出来る。任意のAC工程は、UF工程、NF工程又はBPS-DVB樹脂クロマトグラフィーに後続してもよい。AC処理は、必要に応じ、色材及び／又は塩のような水溶性混入物を除去又は少なくともその量を低減するために役立つ。
クレームされた分離プロセスの一実施形態においては、酵素的な、又は、好ましくは発酵プロセス、特にＥ．ｃｏｌｉ又は酵母から直接的に取得することができ、第１及び第２の水溶液の中性オリゴ糖を含有する水性媒体を、次の工程により処理する：
１）前記水性媒体を清澄化して、懸濁している粒子及び異物、特に細胞、細胞構成物、及び、発酵過程から生じた不溶性代謝物並びに不溶性残骸を除去する；それから、
２）前記工程１）で得られた水溶液から、実質的に全てのタンパク質と共に、ペプチド、アミノ酸、RNA、DNA、及び、後続する精製工程を妨げ得るエンドトキシン並びに糖脂質を除去する；それから、
３）前記工程２）で得られた水溶液から、BPS-DVB上のクロマトグラフィーにより第１及び第２のオリゴ糖を分離する。
１）前記水性媒体を清澄化して、懸濁している粒子及び異物、特に細胞、細胞構成物、及び、発酵過程から生じた不溶性代謝物並びに不溶性残骸を除去する；それから、
２）前記工程１）で得られた水溶液から、実質的に全てのタンパク質と共に、ペプチド、アミノ酸、RNA、DNA、及び、後続する精製工程を妨げ得るエンドトキシン並びに糖脂質を除去する；それから、
３）前記工程２）で得られた水溶液から、BPS-DVB上のクロマトグラフィーにより第１及び第２のオリゴ糖を分離する。
工程１）において、第１及び第２のオリゴ糖を含有する水性媒体は、例えば遠心分離又はろ過による従来の手法で、清澄化される。好ましくは、水性媒体は、先ず凝集を行ってから遠心分離又はろ過を行うことにより、残留している不溶性の粒子及び異物と共に、細胞と、細胞構成物と、不溶性の代謝物並びに残骸とを除去する。
工程２）において、蛋白質及びこれに関連する不純物は、例えば限外ろ過、ナノろ過、タンジェンシャルフローハイパフォーマンスろ過、タンジェンシャルフロー限外ろ過、アフィニティクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、ゲルろ過、サイズ排除クロマトグラフィー、活性炭処理による従来の手法で、水性媒体から除去される。活性炭処理は、必要に応じ、色材及び／又は塩のような水溶性混入物を除去又は少なくともその量を低減するために役立つ。イオン交換クロマトグラフィーは、塩、着色物、蛋白質、アミノ酸、脂質及びDNAのような、帯電した成分を効率よく除去する。
工程２）において、蛋白質及びこれに関連する不純物は、例えば限外ろ過、ナノろ過、タンジェンシャルフローハイパフォーマンスろ過、タンジェンシャルフロー限外ろ過、アフィニティクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、ゲルろ過、サイズ排除クロマトグラフィー、活性炭処理による従来の手法で、水性媒体から除去される。活性炭処理は、必要に応じ、色材及び／又は塩のような水溶性混入物を除去又は少なくともその量を低減するために役立つ。イオン交換クロマトグラフィーは、塩、着色物、蛋白質、アミノ酸、脂質及びDNAのような、帯電した成分を効率よく除去する。
好ましい及び／又は開示された実施形態を含め、第１の親水性の中性オリゴ糖をBPS-DVB上のクロマトグラフィーにより第２の親水性の中性オリゴ糖から分離する方法において、第１及び第２のオリゴ糖は、少なくとも１つの構造的特徴によって互いに異なっている。例えば、少なくとも１つの単糖単位が異なるとか、単糖単位の数が異なるとか、又は、内部グリコシド結合のうちの少なくとも１つの配向が異なる（αであるのか、ベータであるのかということ）などである。
一実施形態において、オリゴ糖のうちの一方は、他方のオリゴ糖よりも１つ多い単糖単位から構成される。他の実施形態において、オリゴ糖のうちの一方は、他方のオリゴ糖よりも２つ又は２つ以上多い単糖単位から構成され、その例としては、オリゴ糖のうちの一方は３糖であり、他方のオリゴ糖は５糖であるとか、オリゴ糖のうちの一方は４糖であり、他方のオリゴ糖は６糖であるなどがある。
他の実施形態において、オリゴ糖のうちの一方は少なくとも１つのGlcNAc-又はGalNAc-単位、好ましくはGlcNAc-単位を含むが、他方のオリゴ糖はそれらを含まない。
他の実施形態において、オリゴ糖のうちの一方は他方のオリゴ糖よりも多くのGlcNAc-又はGalNAc-単位、好ましくはGlcNAc-単位を含む。
一実施形態において、オリゴ糖のうちの一方は、他方のオリゴ糖よりも１つ多い単糖単位から構成される。他の実施形態において、オリゴ糖のうちの一方は、他方のオリゴ糖よりも２つ又は２つ以上多い単糖単位から構成され、その例としては、オリゴ糖のうちの一方は３糖であり、他方のオリゴ糖は５糖であるとか、オリゴ糖のうちの一方は４糖であり、他方のオリゴ糖は６糖であるなどがある。
他の実施形態において、オリゴ糖のうちの一方は少なくとも１つのGlcNAc-又はGalNAc-単位、好ましくはGlcNAc-単位を含むが、他方のオリゴ糖はそれらを含まない。
他の実施形態において、オリゴ糖のうちの一方は他方のオリゴ糖よりも多くのGlcNAc-又はGalNAc-単位、好ましくはGlcNAc-単位を含む。
好ましくは、オリゴ糖のうちの一方は、他方のオリゴ糖の構造を含むものであり、すなわち、オリゴ糖のうちの一方は、他方のオリゴ糖のグリコシル化誘導体である。より好ましくは、グリコシル化反応は、少なくとも２つの単糖を付加することを含む。よりさらに好ましくは、第１及び第２のオリゴ糖によって共有される構造は、ラクトース又はそのグリコシル化誘導体である。
また、好ましくは、第１及び第２の親水性の中性オリゴ糖は、ラクトース（Galβ1-4Glc）残基を還元末端に含む。より好ましくは、第１及び第２の親水性の中性オリゴ糖は、下記式１により表される。
Ｒ１は、フコシル基又はＨである、
Ｒ２は、フコシル基又はＨである、
Ｒ３は、Ｈ、Ｎ－アセチル－グルコサミニル基、Ｎ－アセチル－ラクトサミニル基、及び、ラクト－Ｎ－ビオシル基から選ばれ、Ｎ－アセチル－ラクトサミニル基又はラクト－Ｎ－ビオシル基は、１つ又はそれよりも多いＮ－アセチル－グルコサミニル基、Ｎ－アセチル－ラクトサミニル基、及び／又は、ラクト－Ｎ－ビオシル基を含むグリコシル残基を有していてもよく、；いずれのＮ－アセチル－ラクトサミニル基及びラクト－Ｎ－ビオシル基も、１つ又はそれよりも多いフコシル残基で置換されていてもよい、
Ｒ４は、Ｈ、Ｎ－アセチル－グルコサミニル基、及び、Ｎ－アセチル－ラクトサミニル基から選ばれ、Ｎ－アセチル－ラクトサミニル基は、任意に、１つ又はそれよりも多いＮ－アセチル－グルコサミニル基、Ｎ－アセチル－ラクトサミニル基、及び／又は、１つ又はそれよりも多いラクト－Ｎ－ビオシル基を含むグリコシル残基で置換されていてもよく、；いずれのＮ－アセチル－ラクトサミニル基及びラクト－Ｎ－ビオシル基も、１つ又はそれよりも多いフコシル残基で置換されていてもよい；
Ｒ２は、フコシル基又はＨである、
Ｒ３は、Ｈ、Ｎ－アセチル－グルコサミニル基、Ｎ－アセチル－ラクトサミニル基、及び、ラクト－Ｎ－ビオシル基から選ばれ、Ｎ－アセチル－ラクトサミニル基又はラクト－Ｎ－ビオシル基は、１つ又はそれよりも多いＮ－アセチル－グルコサミニル基、Ｎ－アセチル－ラクトサミニル基、及び／又は、ラクト－Ｎ－ビオシル基を含むグリコシル残基を有していてもよく、；いずれのＮ－アセチル－ラクトサミニル基及びラクト－Ｎ－ビオシル基も、１つ又はそれよりも多いフコシル残基で置換されていてもよい、
Ｒ４は、Ｈ、Ｎ－アセチル－グルコサミニル基、及び、Ｎ－アセチル－ラクトサミニル基から選ばれ、Ｎ－アセチル－ラクトサミニル基は、任意に、１つ又はそれよりも多いＮ－アセチル－グルコサミニル基、Ｎ－アセチル－ラクトサミニル基、及び／又は、１つ又はそれよりも多いラクト－Ｎ－ビオシル基を含むグリコシル残基で置換されていてもよく、；いずれのＮ－アセチル－ラクトサミニル基及びラクト－Ｎ－ビオシル基も、１つ又はそれよりも多いフコシル残基で置換されていてもよい；
よりさらに好ましくは、式１は、下記式１ａ、１ｂ又は１ｃにより表される。
上記式において、Ｒ１及びＲ２は、上記定義のとおりである、
Ｒ３ａは、Ｎ－アセチル－グルコサミニル基、又は、Ｎ－アセチル－グルコサミニル基、Ｎ－アセチル－ラクトサミニル基及び／又はラクト－Ｎ－ビオシル基を含むグリコシル残基で任意に置換されたＮ－アセチル－ラクトサミニル基であり、；いずれのＮ－アセチル－ラクトサミニル基及びラクト－Ｎ－ビオシル基も、１つ又はそれよりも多いフコシル残基で置換されていてもよい、
Ｒ４ａは、Ｈ、又は、Ｎ－アセチル－グルコサミニル基、又は、Ｎ－アセチル－グルコサミニル基又はラクト－Ｎ－ビオシル基で任意に置換されたＮ－アセチル－ラクトサミニル基であり、；いずれのＮ－アセチル－ラクトサミニル基及びラクト－Ｎ－ビオシル基も、１つ又はそれよりも多いフコシル残基で置換されていてもよい、
Ｒ３ｂは、Ｎ－アセチル－グルコサミニル基、又は、Ｎ－アセチル－グルコサミニル基、Ｎ－アセチル－ラクトサミニル基及び／又はラクト－Ｎ－ビオシル基を含むグリコシル残基で任意に置換されたラクト－Ｎ－ビオシル基であり、；いずれのＮ－アセチル－ラクトサミニル基及びラクト－Ｎ－ビオシル基も、１つ又はそれよりも多いフコシル残基で置換されていてもよい、
Ｒ４ｂは、Ｈ、又は、Ｎ－アセチル－グルコサミニル基、又は、１つ又は２つのＮ－アセチル－グルコサミニル基、Ｎ－アセチル－ラクトサミニル基及び／又は１つのラクト－Ｎ－ビオシル基で任意に置換されたＮ－アセチル－ラクトサミニル基であり、；いずれのＮ－アセチル－ラクトサミニル基及びラクト－Ｎ－ビオシル基も、１つ又はそれよりも多いフコシル残基で置換されていてもよい；
Ｒ３ａは、Ｎ－アセチル－グルコサミニル基、又は、Ｎ－アセチル－グルコサミニル基、Ｎ－アセチル－ラクトサミニル基及び／又はラクト－Ｎ－ビオシル基を含むグリコシル残基で任意に置換されたＮ－アセチル－ラクトサミニル基であり、；いずれのＮ－アセチル－ラクトサミニル基及びラクト－Ｎ－ビオシル基も、１つ又はそれよりも多いフコシル残基で置換されていてもよい、
Ｒ４ａは、Ｈ、又は、Ｎ－アセチル－グルコサミニル基、又は、Ｎ－アセチル－グルコサミニル基又はラクト－Ｎ－ビオシル基で任意に置換されたＮ－アセチル－ラクトサミニル基であり、；いずれのＮ－アセチル－ラクトサミニル基及びラクト－Ｎ－ビオシル基も、１つ又はそれよりも多いフコシル残基で置換されていてもよい、
Ｒ３ｂは、Ｎ－アセチル－グルコサミニル基、又は、Ｎ－アセチル－グルコサミニル基、Ｎ－アセチル－ラクトサミニル基及び／又はラクト－Ｎ－ビオシル基を含むグリコシル残基で任意に置換されたラクト－Ｎ－ビオシル基であり、；いずれのＮ－アセチル－ラクトサミニル基及びラクト－Ｎ－ビオシル基も、１つ又はそれよりも多いフコシル残基で置換されていてもよい、
Ｒ４ｂは、Ｈ、又は、Ｎ－アセチル－グルコサミニル基、又は、１つ又は２つのＮ－アセチル－グルコサミニル基、Ｎ－アセチル－ラクトサミニル基及び／又は１つのラクト－Ｎ－ビオシル基で任意に置換されたＮ－アセチル－ラクトサミニル基であり、；いずれのＮ－アセチル－ラクトサミニル基及びラクト－Ｎ－ビオシル基も、１つ又はそれよりも多いフコシル残基で置換されていてもよい；
よりさらに好ましくは、式１ａ及び１ｂは次のとおり特徴づけられる：
－ Ｒ３ａのグリコシル残基内のＮ－アセチル－ラクトサミニル基は、他のＮ－アセチル－ラクトサミニル基に対し１－３内部グリコシド結合で付加される、
－ Ｒ３ａのグリコシル残基内のラクト－Ｎ－ビオシル基は、Ｎ－アセチル－ラクトサミニル基に対し１－３内部グリコシド結合で付加される、
－ Ｒ４ａのグリコシル残基内のラクト－Ｎ－ビオシル基は、Ｎ－アセチル－ラクトサミニル基に対し１－３内部グリコシド結合で付加される、
－ Ｒ４ｂのグリコシル残基内のＮ－アセチル－ラクトサミニル基は、他のＮ－アセチル－ラクトサミニル基に対し１－３又は１－６内部グリコシド結合で付加される、
－ Ｒ４ｂのグリコシル残基内のラクト－Ｎ－ビオシル基は、Ｎ－アセチル－ラクトサミニル基に対し１－３内部グリコシド結合で付加される。
－ Ｒ３ａのグリコシル残基内のＮ－アセチル－ラクトサミニル基は、他のＮ－アセチル－ラクトサミニル基に対し１－３内部グリコシド結合で付加される、
－ Ｒ３ａのグリコシル残基内のラクト－Ｎ－ビオシル基は、Ｎ－アセチル－ラクトサミニル基に対し１－３内部グリコシド結合で付加される、
－ Ｒ４ａのグリコシル残基内のラクト－Ｎ－ビオシル基は、Ｎ－アセチル－ラクトサミニル基に対し１－３内部グリコシド結合で付加される、
－ Ｒ４ｂのグリコシル残基内のＮ－アセチル－ラクトサミニル基は、他のＮ－アセチル－ラクトサミニル基に対し１－３又は１－６内部グリコシド結合で付加される、
－ Ｒ４ｂのグリコシル残基内のラクト－Ｎ－ビオシル基は、Ｎ－アセチル－ラクトサミニル基に対し１－３内部グリコシド結合で付加される。
よりさらに好ましくは、式１ａ、１ｂ及び１ｃで表される化合物は、人乳オリゴ糖である。ここで、式１ａの好ましい化合物は、ラクト－Ｎ－ネオテトラオース、パラ－ラクト－Ｎ－ヘキサオース、パラ－ラクト－Ｎ－ネオヘキサオース、ラクト－Ｎ－ネオヘキサオース、パラ－ラクト－Ｎ－オクタオース、又は、ラクト－Ｎ－ネオオクタオースであり、それら全ては１つ又はそれよりも多いフコシル残基で任意に置換されていてもよい；式１ｂの好ましい化合物は、ラクト－Ｎ－テトラオース、ラクト－Ｎ－ヘキサオース、ラクト－Ｎ－オクタオース、イソ－ラクト－Ｎ－オクタオース、ラクト－Ｎ－デカオース、又は、ラクト－Ｎ－ネオデカオースであり、それら全ては１つ又はそれよりも多いフコシル残基で任意に置換されていてもよい。特に、式１ａ又は１ｂの化合物は、Ｎ－アセチル－ラクトサミニル基及び／又はラクト－Ｎ－ビオシル基に付加しているフコシル残基が、
－ ラクト－Ｎ－ビオシル基のガラクトースに、１－２内部グリコシド結合で連結している、及び／又は、
－ ラクト－Ｎ－ビオシル基のＮ－アセチル－グルコサミンに、１－４内部グリコシド結合で連結している、及び／又は、
－ Ｎ－アセチル－ラクトサミニル基のＮ－アセチル－グルコサミンに、１－３内部グリコシド結合で連結していることにより、特徴づけられる。
－ ラクト－Ｎ－ビオシル基のガラクトースに、１－２内部グリコシド結合で連結している、及び／又は、
－ ラクト－Ｎ－ビオシル基のＮ－アセチル－グルコサミンに、１－４内部グリコシド結合で連結している、及び／又は、
－ Ｎ－アセチル－ラクトサミニル基のＮ－アセチル－グルコサミンに、１－３内部グリコシド結合で連結していることにより、特徴づけられる。
最も好ましい態様によれば、下位式１ａ、１ｂ及び１ｃの化合物は、以下よりなる群から選ばれる：ラクトース、２’－フコシルラクトース、３－フコシルラクトース、２’，３－ジフコシルラクトース、ラクト－Ｎ－テトラオース、ラクト－Ｎ－ネオテトラオース、LNFP I、LNFP II、LNFP III、LNFP V、LNFP VI、LNDFH I、LNDFH II、LNDFH III、pLNnH、モノフコシル化pLNnH、pLNnH II、モノフコシル化pLNH II、及び、ラクト－Ｎ－トリオース II。
一実施形態において、第１及び第２の親水性の中性オリゴ糖のうちの一方は、GlcNAc又はGalNAc単位をその構造中に含まないが、他方のオリゴ糖は含む。
一実施形態において、第１及び第２の親水性の中性オリゴ糖は両方とも、GlcNAc又はGalNAc単位、好ましくはGlcNAc単位をその構造中に含む。
一実施形態において、第１及び第２の親水性の中性オリゴ糖のうちの一方は、他方のオリゴ糖よりも多いGlcNAc又はGalNAc単位、好ましくはGlcNAc単位をその構造中に含む。好ましい実施形態において、第１及び第２のオリゴ糖は、式１ａで表され、より好ましくは、Ｒ１がＨ、Ｒ３ａがＮ－アセチル－ラクトサミニル基及び／又はラクト－Ｎ－ビオシル基で任意に置換されたＮ－アセチル－ラクトサミニル基であり；いずれのＮ－アセチル－ラクトサミニル基及びラクト－Ｎ－ビオシル基も、１つ又はそれよりも多いフコシル残基で置換されていてもよく、及び、Ｒ４ａがＨである。よりさらに好ましくは、オリゴ糖のうちの一方は４糖、例えばLNnTであり、他方のオリゴ糖は５糖又は６糖、例えばpLNnHである。
一実施形態において、第１及び第２の親水性の中性オリゴ糖は両方とも、GlcNAc又はGalNAc単位、好ましくはGlcNAc単位をその構造中に含む。
一実施形態において、第１及び第２の親水性の中性オリゴ糖のうちの一方は、他方のオリゴ糖よりも多いGlcNAc又はGalNAc単位、好ましくはGlcNAc単位をその構造中に含む。好ましい実施形態において、第１及び第２のオリゴ糖は、式１ａで表され、より好ましくは、Ｒ１がＨ、Ｒ３ａがＮ－アセチル－ラクトサミニル基及び／又はラクト－Ｎ－ビオシル基で任意に置換されたＮ－アセチル－ラクトサミニル基であり；いずれのＮ－アセチル－ラクトサミニル基及びラクト－Ｎ－ビオシル基も、１つ又はそれよりも多いフコシル残基で置換されていてもよく、及び、Ｒ４ａがＨである。よりさらに好ましくは、オリゴ糖のうちの一方は４糖、例えばLNnTであり、他方のオリゴ糖は５糖又は６糖、例えばpLNnHである。
他の好ましい実施形態によれば、第１及び第２のオリゴ糖は、式１ｂで表され、より好ましくは、Ｒ１がＨ、Ｒ３ｂがＮ－アセチル－グルコサミニル基、Ｎ－アセチル－ラクトサミニル基及び／又はラクト－Ｎ－ビオシル基を含むグリコシル残基で任意に置換されたラクト－Ｎ－ビオシル基；いずれのＮ－アセチル－ラクトサミニル基及びラクト－Ｎ－ビオシル基も、１つ又はそれよりも多いフコシル残基で置換されていてもよく、及び、Ｒ４ｂがＨである。よりさらに好ましくは、オリゴ糖のうちの一方は４糖、例えばLNTであり、他方のオリゴ糖は５糖又は６糖、例えばpLNH IIである。
実施例
包括的説明：使用前に、PS-DVB又はBPS-DVB樹脂を３０％酢酸溶液中に２時間混合し、脱気した。それから、それらをガラス製カラムに充填し、導電率が５００μＳ／ｃｍ未満に到達するまで水で洗浄した。
包括的説明：使用前に、PS-DVB又はBPS-DVB樹脂を３０％酢酸溶液中に２時間混合し、脱気した。それから、それらをガラス製カラムに充填し、導電率が５００μＳ／ｃｍ未満に到達するまで水で洗浄した。
［実施例１］
２本のガラス製カラム（ｌ：４０ｃｍ、ｄ：２６ｍｍ）にPurosorb PAD428 BPS-DVB樹脂、及び、Sepabeads SP825L PS-DVB（非臭素化）樹脂を、それぞれ充填した。LNnT（５００ｍｇ）及びpLNnH（１１５ｍｇ、４．３５：１の割合）の混合物を１０ｍｌの水に溶解した溶液のクロマトグラフィーを、流速およそ２．５ｍｌ／ｍｉｎとし各樹脂上で行った。分画（およそ２０ｍｌ）を捕集し、ＨＰＬＣにより分析した。
結果：
Purosorb PAD428 臭素化PS-DVB樹脂については、LNnT：pLNnHを８．７：１の割合で含有している分画３－分画１０（９６ｍｌ、およそ０．５－１．６７ベッド体積）を貯蔵した（LNnTの７７％を回収した。）。
Sepabeads SP825L PS-DVB樹脂については、LNnT：pLNnHを４．７：１の割合で含有している分画２－分画８（１０４ｍｌ、およそ０．３－１．１７ベッド体積）を貯蔵した（LNnTの９８％を回収した。）。
BPS-DVB樹脂は、LNnTを、その割合が２倍ほどに濃縮したのに対し、非臭素化PS-DVB樹脂は、実用的な分離が見られなかった。
２本のガラス製カラム（ｌ：４０ｃｍ、ｄ：２６ｍｍ）にPurosorb PAD428 BPS-DVB樹脂、及び、Sepabeads SP825L PS-DVB（非臭素化）樹脂を、それぞれ充填した。LNnT（５００ｍｇ）及びpLNnH（１１５ｍｇ、４．３５：１の割合）の混合物を１０ｍｌの水に溶解した溶液のクロマトグラフィーを、流速およそ２．５ｍｌ／ｍｉｎとし各樹脂上で行った。分画（およそ２０ｍｌ）を捕集し、ＨＰＬＣにより分析した。
結果：
Purosorb PAD428 臭素化PS-DVB樹脂については、LNnT：pLNnHを８．７：１の割合で含有している分画３－分画１０（９６ｍｌ、およそ０．５－１．６７ベッド体積）を貯蔵した（LNnTの７７％を回収した。）。
Sepabeads SP825L PS-DVB樹脂については、LNnT：pLNnHを４．７：１の割合で含有している分画２－分画８（１０４ｍｌ、およそ０．３－１．１７ベッド体積）を貯蔵した（LNnTの９８％を回収した。）。
BPS-DVB樹脂は、LNnTを、その割合が２倍ほどに濃縮したのに対し、非臭素化PS-DVB樹脂は、実用的な分離が見られなかった。
［実施例２］
ガラス製カラム（ｌ：４０ｃｍ、ｄ：２６ｍｍ）にPurosorb PAD428 BPS-DVB樹脂を充填した。LNnT（１．２ｇ）及びpLNnH（０．２５ｇ、４．８：１の割合）の混合物を２０ｍｌの水に溶解した溶液のクロマトグラフィーを、流速およそ４ｍｌ／ｍｉｎとし各樹脂上で行った。分画（およそ３０ｍｌ）を捕集し、ＨＰＬＣにより分析した。
LNnT：pLNnHを７．６５：１の割合で含有している分画２－分画１０（２４０ｍｌ、およそ０．５－２．６ベッド体積）を貯蔵し、LNnTの９０％を回収した。
ガラス製カラム（ｌ：４０ｃｍ、ｄ：２６ｍｍ）にPurosorb PAD428 BPS-DVB樹脂を充填した。LNnT（１．２ｇ）及びpLNnH（０．２５ｇ、４．８：１の割合）の混合物を２０ｍｌの水に溶解した溶液のクロマトグラフィーを、流速およそ４ｍｌ／ｍｉｎとし各樹脂上で行った。分画（およそ３０ｍｌ）を捕集し、ＨＰＬＣにより分析した。
LNnT：pLNnHを７．６５：１の割合で含有している分画２－分画１０（２４０ｍｌ、およそ０．５－２．６ベッド体積）を貯蔵し、LNnTの９０％を回収した。
［実施例３］
ガラス製カラム（ｌ：４０ｃｍ、ｄ：２６ｍｍ）にSepabeads SP207 BPS-DVB樹脂を充填した。LNnT（１．５ｇ）、pLNnH（１００ｍｇ）及びF-pLNnH（Galβ1-4[Fucα1-3]GlcNAcβ1-3Galβ1-4GlcNAcβ1-3Galβ1-4Glc、WO 2016/063261を参照、５０ｍｇ；３０：２：１の割合）の混合物を３０ｍｌの水に溶解した溶液のクロマトグラフィーを、流速およそ６ｍｌ／ｍｉｎとし各樹脂上で行った。分画（およそ３０ｍｌ）を捕集し、ＨＰＬＣにより分析した。
分画３－分画１４（４００ｍｌ）を貯蔵した。その分画は、LNnT：pLNnH：Galβ1-4[Fucα1-3]GlcNAcβ1-3Galβ1-4GlcNAcβ1-3Galβ1-4Glcを１２９：２．６：１の割合で含有していた。
ガラス製カラム（ｌ：４０ｃｍ、ｄ：２６ｍｍ）にSepabeads SP207 BPS-DVB樹脂を充填した。LNnT（１．５ｇ）、pLNnH（１００ｍｇ）及びF-pLNnH（Galβ1-4[Fucα1-3]GlcNAcβ1-3Galβ1-4GlcNAcβ1-3Galβ1-4Glc、WO 2016/063261を参照、５０ｍｇ；３０：２：１の割合）の混合物を３０ｍｌの水に溶解した溶液のクロマトグラフィーを、流速およそ６ｍｌ／ｍｉｎとし各樹脂上で行った。分画（およそ３０ｍｌ）を捕集し、ＨＰＬＣにより分析した。
分画３－分画１４（４００ｍｌ）を貯蔵した。その分画は、LNnT：pLNnH：Galβ1-4[Fucα1-3]GlcNAcβ1-3Galβ1-4GlcNAcβ1-3Galβ1-4Glcを１２９：２．６：１の割合で含有していた。
［実施例４］
LNnTを、ＬａｃＺ－、ＬａｃＹ＋、ｐｈｅｎｏｔｙｐｅの遺伝子改変Ｅ．ｃｏｌｉを用いる発酵により生産した。ここで、当該細胞は、UDP-GlcNAc のGlcNAcを、当該細胞に取り込まれたラクトースに転移させることができるβ－１，３－Ｎ－アセチル－グルコサミニルトランスフェラーゼをエンコードする組み換え遺伝子、UDP-Galのガラクトシル残基をＮ－アセチル－グルコサミニル化ラクトースに転移させることができるβ－１，４－ガラクトシルトランスフェラーゼをエンコードする組み換え遺伝子、及び、UDP-GlcNAc及びUDP-Gal方向への生合成経路をエンコードする遺伝子を有する。
発酵は、外部から添加したラクトース及び適当な炭素源の存在下で当該細胞を培養することにより実施し、それによって、LNnTがラクト－Ｎ－トリオース ＩＩ、pLNnH及びラクトースを随伴して発酵培養液中に生産された。
LNnTを、ＬａｃＺ－、ＬａｃＹ＋、ｐｈｅｎｏｔｙｐｅの遺伝子改変Ｅ．ｃｏｌｉを用いる発酵により生産した。ここで、当該細胞は、UDP-GlcNAc のGlcNAcを、当該細胞に取り込まれたラクトースに転移させることができるβ－１，３－Ｎ－アセチル－グルコサミニルトランスフェラーゼをエンコードする組み換え遺伝子、UDP-Galのガラクトシル残基をＮ－アセチル－グルコサミニル化ラクトースに転移させることができるβ－１，４－ガラクトシルトランスフェラーゼをエンコードする組み換え遺伝子、及び、UDP-GlcNAc及びUDP-Gal方向への生合成経路をエンコードする遺伝子を有する。
発酵は、外部から添加したラクトース及び適当な炭素源の存在下で当該細胞を培養することにより実施し、それによって、LNnTがラクト－Ｎ－トリオース ＩＩ、pLNnH及びラクトースを随伴して発酵培養液中に生産された。
培養液に対し、UF、ダイアフィルトレーションと組み合わせたNF、活性炭を用いた脱色、及び、イオン交換処理（陽イオンと陰イオンの両方）により、標準的な細胞除去操作を行った。得られた溶液は、LNnT（３０ｇ／ｌ）、ラクトース、ラクト－Ｎ－トリオース ＩＩ及びpLNnH（１０．６％vs. LNnT）を含有していた。当該溶液を、Sepabeads SP207 BPS-DVB樹脂を充填したカラムに装填（ベッド容積１００ｍｌ当たり約１．６ｇのLNnT）し、０．０２％のイソプロパノールを含有する水を用いて溶出させた。およそ１．１－２．１ベッド容積の分画を捕集した。
ＨＰＬＣ分析は、LNnTの８２％が回収され、その一方で、pLNnHの量が０．３％vs. LNnTまで低減されたことを示した。
ＨＰＬＣ分析は、LNnTの８２％が回収され、その一方で、pLNnHの量が０．３％vs. LNnTまで低減されたことを示した。
［実施例５］
LNTを、ＬａｃＺ－、ＬａｃＹ＋、ｐｈｅｎｏｔｙｐｅの遺伝子改変Ｅ．ｃｏｌｉを用いる発酵により生産した。ここで、当該細胞は、UDP-GlcNAc のGlcNAcを、当該細胞に取り込まれたラクトースに転移させることができるβ－１，３－Ｎ－アセチル－グルコサミニルトランスフェラーゼをエンコードする組み換え遺伝子、UDP-Galのガラクトシル残基をＮ－アセチル－グルコサミニル化ラクトースに転移させることができるβ－１，３－ガラクトシルトランスフェラーゼをエンコードする組み換え遺伝子、及び、UDP-GlcNAc及びUDP-Gal方向への生合成経路をエンコードする遺伝子を有する。
発酵は、外部から添加したラクトース及び適当な炭素源の存在下で当該細胞を培養することにより実施し、それによって、LNTがラクト－Ｎ－トリオース ＩＩ、pLNH II及びラクトースを随伴して発酵培養液中に生産された。
LNTを、ＬａｃＺ－、ＬａｃＹ＋、ｐｈｅｎｏｔｙｐｅの遺伝子改変Ｅ．ｃｏｌｉを用いる発酵により生産した。ここで、当該細胞は、UDP-GlcNAc のGlcNAcを、当該細胞に取り込まれたラクトースに転移させることができるβ－１，３－Ｎ－アセチル－グルコサミニルトランスフェラーゼをエンコードする組み換え遺伝子、UDP-Galのガラクトシル残基をＮ－アセチル－グルコサミニル化ラクトースに転移させることができるβ－１，３－ガラクトシルトランスフェラーゼをエンコードする組み換え遺伝子、及び、UDP-GlcNAc及びUDP-Gal方向への生合成経路をエンコードする遺伝子を有する。
発酵は、外部から添加したラクトース及び適当な炭素源の存在下で当該細胞を培養することにより実施し、それによって、LNTがラクト－Ｎ－トリオース ＩＩ、pLNH II及びラクトースを随伴して発酵培養液中に生産された。
培養液に対し、UF、ダイアフィルトレーションと組み合わせたNF、活性炭を用いた脱色、及び、イオン交換処理（陽イオンと陰イオンの両方）により、標準的な細胞除去操作を行った。得られた溶液は、LNT（２０．７ｇ／ｋｇ、ＨＰＬＣによる純度：７６．１％）、ラクトース、ラクト－Ｎ－トリオース ＩＩ及びpLNH II（３．２３％vs. LNT）を含有していた。当該溶液を凍結乾燥した。凍結乾燥粉末（３．４０ｇ）の試料を４５ｍｌの水に溶解し、当該溶液を、Sepabeads SP207 BPS-DVB樹脂を充填したカラム（カラム径：１．６ｃｍ、ベッド容積：１７０ｍｌ）に装填し、水（１．５ベッド容積）を用いて溶出させてから、２０％メタノールを用いて溶出させた。分画の容量は１７０ｍｌであった。分画１１－分画２６を貯蔵し、凍結乾燥し、２．８５ｇの固形物が得られた。
ＨＰＬＣ分析は、LNTの純度が８１．３％まで増大し、その一方で、pLNH IIの量が０．２５％vs. LNTまで低減されたことを示した。
ＨＰＬＣ分析は、LNTの純度が８１．３％まで増大し、その一方で、pLNH IIの量が０．２５％vs. LNTまで低減されたことを示した。
Claims (22)
- 第１の親水性の中性オリゴ糖を第２の親水性の中性オリゴ糖から分離する方法であって、
当該第１及び第２のオリゴ糖を含む水溶液に対し、臭素化されたポリスチレンのジビニルベンゼン架橋物（BPS-DVB）固定媒体上でのクロマトグラフィー処置を行う工程を含む方法。 - 前記BPS-DVB固定媒体のブロム化レベルが、乾燥重量基準で約２５－６１ｗ／ｗ％である、請求項１に記載の方法。
- 前記第１及び第２のオリゴ糖は、水性培地中での発酵によって、好ましくはＥ．ｃｏｌｉによって、細胞内で生産させてから、当該水性培地中へ分泌させ、移動させ、又は、取り込ませる、請求項１又は２に記載の方法。
- 下記工程のうちの少なくとも１つが、前記BPS-DVB固定媒体上でのクロマトグラフィーに先行して行われる、請求項３に記載の方法：
ａ）前記水性培地を清澄化して、当該水性培地から、粒子及び異物、好ましくは細胞、細胞構成物、及び、発酵過程から生じた不溶性代謝物並びに不溶性残骸を除去し、清澄化した水性媒体を得る工程、
ｂ）前記水性培地、好ましくは、前記工程ａ）の清澄化した水性媒体から、実質的に全ての蛋白質を除去して、蛋白質フリー水性媒体を得る工程、
ｃ）前記水性培地、前記工程ａ）の清澄化した水性媒体、又は、前記工程ｂ）の蛋白質フリー水性媒体から、塩及び帯電した成分を除去する工程。 - 前記工程ａ）、ｂ）及び／又はｃ）は、限外ろ過、ナノろ過、イオン交換処理、及び、任意に活性炭処理を含む、請求項４に記載の方法。
- 前記オリゴ糖のうちの一方に含まれる単糖単位の数は、他方のオリゴ糖に含まれる単糖単位の数よりも高い、請求項１乃至５のいずれか一項に記載の方法。
- 前記オリゴ糖のうちの一方は、他方のオリゴ糖よりも少なくとも２つ多い単糖単位を含む、請求項６に記載の方法。
- 前記オリゴ糖のうちの少なくとも一方は、GlcNAc-又はGalNAc-残基を含む、請求項６又は７に記載の方法。
- 前記オリゴ糖は両方とも、GlcNAc-又はGalNAc-残基を含む、請求項８に記載の方法。
- 前記オリゴ糖のうちの一方は、他方のオリゴ糖よりも多くのGlcNAc-又はGalNAc-残基を含む、請求項９に記載の方法。
- 前記の高単糖単位オリゴ糖は、低単糖単位オリゴ糖よりも多くのGlcNAc-又はGalNAc-残基を含む、請求項１０に記載の方法。
- 前記オリゴ糖のうちの一方は４糖であり、他方のオリゴ糖は６糖又は７糖である、請求項６乃至１１のいずれか一項に記載の方法。
- 前記第１及び第２のオリゴ糖は、人乳オリゴ糖（HMOs）である、請求項１乃至５のいずれか一項に記載の方法。
- 前記HMOsのうちの一方に含まれる単糖単位の数は、他方のHMOよりも高い、請求項１３に記載の方法。
- 前記HMOsのうちの一方は、他方のHMOよりも少なくとも２つ多い単糖単位から構成される、請求項１４に記載の方法。
- 前記HMOsのうちの少なくとも一方は、GlcNAc-残基を含む、請求項１３乃至１５のいずれか一項に記載の方法。
- 前記HMOsは両方とも、GlcNAc-残基を含む、請求項１６に記載の方法。
- 前記HMOsのうちの一方は、他方のHMOよりも多くのGlcNAc-残基を含む、請求項１７に記載の方法。
- 前記の高単糖単位HMOは、低単糖単位HMOよりも多くのGlcNAc-残基を含む、請求項１８に記載の方法。
- 前記HMOsのうちの一方は４糖であり、他方のHMOは６糖又は７糖である、請求項１３乃至１９のいずれか一項に記載の方法。
- 前記４糖はLNnTであり、前記６糖はpLNnHである、請求項１２又は２０のいずれか一項に記載の方法。
- 前記４糖はLNTであり、前記６糖はpLNH IIである、請求項１２又は２０のいずれか一項に記載の方法。
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